MX2010012239A - Montajes micelares. - Google Patents

Montajes micelares.

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MX2010012239A
MX2010012239A MX2010012239A MX2010012239A MX2010012239A MX 2010012239 A MX2010012239 A MX 2010012239A MX 2010012239 A MX2010012239 A MX 2010012239A MX 2010012239 A MX2010012239 A MX 2010012239A MX 2010012239 A MX2010012239 A MX 2010012239A
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MX
Mexico
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micellar
micellar assembly
species
destabilizing
Prior art date
Application number
MX2010012239A
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Inventor
Paul Johnson
Anna Gall
Patrick S Stayton
Allan S Hoffman
Anthony J Convertine
Craig L Duvall
Danielle Benoit
Robert Overell
Mary Prieve
Amber Paschal
Charbel Diab
Priyadarsi De
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Univ Washington
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan en la presente los montajes micelares que comprenden una pluralidad de copolímeros. En ciertos casos, los montajes micelares proporcionados en la presente son partículas sensibles al pH.

Description

MONTAJES MICELARES REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/052,908, presentada el 13 de Mayo del 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/052,914, presentada el 13 de Mayo del 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/091,294, presentada el 22 de Agosto del 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/112,048, presentada el 06 de Noviembre del 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos ( Núm. 61/140,774, presentada el 24 de Diciembre del 2008, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/171,369, presentada el 21 de Abril del 2009, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
DECLARACIÓN RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN FEDERAL ENTE PATROCINADA Esta invención fue realizada con el apoyo gubernamental bajo el Número de Contrato NIH1RO1EB002991 , concedido por los Institutos Nacionales de la Salud.1 El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención .
CAMPO DE LA INVENCIÓN Se describe en la presente los montajes micelares presentados a partir de polímeros y el uso de ¡tales montajes micelares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En ciertos casos, es benéfico proporcionar agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos) a las células vivas. En algunos casos, la distribución de ( tales polinucleótidos a una célula viva proporciona un beneficio terapéutico.
SÜMARIO DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades de la presente se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, el s montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, y en donde el bloque de envoltura es hidrofílico aproximadamente a un pH neutro. En algunas modalidades, el término "membrana" se refiere a una membrana citoplásmica, una membrana vesicular, una membrana de hoyuelo recubierto, una membrana endosomal y/o una membrana celular.
En ciertas modalidades de la presente se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a un pH aproximadamente neutro, el bloque de núcleo es un bloque copolimérico, y en donde el bloque de envoltura es hidrofílico a aproximadamente a un pH neutro. Cuando el pH está aproximadamente en el pka de la especie cargable, existirá una distribución en equilibrio de las especies cargables en ambas formas . En el caso de una especie aniónica, aproximadamente 50% de la población será aniónica y aproximadamente 50% será no cargada cuando el pH esté al pKa de la especia aniónica. Entre más alejado esté el pH del pKa de la especie cargable, existirá un desplazamiento correspondiente en este equilibrio, tal que a valores de pH más altos, la forma aniónica predominará, y a valores de pH más bajos, predominará la forma no cargada. Las modalidades descritas en la presente incluyen la forma de los copolímeros a cualquier valor de pH. j En ciertas modalidades de la presenté se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, la primera especie cargable está hidrofóbicamente blindada, en donde el bloque de envoltura es hidrofílico a un pH aproximadamente neutro.
En ciertas modalidades de la presente se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadorés de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y una segunda especie cargable que es catiónica a pH aproximadamente neutro, y en donde la envoltura es hidrofílica a un pH aproximadamente neutro.
En ciertas modalidades de la presente se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de i la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y en donde el bloque de envoltura es un hidrófilo independiente de la temperatura a un pH aproximadamente neutro. En una modalidad, el "hidrófilo independiente a la temperatura" se refiere a un hidrófilo que tiene propiedades hidrofílicas que son sustancialmente no variantes sobre el intervalo de temperatura de 20 a 40 grados Celsius. Como resultado, las propiedades hidrofílicas son sustancialmente no variantes antes de y después de la administración del montaje micelar a un paciente humano. En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana que son desestabilizadores de la membrana a un pH de aproximadamente 6.5 o menos a aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5, o de aproximadamente 6.2 o menor .
En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana utilizados en los montajes micelares proporcionados en la presente comprenden al menos dos bloques, o son copolímeros dibloque.
En ciertas modalidades, la envoltura del montaje micelar comprende un grupo polietilenglicol . En modalidades específicas, el bloque de envoltura1 del copolímero en bloque desestabilizador de membrana es o comprende polietilenglicol. En algunas modalidades, el bloque de envoltura comprende una pluralidad de unidades monoméricas de envoltura, y en donde una o más de la pluralidad de unidades monoméricas de envoltura están sustituidas o funcionalizadas con un grupo PEG.
En algunas modalidades, la forma del montaje micelar sobre el intervalo de pH de aproximadamente 6.2 a 7.5 es una micela, o una pseudo-micela o una estructura similar a micela. En modalidades adicionales y alternativas, la forma del montaje micelar sobre el intervalo de pH de aproximadamente 6.2 a 7.5 es una micela.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar en el cual al menos un bloque de uno o más copolímeros en bloque desestabilizadores de membrana es un bloque en gradiente.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende al menos un reactivo de investigación. En ciertas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente comprende al menos un agente de diagnóstico. En algunas modalidades, el montaje micelar comprende al menos un agente terapéutico. En modalidades específicas, el agente terapéutico es enlazado al bloque de envoltura de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en el montaje micelar por un enlace covalente, una interacción no covalente, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente, comprende un primer agente terapéutico enlazado al bloque de envoltura de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, y al menos un segundo agente terapéutico dentro de la porción de núcleo del montaje micelar. En algunas modalidades, cada montaje micelar comprende en promedio 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 50 agentes terapéuticos. En algunas modalidades, un agente terapéutico proporcionado en los montajes micelares descritos en la presente, comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato, o al menos un aminoácido. En ciertas modalidades, el agente terapéutico es un polinucleótido, un oligonucleótido, un modulador de expresión de genes, un agente de knockdown, un ARNsi, un agente de AR i, un sustrato cortador, un ARNmi, un ARNsh, un oligonucleótido antisentido, o un aptámero. En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente terapéutico proteico (por ejemplo, una proteína, péptido, enzima, proteína dominante-negativa, hormona, anticuerpo, molécula similar a anticuerpo, o fragmento de anticuerpo) . , En ciertas modalidades, el agente terapéutico es un carbohidrato o una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Daltones. En algunas modalidades, uno o más de la pluralidad de copolímerós en bloque desestabilizadores de la membrana está enlazado a un agente terapéutico.
En algunas modalidades, el bloque de envoltura de los copolímerós en bloque desestabilizadores de la membrana comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido. En algunas modalidades, el bloque de envoltura es no peptídico. En ciertas modalidades, al menos un nucleótido es un ribonucleótido . En algunas modalidades, al menos un nucleótido es un modulador de expresión de genes, un agente de knockdo n, un ARNsi, un agente de ARNi, un sustrato cortador, un ARNmi, un ARNsh, un oligonucleótido antisentido, o un aptámero. En modalidades específicas, el agente de knockdown es un ARNsi, un oligonucleótido antisentido, un ARNmi o un ARNsh.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende al menos una porción de dirección al objetivo.
En ciertas modalidades, el bloque de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es cargado o cargable. En algunas modalidades, el bloque de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es policatiónico a un pH aproximadamente neutro. En ciertas modalidades, el bloque de envoltura comprende unidades monoméricas catiónicas y no catiónicas. En algunas modalidades, el bloque de envoltura comprende al menos una unidad monomérica cargable, catiónica y al menos una unidad monomérica no cargable.
En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana con un bloque de envoltura que es un bloque homopolimérico . En modalidades adicionales o alternativas, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana con un bloque de envoltura que es un bloque heteropolimérico . En algunas modalidades, el bloque de envoltura de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana de un montaje micelar proporcionado en la presente, comprende una unidad monomérica de N, N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -etacrilato, una unidad monomérica de N, -di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -metacrilato, una unidad monomérica de N, -di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Cx-C6) -acrilato o una combinación de los mismos. ¡ En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende un núcleo con al menos una primera especie cargable y al menos una segunda especie cargable, en donde la primera especie cargable es cargable o cargada a una especie aniónica, en donde la segunda especie cargable es cargable o cargada a una especie catiónica, y en donde la proporción de la primera especie cargable a la segunda especie cargable presente en el núcleo, es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1. En ciertas modalidades, la proporción del grupo positivamente cargado a grupos negativamente cargados en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1 a pH aproximadamente neutro. En ciertas modalidades, la proporción de los grupos positivamente cargados a los grupos negativamente cargados en el núcleo es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a pH aproximadamente neutro. En algunas modalidades^ la proporción de los grupos positivamente cargados a los grupos negativamente cargados en el núcleo es de aproximadamente 1:1.1 hasta aproximadamente 1.1:1 ¡a pH aproximadamente neutro.
En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana comprenden más de 5, más de 20, o más de 100 especies cargables que son cargadas o cargables a especies aniónicas . En algunas modalidades, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana que comprende mas de 5, mas de 20, mas de 50, o mas dé 100 primeras especies cargables. En modalidades específicas, cada primer especie cargable es cargable o cargada a una especie aniónica. En algunas modalidades, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50, o más de 100 segundas especies cargables. En algunas modalidades, cada segunda especie cargable es cargada o cargable a una especie catiónica. En ciertas modalidades, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50, o más de 100 segundas especies hidrofóbicas . En algunas modalidades, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende más de i 5, más de 20, más de 50, o más de 100 especies cargables que son cargadas o cargables a especies aniónicas. En ciertas modalidades, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana proporcionado en la presente, comprende más de 5, más de 20, más de 50, o más de 100 primeras especies cargables. En modalidades específicas, cada primer especie cargable es cargable o cargada a una especie aniónica. En algunas modalidades, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50, o más de 100 segundas especies cargables. En modalidades específicas, cada especie cargable es cargada o cargable a una especie catiónica. En ciertas modalidades, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana proporcionado en la presente, comprende más de 5, más de 20, más de 50, o más de 100 especies hidrofóbicas .
En algunas modalidades, un bloque de núcleo de al menos un copolímero en bloque desestabilizador dé la membrana comprende una primera especie cargable (por ejemplo, cargable aniónica) presente sobre una primera unidad monomérica, y la segunda especie cargable (por ejemplo, cargable catiónica) sobre una segunda unidad monomérica . En modalidades alternativas, una primera y una segunda especies cargables están sobre la misma unidad monomérica (por ejemplo, una unidad monomérica zwiteriónicamente cargable) . En algunas modalidades, la proporción del número de primeras unidades monoméricas al número de segundas unidades monoméricas presentes en el núcleo, es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4: i.
En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente, comprende al menos un copolimero en bloque desestabilizador de la membrana con bloque de núcleo que comprende al menos una primera unidad monomérica cargable y al menos una segunda unidad monomérica cargable. En algunas modalidades, la primera unidad monomérica cargable es un ácido de Bronsted. En ciertas modalidades, al menos 80% de la primera unidad monomérica cargable está cargada, por pérdida de un H+, a una especie aniónica a un pH de aproximadamente 7.4. En modalidades adicionales o alternativas, menos del 50% de la primera unidad monomérica cargable es cargado a una especie aniónica a un pH de aproximadamente 6. En algunas modalidades, la primera unidad monomérica cargable es un ácido alquilacrílico de (C2-C8) . En ciertas modalidades, la segunda unidad monomérica cargable es una base de Bronsted. En algunas modalidades, al menos 40% de la segunda unidad monomérica cargable está cargada, por ganancia de un H+, a una especie catiónica a un pH de aproximadamente 7.4. En ciertas modalidades, la segunda unidad monomérica cargable es N, N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -etacrilato, N(N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -metacrilato, o N, N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil d'e Cx-C6) -acrilato. En algunas modalidades, el bloque de núcleo comprende además al menos una unidad monomérica no cargable. En ciertas modalidades, una unidad monomérica no cargable es un etacrilato de alquilo de (C2 -Ce) un metacrilato de alquilo de (C2-C8) o un acrilato de alquilo de (C2-C8) -acrilato.
En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente es una partícula con un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 200 nm. En modalidades específicas, el montaje micelar tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 20 nm hasta aproximadamente 100 nm. En modalidades más específicas, el montaje micelar tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 30 nm hasta aproximadamente 80 nm.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que es autoensamblado . En ciertas modalidades, el montaje micelar se auto-ensambla en un medio acuoso a un pH de entre de aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. En algunas modalidades, el auto-ensamble ocurre en menos de 2 horas, en menos de 1 hora, en menos de 30 minutos, en menos de 15 minutos. En algunas modalidades, el montaje micelar es desestabilizador de la membrana en un medio acuoso a un pH dentro de aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.4.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende una carga catiónica neta mayor a un pH de aproximadamente 5 que1 a un pH de aproximadamente 7. En algunas modalidades, el valor absoluto de la carga del montaje micelar es mayor a pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana que tienen un bloque de núcleo y un bloque de envoltura, en donde la proporción del peso molecular promedio en número del bloque de núcleo al peso molecular promedio en número del bloque de envoltura es de aproximadamente 5 : 1 hasta aproximadamente 1:1, o de 1:1 a aproximadamente 5:1. En modalidades más específicas, la proporción del peso molecular promedio en número del bloque de núcleo del . peso molecular promedio en número del bloque de envoltura es de aproximadamente 2:1.
En ciertas modalidades, el montaje micelar proporcionado en la presente comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana con un bloque de núcleo que tiene cualquier peso molecular promedio en número, adecuado (Mn) , por ejemplo, mayor de 2,000 daltones, de aproximadamente 2,000 daltones hasta aproximadamente 200,000 daltones, de aproximadamente 2,000 daltones hasta aproximadamente 100,000 daltones, de aproximadamente 2,000 daltones hasta aproximadamente 100,000 daltones, de aproximadamente 10,000 daltones hasta aproximadamente 200,000 daltones, o de aproximadamente 10,000 daltones hasta aproximadamente 100,000 daltones. En algunas modalidades, el montaje micelar se proporciona en la presente comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana con un bloque de envoltura que tiene cualquier peso molecular promedio en número, adecuado (Mn) , por ejemplo, mayor de 5,000 daltones, o de aproximadamente 5,000 daltones hasta aproximadamente 50,000 daltones.
En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana proporcionados en la presente tiene un índice de polidispersión menor de 2, menor de 1.8, menor de 1.6, menor de 1.5, menor de 1.4, o menor de 1.3.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que es estable a un pH de aproximadamente 7.4. En ciertas modalidades, el montaje micelar es substancialmente menos estable a un pH de aproximadamente 5.8 que a un pH de aproximadamente 7.4.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que es estable a una concentración de aproximadamente 10 pg/ml, o mayor (por ejemplo, aproximadamente a pH neutro) . En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que es estable a una concentración de aproximadamente 100 µ9/p?1, o mayor (por ejemplo, aproximadamente a pH neutro) .
En ciertas modalidades, se describe en la presente, cualquiera de , los polímeros que constituyen los montajes micelares descritos en la presente. Es decirj, las subunidades poliméricas (por ejemplo, los copolímeros en bloque) o los polímeros individuales (ya sea que estén o no en la forma de un montaje micelar) son también modalidades descritas en la presente. Para ser explícitos, todos y cada uno de los copolímeros en bloque que son presentados en la presente, están dentro del alcance de la invención descrita en la presente, ya sea como un polímero individual, o bien como una unidad polimérica/hebra/componente del montaje micelar descrito en la presente. i BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las numerosas características de la invención son descritas con particularidad en las reivindicaciones anexas. Un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención será obtenido1 por referencia a la siguiente descripción detallada que describe las modalidades ilustrativas, en la cual son utilizados los principios de la invención, y los dibujos anexos de los cuales : Figura 1A: Es un ejemplo ilustrativo de la composición y las propiedades de los polímeros sintetizados por RAFT Figura IB: Es un ejemplo ilustrativo de la composición y las propiedades de los copolímeros PEGMA-DMAEMA Figuras 2A y 2B: Son un ejemplo ilustrativo de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (R N) de los copolímeros en bloque PRx0729v6.
Figura 3: Es un ejemplo ilustrativo de la determinación de dispersión de luz dinámica (DLS, por sus siglas en inglés) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 formado en complejo con el ARNsi.
Figura 4: Es un ejemplo ilustrativo del análisis de desplazamiento en gel de los complejos poliméricos de PRx0729v6/AR si a diferentes proporciones de carga. i Figura 5 : Es un ejemplo ilustrativo de la concentración de estabilidad crítica (CSC) del polímero PRx0729v6.
Figura 6 : Es un ejemplo ilustrativo de la estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en solventes orgánicos.
Figuras 7A-7C: Es un ejemplo ilustrativo de la actividad de knockdown de los complejos ARNsi-micela en células de mamífero cultivadas.
Figuras 8A-8B: Es una demostración ilustrativa de la actividad desestabilizadora de la membrana de las micelas poliméricas y sus complejos con ARNsi.
Figura 9: Es un análisis de microscopía electrónica de transmisión, ilustrativa (TE ) del polímero PRx0729v6. j Figuras 10A y 10B: Es una microscopía de fluorescencia ilustrativa de la absorción celular y la. distribución intracelular de los complejos polímero-ARNsi.
Figuras 11A y 11B: Es un ejemplo ilustrativo del efecto del pH sobre la estructura del polímero.
Figuras 12A y 12B: Es un resumen ilustrativo de los datos de knockdown de los complejos ARNsi-micela en células de mamífero cultivadas.
Figura 13: Es un ejemplo ilustrativo del poli [DMAEMA] -macro CTA funcionalizado en el extremo con galactosa .
Figura 14: Es un ejemplo ilustrativo de la síntesis de [PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] Figuras 15A-15C: Son un ejemplo ilustrativo de la copolimerización de RAFT de PEGM y MAA-NHS Figura 16: Es un ejemplo ilustrativo de los copolímeros de dos bloques de DMAEMA-MAA (NHS) o PEGMA-MAA (NHS) funcionalizados con galactosa Figuras 17A-17D: Son un ejemplo ilustrativo de las estructuras de los ARNsi conjugables, péptidos, y piridil-disulfuro-amina DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades de la presente se proporcionan los montajes micelares y los procesos para la elaboración de los mismos. En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende una pluralidad de copolímeros en bloque, los copolímeros en bloque que comprenden un bloque de envoltura y un bloque de núcleo. En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende un bloque de núcleo del polímero de bloques múltiples, y en donde la envoltura comprende un bloque de envoltura del polímero de bloques múltiples. En algunas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente son autoensamblados. En modalidades específicas, los montajes micelares son espontáneamente autoensamblados. En algunas modalidades, el montaje micelar es una micela.
En ciertas modalidades, el núcleo del montaje micelar comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos . En algunas modalidades, los grupos hidrofóbicos son hidrofóbicos aproximadamente a un pH neutro. En modalidades más específicas, el grupo hidrofóbico es hidrofóbico a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6 y/o un pH de aproximadamente 5) l En ciertas modalidades, dos o más grupos hidrofóbicos diferentes están presentes. En algunas modalidades, un grupo hidrofóbico tiene un valor p de aproximadamente uno, o más . Un valor p del compuesto es una medida de su valor hidrofílico-lipofílico relativo (ver por ejemplo, Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ . 45:11-13 (1981)).
En algunas modalidades, el núcleo del montaje micelar comprende al menos una carga aproximadamente a un pH neutro (por ejemplo, aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, al menos una carga es una carga negativa. En una modalidad más específica, al menos una carga es al menos una carga negativa y al menos dos cargas positivas .
En modalidades específicas, el bloque de envoltura es hidrofílico (por ejemplo, aproximadamente a un pH neutro) . En algunas modalidades, el montaje micelar es perturbado o disociado a un pH dentro de aproximadamente 4.7 a aproximadamente 6.8.
En algunos casos, se proporcionan en la presente los montajes micelares adecuados para la distribución de agentes terapéuticos (incluyendo, por ejemplo, oligonucleótidos o péptidos) a una célula viviente. En algunas modalidades, los montajes micelares comprenden una pluralidad de copolímeros en bloque y, opcionalmenté , al menos un agente terapéutico. En ciertas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son biocompatibles, estables (incluyendo química y/o físicamente estables), y/o reproduciblemente sintetizados. Adicionalmente, en algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son no tóxicos (por ejemplo, muestran baja toxicidad) , protegen la carga del agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido o el péptido) de la degradación, entran a las células vivas por medio de un proceso de origen natural (por ejemplo, mediante endocitosis) , y/o distribuyen la carga del agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido o el péptido) dentro del citoplasma de una célula viviente, después de ser puestos en contacto con la célula. En ciertos casos, el polinucleótido (por ejemplo, el oligonucleótido) es un ARNsi y/u otro agente "basado en nucleótido" que altera la expresión de al menos un gen en la célula. En consecuencia, en ciertas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son útiles para distribuir el ARNsi o el péptido dentro de una célula. En ciertos casos, la célula está in vi tro, y en otros casos, la célula está in vivo. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva de los montajes micelares que comprenden un ARNsi o péptido es administrada a un individuo en necesidad de la misma (por ejemplo, en necesidad de tener un gen inactivado en donde el gen es capaz de ser inactivado por el ARNsi administrado) . En casos específicos, los montajes micelares son útiles para y están específicamente diseñados para la distribución del ARNsi o el péptido a las células específicamente dirigidas del individuo.
DEFINICIONES Se entiende que, con respecto a esta solicitud, el uso del singular incluye el plural y viceversa, a no ser que se establezca expresamente de otro modo. Es decir, "un", "uno", "una" y "el", "la" se refieren a uno o más de lo que la palabra modifique. Por ejemplo, "el polímero" o "un nucleótido" pueden referirse a un polímero o nucleótido o a una pluralidad de polímeros o nucleótidos . Por el mismo tenor, los "polímeros" y "nucleótidos" se podrían referir a un polímero o un nucleótido así como a una pluralidad de polímeros o nucleótidos a no ser J que, nuevamente, sea expresamente establecido o hecho obvio a partir del contexto que tal cosa no es pretendida.
Como se utiliza en la presente, dos porciones o compuestos son "enlazados" si éstos son mantenidos juntos por una interacción que incluye, a manera de ejemplo no limitante, uno o más enlaces covalentes, una o más i interacciones no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, fuerzas estáticas, interacciones de van der Waals, combinaciones de los mismos, o similares) , o una combinación de los mismos .
Alif tico o grupo alifático: el término "alifático" o "grupo alifático" , como se utiliza en la presente, significa una porción hidrocarburo que puede ser de cadena lineal (por ejemplo, no ramificada) , ramificada o cíclica (incluyendo fusionada, unida en puente o policíclica espirofusionada) y puede estar completamente saturada o puede contener una o más unidades de insaturación, pero no aromática. A no ser que se especifique de otro modo, los grupos alifáticos contienen 1-20 átomos de carbono. i Monómero aniónico: "Monómero aniónico" o "unidad monomérica aniónica" , como se utiliza en la presente, es un raonómero o unidad monomérica que posee un grupo que está presente en un estado aniónico cargado o en un estado no cargado, pero en el estado no cargado es capaz de volverse cargado aniónico, por ejemplo, después de la eliminación de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) , por ejemplo de una manera dependiente del pH) . En ciertos casos, el grupo está sustancial y negativamente cargado, a un pH aproximadamente fisiológico, pero sufre protonación y se vuelve sustancialmente neutro a un pH débilmente ácido. Los ejemplos no limitantes de tales grupos incluyen grupos carboxilo, ácido barbitúrico y derivados del mismo, xantina y derivados de la misma, ácidos borónicos, ácidos fosfínicos, ácidos fosfónicos, ácidos sulfínicos, fosfatos y sulfonamidas .
Especie aniónica: "Especie aniónica" , como se utiliza en la presente, es un grupo, residuo o molécula que está presente en un estado cargado aniónico o no cargado, pero en el estado no cargado es capaz de volverse cargado aniónico, por ejemplo, después de la eliminación de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) , por ejemplo de una manera dependiente del pH) . En ciertos casos, el grupo, residuo o molécula está sustancial y negativamente cargado a un pH aproximadamente fisiológico, pero sufre protonación y se vuelve sustancialmente neutro a un pH débilmente ácido.
Arilo o grupo arilo: como se utiliza en la presente, el término "arilo" o "grupo arilo" se refiere a los sistemas de anillos monocíclicos , bicíclicós y tricíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros en el anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático, y en donde cada anillo en el sistema contiene tres a siete miembros en el anillo.
Como se utiliza en la presente, una "carga neutralizada" significa una partícula que tiene un potencial Zeta que está entre ±10 a ±30 mV, y/o la presencia de un primer número (z) de las especies cargables que son cargables a una carga negativa (por ejemplo, las especies acidas que se vuelven aniónicas después de la desprotonación) y un segundo número (0.5.z) de las especies cargables que son cargables a una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas después de la protonación) .
Como se utiliza en la presente, pH fisiológico normal se refiere al pH de los fluidos predominantes del cuerpo de mamífero tales como la sangre, el suero, el citosol de las células normales, etc. En ciertos casos, el pH fisiológico normal es pH aproximadamente neutro, incluyendo, por ejemplo, un pH de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.4. En algunos casos, el pH aproximadamente neutro es un pH de 6.6 a 7.6. Como se utiliza en la presente, los términos pH neutro, pH fisiológico son sinónimos e intercambiables.
Como se utiliza en la presente, un montaje micelar es "perturbado" , si éste no funciona de una manera idéntica, similar o sustancialmente similar y/o posee características físicas y/o químicas idénticas, similares o sustancialmente similares como las que podría tener un montaje micelar estable. En una "perturbación" de un montaje micelar puede ser determinada de cualquier manera adecuada. En un caso, un montaje micelar es "perturbado" si éste no tiene un tamaño de partícula hidrodinámico que sea menor de 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces, 1.8 veces, 1.6 veces, 1.5 veces, 1.4 veces, 1.3 veces, 1.2 veces, o 1.1 veces, el tamaño de partícula hidrodinámica de un montaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque y como es formado en una solución acuosa a un pH de 7.4, o formado en suero humano. En un caso, un montaje micelar es "perturbado" si éste no tiene una concentración del ensamblaje que sea menor de 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces, 1.8 veces, 1.6 veces, 1.5 veces, 1.4 veces, 1.3 veces, 1.2 veces, o 1.1 veces la concentración del ensamblaje de un montaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque y como es formado en una solución acuosa a un pH de 7.4 , o formado en suero humano .
Heteroalquilo : el término "heteroalquilo" significa un grupo alquilo, en donde al menos uno de los átomos de carbono de la cadena principal es reemplazado con un heteroátomo. ! Heterparilo: el término "heteroarilo" significa un grupo arilo en donde al menos uno de los miembros del anillo es un heteroátomo. ¡ i Como se utiliza en la presente, una "especie cargable" , "grupo cargable" , o "unidad monomérica cargable" es una especie, grupo o unidad monomérica en un estado ya sea cargado o no cargado. En ciertos casos, una "unidad monomérica cargable" es una que puede ser convertida a un estado cargado (ya sea un estado cargado aniónico o catiónico) por la adición o eliminación de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) , por ejemplo de una manera dependiente del pH) . El uso de cualquiera de los términos "especie cargable", "grupo cargable", o "unidad monomérica cargable" incluye la descripción de cualquiera otra de una "especie cargable", "grupo cargable", o "unidad monomérica cargable" a no ser que se establezca de otro modo. Una "especie cargable" que es "cargada o cargable a un anión" o "cargada o cargable a una especie aniónica" , es una especie o grupo que está ya sea en un estado aniónico cargado o en un estado no cargado, pero en el estado no cargado, es capaz de ser convertida a un estado cargable aniónico, por ejemplo, por eliminación de un electrófilo, tal como un protón (H+) . En modalidades específicas, una especie cargable es una especie que es cargada a un anión aproximadamente a un pH neutro. Se debe enfatizar qúe no todas las especies cargables sobre un polímero serán aniónicas a un pH cercano al pKa (constante de disociación de ácido) de la especie cargable, sino más bien un equilibrio de la especie aniónica y no aniónica coexistirá. Una "especie cargable" que es "cargable o cargada a un catión" o "cargada o cargable a una especie catiónica" , es una especie o grupo que está ya sea en un estado cargado catiónico o en un estado no cargado, pero en el estado no cargado es capaz de ser convertida a un estado cargado catiónico, por ejemplo, por la adición de un electrófilo, tal como un protón (H+) . En modalidades específicas, una especie cargable es una especie que es cargada a un catión a un pH aproximadamente neutro. Se debe enfatizar que no i todas las especies catiónicas cargadas sobre un polímero serán catiónicas a un pH cercano al pKa (constante de disociación ácida) de la especie catiónica cargada, sino más bien coexistirá un equilibrio de las especies catiónicas y no catiónicas. "Unidades monoméricas cargables" descritas en la presente, son utilizadas intercambiablemente con "residuos monoméricos cargables" .
Heteroátomo: el término "heteroátomo" significa un átomo diferente de hidrógeno o de carbono, tal como el oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, boro, arsénico, selenio, o átomo de silicio.
Especie hidrofóbica: "especie hidrofóbica" (utilizada intercambiablemente en la presente con "porción aumentadora de la hidrofobicidad" ) , como se utiliza en la presente, es una porción tal como un sustituyente , residuo o un grupo el cual, cuando se enlaza covalentemente a una molécula, tal como un monómero o un polímero, incrementa la hidrofobicidad de la molécula o sirve como una porción aumentadora de la hidrofobicidad. El término "hidrofobicidad" es un término de la técnica que describe una propiedad física de un compuesto, medida por la energía libre de transferencia del compuesto entre un solvente no polar y el agua (Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6:1302-1307.) La hidrofobicidad de un compuesto puede ser medida por su valor logP, el logaritmo de un coeficiente de partición (P) , el cual es definido como la proporción de las concentraciones de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos solventes no miscibles, por ejemplo, octanol y agua. Los métodos experimentales de determinación de la hidrofobicidad, así como los métodos de cálculo asistido por computadora de los valores logP, son conocidos por aquellos expertos en la materia. Las especies hidrofóbicas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, los grupos alif ticos, heteroalif tico, arilo y heteroarilo.
Como se utiliza en la presente, un "núcleo hidrofóbico" · comprende las porciones hidrofóbicas . En ciertos casos, un "núcleo hidrofóbico" está sustancialmente no cargado (por ejemplo, la carga es sustancialmente neutra neta) . 1 Inhibición: Los términos "inhibición", "silenciamiento" y "atenuación", como se utilizan en la presente, se refieren a una reducción mensurable en la expresión de un ARNm objetivo o la proteína correspondiente en comparación a la expresión del ARNm objetivo o la proteína correspondiente en ausencia de un agente de knockdown. "knockdown" , o la reducción en la expresión del ARNm objetivo o la proteína correspondiente, puede ser evaluada por la medición de los niveles de ARNm utilizando técnicas bien conocidas en la materia, tal como la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) , hibridación en solución de ARN, protección de nucleasa, transferencia de northern (northern blot) e hibridación, y monitoreo de expresión de genes con un microarreglo; y en el caso de las proteínas mediante técnicas bien conocidas en la materia tales como SDS-PAGE, enlace al anticuerpo, análisis de transferencia de Western, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo o ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) , análisis celular activado por fluorescencia e inmunocitoquímica .
Sin estar comprometidos por alguna teoría no expresamente indicada en las reivindicaciones, un polímero desestabilizador de la membrana puede directa o indirectamente promover un cambio (por ejemplo, un cambio en la permeabilidad) en una estructura membranal celular (por ejemplo, una membrana endosomal) para permitir así que un agente (por ejemplo, polinucleótido) , en asociación con o independiente de un montaje micelar o micela (o un polímero constituyente del mismo) , pase a través de tal estructura membranal -por ejemplo entre a una célula o salga de una vesícula celular (por ejemplo, un endosoma) . Un polímero desestabilizador de la membrana puede ser (pero no necesariamente) un polímero perturbador de la membrana. Un polímero perturbador de la membrana puede directa o indirectamente promover la lisis de una vesícula celular o la perturbación de una membrana celular (por ejemplo, 1 como se observa para una fracción sustancial de membranas celulares) .
En general, las porciones desestabilizadas de la membrana o perturbadores de la membrana de los polímeros o micelas, pueden ser evaluados por diversos medios. Én un procedimiento no limitante, un cambio en una estructura de la membrana celular puede ser observado mediante la evaluación en ensayos que miden (directa o indirectamente) la liberación de un agente (por ejemplo, polinucleótido) a partir de las membranas celulares (por ejemplo, membranas endosomales) -por ejemplo, mediante la determinación de la presencia o la ausencia de tal agente, o una actividad de tal agente, en un ambiente externo a tal membrana. 1 Otro procedimiento no limitante involucra la medición de la lisis de la célula sanguínea roja (hemolisis) -por ejemplo, como un ensayo sustituto para una membrana celular de interés. Los ensayos son opcionalmente realizados a un valor de pH simple o a valores de pH múltiples.
Como se utiliza en la presente, una "micela" incluye una partícula que comprende un núcleo y una envoltura hidrofílica, en donde el núcleo es mantenido junto al menos parcialmente, predominantemente o sustancialmente a través de interacciones hidrofóbic s1. En ciertos casos, como se utiliza en la presente, una "micela" es una nanopartícula de componentes múltiples que comprende al menos dos dominios, el dominio interno o núcleo, y el dominio externo o envoltura. El núcleo es al menos parcial, predominante o sustancialmente mantenido junto por interacciones hidrofóbicas , y está presente en el centro de la micela. Como se utiliza en la presente, la "envoltura de una micela" es definida como la porción no nuclear de la micela.
Como se utiliza en la presente, una partícula o montaje es "similar a micela" si sustancialmente se comporta como una micela: (1) ésta es formada por autoasociación espontánea de los copolímeros en bloque para formar montajes organizados (por ejemplo, micelas) después de la dilución a partir de un solvente miscible en agua (tal como, pero no limitado a etanol) a solventes acuosos (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4); (2) es estable a la dilución (por ejemplo, hasta una concentración del polímero de 100 yg/ml, 50 pg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml o 1 pg/ml, que constituye la concentración de estabilidad crítica o la concentración micelar crítica (CMC)); (3) es estable a alta fuerza iónica del medio circundante (por ejemplo, NaCl 0.5M); y/o (4) tiene una inestabilidad cada vez mayor conforme se incrementa la concentración del solvente orgánico, tales solventes orgánicos incluyen, pero no están limitados a dimetilformamida (DMF) , sulfóxido de dimetilo (DMS) , y dioxano.
Un "hidrófobo desestabilizador de la membrana, dependiente del pH" es un grupo que es al menos parcialmente, predominantemente, o sustancialmente hidrofóbico y es desestabilizador de la membrana de una manera dependiente del pH. En ciertos casos, un hidrófobo cargable desestabilizador de la membrana, dependiente del pH es un segmento polimérico hidrofóbico de un copolímero en bloque y/o comprende una pluralidad de especies hidrofóbicas ; y comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas . En algunas modalidades, la especie cargable aniónica es aniónica a un pH aproximadamente neutro. En modalidades adicionales o alternativas, la especie cargable aniónica es no cargada a un pH más bajo, por ejemplo, endosomal . En algunas modalidades, el hidrófobo cargable desestabilizador de la membrana comprende una pluralidad de especies catiónicas . El hidrófobo cargable desestabilizador de la membrana, dependiente del pH comprende una cadena principal polimérica no peptídica y no lipídica.
Como se utiliza en la presente, un montaje micelar descrito en la presente es "estable" si el montaje no se disocia o se llega a desestabilizar. En ciertos casos, un montaje micelar estable es uno que tiene un tamaño de partícula hidrodinámico que está dentro de aproximadamente 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, ó 10% del tamaño de partícula hidrodinámico de un montaje micelar' que comprende los mismos copolímeros en bloque inicialmente formados en una solución acuosa a un pH de 7.4 (por ejemplo, una solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4). En algunos casos, un montaje micelar estable es uno que tiene una concentración de formación/ensamble que está dentro de aproximadamente 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, ó 10% de la concentración de formación/ensamble de un montaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque inicialmente en una solución acuosa a un pH de 7.4 (por ejemplo, una solución salina amortiguada con fosfató, pH 7.4).
Nanopartícula : Como se utiliza en la presente, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tiene un diámetro menor de 1000 nanómetros (nm) , En general, las nanopartículas deben tener dimensiones lo suficientemente pequeñas para permitir su absorción por las células eucarióticas . Típicamente, las nanopartículas tienen una dimensión recta más larga (por ejemplo, diámetro) de 200 nm o menos. En algunas modalidades, las nanopartículas tienen un diámetro de 100 nm o menos. Las nanopartículas más pequeñas, por ejemplo, que tienen diámetros de aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 200 nm, aproximadamente 20 nm hasta aproximadamente 100 nm, ó 50 nm o menos, por ejemplo, 5 nm-30 nm, ó 10 nm-30 nm, son utilizadas en algunas modalidades.
Nucleótido: Como se utiliza en la presente, el término "nucleótido" , en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que sea o que pueda ser incorporada dentro de una cadena polinucleotídica (por ejemplo, el oligonucleótido) . En algunas modalidades, un nucleótido es un compuesto y/o sustancia que es o que puede ser incorporado dentro de un polinucleótido (por ejemplo, el oligonucleótido) vía un enlace fosfodiéster . En algunas modalidades, "nucleótido" se refiere a los residuos individuales de ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos) . En ciertas modalidades, "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más nucleótidos presentes; en diversas modalidades, uno o más nucleótidos, son nucleótidos discretos, son no covalentemente enlazados uno al otro, o están covalentemente uno al otro. Como tales, en ciertos casos, "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más polinucleótidos (por ejemplo, el oligonucleótido) . En algunas modalidades, un polinucleótido es un polímero que comprende dos o más unidades monoméricas nucleotídicas .
Modulador de la expresión de gen1 de oligonucleótidos : como se utiliza en la presente', un "modulador de la expresión de gen de oligonucleótido" es un agente oligonucleotídico capaz de inducir una modulación selectiva de la expresión del gen en una célula viva mediante mecanismos que incluyen, pero no están limitados a un mecanismo antisentido o por medio de una vía mediada por el ARN de interferencia (R Ai) -que puede incluir (i) la inactivación de la transcripción; (ii) la degradación o el secuestro del AR m; (iii) la inhibición o la atenuación transcripcional o (iv) la inhibición o la atenuación de la traducción. Los moduladores de expresión del gen de oligonucleótido incluyen AR regulador (incluyendo virtualmente cualquier ARN regulador) tales como, pero no limitados a, oligonucleótidos antisentido, ARNmi, ARNsi, i ARNi, ARNsh, aptámeros y cualesquiera análogos o precursores de los mismos. 1 Agente de knockdown de oligonucleótido: como se utiliza en la presente, un "agente de knockdown de ¦ i oligonucleótido" es una especie oligonucleotídica que puede inhibir la expresión del gen al dirigirse a y enlazarse a un ácido nucleico intracelular de una manera específica de secuencia. Los ejemplos no limitantes de los agentes de knockdown oligonucleótidos incluyen ARNsi, ARNmi, ARNsh, sustratos cortadores, oligonucleótidos antisentido, ARN o ADN señuelo, oligonucleótidos antigénicos y cualesquiera análogos y precursores de los mismos.
Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un polímero que comprende 7-200 unidades monoméricas nucleotídicas . En algunas modalidades, "oligonucleótido" abarca el ARN de una: sola hebra y/o de doble hebra, así como el ADN de una sola hebra y/o de doble hebra. Además, los términos "nucleótido" , "ácido nucleico" , "ADN" , "ARN" , y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, por ejemplo, análogos que tienen una cadena principal modificada, incluyendo pero no limitados a ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ácidos nucleicos asegurados (LNA) , fosfono-PNA, ácidos nucleicos con grupo funcional morfolino, o ácidos nucleicos con grupos fosfato modificado (por ejemplo, fosforotioatos , fosfonatos, enlaces 5 ' -N-fosforamidita) . Los nucleótidos pueden ser purificados a partir de fuentes naturales, producidos utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificados, químicamente sintetizados, etc. Como se utiliza en la presente, un "nucleósido" es el término que describe un compuesto que comprende un monosacárido y una base. El monosacárido incluye, pero no está limitado a los monosacáridos pentosa y hexosa. El monosacárido también incluye miméticos de monosacárido y monosacáridos modificados al sustituir los grupos hidroxilo con halógenos, grupos metoxi, hidrógeno o amina, o mediante esterificación de grupos hidroxilo adicionales. En algunas modalidades, un nucleótido es o comprende un fosfato de nucleósido natural (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y fosfato de desoxicitidina) . En algunas modalidades, la base incluye cualesquiera bases de origen natural en diversos ácidos nucleicos, así como otras modificaciones que imitan o asemejan a tales bases de origen natural. Los ejemplos no limitantes de bases modificadas o derivatizadas incluyen 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmeti1 ) uracilo, 5 -carboximetilaminómeti1- 2 -tiouridina, 5-carboximetilaminometilurácilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- i dimetilguanina, 2 -metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouracilo, quedsina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, ¡ 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, 2-aminoadenina, pirrolopirimidina, y 2, 6-diaminopurina. , Las bases nucleosídicas también incluyen nucleobases universales tales como difluorotolilo, nitroindolilo, nitropirrolilo, o nitroimidazolilo . Los nucleótidos también incluyen nucleótidos que albergan un marcador o contienen monómeros abásicos, por e emplo, que carecen de una base. La secuencia de ácido nucleico es presentada en la dirección 5' a 3' a no ser que se indique de otro modo. Un nucleótido puede enlazarse a otro nucleótido de una manera específica de secuencia a través de enlaces de hidrógeno vía los pares de bases de Watson-Crick. Se dice que tales pares de bases son complementarios uno al otro. Un oligonucleótido puede ser de una sola hebra, de !doble hebra o de triple hebra.
Interferencia de ARN (ARNi) : Como se utiliza en la presente, el término "interférente de ARN" o "ARNi" se refiere a la inhibición específica de secuencia de la expresión del gen y/o la reducción del ARNm objetivo y los niveles de proteína mediados por un ARN al menos parcialmente de doble hebra, el cual también comprende una porción que es sustancialmente complementaria al ARN objetivo.
Agente de AR i: Como se utiliza en la presente, el término "agente de ARNi" se refiere a un oligonucleótido que puede mediar la inhibición de la expresión del gen a través de un mecanismo de ARNi e incluye, pero no está limitado al ARNsi, ARNmicro (ARNmi) , ARN de horquilla corto (ARNsh) , ARN de interferencia asimétrico (ARNai) , sustrato cortador y los precursores de los mismos.
ARN de interferencia corto (ARNsi) : Como se utiliza en la presente, el término "ARN de interferencia corto" o "ARNsi" se refiere a un agente de ARNi que comprende un dúplex nucleotídico que es de aproximadamente 15-50 pares de bases de longitud y comprende además opcionalmente cero a dos proyecciones de una sola hebra. Una hebra del ARNsi incluye una porción que se híbrida con un ARN objetivo de una manera complementaria. En algunas modalidades, uno o más malos acoplamientos entre el ARNsi y la porción objetivo del ARN objetivo puede existir. En algunas modalidades, los ARNsi son mediadores de la inhibición de la expresión del gen, al provocar degradación de los transcriptos objetivo.
ARN de horquilla corto (ARNsh) : El ARN de horquilla corto (ARNsh) se refiere a un oligonucleótido que tiene al menos dos porciones complementarias hibridadas o capaces de hibridarse una con la otra para formar una estructura de doble hebra (dúplex) y al menos una porción de una sola hebra. .
Sustrato cortador: un "sustrato cortador" es un ARN dúplex mayor de aproximadamente 25 pares de bases que es un sustrato para el miembro Cortador de la familia de ARNasa III en células. Los sustratos cortadores son escindidos para producir ARNs de interferencia pequeños, dúplex de aproximadamente 21 pares de bases (ARNsi) que evocan un efecto de interferencia de ARN que da como resultado el silenciamiento del gen mediante knockdown del ARNm.
Inhibir la expresión del gen: Como se utiliza en la presente, la frase "inhibir la expresión del gen" significa provocar cualquier reducción mensurable en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un AR transcrito a partir del gen (por ejemplo, un ARNm) y/o un polipéptido traducido a partir del ARNm transcrito a partir del gen. El nivel de expresión puede ser determinado utilizando técnicas estándares para medir el ARNm o la proteína.
Como se utiliza en la presente, "sustancialmente no cargado" incluye un potencial Zeta que está entre +10 a ±30 mV, y/o la presencia de un primer número (z) de la especie cargable que son cargables a una carga negativa (por ejemplo, especies acidas que se vuelven aniónicas después de la desprotonación) y un segundo número (0.5-z) de la especie cargable que son cargables a una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas después de la protonación) .
Agente terapéutico: Como se utiliza en la presente, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando es administrado a un sujeto, órgano, tejido o célula tiene un efecto terapéutico y/o promueve un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que sufre de o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retardar el inicio del o de los síntomas de la enfermedad, el trastorno y/o la condición.
Estructura de Montaje micelar En algunas modalidades de la presente se proporciona un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana. En ciertas modalidades, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura. ( En algunas modalidades, los bloques de núcleos de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son desestabilizadores de la membrana. En modalidades específicas, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana descritos en la presente es un hidrófobo desestabilizador de la membrana, dependiente del pH. En ciertas modalidades, el bloque de envoltura es hidrofílico. En modalidades específicas, el bloque de envoltura es hidrofílico a un pH aproximadamente neutro.
Como se utiliza en la presente, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana incluyen copolímeros en bloque disruptivos de la membrana (por ejemplo, polímeros que lisan una membrana endosomal) y copolímeros en bloque que desestabilizan localmente una membrana (por ejemplo, vía una hendidura temporal en una membrana endosomal) . En algunas modalidades, un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende (i) una pluralidad de residuos monoméricos hidrofóbicos , (ii) una pluralidad de residuos monoméricos aniónicos que tiienen especies cargables, las especies cargables son aniónicas a pH fisiológico en suero, y son sustancialmente neutros o no cargados a un pH endosomal, y (iii) opcionalmente una pluralidad de residuos monoméricos catiónicos. En algunas modalidades, la modificación de la proporción de las I especies aniónicas a catiónicas en un copolímero en bloque permite la modificación de la actividad desestabilizadora de la membrana de un montaje micelar descrito en la presente. En algunas de tales modalidades, la proporción de las especies aniónicas : catiónicas en un copolímero en bloque está en el intervalo de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:4 a pH fisiológico en suero. En algunas de tales modalidades, la modificación de la proporción de las especies aniónicas a catiónicas en un bloque hidrofóbico a un copolímero en bloque permite la modificación de la actividad desestabilizadora de la membrana de un montaje micelar descrito en la presente. En algunas de tales modalidades, la proporción de las especies aniónicas : catiónicas en un bloque hidrofóbico de un copolímero en bloque descrito en la presente, está en el intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 3:1, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 a pH fisiológico en suero.
En ciertas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana presentes en un montaje micelar proporcionado en la presente, comprenden una sección de núcleo (por ejemplo, un bloque de núcleo) que comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos . En modalidades más específicas, la sección de núcleo (por i ejemplo, el bloque de núcleo) comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos y una pluralidad de primeras especies o grupos cargables. En modalidades aún más específicas, tales primeras especies o grupos cargables son negativamente cargados y/o son cargables a una especie o grupo negativamente cargado (por ejemplo, aproximadamente a un pH, o un pH de aproximadamente 7.4) . En algunas modalidades específicas, la sección de núcleo (por ejemplo, el bloque de núcleo) comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos, una pluralidad de primeras especies o grupos cargables, y una pluralidad de segundas especies o grupos cargables. En modalidades más específicas, las primeras especies o grupos cargables son negativamente cargados y/o son cargables a una especie o grupo negativamente cargado, y las segundas especies o grupos cargables ¡ son positivamente cargados y/o son cargables a una especie o grupo positivamente cargado (por ejemplo, aproximadamente a un pH neutro, o un pH de aproximadamente 7.4) .
En ciertas modalidades, la envoltura del montaje micelar y/o los bloques de envoltura de los copolimeros en bloque desestabilizadores de la membrana descritos en la presente también comprenden una especie o grupo cargable. En algunas modalidades, uno o más de los copolimeros en bloque desestabilizadores de la membrana presentes en un montaje micelar proporcionado en la presente, tienen una sección de envoltura que comprende una pluralidad de especies de grupos catiónicamente cargables. Dependiendo de la concentración de los electrolitos en un medio que rodea el montaje micelar (por ejemplo, sobre el pH) , estas especies catiónicamente cargables están ya sea en un estado catiónicamente cargado o en un estado no cargado.
En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente tiene una carga catiónica neta a un pH de aproximadamente 5. En algunas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente tiene una carga neutra neta aproximadamente a un pH neutro. En ciertas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente tiene una carga catiónica neta aproximadamente a pH neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En algunas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente tiene una carga catiónica neta más grande, a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7. En modalidades adicionales o alternativas, un montaje micelar proporcionado en la presente tiene una carga nominal (o un valor absoluto de) que es mayor a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar en donde la forma del montaje micelar es una micela, una pseudo-micela, o una estructura similar a micela en un intervalo de pH de aproximadamente 6 y superior, aproximadamente 6.5 y superior, aproximadamente 7 y superior, aproximadamente 6 a aproximadamente 14, o más ; aproximadamente 6 a aproximadamente 10, o más ; aproximadamente 6 a aproximadamente 9.5, o ! más ; aproximadamente 6 a aproximadamente 9, o más ; aproximadamente 6 a aproximadamente 8.5, o más ; aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o más; aproximadamente 6. 5 a aproximadamente 14, o más ; aproximadamente 6. 5 a aproximadamente 10, o 1 más; aproximadamente 6. 5 a aproximadamente 9.5, o más ; aproximadamente 6. .5 a aproximadamente 9, o más ; aproximadamente 6. 5 a aproximadamente 8.5, o más ,· aproximadamente 7 a aproximadamente 14, o más ,· aproximadamente 7 a aproximadamente 10, o más; aproximadamente 7 a aproximadamente 9.5, o más ; aproximadamente 7 a aproximadamente 9, o más; aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5, o más ; aproximadamente 6.2 hasta aproximadamente 7.5, o más; 6.2 a 7.5; ó aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.4. En ciertas modalidades, a un pH de aproximadamente 7, o menor; aproximadamente 6.8, o menor; aproximadamente 6.5, o menor; aproximadamente 6.2, o menor; aproximadamente 6, o menor; aproximadamente 5.8, o menor; o aproximadamente 5.7, o menor, el montaje micelar, la micela, la pseudo-micela, o la estructura en forma de micela proporcionadas en la presente, se vuelven sustancialmente, o al menos parcialmente perturbadas o desasociadas. En modalidades específicas, la forma del montaje micelar en el intervalo de pH de aproximadamente 6.2 a 7.5 es una micela. Se debe entender que como se utiliza en la presente, los montajes micelares tienen una forma sobre al menos el pH descrito, y puede también tener la forma descrita a un pH fuera del intervalo de pH descrito.
En ciertas modalidades, los "copolímeros en bloque" descritos en la presente comprenden una sección de núcleo y una sección de envoltura. Como se discute en la presente, la sección de núcleo opcionalmente es o comprende un bloque de núcleo y la sección de envoltura opcionalmente comprende o es un bloque de envoltura. En algunas modalidades, al menos uno de tales bloques es un bloque polimérico en gradiente. En modalidades adicionales, el copolímero en bloque utilizado en la presente está opcionalmente sustituido con un polímero en gradiente (por ejemplo, el polímero utilizado en el montaje micelar es un polímero en gradiente que tiene una sección de núcleo y una sección de envoltura) . 1 En ciertas modalidades, el montaje micelar es una nanopartícula . En modalidades específicas, el montaje micelar es una micela. En otras modalidades más, el montaje micelar es una nanopartícula o micela con el tamaño de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 ! nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, o aproximadamente 30-80 nm. El tamaño en particular puede ser determinado de cualquier manera, incluyendo, pero no limitado a, mediante cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés) , dispersión dinámica de luz (DLS) , técnicas de microscopía electrónica (por ejemplo, TEM, por sus siglas en inglés), y otros métodos.
En ciertas modalidades, la envoltura y/ó el bloque de envoltura es hidrofílico y/o cargado (por ejemplo, no cargado, catiónico, policatiónico, anióñico o polianiónico, o zwiteriónico) . En ciertas modalidades, la envoltura y/o el bloque de envoltura es hidrofílico y neutro (no cargado) . En modalidades específicas, la envoltura y/o el bloque de envoltura comprende una carga positiva neta. En modalidades específicas, la envoltura y/o el bloque de envoltura comprende una carga negativa neta. En modalidades específicas, la envoltura y/p el bloque de envoltura comprende una carga neutra neta. En algunas modalidades, el núcleo y/o el bloque de núcleo es hidrofóbico y/o comprende grupos hidrofóbicos , porciones, unidades monoméricas, especies, o similares. En modalidades específicas, el núcleo hidrofóbico y/o el bloque de núcleo comprenden una pluralidad de grupos, porciones, unidades monoméricas, especies hidrofóbicas , o similares, y una pluralidad de especies cargables o unidades monoméricas. En modalidades más específicas, la pluralidad de unidades o especies monoméricas cargables comprende una pluralidad de unidades o especies monoméricas cargables, aniónicas. En modalidades más específicas, la pluralidad de las unidades o especies monoméricas cargables comprende una pluralidad de unidades o especies monoméricas cargables catiónicas. En modalidades aún más específicas, la pluralidad de unidades o especies monoméricas cargables comprende una pluralidad de unidades o especies monoméricas cargables catiónicas y aniónicas. En algunas modalidades, los copolímeros en bloque cada uno tienen (1) un bloque cargado hidrofílico (por ejemplo, aniónico o polianiónico; o catiónico o policatiónico; o zwiteriónico ; o no cargado) que forma la envoltura de los montajes micelares (por ejemplo, micela) , (2) un bloque hidrofóbico, y (3) una pluralidad de especies cargables aniónicas, y son desestabilizadores de la membrana (por ejemplo, se vuelven desestabilizadores de la membrana de una manera dependiente del pH) . En algunas modalidades, la pluralidad de especies cargables aniónicas está presente en el bloque hidrofóbico. En ciertas modalidades, el núcleo hidrofóbico y/o el bloque de núcleo comprenden opcionalmente unidades monoméricas espadadoras que pueden o no comprender grupos hidrofóbicos, grupos cargables, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, un bloque polimérico que forma o está presente en el núcleo de los montajes micelares (por ejemplo, micela) (por ejemplo, uno o más bloques de núcleo del copolímero) es cargable (por ejemplo, contiene especies catiónicas y/o aniónica un pH fisiológico) . En algunos casos, los montajes micélares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presenté son formados a partir de una pluralidad de copolímeros en bloque los cuales se autoasocian. En ciertos casos, la autoasociación ocurre a través de las interacciones de los bloques hidrofóbicos de los copolímeros en bloque y los montajes micelares resultantes (por ejemplo, micelas) son estabilizados a través de interacciones hidrofóbicas de los bloques hidrofóbicos presentes en el núcleo de los montajes micelares.
En algunas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente conservan la actividad (por ejemplo, la actividad del montaje micelar para distribuir un agente terapéutico, por ejemplo, un polinucleótido) en suero humano al 50% por al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas. En modalidades adicionales o alternativas, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente conservan la actividad (por ejemplo, la actividad del montaje micelar para distribuir un polinucleótido) en plasma humano en al menos 50% por al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas. En modalidades adicionales o alternativas, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente conservan la actividad (por ejemplo, la actividad del montaje micelar para distribuir un polinucleótido) en suero de ratón al 50% por al menos 2 horas , al menos 4 horas , al menos 6 horas , al menos 8 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas. En modalidades adicionales o alternativas, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente conservan la actividad (por ejemplo, la actividad del montaje micelar para distribuir un agente terapéutico, por ejemplo, un polinucleótido) en plasma de ratón, en al menos 50% por al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas. En modalidades específicas, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente conservan la actividad (por ejemplo, la actividad del montaje micelar para distribuir un agente terapéutico,, por ejemplo, un polinucleótido) en suero humano al 50% por al menos 2 horas, en plasma humano al menos al 50% por al menos 2 horas, en suero de ratón al 50% por al menos 2 horas, en plasma de ratón al menos al 50% por al menos 2 horas, o una combinación de los mismos.
En diversas modalidades, los copolímeros en bloque utilizados en los montajes micelares (por ejemplo, micelas) descritos en la presente tienen o son seleccionados para tener una influencia sobre un cierto aspecto o funcionalidad de los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, incluyendo pero no limitados a: (1) las propiedades biofísicas del montaje micelar (por ejemplo, micela) tal como, a manera de ejemplo no limitante, la solubilidad, solubilidad acuosa, estabilidad, estabilidad en un medio acuoso, hidrofilicidad, lipofilicidad, hidrofobicidad, o similares; (2) la facilitación de la formulación del montaje micelar en una forma administrable , u otros propósitos; (3) la habilidad del montaje micelar para dirigirse a un tipo específico o seleccionado de célula (por ejemplo, al llevar una porción de dirección al objetivo) ; y/o (4) la habilidad para incrementar la biocompatibilidad de los montajes micelares (por ejemplo, micelas) . En algunas modalidades, un montaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente está caracterizado por uno o más dé los siguientes: (1) el montaje micelar (por ejemplo, micela) es formado mediante la autoasociación espontánea de los copolímeros en bloque para formar montajes organizados (por ejemplo, micelas) después de la dilución a partir de un solvente miscible en agua (tal como, pero no limitado a etanol) a solventes acuosos (por ejemplo solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4); (2) el montaje micelar (por ejemplo, micela) es estable a la dilución i (por ejemplo, hasta una concentración del polímero de 100 g/ml, 50 µ?/???, 10 µq/mlt 5 g/ml o 1 µ?/ml, que constituye la concentración de estabilidad crítica o la concentración micelar crítica (CMC)); (3) el montaje micelar (por ejemplo, micela) es estable a una alta fuerza iónica del medio circundante (por ejemplo, NaCl 0.5M); y/o (4) el i montaje micelar (por ejemplo, micela) tiene una inestabilidad cada vez mayor conforme se incrementa la concentración del solvente orgánico, tales solventes orgánicos incluyen, pero no están limitados a dimetilformamida (DMF) , sulfóxido de dimetilo (DMS) , y dioxano. En algunas modalidades, un montaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente está caracterizado por tener al menos dos de las propiedades anteriormente mencionadas. En algunas modalidades, un montaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente está caracterizado por tener al menos tres de las propiedades anteriormente mencionadas . En algunas modalidades, un montaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente está caracterizado por tener i todas las propiedades anteriormente mencionadas.
En ciertas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presenté son además o alternativamente caracterizado por otros criterios: (1) el peso molecular de los bloques individuales y sus porciones de longitud relativas es disminuida o incrementada con el fin de gobernar el tamaño del montaje micelar formado y su estabilidad relativa y (2) el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la envoltura es variado con el fin de proporcionar formación efectiva del complejo con y/o neutralización de carga de un agente terapéutico aniónico (por ejemplo, un fármaco oligonucleotídico) .
Además, en ciertas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente captan selectivamente moléculas hidrofóbicas pequeñas, tales como compuestos de molécula pequeña hidrofóbicos (por ejemplo, fármacos de molécula pequeño hidrofóbico) dentro del núcleo hidrofóbico de los montajes micelares . En modalidades específicas, los montajes micelares proporcionados én la presente captan selectivamente moléculas hidrofóbicas pequeñas, tales como el compuesto de molécula pequeño hidrofóbico pireno dentro del núcleo hidrofóbico de un montaje micelar. 1 I Núcleo En ciertas modalidades de la presente, se proporciona el núcleo de un montaje micelar descrito én la presente que comprende una pluralidad de hidrófobos desestabilizadores de la membrana, dependientes del pH. En ciertas modalidades, el núcleo de un montaje micelar descrito en la presente es mantenido junto al menos parcialmente, sustancialmente, o predominantemente, por interacciones hidrofóbicas.
En algunas modalidades, el núcleo de un montaje micelar descrito en la presente comprende una pluralidad de primeras especies cargables . En modalidades específicas, la primeras especies cargables son cargadas o cargables a una especie aniónica. Se debe entender que ninguna, algunas o todas las primeras especies cargables dentro del núcleo están cargadas.
En ciertas modalidades, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende una pluralidad de primeras especies cargables, y una pluralidad de segundas especies cargables. En algunos casos, la primera especie cargable es cargada o cargable a una especie aniónica; y la segunda especie cargable está cargada o cargable a una especie catiónica. En algunas modalidades, el núcleo de un montaje micelar descrito en la presente comprende una pluralidad de primeras especies cargables; una pluralidad de segundas especies cargables; y una pluralidad de especies hidrofóbicas . 1 En ciertas modalidades, donde el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas y una pluralidad de especies cargables catiónicas, la proporción del número de la pluralidad de especies cargables aniónicas al número de la pluralidad de especies cargables catiónicas es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas que son aniónicamente cargadas, y una pluralidad de especies catiónicamente cargables que son catiónicamente cargadas, en donde la proporción del número de especies aniónicamente cargadas al número de especies catiónicamente cargadas presentes en el núcleo es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1.
En algunas modalidades, la proporción, aproximadamente a un pH neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4), del número de la pluralidad de especies cargables aniónicas al número de la pluralidad de especies cargables catiónicas es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1, o es de aproximadamente 1:1.! En algunas modalidades, el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas que son aniónicamente cargadas, y una pluralidad de especies catiónicamente cargables que son catiónicamente cargadas, en donde la proporción, a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un H de aproximadamente 7.4), del número de especies aniónicamente cargadas al número de especies catiónicamente cargadas presentes en el núcleo, es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente í 2:3 a aproximadamente 3:2, aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1, o es de aproximadamente 1:1. En modalidades específicas, la proporción de las especies positivamente cargadas presentes en el núcleo a las especies negativamente cargadas en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, a un pH aproximadamente neutro. En modalidades más específicas, la proporción de las especies positivamente cargadas presentes en el núcleo a las especies negativamente cargadas en el i núcleo es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a un pH aproximadamente neutro. En modalidades específicas, la proporción de las especies positivamente cargadas presentes en el núcleo a las especies negativamente cargadas en el núcleo es de aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1 a un pH aproximadamente neutro .
En modalidades específicas, la primera especie cargable es ácido de Bronsted. En ciertos casos, como se utiliza en la presente, una especie cargable incluye una especie en donde la adición o la eliminación de un protón (por ejemplo, de una manera dependiente del pH) , proporciona una especie, grupo o unidad monomérica catiónica o aniónica, respectivamente.
En algunas modalidades, la primera especie cargable presente en el núcleo son especies que s n al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% negativamente cargadas a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades especificas, estas primeras especies cargables son cargadas por pérdidas de un H+, a una especie aniónica a un pH aproximadamente neutro. i En modalidades adicionales o alternativas, las primeras especies cargables presentes en el núcleo son especies que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% neutras o no cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menor; aproximadamente 6.2, o menor; aproximadamente 6, o menor; aproximadamente 5.9, o menor; aproximadamente 5.8, o menor; o aproximadamente pH endosomal .
En algunas modalidades, la primera especie cargable es, a manera de ejemplo no limitante, un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso, o similares.
En algunas modalidades, las segundas especies cargables presenten en el núcleo son especies que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4) i. En modalidades específicas, estas segundas especies cargables son cargadas por la adición de un H+, a una especie catiónica. En modalidades adicionales o alternativas, las segundas especies cargables presentes en el núcleo son especies que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menor; aproximadamente 6.2, o menor; aproximadamente 6, o menor; aproximadamente 5.9, o menor; aproximadamente 5.8, o menor; o aproximadamente pH endosomal) . 1 En algunas modalidades proporcionadas en la presente está un montaje micelar que comprende una pluralidad de porciones desestabilizadoras de la membrana en el núcleo del montaje micelar.
I Envoltura En algunas modalidades, la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente es hidrofílica. En modalidades específicas, la envoltura de un montaje micelar descrita en la presente, comprende una pluralidad de especies cargables. En modalidades específicas, la especie cargable está cargada o cargable a una especie catiónica. En otras modalidades específicas, la especie cargable es cargada o cargable a una especie aniónica. En otras modalidades, la envoltura del montaje micelar es hidrofílica y no cargada (por ejemplo, sustancialmente no cargada) . Se debe entender que tales bloques de envoltura incluyen especies en donde ninguna, algunas o todas las especies cargables son cargadas.
En modalidades específicas, la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente es policatiónica a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4) . En algunas modalidades, la especie cargable en la envoltura de un montaje micelar son especies, grupos o unidades monoméricas que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, estas especies cargables en la envoltura de un montaje micelar son cargadas por la adición de un H+, a una especie catiónica (por ejemplo, una base de Bronsted) . En modalidades adicionales o alternativas, la especie cargable en la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente son especies que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menor; aproximadamente 6.2, o menor; i aproximadamente 6, o menor; aproximadamente 5.9, o menor; aproximadamente 5.8, o menor; o aproximadamente, ¡a pH endosomal) .
En algunas modalidades, la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente es catiónica en o cerca del pH fisiológico (por ejemplo, el pH del plasma humano en circulación). En algunas modalidades, el bloque de envoltura es policatiónico . En algunas modalidades, la envoltura comprende uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, un polinucleótido, tal como el ARNsi) , en donde los agentes terapéuticos son polianiónicos . En algunas modalidades, la pluralidad de agentes terapéuticos comprende un total de x aniones, y la envoltura policatiónica de un montaje micelar descrito en la presente comprende aproximadamente 0.6 x, aproximadamente 0.7 x, aproximadamente 0.8 x, aproximadamente 0.9 x, aproximadamente 1.0 x, aproximadamente 1.1 x cationes, o más.
En algunas modalidades, la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente es hidrofílica y no cargada. Las especies no cargadas, hidrofílicas , útiles en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, polietilenglicol (PEG) , óxido de polietileno (PEO) , o similares .
En ciertas modalidades, la envoltura de un montaje micelar descrito en la presente comprende una pluralidad de especies hidrofílicas diferentes (por ejemplo, al menos una especie hidrofílica no cargada y al menos una especie hidrofílica cargada) .
Tamaño de Partícula En ciertas modalidades, el montaje micelar proporcionado en la presente es una nanopartícula que tiene cualquier tamaño adecuado. El tamaño de las nanopartículas es ajustado para cumplir las necesidades específicas mediante el ajuste del grado de polimerización de las secciones de núcleo, las secciones de envoltura, las secciones adicionales, o una combinación de las mismas. En modalidades específicas, un montaje micelar proporcionado en la presente tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm. En modalidades más específicas, el montaje micelar proporcionado en la presente tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm, o similares en un medio acuoso. En modalidades aún más específicas, un montaje micelar proporcionado en la presente tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm, o similar en un medio acuoso con un 1 pH aproximadamente neutro (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7.4) . En algunas modalidades, un montaj e micelar proporcionado en la presente tiene un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 10 ntn a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm, o similar, en suero humano. En modalidades específicas, se proporciona en la presente un montaje micelar que tiene un tamaño de partícul de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm en un medio i acuoso que tiene un pH de aproximadamente 7.4 y en suero i humano . ! I i Ensamble j En algunas modalidades, un montaje micelar i proporcionado en la presente es autoensamblado. En cifertas modalidades, el montaje micelar es autoensamblado jo es capaz de ser autoensamblado en un medio acuoso. En algunas modalidades, el montaje micelar es autoensamblado o es capaz de ser autoensamblado en un medio acuoso que tie: e un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, que tiene un pH de aproximadamente 7.4). En algunas modalidades, el montaje I micelar es autoensamblado o es capaz de ser autoensamblado i después de la dilución de una solución orgánica de1 los copolímeros en bloque con un medio acuoso que tiene un pH neutro (por ejemplo, que tiene un pH de aproximadamente i 7.4). En algunas modalidades, el montaje micelar es I autoensamblado o es capaz de ser autoensamblado en suero humano. En algunas modalidades, un montaje micelar i proporcionado en la presente es autoensamblado. j En modalidades específicas, un montaje micelar proporcionado en la presente se autoensambla en un medio acuoso al menos a un valor de pH dentro de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, aproximadamente 6 a aproximadamente 8 , aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9 , aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 7 a aproximadamente 9, o aproximadamente 7 a aproximadamente 8. En algunas modalidades, un montaje micelar es desestabilizador de la membrana en un medio acuoso a un valor de pH dentro de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.4. Se debe entender que como se utiliza en la presente, los montajes micelares se autoensamblan al menos a un pH descrito en la presente, pero pueden también autoensamblarse a uno o más valores de pH fuera del intervalo de pH descrito.
En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente se autoensambla a cualquier concentración adecuada. En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente se autoensambla (por ejemplo, tiene una concentración de ensamblaje crítica (CAC) , o la concentración mínima a la cual se forma un montaje micelar) de aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 5 µ?/p??, aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 10 yg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 25 µg/ml, aproximadamente 30 g/ml, aproximadamente 40 g/ml, aproximadamente 50 g/ml, aproximadamente 60 pg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 80 pg/ml, aproximadamente 90 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, o mayor. En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente se autoensambla al menos a una concentración entre aproximadamente 1 pg/ml y aproximadamente 100 pg/ml.
En algunas modalidades, el montaje micelar (por ejemplo, micelas) proporcionado en la presente es preparado mediante el autoensamblaje espontáneo de los polímeros descritos en la presente. En ciertas modalidades, los polímeros descritos en la presente se ensamblan en los montajes micelares proporcionados en la presente después de (a) la dilución de una solución del polímero en solvente orgánico miscible en agua dentro del medio acuoso; o (b) es disuelto directamente en una solución acuosa. En algunas modalidades, los polímeros descritos en la presente se ensamblan en los montajes micelares proporcionados en la presente en ausencia de polinucleótidos .
En algunas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) son estables a la dilución en una solución acuosa. En modalidades específicas, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) son estables a la dilución a pH fisiológico (incluyendo el pH de la sangre en circulación de un ser humano) con una concentración de estabilidad crítica (por ejemplo, una concentración micelar crítica (CMC) ) de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 pg/ml, o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 yg/ml, menos de 10 g/ml, menos de 5 pg/ml, o menos de 2 .p!g/ml. Como se utiliza en la presente, "desestabilización de un montaje micelar" significa que las cadenas poliméricas que forman un montaje micelar al menos se degradan parcialmente, se alteran estructuralmente (por ejemplo, se expanden en tamaño y/o cambian de forma) , y/o pueden formar estructuras supramoleculares amorfas (por ejemplo, estructuras supramoleculares no micelares) . Los términos concentración de estabilidad crítica (CSC) , concentración micelar crítica (CMC) , y concentración de montaje crítica (CAC) son utilizados aquí intercambiablemente.
Estabilidad En algunas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente es estable en un medio acuoso. En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente es estable en un medio acuoso a un pH seleccionado, por ejemplo, un pH fisiológico, (por ejemplo, el pH del plasma humano en circulación) . En modalidades específicas, un montaje micelar proporcionado en la presente es estable a un pH aproximadamente neutro , (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4) en un medio acuoso. En modalidades específicas, el medio acuoso es suero animal (por ejemplo, humano) o plasma animal (por ejemplo, humano) . En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente es estable en suero humano y/o en plasma humano. En modalidades específicas, el montaje micelar es estable en el plasma humano en circulación. Se debe entender que la estabilidad del montaje micelar no está limitada al pH designado, pero que es estable a valores de pH que incluyen, a un mínimo, el pH designado. En modalidades específicas, un montaje micelar I descrito en la presente es sustancialmente menos estable a un pH ácido que a un pH que es aproximadamente neutro. En modalidades más específicas, un montaje micelar descrito en la presente es sustancialmente menos estable a un pH de aproximadamente 5.8 que a un pH de aproximadamente 7.4.
En modalidades específicas, el montaje micelar es estable a una concentración de aproximadamente 10 µ?/???, o mayor (por ejemplo, aproximadamente a un pH neutro) . En algunas modalidades, el montaje micelar es estable a una concentración de aproximadamente 100 o mayor (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro) .
Copolímeros en bloque En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, proporcionados en la presente son desestabilizadores de la membrana a cualquier pH adecuado. En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son desestabilizadores de la membrana (por ejemplo, en un medio acuoso) a un pH endosomal, un pH de aproximadamente 6.5, o menor, aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5, o aproximadamente 6.2, o menor .
En modalidades específicas, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, proporcionados en la presente comprenden una pluralidad de primeros grupos, especies o unidades monoméricas cargables, y una pluralidad de segundas especies, grupos o unidades monoméricas cargables. En ciertos casos, los primeros grupos, especies o unidades monoméricas cargables son negativamente cargados o cargables a una especie, grupo o unidad monomérica negativa. En algunos casos, los segundos grupos, especies o unidades monoméricas cargables son positivamente cargados o cargables a especies, grupos o unidades monoméricas catiónicas. En ciertas modalidades, conforme se incrementa el pH de un medio acuoso que comprende un montaje micelar descrito en la presente, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana y el núcleo del montaje micelar se llegan a cargar; más positivamente, dando como resultado una ruptura de la forma y/o el tamaño del montaje micelar, y provocando una ruptura parcial o sustancial de una membrana (por ejemplo, una membrana endosomal que rodea un montaje micelar) .
En ciertas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente comprenden una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana que desestabilizan una membrana endosomal de una manera dependiente del pH. En diversas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana desestabilizan una membrana cuando son ensamblados en los montajes micelares y/o cuando están presentes independientes de la forma de los montajes micelares (por i ejemplo, cuando los montajes micelares son desasociados y/o desestabilizados) . En algunas modalidades, en o cerca del pH fisiológico (por ejemplo, pH de la sangré en circulación) , los polímeros que constituyen los montajes micelares son mínimamente desestabilizadores de la membrana, pero después de la exposición a pH disminuido (por ejemplo, el pH endosomal) , el polímero es desestabilizador de la membrana. En ciertos casos, esta transición a un estado de desestabilización de la membrana ocurre vía la protonación de residuos débilmente ácidos que son incorporados dentro de los polímeros, tal protonación conduce a un incremento en la hidrofobicidad de los polímeros. En ciertos casos, la hidrofobicidad incrementada del polímero da como resultado un cambio conformacional de los montajes micelares, realizando la desestabilización membranal de los montajes micelares (por ejemplo, provocando una desestabilización de la membrana) . En algunas modalidades, el mecanismo de desestabilización de la membrana de los montajes micelares proporcionados en i la presente, no confía en un mecanismo de desestabilización de la membrana puramente de esponja de protones, de los policationes tales como PEI u otros policationes . En algunas modalidades, la combinación de dos mecanismos de ruptura membranal, (a) un policatión (tal como DMAEMA) y (b) un polianión hidrofobizado (tal como el ácido propilacrílico) , que actúan conjuntamente, tienen un efecto aditivo sinérgico sobre la potencia de la desestabilización de la membrana conferida por el polímero.
En algunas modalidades, los bloques poliméricos son opcionalmente seleccionados de, a manera de ejemplos no limitantes, polinucleótidos , oligonucleótidos , polietilenglicoles , bloques hidrofílieos, bloques hidrofóbicos , bloques cargados, o similares.
En ciertas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente comprenden copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde los copolímeros en bloque son no peptídicos y/o no lipidíeos. Se proporcionan en la presente, montajes micelares que comprenden copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en donde el bloque de núcleo es no peptídico y/o no lipídico. En ciertas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente comprenden copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en donde el bloque de envoltura es no peptídico y/o no lipídico i En algunas modalidades, la columna vertebral de los copolímeros en bloque que forman el montaje micelar es no i peptídica y/o no lipídica. En ciertas modalidades, la columna vertebral del bloque de núcleo es no peptídica y/o no lipídica. En algunas modalidades, el bloque de envoltura es no peptídico y/o no lipídico. Como se utiliza en la presente, los lípidos son un grupo diverslo de compuestos ampliamente definidos como moléculas hidrofóbicas o anfifílicas que se originan completamente o en parte de dos tipos distintos de subunidades bioquímicas : grupos cetoacilo e isopreno, por ejemplo, ácidos grasos, i glicerolípidos, glicerofosfolípidos , esfingolípidos , sacarolípidos, policétidos, lípidos de esterol, y lípidos i de prenol .
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana que comprenden una sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) y una sección de envoltura (por ejemplo, bloque de envoltura) en donde la proporción del peso molecular promedio en número de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular promedio en número de la sección de envoltura (por ejemplo, bloque de envoltura) está presente en cualquier proporción adecuada. En modalidades específicas, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en donde la proporción del peso molecular promedio en número de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular promedio en número de la sección de envoltura (por ejemplo, bloque de envoltura) está presente en una proporción de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 5:4 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1¡.5 : 1 , aproximadamente 1.1:1, aproximadamente 1.2:1, aproximadamente 1.3:1, aproximadamente 1.4:1, aproximadamente 1.6:1, aproximadamente 1.7:1, aproximadamente 1.8:1, aproximadamente 1.9:1, o aproximadamente 2.1:1. En algunas modalidades, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en donde la proporción del peso molecular promedio en número de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular promedio en número de la sección de envoltura (por ejemplo, bloque de envoltura) está presente en una proporción de aproximadamente 2 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.5 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.1 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.2 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.3 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.4 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.6 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.7 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.8 (o más) hasta 1; aproximadamente 1.9 (o más) hasta 1; o aproximadamente 2.1 (o más) hasta 1. En modalidades específicas, la proporción del peso molecular promedio en número del bloque de núcleo al peso molecular promedio en número del bloque de envoltura es de aproximadamente 2:1.
En modalidades específicas, el montaje micelar proporcionado en la presente comprende al menos un tipo de polímero (por ejemplo, copolímeros en bloque y/o polímeros i monobloque, que incluyen copolímeros monobloque) que tienen un segmento hidrofílico y un segmento hidrofóbico. j En ciertas modalidades, el segmento hidrofílico es un bloque hidrofílico y el segmento hidrofóbico es un bloque hidrofóbico. En algunas modalidades, estos polímeros son no peptídicos . En otras modalidades, el segmento hidrofílico y el segmento hidrofóbico son regiones diferentes de un copolímero en gradiente monobloque. En varios casos, un "segmento polimérico" es una sección polimérica con una propiedad física dada (por ejemplo, una propiedad física de un bloque descrito en la presente, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, capacidad de carga, etc.) o que comprende uno o más bloques con propiedades físicas similares (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, capacidad de carga, etc.).
En ciertas modalidades, uno o más o todos los polímeros (que incluyen al menos una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, y, opcionalmente , los copolímeros en bloque no desestabilizadores de la membrana) de un montaje micelar descrito en la presente cada uno tiene (1) un segmento hidrofílico opcionalmente cargado (por ejemplo, un bloque de envoltura) que forma al menos una porción de la envoltura del montaje micelar (por ejemplo, micela) ; y (2) un segmento sustancialmente hidrofóbico (por ejemplo, un bloque de núcleo) que forma al menos una porción del núcleo hidrofóbico del montaje micelar (por ejemplo, micela) que es estabilizada a través de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos formados del núcleo. En algunas modalidades, el segmento hidrofílico es neutro o no cargado. En algunas modalidades, el segmento hidrof'ílico es cargado y catiónico, o policatiónico . En algunas modalidades el segmento hidrofílico es cargado y aniónico, o polianiónico . En algunas modalidades, el segmento hidrofílico es cargado y zwiteriónico . En algunos casos, el segmento hidrofílico puede servir al menos tres funciones: (1) formar la envoltura de la estructura micelar, (2) incrementar la dispersabilidad acuosa del montaje micelar, y (3) acoplarse a (por ejemplo, enlazarse) uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, las moléculas terapéuticas basadas en oligonucleótido tales como el AR si) . En algunas modalidades, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana y/o el núcleo del montaje micelar también comprenden especies cargables o cargadas (por ejemplo, especies/unidades monoméricas aniónicas y/o catiónicas a un pH fisiológico) y son desestabilizadoras de la membrana (por ejemplo, desestabilización de la membrana de una manera dependiente del pH) . En algunas modalidades, el bloque sustancialmente hidrofóbico (por ejemplo, bloque de núcleo) y/o el núcleo del montaje micelar comprende una o más especies cargables (por ejemplo, la unidad monomérica, porción, grupo o similar) . En modalidades más específicas, el bloque sustancialmente hidrofóbico y/o el núcleo del montaje micelar comprende una pluralidad de especies catiónicas y una pluralidad de especies aniónicas . En modalidades aún más específicas, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana y/o el núcleo del montaje micelar comprende un número sustancialmente similar de especies catiónica y aniónicas (por ejemplo, el bloque hidrofóbico y/o el núcleo son sustancialmente neutral netos) .
En ciertas modalidades, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende un bloque de núcleo hidrofóbico que incluye una primera y una segunda especies cargables. En algunas modalidades, la primera especie cargable es como se describe en la presente y la segunda especie cargable es cargable a una especie catíónica después de la protonación. En modalidades específicas, la i primera especie cargable es no cargada a un pH ácido (por ejemplo, un pH endosomal, un pH por debajp de aproximadamente 6.5, un pH por debajo de aproximadamente 6.0, un pH por debajo de aproximadamente 5.8, un pH por debajo de aproximadamente 5.7, o similares). En modalidades específicas, el pKa de la segunda especie cargable es aproximadamente 6 a aproximadamente! 10, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8 , aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, o cualquier otro pKa adecuado. En ciertas modalidades, al menos una de la primera especie cargable y al menos una de la segunda especie cargable están presentes sobre una unidad monomérica simple. En algunas modalidades, la primera especie cargable es encontrada sobre una primera unidad monomérica cargable, y la segunda especie cargable está sobre una segunda unidad monomérica cargable. En ciertas modalidades, la primera especie cargable es cargable a una especie aniónica después de la desprotonación, la segunda especie cargable es una especie catiónica después de la protonación, y la proporción de la especie aniónica a la especie catiónica está entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:2 y 3:2, o aproximadamente 1 : 1 aproximadamente a un pH neutro . En algunas modalidades, la proporción de la primera unidad monomérica cargable a la segunda unidad monomérica cargable es aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:2 y 3:2, o aproximadamente 1:1.
El término "copolímero" , como se utiliza n la presente, significa que el polímero es el resultado de la polimerización de dos o más monómeros diferentes. Un "polímero monobloque" o un "polímero subunitario" de un montaje micelar descrito en la presente es un producto sintético de un paso de polimerización simple. El término polímero monobloque incluye un copolímero (por ejemplo, un producto de polimerización de más de un tipo de monómeros) y un homopolímero (por ejemplo, un producto de polimerización de un tipo simple de monómeros) . Un copolímero en "bloque" se refiere a una estructura que comprende una o más subcombinaciones de unidades constitucionales o monoméricas, utilizadas aquí intercambiablemente. Tales unidades constitucionales o monoméricas comprenden residuos de monómeros polimerizados . En algunas modalidades, un copolímero en bloque descrito en la presente comprende unidades constitucionalés o monoméricas no lipídicas. En algunas modalidades, el copolímero en bloque es un copolímero dibloque. , Un copolímero dibloque comprende dos bloques; una generalización esquemática de tal polímero es representada por lo siguiente: [AaBbCc ...]m - [XxYyZz ...]n, en donde cada letra significa una unidad constitucional o monomérica, y en donde cada subíndice a una unidad constitucional, representa la fracción molar de esa unidad en el bloque particular, los tres puntos indican que puede existir más i (pueden existir también menos) unidades constitucionales en cada bloque, y m y n indican el peso molecular de cada bloque en el copolímero dibloque. Como es sugerido por el esquema, en algunos casos, el número y la naturaza de cada unidad constitucional es separadamente controlado para cada bloque. El esquema no se entiende y no debe ser considerado que infiera alguna relación entre el número de unidades constitucionales o el número de diferentes tipos de unidades constitucionales en cada uno de los bloques.
Tampoco se entiende que el esquema describa algún número particular o arreglo de unidades constitucionales dentro de un bloque particular. En cada bloque, las unidades constitucionales pueden estar colocadas en ¡ una configuración puramente aleatoria, una configuración aleatoria alternada, alternada regular, en bloque regular o en bloque aleatorio, a no ser que se establezca expresamente de otro modo. Una configuración puramente aleatoria, por ejemplo, puede tener la forma no limitante: x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z ... Una configuración aleatoria alternada, ejemplar, no limitante puede tener la forma no limitante: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z ... , y una configuración alternada regular, ejemplar puede tener la forma no limitante: x-y-z-x-y-z-x-y-z ... Una configuración en bloque regular, ejemplar puede tener la siguiente configuración no limitante: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x... , mientras una configuración en bloque aleatoria ejemplar puede tener la configuración no limitante: ...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z- ... En un polímero en gradiente, el contenido de una o más unidades monoméricas se incrementa o disminuye de una manera en gradiente desde el extremo a hasta el extremo ?. En ninguno de los ejemplos genéricos precedentes está la yuxtaposición particular de las unidades o bloques constitucionales individuales o el número de unidades constitucionales en un bloque, o el número de bloques debe ser considerado como construido de alguna manera llevando sobre o limitando la estructura efectiva de los copolimeros en bloque que forman el montaje micelar de esta invención. En ciertas modalidades, se proporciona en la presente algún polímero subunitario o composición de polímeros subunitarios descritos en la presente, no obstante de si los polímeros están o no ensamblados en un montaje micelar.
Como se utiliza en la presente, los corchetes que encierran las unidades constitucionales no se entiende y no deben ser considerados para dar a entender que las unidades constitucionales mismas forman bloques. Es decir, las unidades constitucionales dentro de los corchetes cuadrados pueden combinarse de alguna manera con las otras unidades constitucionales dentro del bloque, por ejemplo, configuraciones puramente aleatorias, aleatorias alternadas, alternadas regulares, en bloque regular, o en bloque aleatorio. Los copolimeros en bloque descritos en la presente son, opcionalmente, copolimeros en bloque alternados, en gradiente o aleatorios. En algunas modalidades, los copolimeros en bloque son copolimeros dendrímeros, en estrella o de injerto.
En ciertas modalidades, los copolimeros en bloque (por ejemplo, copolimeros en bloque desestabilizadores de la membrana) de los montajes micelares proporcionados en la presente, comprenden monómeros etilénicamente insaturádos .
El término "monómero etilénicamente insaturado" es definido en la presente como un compuesto que tiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos no limitantes de los monómeros etilénicamente insaturados son: un (alquil) acrilato de alquilo, un metacrilato; un acrilato, una alquilacrilamida, una metacrilamida, una acrilamida, un estireno, una alilamina, un alilamonio1, una dialilamina, un dialilamonio, una N-vinilformamida, un éter de vinilo, un sulfonato de vinilo, un ácido acrílico, una sulfobetaina, una carboxibetaina, una fosfobetaina, o anhídrido maleico.
En diversas modalidades, cualquier monómero adecuado para proporcionar los polímeros (incluyendo, por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) de los montajes micelares descritos en la presente es utilizado. En algunas modalidades, los monómeros adecuados para el uso en la preparación de los polímeros (incluyendo, por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) de los montajes micelares proporcionados en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, uno o más de los siguientes monómeros: metacrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros) , metacrilato de butilo (todos los isómeros) , metacrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de isobornilo, ácido metacrílico, metacrilato de bencilo, metacrilato de fenilo, metacrilonitrilo, alfa-metilestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo (todos los isómeros) , acrilato de butilo (todos los isómeros) , acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de isobornilo, ácido acrílico, acrilato de bencilo, acrilato de fenilo, acrilonitrilo, estiireno, acrilatos y estírenos seleccionados de metacrilato de glicidilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros) , metacrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros), metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo, metacrilato de N, N-dietilaminoetilo, metacrilato de trietilenglicol, metacrilato de oligoetilenglicol , anhídrido itacónico, ácido itacónico, acrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros) , acrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros), acrilato de N,N-dimetilaminoetilo, acrilato de N, -dietilaminoetilo, acrilato de trietilenglicol, metacrilamida, N-metilacrilamida, N, N-dimetilacrilamida, IsiLter-butilmetacrilamida, N-n-butilmetacrilamida, N-metilolacrilamida, N-etilolacrilamida, ácido vinilbenzoico (todos los isómeros) , dietilaminoestireno (todos los isómeros) , ácido alfa-metilvinilbenzoico (todos , los isómeros) , dietilamino-alf -metilestireno (todos los isómeros) , ácido p-vinilbencensulfónico, sal de ácido p- vinilbencensulfónico, metacrilato de trimetoxisililpropilo, metacrilato de trietoxisililpropilo, metacrilato de tributoxisililpropilo, metacrilato de dimetoximetilsililpropilo, metacrilato de dietoximetilsililpropilo, metacrilato de dibutoximetilsililpropilo, metacrilato de diisopropoximetilsililpropilo, metacrilato de dimetoxisililpropilo, metacrilato de dietoxisililprqpilo, metacrilato de dibutoxisililpropilo, metacrilato de diisopropoxisililpropilo, acrilato de trimetoxisililpropilo, acrilato de trietoxisililpropilo, acrilato de tributoxisililpropilo, acrilato de dimetoximetilsililpropilo, acrilato de dietoximetilsililpropilo, acrilato de dibutoximetilsililpropilo, acrilato de diisopropoximetilsililpropilo, acrilato de dimetoxisililpropilo, acrilato de dietoxisililpropilo, acrilato de dibutoxisililpropilo, acrilato < de diisopropoxisililpropilo, acetato de vinilo, butirato de vinilo, benzoato de vinilo, cloruro de vinilo, fluoruro de vinilo, bromuro de vinilo, anhídrido maleico, N-arilmaleimida, N- fenilmaleimida, N-alquilmaleimida, N-butilimaleimida, N-vinilpirrolidona, N-vinilcarbazol , butadieno, isopreno, cloropreno, etileno, propileno, 1,5-hexadienos, 1 , 4 -hexadienos , 1 , 3 -butadienos , 1,4- pentadienos, alcohol vinílico, vinilamina, N-alquilvinilamina, alilamina, N-alquilalilamina, dialilamina, N-alquildialilamina, alquilenimina, ácidos acrílicos, alquilacrilatos , acrilamidas, ácidos metacrílieos , alquilmetacrilatos , metacrilamidas, N-alquilacrilamidas , N-alquilmetacrilamidas , N-isopropilacrilamida, vinilnaftaleno, vinilpiri!dina, etilvinilbenceno, aminoestireno, vinilpiridina, vinilimidazol , vinilbifenilo, vinilanisol, vinilimidazolilo, vinilpiridinilo, vinilpolietilenglicol , dimetilaminometilestireno, etilmetacrilato de trimetilamonio, etilacrilato de trimetilamonio, propilacrilamida de dimetilamino, etilacrilato de trimetilamonio, etilmetacrilato de trimetilamonio, propilacrilamida de trimetilamonio, acrilato de dodecilo, acrilato de octadecilo, o metacrilato de octadecilo, monomero o combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, las versiones funcionalizadas de estos monómeros son opcionalmente utilizadas. Un monomero funcionalizado, como se utiliza en la presente, es un monomero que comprende un grupo funcional enmascarado o no enmascarado, por ejemplo, un grupo al cual pueden ser enlazadas otras porciones después de la polimerización. Los ejemplos no limitantes de tales grupos son grupos amino primarios, carboxilos, tioles, hidroxilos, azidas, y grupos ciano. Varios grupos de enmascaramiento adecuados son disponibles (ver, por ejemplo, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2a edición) J. iley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994).
Los polímeros descritos aquí son preparados de cualquier manera adecuada. Los métodos sintéticos adecuados, utilizados para producir los polímeros proporcionados en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, la polimerización catiónica, aniónica y radicales libres. En algunos casos, cuando se utiliza un proceso catiónico, el monómero es tratado con un catalizador para iniciar la polimerización. Opcionalmente , uno o más monómeros son utilizados para formar un copolímero. En algunas modalidades, tal catalizador es un iniciador, incluyendo, por ejemplo, ácidos protónicos (ácido de Bronsted) o ácidos de Lewis, en el caso del uso del ácido de Lewis son también opcionalmente utilizados algunos promotores tales como agua o alcoholes . En algunas modalidades, el catalizador es, a manera de ejemplo no limitante, yoduro de hidrógeno, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, fluoruro de hidrógeno, ácido clorosulfónico, ácido metansulfónico, ácido trifluorometansulfónico, tricloruro de aluminio, cloruros de alquilaluminio, complejos de trifluoruro de boro, tetracloruro de estaño, pentacloruro de antimonio, cloruro de zinc, tetracloruro de titanio, pentacloruro de fósforo, oxicloruro de fósforo, u oxicloruro de cromo. En ciertas modalidades, la síntesis del polímero es realizada pura o en cualquier solvente adecuado. Los solventes adecuados incluyen, pero no están limitados a, pentano, hexano, dicloromet no, cloroformo, o dimetilformamida (DMF) . En ciertas modalidades, la síntesis del polímero es realizada a cualquier temperatura de reacción adecuada, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente -50°C hasta aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 70 °C.
En ciertas modalidades, los polímeros son preparados por medio de una polimerización por radipales libres. Cuando es utilizado un proceso de polimerización por radicales libres, (i) el monómero, (ii) opcionalmente el comonómero, y (iii) una fuente opcional de radicales libres son proporcionados para disparar un proceso de polimerización por radicales libres. En algunas modalidades, la fuente de los radicales libres es opcional, debido a que algunos monómeros pueden auto-iniciarse después del calentamiento a alta temperatura. En ciertos casos, después de la formación de la mezcla de polimerización, la mezcla es sometida a condiciones de polimerización. Las condiciones de polimerización son aquellas condiciones que provocan al menos que un monómero forme al menos un polímero, como se discute en la presente. Tales condiciones son opcionalmente variadas a cualquier nivel adecuado e incluyen, a manera de ejemplo no limitante, temperatura, presión, atmósfera, proporciones de los componentes iniciales utilizados en la mezcla de polimerización, y el tiempo de reacción. La polimerización es llevada a cabo de cualquier manera adecuada, incluyendo, por ejemplo, en solución, dispersión, suspensión, emulsión o a granel .
En algunas modalidades, los iniciadores iestán presentes en la mezcla de reacción. Cualesquiera iniciadores adecuados son opcionalmente utilizados y son útiles en los procesos de polimerización descritos en la presente. Tales iniciadores incluyen, a manera de ejemplo no limitante, uno o más de peróxidos de alquilo, peróxidos de alquilo sustituidos, peróxidos de arilo, peróxidos de arilo sustituidos, peróxidos de acilo, hidroperóxidos de alquilo, hidroperóxidos de alquilo sustituido, hidroperóxidos de arilo, hidroperóxidos de arilo sustituido, peróxidos de heteroalquilo, peróxidos de heteroalquilo sustituido, hidroperóxidos de heteroalquilo, hidroperóxidos de heteroalquilo sustituidos, peróxidos de heteroalquilo, peróxidos de heteroalquilo sustituidos, hidroperóxidos de heteroarilo, hidroperóxidos de heteroarilo sustituidos, perésteres de alquilo, perésteres de alquilo sustituidos, perésteres de arilo, perésteres de arilo sustituidos, o compuestos azo. En modalidades específicas, el peróxido de benzoilo (BPO) y/o AIBN son utilizados como iniciadores.
En algunas modalidades, los procesos de polimerización son llevados a cabo en un modo activó, de cualquier manera adecuada, tal como pero no limitado Polimerización por Radicales de Transferencia de Átomos (ATRP) , polimerización por radicales libres activa mediada por nitróxido (NMP) , polimerización por apertura de anillo (ROP) , transferencia degenerativa (DT) , o Transferencia de Fragmentación por Adición Reversible (RAFT) . Utilizando métodos de polimerización convencionales y/o activos/controlados, pueden ser producidas diversas arquitecturas de polímero, tales como pero no limitada a copolímeros en bloque, de injerto, en estrella y en gradiente, con lo cual las unidades monoméricas son y sea estadísticamente distribuidas o de una manera en gradiente a través de la cadena u homopolimerizados en secuencias de bloques o injertos sobresalientes. En otras modalidades, los polímeros son sintetizados mediante diseño Macromolecular vía la transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible de Xantatos (MADIX) (Síntesis Directa de Copolímeros de Di- y Tri-Bloques Estadísticos, Hidrofílieos Dobles, Comprendidos de Acrilamida y Unidades de Ácido Acrílico vía el Proceso MADIX" , Daniel Taton, et al., Macroraolecular Rapid Communications, 22, Núm. 18, 1497-1503 (2001) . ) En ciertas modalidades, la Transferencia de cadena por Adición-Fragmentación Reversible o RAFT es utilizada en la síntesis de polímeros de cadena principal etilénica de esta invención. RAFT es un proceso de polimerización activa. RAFT comprende un proceso de transferencia de cadena degenerativo, por radicales libres. En algunas modalidades, los procedimientos RAFT para preparar un polímero descrito en la presente, emplean compuestos de tiocarboniltio tales como, sin limitación, ditioésteres, ditiocarbamatos , tritiocarbonatos y xantatos para mediar la polimerización por un mecanismo de transferencia de cadena reversible. En ciertos casos, la reacción de un radical polimérico con el grupo C=S de cualquiera de los compuestos precedentes, conduce a la formación de intermediarios de radicales estabilizados. Típicamente, estos intermediarios de radicales estabilizados no sufren las reacciones de terminación típicas de la polimerización por radicales estándar sino más bien reintroducen un radical capaz de realizar el reinicio o la propagación con el monómero, reformando el enlace C=S en el proceso. En la mayoría de los casos, este ciclo de adición al enlace C=S seguido por fragmentación del radical resultante continua hasta que todo el monómero ha sido consumido o la reacción se apaga. En general, la baja concentración de los radicales activos a cualquier tiempo particular limita las reacciones de terminación normales .
En algunas modalidades, los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) utilizados en los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente tienen un bajo índice de polidispersión (PDI) o diferencias en la longitud de cadena. El índice de polidispersión (PDI) puede ser determinado de cualquier manera adecuada, por ejemplo, al dividir el peso molecular promedio en peso de las cadenas poliméricas entre su peso molecular promedio en número. El peso molecular promedio en número es la suma de los pesos moleculares de las cadenas individuales divido entre el número de cadenas. El peso molecular promedio en peso es proporcional al cuadrado de peso molecular dividido entre el número de moléculas de ese peso molecular. Ya que el peso molecular promedio en peso es siempre mayor que el peso molecular promedio en número, la polidispersión es siempre mayor que o igual a uno. Conforme los números se vuelven cada vez más y más parecidos, por ejemplo, conforme la polidispersión se aproxima a un valor de uno, el polímero se vuelve más cercano a ser monodisperso, en el cual cada cadena tiene exactamente el mismo número de unidades constitucionales . Los valores de polidispersión que se aproximan a uno son alcanzables utilizando la polimerización activa por radicales. Los métodos para determinar la polidispersión, tales como, pero no limitados a, cromatografía de exclusión de tamaño, dispersión dinámica de luz, cromatografía de deserción/ionización por láser asistida por matriz, y cromatografía de masa de electrorrocío son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, los copolímeros en bloque (por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) de los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, tienen un índice de polidispersión (PDI) menor de 2.0, o menor de 1.8, o menor I de 1.6, o menor de 1.5, o menor de 1.4, o menor de 1.3 , o menor de 1.2.
Los procesos de polimerización descritos en la presente ocurren opcionalmente en cualquier solvente adecuado o mezclas de los mismos . Los solventes adecuados incluyen agua, alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, butanol) , tetrahidrofurano i(THF) sulfóxido de dimetilo (DMSO) , dimetilformamida (DMF) , acetona, acetonitrilo, hexametilfosforoamida, ácido acético, ácido fórmico, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, dioxano, cloruro de metileno, éter (por ejemplo, éter dietílico) , cloroformo, y acetato de etilo. En un aspecto, el solvente incluye agua, y mezclas de agua y solventes orgánicos miscible en agua tales como DMF.
En ciertas modalidades, el poli (DMAEMA) y otras entidades poliméricas utilizadas en la presente ¡ (por ejemplo, copolímeros o bloques copoliméricos de BMA, DMAEMA y PAA) son preparados de cualquier manera adecuada. En una i modalidad, el poli (DMAEMA) es preparado mediante la polimerización de DMAEMA en presencia de RAFT CTA, ECT, y un iniciador por radicales. En algunas modalidades, un bloque, poli (DMAEMA) macroCTA es utilizado para preparar una serie de copolímeros dibloque donde el segundo bloque contenía BMA, DMAEMA y PAA. En otras modalidades específicas, la orientación de los bloques sobre el polímero dibloque está invertida, tal que después de auto-ensambladura, el extremo ? del polímero es expuesto sobre él segmento hidrofílico de la micela o el montaje micelar. En diversas modalidades, esto es logrado de cualquier manera adecuada, incluyendo un número de formas sintéticamente. Por ejemplo, en algunas modalidades, la síntesis de los copolímeros en bloque descritos en la presente comienza con la preparación del bloque hidrofóbico formado de núcleo PAA/BMA/DMAEMA, el bloque cargado hidrofílico, formador de la envoltura es agregado en el segundo paso sintético, al someter el macroCTA PAA/BMA/DMAEMA resultante, a un segundo paso de polimerización por RAFT. Los procedimientos alternativos incluyen la reducción del macroCTA PAA/BMA/DMAEMA ' para formar un extremo tiol y luego enlazar covalentemente un copolímero cargado, hidrofílico, pre-formado al tiol formado. Este procedimiento sintético proporciona un método para la introducción de un grupo reactivo sobre el extremo ? de la cadena polimérica expuesta a la superficie de la micela, proporcionando de este modo procedimientos alternativos para la conjugación química a la micela.
En algunas modalidades, los copolímeros en bloque son sintetizados mediante conjugación química de varios bloques poliméricos que son preparados mediante procesos de polimerización separados.
En algunos casos, los copolímeros en bloque (por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) comprenden monómeros que comprenden grupos reactivos que pueden ser utilizados para la introducción postpolimerización de grupos funcionales adicionales que son conocidos en las técnicas químicas, por ejemplo, la química de "click" (por ejemplo de las reacciones "click", ver Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17) .
En casos específicos, se proporcionan en la presente los polímeros (por ejemplo, los copolímeros en bloque que incluyen los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana) de la siguiente estructura: a- [Ds-Xt] b- [Bx-Py-Dz] 3-? [Estructura 1] a- [Bx-Py-Dz] a- [Dg-Xtl b-? [Estructura 2] en donde x, y, z, s y t son la composición en mol % (en general, 0-50%) de las unidades monoméricas individuales D (DMAEMA) , B (BMA) , P (PAA) , y un monómero hidrofílico neutro (X) en el bloque polímero, a y b son los pesos moleculares de los bloques, [Ds-Xt] es el bloque de núcleo hidrofílico, y y ? denotan los extremos opuestos del polímero. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas modalidades, x es 60%, y es 20% y z es 20%. En ciertas modalidades, x es 70%, y es 15% y z es 15%. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas modalidades, x es 33%, y es 33% y z es 33%. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 20% y z es 30%. En ciertas modalidades, x es 20%, y es 40% y z es 40%. En ciertas modalidades, x es 30%, y es 40% y z es 30%. En algunas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente comprende un bloque hidrofílico de aproximadamente 2,000 Da a aproximadamente 30,000 Da, aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 20,000 Da, o aproximadamente 7,000 Da a aproximadamente 15,000 Da. En modalidades específicas, el bloque hidrofílico es de aproximadamente 7,000 Da, 8,000 Da, 9,000 Da, 10,000 Da, 11,000 Da, 12,000 Da, 13,000 Da, 14,000 Da, ó 15,000 Da. En ciertas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente comprende un bloque de núcleo hidrofóbico de aproximadamente 2,000 Da a aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 10,000 Da a aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 15,000 Da a aproximadamente 35,000 Da, o aproximadamente 20,000 Da a aproximadamente 30,000 Da. En algunas modalidades específicas, el polímero con un bloque hidrofílico es de 12,500 Da y un bloque de núcleo hidrofóbico de 25,000 Da (proporción de longitud de 1:2) forma montajes micelares (por ejemplo, micelas) . En algunas modalidades específicas, el polímero con un bloque hidrofílico es de 10,000 Da y un bloque de núcleo hidrofóbico de 30,000 Da (proporción de longitud de 1:3) forma montajes micelares (por ejemplo, micelas) . En algunas modalidades específicas, el polímero con un bloque hidrofílico es de 10,000 Da y un bloque de núcleo hidrofóbico de 25,000 Da (proporción de longitud de 1:2.5) forma montajes micelares (por ejemplo, micelas) de aproximadamente 45 nm (como es determinado por las mediciones de dispersión dinámica de luz o microscopía electrónica) . En algunas modalidades específicas, las micelas son de 80 o de 130 nm (como es determinado por las mediciones de dispersión dinámica de luz o la microscopía electrónica) . Típicamente, conforme se incrementa el peso molecular (o la longitud) de [Ds-Xt] , que forma la envoltura de la micela, con relación a [Bx-Py-Dz] el bloque de núcleo hidrofóbico que forma el núcleo, el tamaño de la micela también se incrementa. En algunos casos, el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la envoltura ( [Ds-Xt] es importante en la provisión de la formación compleja efectiva/neutralización de carga con el fármaco oligonucleótido . Por ejemplo, en ciertos casos, para el AR si de aproximadamente 20 pares de bases (por ejemplo, 40 cargas aniónicas) un bloque catiónico tiene una longitud adecuada para proporcionar enlace efectivo, por ejemplo 40 cargas catiónicas. Para un bloque de envoltura que contiene 80 monómeros de DMAEMA (PM = 11,680) con un valor pKa de 7.4, el bloque contiene 40 cargas catiónicas a pH 7.4. En algunos casos, los conjugados polímero estable-ARNsi (por ejemplo, complejos) se forman mediante interacciones electrostáticas entre cargas opuestas de número similar. En ciertos casos, al evitar un número grande de carga positiva en exceso se ayuda a prevenir la toxicidad significativa in vitro e in vivo.
En modalidades específicas, el bloque de núcleo hidrofóbico del copolímero en bloque comprende una pluralidad de especies cargables catiónicas, por ejemplo, metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA) . De este modo. en algunas modalidades, la estructura de tal segmento polimérico es representada por la Estructura 3 : Qi [BMAx-PAAy-DMAEMAz] -Q2 [Estructura 3] en donde Qi y Q2 en la designación anterior denotan otros bloques poliméricos o funcionalidades de grupo extremo, y en donde x, y, y z son la composición en % mol (en general, 0-50%) de las unidades monoméricas individuales. En ciertos casos, las unidades monoméricas individuales sirven funciones individuales y sinérgicas. Por ejemplo, el ácido polipropilacrílico, el cual comprende especies aniónicas y especies hidrofóbicas , con un valor de pKa de -6.7 es hidrofílico por arriba de un pH de aproximadamente 6.7 y es cada vez más hidrofóbico por debaj o de un pH de aproximadamente 6.7, donde los carboxilatos se llegan a protonar. En ciertos casos, incrementando la hidrofobicidad del ambiente local,, por ejemplo, al incrementar el % mol de la unidad monomérica predominantemente hidrofóbica BMA en el bloque, se eleva el pKa de PAA y da como resultado la protonación de PAA a un pH más alto, es decir, el bloque que contiene PAA se vuelve más desestabilizador de la membrana a un pH más alto y de este modo más respondedor a los cambios ácidos más pequeños en pH por debajo del pH fisiológico de -7.4. En algunos casos, la protonación de PAA da como resultado un gran incremento en la hidrofobicidad y el cambio conformacional subsiguiente a una forma con propiedades desestabilizadoras de la membrana. Una tercera unidad monomérica en el bloque polimérico anteriormente descrito es la especie catiónica, por ejemplo DMAEMA, la cual, en algunos casos, sirve funciones múltiples, incluyendo, pero no limitadas a las siguientes. Cuando se equipara en cantidades molares equivalentes a la especie aniónica de PAA, éste crea una neutralización de carga y el potencial para formar interacciones electrostáticas que pueden contribuir a la estabilidad del núcleo hidrofóbico de una estructura micelar donde Qi o Q2 en la estructura anterior es un bloque homopolimérico hidrofílico, por ejemplo poli-DMAE A.
En ciertas modalidades, el copolímero en bloque (por ejemplo, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana) tiene la Fórmula química I: En algunas modalidades: A0, Ai, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo que consiste de -C-, -C-C-, -C (0) (C) aC (O) O- , -0(C)aC(0)- y -0(C)bO-; en donde, b es 2-4; Y4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de Ci-Ci0, cicloalquilo de C3-C6 , O-(alquilo de C1-C10) , -C (O) O (alquilo de L-CIO) , C(0)NR6(de Ci-Cío) heteroarilo de C4-Ci0 y arilo de C6-Ci0, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor; Yo/ Yi y 2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de C1-C10, -C (O) O (alquilo de C2-C10)-, -OC (O) (alquilo de Cl-C10) -, -0 (alquilo de C2-C10) - y - S (alquilo de C2-C10)-, C (O) R6 (alquilo de C2-C10)-, heteroarilo de C4-C10 y arilo de C6-C10; Y3 se selecciona del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de C1-C10, heteroarilo de C4-C10 átomos de carbono, y arilo y C6-C10; en donde los átomos de carbono tetravalentes de ?1-?4 que no están completamente sustituidos con R1-R5 y Y0- Y son completados con un número apropiado de átomos de hidrógeno; R1# R2, R3 , R4, R5, y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor; Qo es un residuo seleccionado del grupo que consiste de residuos que son hidrofílicos a pH fisiológico, y son al menos parcialmente cargados positivamente a pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo, o similares) ; al menos parcialmente cargados negativamente a pH fisiológico, pero sufren protonacion a pH más bajo (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o similares) ; sustancialmente neutros (o no cargados) a pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiól, o similares) ; al menos parcialmente zwiteriónicoszwiteriónicos a pH fisiológico (por ejemplo, un residuo monomérico que comprende un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; residuos conjugables o funcionalizables (por ejemplo, residuos que comprenden un grupo reactivo, por ejemplo, azida, alquino, éster de succinimida, éster de tetrafluorofenilo, éster de pentafluorofenilo, éster de p-nitrofenilo, disulfuro de piridilo, o similares) ; o hidrógeno; Qi es un residuo que es hidrofílico a pH fisiológico, y son al menos parcialmente cargados positivamente a pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo, o similares) ; al menos parcialmente cargados negativamente a pH fisiológico, pero sufren protonación a pH más bajo (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o similares) ; sustancialmente neutros a pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o similares) ; al menos parcialmente zwiteriónicos a pH fisiológico (por ejemplo, que comprende un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; Q2 es un residuo que es positivamente cargado a pH fisiológico, incluyendo pero no limitados a amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, y piridilo; Q3 es un residuo que es negativamente cargado a pH fisiológico, pero sufre protonación a pH menor, incluyendo pero no limitado a carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, y fosfato; m es aproximadamente 0 a menos de 1.0 (por ejemplo, 0 aproximadamente a 0.49); n es mayor de 0 a aproximadamente 1.0 (por ejemplo, aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0); en donde m + n = 1 p es aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 0.9 (por ejemplo, aproximadamente de 0.2 a aproximadamente 0.5) ; q es aproximadamente de 0.1 aproximadamente a 0.9 (por ejemplo, aproximadamente de 0.2 a aproximadamente 0.5 ) ; en donde : r es 0 a aproximadamente 0.8 (por ejemplo, 0 a aproximadamente 0.6); en donde p + q + r = 1 v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o aproximadamente de 5 a aproximadamente 25 kDa; y, w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En algunas modalidades, el número o proporción de los residuos monoméricos representados por p y q están dentro de aproximadamente 30% uno del otro, aproximadamente 20% del otro, aproximadamente 10% del otro, o similar. En modalidades específicas, p es sustancialmente el mismo que q. En ciertas modalidades, al menos parcialmente cargado incluye en general más de una cantidad en trazas de la especie cargada, incluyendo, por ejemplo, al menos 20% de los residuos están cargados, al menos 30% de los residuos están cargados, al menos 40% de los residuos están cargados, al menos 50% de los residuos están cargados, al menos 60% de los residuos están cargados, al menos 70% de los residuos están cargados, o similares.
En ciertas modalidades, m es 0 y Qi es un residuo que es hidrofílico y sustancialmente neutro (o no cargado) a pH fisiológico. En algunas modalidades, sustancialmente no cargado incluye, por ejemplo, menos de 5% están cargados, menos de 3% están cargados, menos de 1% están cargados, o similares. En ciertas modalidades, m es 0 y Qx es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es 0 y Qi es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es > O y n es > 0, y uno de Q0 o Qi es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico, y el otro de Q0 o Qi es un residuo que es hidrofílico y es sustancialmente neutro a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es > 0 y n es > 0 y uno de Q0 o Qi es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico y el otro de Q0 o Qi es un residuo que es hidrofílico y es sustancialmente neutro a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es > 0 y n es > 0 y Qi es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es un residuo conjugable o funcionalizable . En ciertas modalidades, m es > 0 y n es > 0 y Qi es un residuo que es hidrofílico y sustancialmente neutro a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es conjugable o funcionalizable .
En ciertas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente comprende un copolímero en bloque de la Fórmula II: (?) En algunas modalidades: A0/ Ai, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo que consiste de -C-C-, -C (O) (C) aC (O) O- , -0(C)aC(0)- y -0(C)b(0)-; en donde, a es 1-4; b es 2-4; Y0 e Y son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-C10, cicloalquilo de C3-C6, O- (alquilo de Cl-ClO) , C(0)0(alquilo de C1-C10) , C (O) NR6 (C1-C10) , heteroarilo de C4-C10 y arilo de C6-C10, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor; Yi e Y2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de Cl-ClO, -C (O) O (alquilo de C2-C10)-, -OC (O) (alquilo de Cl-ClO) --O (alquilo de C2 -CIO )-, -S (alquilo de C2-C10)-, C (O) NRS (alquilo de C2-C10, eteroarilo de C4-C10 y arilo de C6-C10; Y3 se selecciona del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de C1-C10, heteroarilo de C4-C10 y arilo de C6-C10; en donde los átomos de carbono tetravalentes de Ax-A4 que no están completamente sustituidos con R1-R5 y Y0-Y4 son completados con un número apropiado de átomos de hidrogéneRi, R2/ R3, R4, R5, y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor; Qi y Q2 son residuos que son positivamente cargados a pH fisiológico, incluyendo pero no limitados a amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, y piridilo.
Q3 es un residuo que es negativamente cargado a pH fisiológico, pero sufre protonación a pH menor, incluyendo pero no limitado a carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, y fosfato, m es 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0; en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es de aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 0.5; en donde : p es sustancialmente el mismo que q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y, w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En ciertas modalidades, un montaje micelar descrito en la presente comprende un copol mero en bloque (por ejemplo, a pH fisiológico normal) de la Fórmula III: En ciertas modalidades, A0, A1( A2, A3 , y A4 , sustituidos como se indica, comprenden las unidades constitucionales (utilizadas aquí intercambiablemente con las "unidades monoméricas" y los "residuos monoméricos" ) del polímero de la Fórmula III. En modalidades específicas, las unidades monoméricas que constituyen los grupos A de la Fórmula III son polimerizablemente compatibles bajo condiciones apropiadas. En ciertos casos, una cadena principal etilénica o unidad constitucional, -(C-C-)m- polímero, en donde cada C está di-sustituidp con H y/o cualquier otro ¦ grupo adecuado, es polimerizado utilizando monómeros que contienen un doble enlace carbono- i carbono, >C=C<. En ciertas modalidades, cada grupo A (por ejemplo, cada uno de A0, Ai, A2, A3, y A4) puede ser (por ejemplo, independientemente seleccionado de) -C-C- (por ejemplo, una cadena principal polimérica o unidad monomérica etilénica), -C (0) (C) aC(0) 0- (por ejemplo, una cadena principal polimérica o unidad monomérica de polianhídrido) , -0(C)aC(0)- (por ejemplo, una cadena principal polimérica o unidad monomérica de poliéster) , -0(C)bO- (por ejemplo, una cadena principal polimérica o unidad monomérica de polialquilenglicol) , o similares (en donde cada C está di-sustituido con H y/o cualquier otro grupo adecuado tal como se describe en la presente, incluyendo Ri2 y/o Ri3 como se describieron anteriormente) . En modalidades específicas, el término "a" es un número entero de 1 a 4 , y "b" es un número entero de 2 a . En ciertos casos, cada grupo "Y" y "R" enlazado a la cadena principal de la Fórmula III (por ejemplo, cualquiera de Y0, Yi, Y2, Y3, Y4, Ri, 2, R3, R4, Rs) está unido a cualquiera de "C" (incluyendo cualquier (C)a o (C)b) de la unidad monomérica específica. En modalidades específicas, Y y R de una unidad monomérica específica están enlazados a la misma "C" . En ciertas modalidades específicas, Y y R de una unidad monomérica específica está enlazada a la misma "C" , la "C" está alfa al grupo carbonilo de la unidad monomérica, si está presente.
En modalidades específicas, Ri-Rn son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, alquilo de 1C-5C) , cicloalquilo (por ejemplo, cicloalquilo de 3C-6C) , o fenilo, en donde cualquiera de Ri-Rn está opcionalmente sustituido con uno o más flúor, cicloalquilo, o fenilo, el cual puede estar opcionalmente sustituido además con uno o más grupos alquilo.
En ciertas modalidades específicas, Y0 y Y4 son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, alquilo de 1C-10C) , cicloalquilo (por ejemplo, cicloalquilo de C3-C6) , O-alquilo (por ejemplo, O- (alquilo de C2-C10) , -C (O) O-alquilo (por ejemplo, -C (O) O- (alquilo de C2-C10 ) , o fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más flúoros.
En algunas modalidades, Yi y Y2 son independientemente seleccionados de un enlace covalente, alquilo, preferentemente actualmente un grupo (alquilo de C1-C10) , -C (O) O-alquilo, preferentemente actualmente -C (O) O- (alquilo de C2-C10) , -OC (O) alquilo, preferentemente actualmente -OC (0) - (alquilo de C2-C10 ), 0-alquilo, preferentemente actualmente -O(alquilo de C2-C10) y -S-alquilo, preferentemente actualmente -S- (alquilo de C2-CIO) . En ciertas modalidades, Y3 es seleccionado de un enlace covalente, alquilo, de preferencia actualmente de alquilo de C1-C5 y fenilo.
En algunas modalidades, Z~ está presente o ausente. En ciertas modalidades, en donde Ri y/o R4 es hidrógeno, Z~ es OH". En ciertas modalidades, Z~ es cualquier ion contrario (por ejemplo, uno o más iones contrarios) , preferentemente un ion contrario, biocompatible tal como, a manera de ejemplo no limitante, cloruro, fosfato inorgánico u orgánico, sulfato, sulfonato, acetato, propionato, butirato, valerato, caproato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmato, estearato, palmitolato, oleato, linolato, araquidato, gadoleato, vaccinato, lactato, glicolato, salicilato, desaminofenilalanina , desaminoserina , desaminotreonina, e-hidroxicaproato, 3-hidroxibutirato, 4 -hidroxibutirato o 3-hidroxivalerato . En algunas modalidades, cuando cada Y, R y flúor opcional está covalentemente enlazado a un carbono de la cadena principal seleccionada, cualquiera de los carbonos que no están completamente sustituidos son completados con el número apropiado de átomos de hidrógeno.
Los números m, n, p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitucional en su bloque y v y w proporcionan el peso molecular de cada bloque.
En ciertas modalidades, A0, Ai, A2, A3 y A4 son seleccionados del grupo que consiste de -C-, -C-C-, -C (O) (CRi2Ri3 ) aC (O) 0- , -0(CRi2Ri3)aC(0) - y 0(CRi2Ri3)bO en donde, a es 1-4; b es 2-4; Ri/ 2 / R3 / R- R5 6/ R-7 Re» R9/ Rio? ii/ R12 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-C5, cicloalquilo de C3-C6, arilo de C5-C10, heteroarilo de C4-C10 a, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor; Y0 y Y4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-C10, cicloalquilo de C3-C6 , 0- (alquilo de C1-C10), C (O) O (alquilo de C1-C10 ) y fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor; Y1 y Y2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de Cl-C10 -, -C(0)0(alquilo de C2-C10 -, -0C(0) (alquilo de Cl-C10) , -O (alquilo de C2-C10) - y -S (alquilo de C2-C10)-; Y3 es seleccionado del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de C1-C5 y fenilo; en donde los átomos de carbono tetravalentes de Ai-A que no están completamente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y son completados con un número apropiado de átomos de hidrógeno; Z es uno o más iones contrarios fisiológicamente aceptables , m es 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0; en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; en donde : p es sustancialmente el mismo que q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y, w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En una modalidad específica, A0, Ai, A2, A3 y A4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de -C-C-, -C(O) (C)aC(0)0-, -0(C)aC(0)- y -0(C)bO-; en donde, a es 1-4; b es 2-4; Rl, ¾/ 9» Rio y n son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-C5 , cicloalquilo de C3-C6 y fenilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor; Y0 y Y4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-C10 cicloalquilo de C3-C6 , O- (alquilo de C1-C10 ) , C (O) O (alquilo de C1-C10 ) y fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor; Yx y Y2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un enlace covalente, (alquilo de Cl-C10 )-, -C (O) O (alquilo de C2-C10 )-, -OC (O) (alquilo de Cl-C10 )-, -0 (alquilo de C2-C10 )- y -S (alquilo de C2-C10 )-; Y3 es seleccionado del grupo que consiste de un enlace covalente, alquilo de C1-C5 y fenilo; en donde los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están completamente sustituidos con R1-R5 y Y0-Y4 son completados con un número apropiado de átomos de hidrógeno; Z es un ion contrario fisiológicamente aceptable, m es 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0 ; p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5 q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0 p es sustancialmente el mismo que q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es de aproximadamente 5 a aproximadamente w es de aproximadamente 5 a aproximadamente En algunas modalidades, Ai es -C-C- Yi es -C(0)OCH2CH2-; R6 es hidrógeno; R7 y R8 son cada uno -CH3; y, R2 es -CH3.
En algunas modalidades, A2 es -C-C-; Y2 es -C (O) OCH2CH2- ; R3 es hidrógeno; Rio y Rn son cada uno -CH3; y, R3 es -CH3.
En algunas modalidades, A3 es -C-C- R4 es CH3CH2CH2- Y3 es un enlace covalente; y Z~ es un anión fisiológicamente aceptable.
En algunas modalidades, A4 es -C-C-; R5 es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y -CH3; y, Y4 es -C(0)0(CH2)3CH3.
En algunas modalidades, A0 es C-C- Ri es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-C3 y, Y0 es seleccionado del grupo que consiste de -C (O) O (alquilo de C1-C3 ) .
En algunas modalidades, m es 0.
En algunas modalidades, r es 0.
En algunas modalidades, m y r son ambos 0.
En diversas modalidades descritas en la presente, las unidades constitucionales, que son catiónicas o positivamente cargadas a pH fisiológico (incluyendo, por ejemplo, ciertas unidades constitucionales hidrofílicas ) descritas en la presente, comprenden uno o más grupos amino, grupos alquilamino, grupos guanidino, grupos imidazolilo, grupos piridilo, o similares, o las formas protonadas, alquiladas o de otro modo cargadas de los mismos. En algunas modalidades, las unidades constitucionales que son catiónicas a pH fisiológico normal, que son utilizadas en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de dialquilaminoalquilmetacrilatos (por ejemplo, DMAEMA) . En diversas modalidades descritas en la presente, las unidades constitucionales, que son aniónicas o negativamente cargadas a pH fisiológico (incluyendo, por ejemplo, ciertas unidades constitucionales hidrofílicas) descritas en la presente, comprenden uno o más grupos ácidos o bases conjugadas de los mismos, incluyendo, a manera de ejemplo no limitante, carboxilato, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o similares. En algunas modalidades, las unidades constitucionales que son aniónicas o negativamente cargadas a pH fisiológico normal, que son utilizadas en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de ácido acrílico, ácido alquilacrílico (por ejemplo, ácido metilacrílico, ácido etilacrilico, ácido propilacrílico, etc.), o similares. En diversas modalidades descritas en la presente, las unidades constitucionales hidrofílicas que son neutras a pH fisiológico comprenden uno o más grupos hidrofílieos , por ejemplo, los grupos hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o similares.
En algunas modalidades, las unidades constitucionales hidrofílicas que son neutras a pH fisiológico normal que son utilizadas en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de ácido acrilico PEGilado, ácido metacrílico PEGilado, ácido hidroxialquilacrílico, ácido hidroxialquilalquilcacrílico (por ejemplo, HPMA) , o similares. En diversas modalidades descritas en la presente, las unidades constitucionales hidrofílicas que son zwiteriónicas a pH fisiológico comprenden cualquier grupo aniónico o negativamente cargado a pH fisiológico y un grupo catiónico o positivamente cargado a pH fisiológico. En algunas modalidades, las unidades constitucionales hidrofílicas que son zwiteriónicas a pH fisiológico normal que son utilizadas en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, residuos monoméricos que comprenden un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico, tal como se describe en el documento US 7,300,990, que se incorpora por referencia en la presente para tal descripción, o similar.
En ciertas modalidades, los polímeros proporcionados en la presente comprenden además una o más unidades constitucionales que comprenden una cadena lateral conjugable o funcionalizable (por ejemplo, un grupo sobresaliente de un residuo monomérico) . En algunos casos, una cadena lateral conjugable o funcionalizable es un grupo que posee uno o más grupos reactivos que pueden ser utilizados para la introducción post-polimerización de funcionalidad adicionales por medio de las químicas conocidas en la materia, por ejemplo, la química "click" (por ejemplo de reacciones "click", ver Wu, P. ; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition : Reactivity y Applications. Aldrichiw. Acta, 2007, 40, 7-17). En ciertas modalidades, las cadenas laterales conjugables o funcionalizables proporcionadas en la presente, comprenden uno o más de cualquier grupo activado adecuado, tal como pero no limitado a (NHS)éster de N-hidrosuccinimida, (1-hidroxibenzotriazol) éster de HOBt, éster de p-nitrofenilo, éster de tetrafluorofenilo, éster de pentafluorofenilo, grupo piridil disulfuro o similares.
En ciertas modalidades, el copolímero en bloque proporcionado es un copolímero dibloque, que tiene la fórmula química (a pH fisiológico normal o aproximadamente neutro) de la Fórmula IV1 : ÍÍY11 En ciertos casos, las unidades constitucionales del compuesto IV1 son como se muestran dentro del corchete cuadrado a la izquierda, y los corchetes curvados a la derecha, y éstas son derivadas de los monómeros: -0(CH2)3CH3 Las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitucional dentro de su bloque. Las letras v y w representan el peso molecular (promedio en número) de cada bloque en el copolímero dibloque.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un compuesto que es un compuesto que tiene la estructura : Como se discutió anteriormente, las letras p; q y r representan la fracción molar de cada unidad constitucional dentro de su bloque. Las letras v y w representan el peso molecular (promedio en número) de cada bloque en el copolímero dibloque.
En algunas modalidades, se proporcionan en la presente los siguientes polímeros : [DMAEMA] v- [BP-/-Pq-/-Dr] w IV3 [PEGMAlv- [Bp-/-Pq-/-Dr]w IV4 [PEGMA,,,-/ -DMAEMAn] v- [Bp-/ - Pq- / -Dr] w IV5 [PEG An,-/-MAA(NHS)n]v- [Bp-/-Pq-/-Dr]„ IV6 [DMAEMA,,,-/-MAA(NHS)n] v- [Bp-/-Pq-/-Dr]„ IV7 [HPMAm-Z-PDSMnlv- [Bp-/-Pq-/-Dr]w IV8 [PEG A„,-/-PDSMn]v- [Bp- / - Pq-/-Dr] w ,IV9 En algunas modalidades, B es el residuo de metacrilato de butilo; P es el residuo de ácido propilacrílico; D y DMAEMA son el residuo metacrilato de dimetilaminoetilo; PEGMA es el residuo de metacrilato de polietilenglicol (por ejemplo, con 1-20 unidades óxido de etileno, tal como se ilustra en el compuesto IV2 , ó 4-5 unidades óxido de etileno, ó 7-8 unidades óxido de etileno); MAA(NHS) es el residuo de ácido metilacrílico-N-hidroxisuccinamida; HP A es el residuo de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida; y PDSM es el residuo de metacrilato de piridil-disulfuro . En ciertas modalidades, los términos m, n, p, q, r, w y v son como se describen en la presente. En modalidades especificas, w es aproximadamente lx a aproximadamente 5x v.
Los compuestos de las Fórmulas IV1-IV9 son ejemplos de polímeros proporcionados en la presente, que comprenden una variedad de unidades constitucionales que constituyen el primer bloque del polímero. En algunas modalidades, la o las unidades constitucionales del primer bloque son variadas o químicamente tratadas con el fin de crear polímeros donde el primer bloque es o comprende una unidad constitucional que es neutra (por ejemplo, PEGMA) , catiónica (por ejemplo, DMAEMA), aniónica (por ejemplo, PEGMA- HS , donde el NHS es hidrolizado al ácido, o ácido acrílico) , anfolítico (por ejemplo, DMAEMA-NHS , donde el NHS es hidrolizado al ácido) , o zwiteriónico (por ejemplo, fosfato de poli [2-metacriloiloxi-2 ' trimetilamonioetilo] ) .
En algunas modalidades, los polímeros que comprenden el grupo funcional disulfuro de piridilo en el primer bloque, por ejemplo, [PEGMA-PDSM] - [B-P-D] , que se puede hacer reaccionar opcionalmente con un AR si tiolado para formar un conjugado polímero-AR si .
En una modalidad específica, un compuesto de la Fórmula IV3 es un polímero de la clase P7, como se describe en la presente, y tiene el peso molecular, la polidispersión, y composición monomérica como se describe en la Tabla 1.
Determinado por las columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Mongomeryville , PA) conectadas en serie a un Viscotek GPCmax VE2001 y el refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . La DMF grado HPLC que contenía 0.1% en peso de LiBr se utilizó como la fase móvil. Los pesos moleculares de los copolímeros sintetizados fueron determinados utilizando una serie de estándares de poli (metacrilato de metilo). b Determinado mediante espectroscopia de R N^H ( 3 % en peso en CDCL3 ; Bruker DRX 499) En algunas modalidades específicas, un polímero de la Fórmula IV3 es un polímero de la clase P7 de acuerdo a la Tabla 2. En algunas modalidades específicas, un polímero de la Fórmula IV3 es un polímero de la clase P7 llamado P7v6. PRx0729v6 es utilizado intercambiablemente con P7v6 en esta solicitud y en diversas solicitudes de prioridad.
Tabla 2 Bloque de Núcleo En ciertas modalidades de la presente, proporciona el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente es o comprende un hidrófobo desestabilizador de la membrana dependiente del pH. En ciertas modalidades, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana es al menos parcialmente, sustancialmente , o predominantemente hidrofóbico.
En algunas modalidades, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente comprende una primera especie cargable que es aniónica a un pH aproximadamente neutro. En ciertas modalidades, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, el bloque de núcleo es un bloque copolimérico . En algunas modalidades, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, la primera especie cargable está hidrofóbicamente protegida (por ejemplo, al estar en proximidad de la cadena principal polimérica de un bloque polimérico que comprende porciones hidrofóbicas sobresalientes) . En ciertas modalidades, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y una segunda especie cargable que es catiónica a pH aproximadamente neutro.
En algunas modalidades, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende al menos una de la primera especie, grupo, o unidad monomérica cargable. En modalidades específicas, la primera especie, grupo, o unidad monomérica cargable es cargada o cargable a una especie, grupo o unidad monomérica aniónica. Se debe entender que tales bloques de núcleo incluyen especies, grupos, y/o unidades monoméricas en donde ninguna, algunas o todas de las especies, grupos o unidades monoméricas cargables están cargadas.
En ciertas modalidades, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende al menos una de la primera especie, grupo, o unidad monomérica cargable, y al menos una segunda especie, grupo, o unidad monomérica cargable. En algunos casos, la primera especie, grupo, o unidad monomérica cargable es como se describe anteriormente y la segunda especie, grupo, o unidad monomérica cargable es cargada o cargable a una especie, grupo, o unidad monomérica catiónica. En algunas modalidades, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, comprende al menos una primera especie, grupo, o unidad monomérica cargable; al menos una segunda especie, grupo, o unidad monomérica cargable; y al menos una especie, grupo, o unidad monomérica adicional. En modalidades específicas, la especie, grupo, o unidad monomérica adicional es una especie, grupo, o unidad monomérica no cargable. En ciertas modalidades, la especie, grupo, o unidad monomérica adicional es una especie, grupo, o unidad monomérica hidrofóbica.
En ciertas modalidades, donde el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable aniónica y al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable catiónica, la proporción del número de al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable aniónica al número de al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable catiónica es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable aniónica que es aniónicamente cargada, y al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable catiónica que es catiónicamente cargada, en donde la proporción del número de la especie, grupo, o unidad monomérica aniónicamente cargada al número de la especie, grupo, o unidad monomérica catiónicamente cargada presente sobre el bloque de núcleo es aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es aproximadamente 1:1.
En algunas modalidades, la proporción, aproximadamente a un pH neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4), del número de al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable aniónica al número de al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable catiónica es aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1, o es aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable aniónica que es aniónicamente cargada, y al menos una especie, grupo, o unidad monomerica cargable catiónica que es catiónicamente cargada, en donde la proporción, aproximadamente a un pH neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4), del número de especies, grupos, o unidades monoméricas aniónicamente cargadas al número de especies, grupos, o unidades monoméricas catiónicamente cargadas presentes sobre el bloque de núcleo es aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1, o es aproximadamente 1:1. En modalidades específicas, la proporción de especies, grupos, o unidades monoméricas positivamente cargadas presentes sobre el bloque de núcleo a las especies, grupos, o unidades monoméricas negativamente cargadas en el núcleo, es aproximadamente de 1:4 a aproximadamente 4:1 a un pH aproximadamente neutro . En modalidades más específicas, la proporción de las especies, grupos, o unidades monoméricas positivamente cargadas, presentes sobre el bloque de núcleo a las especies, grupos, o unidades monoméricas negativamente cargadas en el núcleo es aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a un pH aproximadamente neutro. En modalidades específicas, la proporción de las especies, grupos, o unidades monoméricas positivamente cargadas presentes sobre el bloque de núcleo a las especies, grupos, o unidades monoméricas negativamente cargadas en el núcleo es aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1.1:1 a un pH aproximadamente neutro.
En modalidades específicas, la primera unidad monomérica cargable es un ácido de Bronsted. En ciertos casos, como se utilizan en la presente, una especie, grupo, j o unidad monomérica cargable incluye especies, grupos i y/o unidades monoméricas en donde la adición o eliminación de un protón (por ejemplo, de una manera dependiente delipH), proporciona una especie, grupo, o unidad monomérica catiónica o aniónica, respectivamente.
En algunas modalidades, las primeras especies, grupos, o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos, o unidades monoméricas que son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% negativamente cargadas a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, estas primeras especies, grupos, o unidades monoméricas cargables están cargadas por pérdida de un H+, a una especie aniónica a un pH aproximadamente neutro. En modalidades adicionales o alternativas, las primeras especies, grupos, o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos, o unidades monoméricas que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% neutras o no cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menos ; aproximadamente 6.2, o menos ; aproximadamente 6 , o menos ; aproximadamente 5.9, o menos ; aproximadamente 5.8, o menos ; o aproximadamente pH endosomal) .
En algunas modalidades, la primera especie o grupo cargable es, a manera de ejemplo no limitante, un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfóiico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso, o similares.
Similarmente , en ciertas modalidades, una primera unidad monomérica cargable, útil en la presente, es una unidad monomérica que comprende un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso, o similares. En modalidades específicas, la primera unidad monomérica cargable, útil en la presente, es un ácido (alquil de C2-C8) acrílico.
En algunas modalidades, las segundas especies, grupos, o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos, o unidades monoméricas que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, estas segundas especies, grupos, o unidades monoméricas cargables están cargadas por adición de un H+, a una especie catiónica. En modalidades adicionales o alternativas, las segundas especies, grupos, o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos, o unidades monoméricas que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menos ; aproximadamente 6.2, o menos ; aproximadamente 6, o menos; aproximadamente 5.9, o menos; aproximadamente 5.8, o menos ; o aproximadamente pH endosomal) .
En modalidades específicas, la segunda unidad monomérica cargable es una base de Bronsted. En ciértas modalidades, la segunda especie o grupo cargable es una amina (incluyendo, por ejemplo, aminas no cíclicas y cíclicas). En algunas modalidades, la segunda unidad monomérica cargable es una unidad monomérica que comprende una amina, tal como, a manera de ejemplo no limitante, N,N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de d-C6) -etacrilato, N,N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -metacrilato, o N, N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -acrilato . En algunas modalidades, la segunda unidad monomérica cargable comprende un heterociclo nitrogenado, por ejemplo un imidazol, una piridina, una piperidina, una pirimidi a, o similares.
En ciertas modalidades, el segmento del núcleo (por ejemplo, el bloque de núcleo) de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana descrito en la presente, es hidrofóbico y comprende uno o más tipos de especies cargables. En modalidades específicas, la especie cargable es cargable a una especie catiónica. Los montajes micelares descritos en la presente, que comprenden una especie cargable incluyen montajes micelares en donde cada una de las especies cargables están, cada una individualmente presente en el montaje micelar en un estado cargado o un estado no cargado. Además, en donde los montajes micelares descritos en la presente comprenden una población de una primera especie cargable, una población de una segunda especie cargable y/o una población de cualquier especie cargable adicional, los montajes micelares descritos en la presente incluyen montajes micelares en donde cada una de las poblaciones de la primera, segunda, y cualesquiera especies cargables adicionales están, cada una individualmente, presentes en el montaje micelar en un estado completamente cargado, un estado parcialmente cargado o un estado completamente no cargado.
En algunas modalidades, la especie cargable aniónica es cualquier residuo de ácido orgánico o inorgánico que esté opcionalmente presente, ya sea como una especie protegida, por ejemplo, un éster, o como el ácido libre, en el proceso de polimerización seleccionado. En algunas modalidades, la especie cargable aniónica es un ácido débil, tal como pero no limitado a los siguientes grupos: ácido borónico, sulfonamida, ácido fosfónico, ácido arsónico, ácido fosfínico, fosfato, ácido carboxílico, xantenos, tetrazol o sus derivados (por ejemplo ésteres) . En ciertas modalidades los monómeros tales como el anhídrido maleico, (Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sáyed, Christopher M. Pirie, Alian S. Hoffman, y Patrick S. Stayton pH-Responsive Poly (styrene-alt-maleic anhydride) Alkilamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414) son utilizados para la introducción de la primera especie cargable mediante hidrólisis post-polimerización de las unidades monoméricas anhídrido maleico. En modalidades específicas, las especies cargables que son aniónicas a pH fisiológico normal son ácidos carboxílicos tales como, pero no limitados a, ácido 2-propilacrílico o, más precisamente, la unidad constitucional derivada de éste, el cido 2-propilpropiónico, -CH2C( (CH2)2CH3) (COOH) (PAA) .
En algunas modalidades, la especie cargable es catiónica. En ciertas modalidades, la especie cargable es catiónica a pH fisiológico. En modalidades específicas, las especies catiónicas a pH fisiológico son especies nitrogenadas tales como amonio, -NRR'R", guanidinio ( -NRC (=NR'H) +NR"R' " , incluyendo las formas canónicas), en donde los grupos R son independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo o dos grupos R enlazados al mismo o a átomos de nitrógeno adyacentes pueden ser también unidos uno con el otro para formar una especie heterocíclica tal como, pero no limitada a pirrol, imidazol, pirimidina, o indol .
En algunas modalidades, la especie cargable está presente en unidades monoméricas zwiteriónicas (por ejemplo, en donde una especie aniónica y una especie catiónica cargables están presentes en la misma unidad monomérica) .
En ciertas modalidades, el bloque de núcleo comprende al menos una unidad monomérica, grupo, o especie no cargable. En algunas modalidades, unidad monomérica no cargable es hidrofóbica o comprende un grupo o especie hidrofóbica. En ciertas modalidades, el grupo hidrofóbico tiene un valor p de aproximadamente 1, o más; aproximadamente 2 , o más ; aproximadamente 3 , o más ; aproximadamente 4, o más; aproximadamente 5, o más; o similar. En modalidades especificas, la unidad monomérica no cargable es, a manera de ejemplo no limitante, un etacrilato de (alquilo de C2-C8 )-, un metacrilato de (alquilo de C2-C8 )-, o un acrilato de (alquilo de C2-C8 ) .
En algunas modalidades, los copolímeros en bloque comprenden una pluralidad de especies hidrofóbicas . En algunas modalidades, el copolímero en bloque comprende unidades monoméricas hidrofóbicas . En ciertas modalidades, la unidad monomérica hidrofóbica es un compuesto aromático o heteroaromático sustituido con vinilo. En modalidades específicas adicionales, los monómeros hidrofóbicos son (alquil) acrilatos de alquilo. En modalidades específicas, el monómero hidrofóbico es un derivado de estireno .
En algunas modalidades, se proporciona en la presente el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana que tiene un peso molecular promedio en número (Mn) de aproximadamente 2,000 daltones a aproximadamente 250,000 daltones; 2,000 daltones a aproximadamente 100,000 daltones; aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 100,000 daltones; aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones; o aproximadamente 10,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones.
Bloque de Envoltura | En algunas modalidades, el bloque de envoltura de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, es hidrofílico. En algunas modalidades, el bloque de envoltura de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, es hidrofílico y no cargado a un pH aproximadamente fisiológico, por ejemplo pH 7.4. En algunas modalidades, el bloque de envoltura de un polímero desestabilizador de la membrana descrito en la presente, es hidrofílico y cargado a un pH aproximadamente fisiológico, por ejemplo pH 7.4. En algunas modalidades, el bloque de envoltura del polímero desestabilizador de la membrana comprende al menos una especie, grupo, o unidad monoraérica hidrofílica (por ejemplo, no cargada, catiónica, aniónica, o zwiteriónica) . En modalidades específicas, el bloque de envoltura del polímero desestabilizador de la membrana comprende al menos una especie, grupo, o unidad monomérica cargable. En modalidades específicas, la especie, grupo, o unidad monomérica cargable es cargada o cargable a una especie, grupo, o unidad monomérica catiónica. En otras modalidades específicas, la especie, grupo, o unidad monomérica cargable es cargada o cargable a una especie, grupo, o unidad monomérica aniónica. En modalidades específicas, la especie, grupo, o unidad monomérica cargable es cargada o cargable a una especie, grupo, o unidad monomérica zwiteriónica . Se debe entender que tales bloques de envoltura incluyen especies, grupos, y/o unidades monoméricas en donde ninguna, algunas o todas de las especies, grupos o unidades monoméricas cargables están cargadas.
En algunas modalidades, el bloque de envoltura de un polímero desestabilizador de la membrana es independiente de la temperatura.
En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es no cargado a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana está también no cargado a pH aproximadamente endosomal .
En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es policatiónico a ün pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es también policatiónico a pH aproximadamente endosomal.
En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es polianiónico a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas1, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es también polianiónico a pH aproximadamente endosomal.
En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es zwiteriónico a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es también zwiteriónico a pH aproximadamente endosomal.
En algunas modalidades, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es un bloque homopolimérico . En ciertas modalidades, un bloque de envoltura homopolimérico comprende unidades monoméricas cargables, catiónicas, en donde algunas de las unidades monoméricas cargables catiónicas son catiónicas, y en donde otras de las unidades monoméricas cargables catiónicas son no cargadas. En modalidades adicionales o alternativas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es heteropolimérico . En modalidades específicas, un bloque de envoltura heteropolimérico comprende unidades monoméricas cargables catiónicas y unidades monoméricas no cargables. En ciertas modalidades, un bloque de envoltura homopolimérico comprende unidades monoméricas cargables aniónicas, en donde algunas de las unidades monoméricas cargables aniónicas son aniónicas, y en donde otras de las unidades monoméricas cargables aniónicas son no cargadas . En modalidades adicionales o alternativas, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es heteropolimérico. En modalidades específicas, un bloque de envoltura heteropolimérico comprende unidades monoméricas cargables aniónicas y unidades monoméricas no cargadas . Las unidades monoméricas no cargadas incluyen, por ejemplo, residuos de olefinas polioxiladas , tales como PEGMA, residuos de hidroxi-alquil-olefinas , tales como HPMA, residuos de tiol-alquil-olefinas o similares.
En algunas modalidades, las especies, grupos o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son especies, grupos, o unidades monoméricas que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, !a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, estas especies, grupos, o unidades monoméricas cargablés en el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana están cargadas por adición de un H+, a una especie catiónica. En modalidades adicionales o alternativas, las especies, grupos o unidades i monoméricas cargablés en el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son especies, grupos, o unidades monoméricaé que son al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos|50%, i al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, o al menos 95% positivamente cargadas a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5, o menos; aproximadamente 6.2, o menos ; aproximadamente 6 , o menos ; aproximadamente 5.9, o menos ; aproximadamente 5.8, o menos ; o pH aproximadamente endosomal) . ' i En algunas modalidades, la especie cargable aniónica es cualquier residuo de ácido orgánico o inorgánico que está opcionalmente presente, ya sea como una especie protegida, por ejemplo, un éster, o como el ácido libre, en el proceso de polimerización seleccionado.; En algunas modalidades, la especie cargable aniónica es un ácido débil, tal como pero no limitado a, los siguientes grupos: ácido borónico, sulfonamida, ácido fosfónico, ácido arsénico, ácido fosfínico, fosfato, ácido carboxílico, xantenos, tetrazol o sus derivados (por ejemplo ásteres) . En ciertas modalidades, los monómeros tales como el anhídrido maleico, (Scott M . Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Alian S. Hoffman, y Patrick S. Stayton pH-Responsive Poly (styrene-alt-maleic anhydride) Alkilamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414) son utilizados para la introducción de la primera especie cargable mediante hidrólisis postpolimerización de las unidades monoméricas de anhídrido maleico. En modalidades específicas, las especies cargables que son aniónicas a pH fisiológico normal, son ácidos carboxílieos tal como, pero no limitados a, ácido 2-propilacrílico o, más precisamente, la unidad constitucional derivada de éste, el ácido 2-propilpropiónico, -CH2C ( (CH2) 2CH3) (COOH) (PAA).
En algunas modalidades, el bloque de envoltura es catiónico a pH fisiológico o casi fisiológico (por ejemplo, el pH de plasma humano en circulación) . En algunas modalidades, el bloque de envoltura comprende un policatión. En algunas modalidades, el bloque de envoltura es enlazado a un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido, tal como el AR si) el cual es un polianión que comprende x aniones, y el bloque de envoltura policatiónico comprende aproximadamente 0.6 x, aproximadamente 0.7 x, aproximadamente 0.8 x, aproximadamente 0.9 x, aproximadamente 1.0 j x, aproximadamente 1.1 x cationes, o más. En modalidades específicas, el agente terapéutico (por ejemplo,' un I polinucleótido, tal como el ARNsi) es polianipnico i comprendiendo x aniones, y el bloque de envoltura j policatiónico comprende aproximadamente 0.7- x cationes, o más . I En algunas modalidades, la especie cargable es catiónica. En ciertas modalidades, la especie cargable es catiónica a pH fisiológico. En modalidades específicas, las especies catiónicas a pH fisiológico son especies nitrogenadas tales como amonio, -NRR'R", guanikinio ( -NRC (=N ' H) +NR"R 1 " , incluyendo las formas canónicas)], en donde los grupos R son independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo o dos grupos R enlazados al i mismo o a átomos de nitrógeno adyacentes pueden ser también unidos uno con el otro para formar una especie heterocíclica tal como, pero no limitada a pirrol, i imidazol, pirimidina, o indol . En algunas modalidades, el bloque de envoltura es una poliamida que se enlaza al ácido nucleico, un intercalador, o un oligonucleótido formadpr de dúplex o de triplex. En ciertos casos, el bloque de envoltura es opcionalmente el bloque de extremo o¡, o el bloque de extremo ? del copolímero en bloque (por ejemplo, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana) . De igual modo, el bloque de núcleo es opcionalmente el bloque de extremo a, o el bloque de extremo ? del copolímero en bloque (por ejemplo, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana) .
En algunas modalidades, la especie cargable está presente en unidades monoméricas zwiteriónicas (por ejemplo, en donde una especie aniónica y una especie catiónica cargables están presentes en la misma unidad monomérica) .
En modalidades específicas, la unidad monomérica cargable del bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es una base de Bronsted. En ciertas modalidades, la especie o grupo cargable del bloque de envoltura es una amina (incluyendo, por ejemplo, aminas no cíclicas y cíclicas) . En algunas modalidades, la segunda unidad monomérica cargable es una unidad monomérica que comprende una amina, tal como, a manera de ejemplo no limitante, N, -di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de x-C3) -etacrilato, N, N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de d-C6) -metacrilato, o N,N-di (alquil de Ci-C6) -amino (alquil de Ci-C6) -acrilato . En algunas modalidades, la unidad monomérica cargable del bloque de envoltura es una unidad monomérica que comprende un heterociclo nitrogenado, por ejemplo, un imidazol o piridina.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente el bloque de envoltura del copolímero en bloque °desestabilizador de la membrana que tiene un peso molecular promedio en número (Mn) de aproximadamente 1,000 daltones a aproximadamente 200,000 daltones; 1,000 daltones a aproximadamente 100,000 daltones; aproximadamente 3,000 daltones a aproximadamente 100,000 daltones; aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones; aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 25,000 daltones; o aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 20,000 daltones.
En modalidades especificas, el bloque de envoltura del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana está no cargado e hidrofílico a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En ciertas modalidades, el bloque de envoltura hidrofílico está libre o sustancialmente libre de grupos cargables. En algunas modalidades, un bloque de envoltura hidrofílico no cargado comprende o es polietilenglicol (PEG) , óxido de polietileno (PEO) o similares.
En ciertas modalidades, el bloque de envoltura del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana comprende un grupo de funcionalización (por ejemplo, un grupo de solubilización) . En modalidades específicas, el grupo de funcionalización es un grupo polietilenglicol (PEG) . En ciertas modalidades, el bloque de envoltura comprende grupos polietilengilcol (PEG) , cadenas o bloques con pesos moleculares de aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 30,000. En algunas modalidades, el PEG es una parte de (por ejemplo, incorporada dentro de) la cadena de bloque de envoltura. En ciertas modalidades, el PÉG es incorporado dentro de la cadena del bloque de envoltura durante la polimerización. En algunas modalidades, el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es PEG. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente los montajes micelares que comprenden un primer copolímero en bloque desestabilizador de la membrana con un bloque de envoltura policatiónico, y un segundo copolímero en bloque desestabilizador de la membrana con un bloque de envoltura de PEG. En ciertas modalidades, una o más unidades monoméricas del bloque de envoltura están sustituidas o funcionalizadas con un grupo PEG. En algunas modalidades, PEG es conjugado a los grupos extremos del copolímero en bloque, o a uno o más grupos modificables sobresalientes, presentes en un montaje micelar proporcionado en la presente. En algunas modalidades, los residuos de PEG son conjugados a grupos modificables dentro del segmento o bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) o un polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque) de un montaje micelar proporcionado en la presente. En ciertas modalidades, un monómero que comprende un residuo PEG es co-polimerizado para formar la porción hidrofílica del polímero que forma el montaje micelar proporcionado en la presente.
Segmento/Bloque Hidrofílico de Protección En ciertas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente comprenden uno o más agentes de protección. En algunas modalidades, el bloque/segmento portador polinucleotídico comprende una unidad monomérica sustituida con PEG (por ejemplo, el PEG es una cadena lateral y no comprende la cadena principal del bloque portador polinucleotídico) . En algunos casos, uno o más de los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque) utilizados en los montajes micelares descritos en la presente, comprenden cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 30,000. En algunas modalidades, el PEG es conjugado a los grupos extremos del polímero, o a uno o más grupos modificables sobresalientes presentes en un polímero de un montaje micelar proporcionado en la presente. En algunas modalidades, los residuos de PEG son conjugados a grupos modificables dentro del segmento o bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) de un polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque) de un montaje micelar proporcionado en la presente. En ciertas modalidades, un monómero que comprende un residuo de PEG de 2-20 unidades óxido de etileno es copolimerizado para formar la porción- hidrofílica del polímero que forma un montaje micelar proporcionado en la presente.
En algunos casos, un agente de protección aumenta la estabilidad del agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido o péptido, etc.) contra la digestión enzimática en plasma. En algunos casos, un agente de protección reduce la toxicidad de los montajes micelares descritos en la presente (por ejemplo, el copolímero en bloque enlazado a los polinucleótidos) . En algunas modalidades, un agente de protección comprende una pluralidad de residuos monoméricos hidrofílicos neutros. En algunos casos, un polímero de protección! es covalentemente enlazado a un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana a través de un grupo extremo del polímero. En algunas modalidades, un agente de protección es una porción sobresaliente covalentemente enlazada, acoplada a uno o más residuos monoméricos del polímero. En algunas modalidades, una pluralidad de residuos monoméricos en un montaje micelar descrito en la presente, comprenden especies de protección sobresalientes (por ejemplo, un oligómero de polietilenglicol (PEG) j (por ejemplo, que tiene 20 o menos unidades repetidas) o polímero (por ejemplo, que tiene más de 20 unidades repetidas) ) covalentemente acoplado a través de un grupo funcional al oligómero o polímero de polietilenglicol. En algunos casos, un copolímero en bloque comprendé un oligómero o polímero de polietilenglicol (PEG) covalentemente acoplado al extremo alfa o al extremo bmega del bloque de desestabilización de la membrana del copolímero .
En ciertas modalidades, el bloque/segmento portador polinucleotídico comprende una unidad monomérica que sirve para proteger o blindar, al menos en parte, la carga (por ejemplo, cargas catiónicas) sobre el bloque/segmento portador polinucleotídico. En modalidades particulares, la protección o blindaje surge, al menos en parte, a partir de una porción sobresaliente sobre la unidad monomérica que comprende, al menos parte, del bloque/segmento portador polinucleotídico. Tal protección opcionalmente disminuye la toxicidad celular a partir de las cargas excesivas en este segmento.
Agentes Terapéuticos Proporcionado en ciertas modalidades de la presente, está un montaje micelar que comprende al menos un reactivo de investigación, al menos un agente de diagnóstico, al menos un agente terapéutico, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, tales agentes terapéuticos están presentes en la envoltura del montaje micelar, en el núcleo del montaje micelar, sobre la superficie del montaje micelar, o una combinación de los mismos.
En diversas modalidades, los reactivos de investigación, agentes de diagnóstico, y/o agentes terapéuticos están enlazados al montaje micelar o a los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana de los mismos de cualquier manera apropiada. En modalidades específicas, el enlace es logrado a través de enlaces covalentes, interacciones no covalentes, interacciones estáticas, interacciones hidrofóbicas, o similares, o combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, los reactivos de investigación, agentes de diagnóstico, y/o agentes terapéuticos están enlazados a un bloque de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana. En ciertas modalidades, los reactivos de investigación, agentes de diagnóstico, o agentes terapéuticos forman el bloque de envoltura de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana. En algunas modalidades, los reactivos de investigación, agentes de I diagnóstico, o agentes terapéuticos están en la envoltura del montaje micelar.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende un primer agente terapéutico en la envoltura del montaje micelar y un segundo agente terapéutico en el núcleo del montaje micelar. En modalidades especificas, el primer agente terapéutico es un polinucleótido . Y el segundo agente terapéutico es un fármaco hidrofóbico. En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende un fármaco hidrofóbico (por ejemplo, fármaco hidrofóbico de molécula pequeña) en el núcleo del montaje micelar.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende al menos 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 50 agentes terapéuticos.1 En algunas modalidades, se proporciona en la presente una composición que comprende una pluralidad de montajes micelares descritos en la presente, en donde los montajes micelares en la presente comprenden, en promedio, al menos 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 50 agentes terapéuticos.
En algunas modalidades, los agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, etc., se seleccionan de, a manera de ejemplo no limitante, al menos un nucleótido (por ejemplo, un polinucleótido) , al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido (por ejemplo, un péptido) . En modalidades específicas, el agente terapéutico es un polinucleótido, un oligonucleótido, un modulador de la expresión del gen, un agente de knockdown, un AR si, un agente de AR i, un substrato cortador, un ARNmi, un ARNsh, un oligonucleótido antisentido, o un aptámero. En otras modalidades específicas, el agente terapéutico es un AR ai (Asymmetric RNA duplexes medíate RNA interference in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A Rogoff, Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379 - 1382 (2008)). En ciertas modalidades, el agente terapéutico es una proteína, péptido, proteína dominante negativa, enzima, anticuerpo, o fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, el agente terapéutico es un carbohidrato, o una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Daltones.
En ciertas modalidades, uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es enlazado a un agente terapéutico. En algunas modalidades, uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es enlazado a un primer agente terapéutico, y en donde uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es enlazado a un segundo agente terapéutico. En ciertas modalidades, uno o más de la pluralidad de copolimeros en bloque desestabilizadores j de la membrana es enlazado a un primer agente terapéutico, y en donde uno o más de los polímeros adicionales j está enlazado a un segundo agente terapéutico.
En algunas modalidades, la envoltura del montaje micelar y/o bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato, o al menos un aminoácido. En ciertas modalidades, la envoltura del montaje micelar y/o el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizaciores de la membrana, comprende un polinucleótido, ¡ un oligonucleótido, un modulador de la expresión del geiji, un agente de knockdown, un ARNsi, un agente de AR ij, un substrato cortador, un AR mi, un ARNsh, un oligonucleótido antisentido, o un aptámero, un agente terapéutico proteico, una proteína, un péptido, una enzima, una hormona, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un carbohidrato, una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Daltones, o una combinación de| los mismos .
En algunas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente comprenden un polinucleótido, en donde el polinucleótido es vector de expresión de mamífero. En otra modalidad más, los montajes micelares descritos en la presente comprenden un polinucleótido que está diseñado para recombinarse con y corregir una secuencia de gen endógena en un humano. En algunas modalidades > un polinucleótido proporcionado en un montaje micelar descrito en la presente es un modulador de la expresión del gen.
Un vector de expresión de mamífero comprende una secuencia de ADN complementaria (un "ADNc" o minigen) que está funcionalmente enlazado a una región promotora, tal que el promotor impulsa la expresión del ADNc. En ciertos casos, los vectores de expresión de mamífero también comprenden una señal de poliadenilación en el extremo 3 ' del ADNc. Una región promotora es un segmento nucleotídico que es reconocido por una molécula ARN-polimerasa, con el fin de iniciar la síntesis del ARN (por ejemplo, la transcripción) , y puede también incluir otros elementos regulatorios transcripcionales tales como los aumentadores . Cualquier número de secuencias reguladoras transcripcionales pueden ser utilizadas para mediar la expresión de los genes enlazados en vectores de expresión de mamífero. Los promotores incluyen, pero no están limitados a promotores retrovirales , otros promotores virales tales como aquellos derivados de HSV o CMV, y promotores provenientes de los genes celulares endógenos. Los vectores de expresión de mamífero también tienen típicamente un origen de replicación proveniente de E. Coli, para hacer posible la propagación como plásmidos en bacterias.
En ciertos casos, es deseable ser capaces de introducir vectores de expresión de mamífero dentro de células de mamífero en cultivo o in vivo. En algunas modalidades, los vectores de expresión son transíectadós en células de mamífero utilizando los montajes miceiares proporcionados en la presente.
Como se describe en la presente, los montajes miceiares proporcionados en la presente son utilizados, en algunas modalidades, para la distribución de polinucleótidos dentro de una célula o a un individuo en necesidad de los mismos. En ' ciertas modalidades,, los bloques policatiónicos del montaje micelar (por ejemplo, los bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana descritos en la presente) se enlazan al ADN vector de expresión de mamífero y forma complejos del ADN con el montaje micelar. En ciertos casos, los policationes se enlazan a, y forman complejo con los vectores de expresión de mamífero de ADN. En algunas modalidades, un montaje micelar que comprende un complejo polinucleotídico es neutralizado en cargas (por ejemplo, la envoltura del montaje micelar o el bloque de envoltura de un polímero del montaje micelar y el polinucleótido son sustancialmente neutralizados en carga) . Dependiendo de la longitud del polinucleótido, la longitud del bloque policatiónico es opcionalmente ajustada para proporcionar neutralización de carga para el polinucleótido. En algunos casos, la neutralización de carga es lograda mediante la adición de cationes y/o policationes dentro de la formulación. En algunas modalidades, un montaje micelar que comprende un polímero y un polinucleótido (por ejemplo, un 200+mer) es luego diluido como sea necesario en un amortiguador apropiado y agregado directamente a las células en cultivo. La expresión del gen transfectado o el ADNc en las células resultantes puede ser fácilmente medida mediante la inclusión, en el vector de expresión de mamífero de un cásete de expresión que impulsa un gen indicador tal como la luciferasa, la cloramfenicol-acetil-transferasa o GFP. Estos genes son fácilmente disponibles y los ensayos reporteros son descritos .
En algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son utilizados para la terapia génica. El tratamiento de las enfermedades y trastornos mediante terapia génica involucra en general la transferencia de nueva información genética dentro de las células. Los "vectores de terapia génica" comprenden el nuevo material genético que va a ser distribuido, el cual está, opcionalmente, en un vector de expresión de mamífero. Los usos de montajes micelares incluyen la distribución de secuencias de ADN para el reemplazo de genes, la inhibición de la expresión de genes, la corrección de genes o el aumento de genes, o la introducción de genes para tener algún otro efecto deseado, tal como la modulación de las respuestas inmunitarias . La inhibición de la expresión de genes es lograda de cualquier manera adecuada, incluyendo, a manera de ejemplo no limitante, mediante la expresión de casetes de genes en las células que expresan los ARNsh u otros agentes de ARNi .
En algunas modalidades, los montajes micelares que tienen un bloque de envoltura policatiónico son mezclados con vectores de terapia génica, tal que éstos se llegan a enlazar al montaje micelar. El complejo montaje micelar-vector de terapia génica, en un excipiente adecuado (ver más adelante) es luego administrado a un sujeto vivo mediante las rutas que incluyen, pero no limitadas a intravenosa, intra-articular, intratecal, intracraneal, inhalación, subcutánea o intraocular. ¡ En modalidades específicas, un montaje micelar proporcionado en la presente comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son útiles para distribuir polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a un individuo en necesidad de los mismos. En modalidades específicas, se proporciona en la presente un montaje micelar que comprende al menos 2, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100 polinucleótidos. En algunas modalidades, el montaje micelar proporcionado en la presente comprende 2-50 polinucleótidos, 5-40 polinucleótidos, 5-30 polinucleótidos, 5-25 polinucleótidos, 20-40 polinucleótidos, o similares.. En ciertas modalidades, el polinucleótido es un modulador de la expresión del gen de oligonucleótido . En modalidades adicionales, el polinucleótido es un agente de knockdown de oligonucleótido. En modalidades específicas, el polinucleótido es un agente ARNi, substrato cortador, o AR si. En ciertas modalidades, el montaje micelar es una nanopartícula (por ejemplo, un micela) que comprende un núcleo, una envoltura y uno o más polinucleótidos, en donde el polinucleótido no está en el núcleo del montaje micelar. En modalidades específicas, el polinucleótido es incorporado dentro (por ejemplo, está presente en y/o forma una porción de) la envoltura del montaje micelar. En algunas modalidades, uno o más polinucleótidos (por ejemplo, el oligonucleótido o ARJSTsi) es enlazado al bloque de envoltura de un polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana, o un polímero diluyente/portador no desestabilizador de la membrana) del montaje micelar. En diversas modalidades, el enlace es logrado a través de uno o más enlaces covalentes, una q más interacciones no covalentes, o una combinación de' las mismas. En algunas modalidades, el A Nsi es covalentemente j enlazado a un bloque hidrofóbico del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana (por ejemplo, un bloque de núcleo) . En modalidades específicas, el ARNsi es covalentemente enlazado a un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque de núcleo) del copolímero en bloque y forma al menos una porción de la envoltura del montaje micelar. En modalidades más específicas, el ARNsi es un i bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) del copolímero en bloque. En otras modalidades, el ARNsi es enlazado al bloque hidrofílico de un copolímero en bloque, o a un bloque polimérico opcional (por ejemplo, un bloque espaciador) . ! En algunas modalidades, uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) es enlazado a un copolímero en bloque proporcionado en la presente de cualquier manera apropiada, por ej emplo, mediante asociación no covalente. La asociación no covalente entre (i) un polímero y/o un montaje de polímeros proporcionado en la presente (por ejemplo, una micela formada por una pluralidad de polímeros) y (ii) uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, el oligonucleótido) es lograda de cualquier manera apropiada, incluyendo, pero no limitado a, interacción electrostática (incluyendo interacción electrostática con un polímero que tiene grupos catiónicos y un agente terapéutico que tiene grupos aniónicos) , interacción hidrofóbica, interacción de afinidad, o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, uno o más agentes terapéuticos y/o los i polímeros del montaje micelar (por ejemplo, micela) es modificado con porciones químicas que proporcionan uno o más agentes y/o polímeros terapéuticos que tienen una afinidad uno por el otro, tal como el ácido arilborónico-ácido salicilhidroxámico, cremallera de leucina u otras porciones peptídicas, interacciones iónicas entre cargas positivas y negativas sobre la micela y el agente terapéutico, u otros tipos de enlaces de afinidad química no covalentes . Además, en algunas modalidades, un polinucleótido de doble hebra está asociado con (por ejemplo, formado en complejo con) un polímero o montaje micelar (por ejemplo, micela) descrito en la presente. En algunas modalidades, un polímero o montaje micelar (por ejemplo, micela) está asociado (por ejemplo, formado en complejo) con un agente de enlace al canal menor de ácido nucleico, o un agente de intercalación que está enlazado (por ejemplo, covalentemente) a un componente (por ejemplo, un polímero) del montaje micelar (por ejemplo, micela) .
En algunas modalidades, el agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido) comprende al menos una carga negativa (por ejemplo, comprende una cadena principal negativamente cargada) y está asociado con una envoltura catiónica del montaje micelar (por ejemplo, micela) y/o un bloque de envoltura catiónico de un copolímero en bloque del montaje micelar. En modalidades específicas, la envoltura catiónica o el bloque de envoltura al menos neutraliza parcialmente las cargas negativas presentes en uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos) enlazados a o presentes en el montaje micelar. En ciertas modalidades, uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, uno o más oligonucleótidos, uno o más AR si, o una combinación de los mismos) forma una i asociación (por ejemplo, un complejo) con los bloqués de envoltura policatiónicos del montaje micelar (por ejemplo, micela) . En algunas modalidades, la asociación ' (por ejemplo, el complejo) entre el montaje micelar (por ejemplo, la micela) y el agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) forma a cualquier proporción de carga deseada del copolímero en bloque que forma el montaje micelar (por ejemplo, micela) al agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi), por ejemplo, entre 1:1 y 16:1. En modalidades específicas, el complejo entre la micela y el AR si se forma a la proporción de carga de 2:1, 4:1 u 8:1. En otras palabras, en algunas modalidades, la proporción del número de cargas catiónicas presentes en la envoltura del montaje micelar al número de cargas aniónicas presentes en el agente terapéutico es cualquier valor deseado, por ejemplo, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 16:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 4:1, o aproximadamente 8:1. En algunas modalidades, el ARNsi es neutralizado en carga por un bloque policatiónico de un copolímero en bloque que forma el montaje micelar. Por ejemplo, en algunas modalidades específicas, un polinucleótido de 20 pares de bases (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) que comprende 40 cargas negativas a pH fisiológico, está asociado (por ejemplo, formado en complejo) con un montaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende un bloque de envoltura poliDMAEMA (80 unidades monoméricas en longitud, PM=11,680) con un pKa de aproximadamente 7.4. A este pH, el poliDMAEMA contiene 40 cargas negativas, con lo cual da como resultado la asociación polinucleótido-bloque de envoltura (por ejemplo, complejo) que es sustancialmente neutro neto en carga. En ciertos casos, evitar un gran número de cargas positivas en exceso ayuda a reducir la toxicidad in vitro e in vivo. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) se asocia espontáneamente con una envoltura positivamente cargada de un montaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente.
En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) está químicamente conjugado al montaje micelar (por ejemplo, micela) y/o a uno o más polímeros del montaje micelar (por ejemplo, micela) mediante cualquier técnica de conjugación química adecuada. Los agentes terapéuticos son opcionalmente conjugados a un extremo del polímero, o a una cadena lateral sobresaliente del polímero. En algunas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) que contienen un agente ARNi se forman mediante conjugación del agente ARNi con un montaje micelar ya formado (por ejemplo, micela) que comprenden una pluralidad de polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque) . En otras modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) que contienen un agente ARNi se forma mediante conjugación del agente ARNi con un polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana) y subsecuentemente forman el montaje micelar (por ejemplo, micela) de cualquier manera apropiada, por ejemplo, mediante autoensamblaj e de los conjugados resultantes dentro de un montaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende el agente ARNi . En diversas modalidades, tal montaje micelar opcionalmente comprende además polímeros no conjugados (por ejemplo, copolímeros en bloque) que son similares, idénticos, o diferentes a aquellos conjugados al agente AR i. El enlace covalente entre un polímero y un agente terapéutico de un montaje micelar descrito en la presente es, opcionalmente, no escindible, o escindible. En ciertas modalidades, un precursor de uno o más agentes ARNi (por ejemplo un sustrato portador) es enlazado al montaje micelar (por ejemplo, micela) o a las unidades poliméricas del montaje micelar (por ejemplo, la micela por un enlace no escindible) . En algunas modalidades, uno o más agentes ARNi son enlazados a través de un enlace escindible. En ciertas modalidades, los enlaces escindibles utilizados en los montajes micelares descritos en la presente incluyen, a manera de ejemplo no limitante, enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro que se disocian en el ambiente reductor del citoplasma) . En algunas modalidades, la asociación covalente entre un montaje micelar (incluyendo los componentes del mismo) y un agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNsi o péptido) es logrado a través de cualquier método de conjugación química adecuado, incluyendo pero no limitado a enlazadores amino-carboxilo, enlazadores amino-sulfhidrilo, enlazadores amino-carbohidrato, enlazadores amino-hidroxilo, enlazadores amino-amina, enlazadores carboxil-sulfhidrilo, enlazadores carboxil-carbohidrato, enlazadores carboxil-hidroxilo, enlazadores carboxil-carboxilo, enlazadores sulfhidril-carbohidrato, enlazadores sulfhidril-hidroxilo, enlazadores sulfhidril-sulfhidrilo, enlazadores carbohidrato-hidroxilo, enlazadores carbohidrato-carbohidrato, y enlazadores hidroxil-hidroxilo. En algunas modalidades, la conjugación es también realizada con enlaces o enlazadores sensibles al pH, incluyendo, pero no limitados a, enlaces hidrazona y acetal. Cualquier otro método de conjugación apropiado es opcionalmente utilizado también, por ejemplo una variedad grande de químicas de conjugación están disponibles ¡(ver, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds, Macmillan, 1998 y capítulos en éste) .
En modalidades específicas, el agente distribuido por medio del montaje micelar proporcionado en la presente, es un agente de diagnóstico. En algunas modalidades, el agente de diagnóstico es un agente de formación de imagen de diagnóstico, por ejemplo, un agente útil en la formación de imagen del sistema vascular de mamífero que incluye pero no está limitado a agentes de tomografía de emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) , agentes de tomografía computarizada (CT, por sus siglas en inglés) , agentes de formación de imagen de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) , agentes de formación de imagen de magnética nuclear (NMI, por sus siglas en inglés) , agentes de fluoroscopía y agentes de contraste de ultrasonido. Tales agentes de diagnóstico incluyen radioisótopos de elementos tales como yodo (I) , incluyendo 123i, 125i, 131i, etc., bario (Ba) , gadolinio (Gd) , tecnecio (Te), incluyendo 99Tc, fósforo (P) , incluyendo 31P, hierro (Fe) , manganeso (Mn) , talio (Ti) , cromo (Cr) , incluyendo 51Cr, carbono (C) , incluyendo 14C, o similares, compuestos fluorescentemente marcados, o sus complejos, quelatos, aductos y conjugados. En otras modalidades, el agente de diagnóstico es un gen marcador que codifica para proteínas que son fácilmente detectables cuando son expresadas en una célula (incluyendo, pero no limitada a, ß-galactosidasa, proteína fluorescente verde, luciferasa, y similares) y sondas de ácido nucleico marcadas (por ejemplo, sondas radiomarcadas o fluorescentemente marcadas) . En algunas modalidades, la conjugación covalente de los agentes de diagnóstico a los montajes micelares proporcionados en la presente, es lograda de acuerdo a una variedad de procesos de conjugación. En otras modalidades, el agente de diagnóstico es no covalentemente asociado con el montaje micelar proporcionado en la presente, mediante la formación de complejo con un residuo quelante (por ejemplo, un residuo de ácido carboxílico) incorporando dentro los copolímeros en bloque que forman el montaje micelar. En algunas modalidades, un monómero radiomarcado (por ejemplo, un monómero marcado con 14C) es incorporado dentro de la cadena principal polimérica del montaje micelar (por ejemplo, el bloque de envoltura o el bloque de núcleo de la micela) . En algunas modalidades, un montaje micelar asociado con un agente de diagnóstico comprende una porción de dirección al objetivo.
En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente proteico. La conjugación de agentes terapéuticos proteicos (por ejemplo, un polipéptido) a los montajes micelares proporcionados en la presente, es lograda de acuerdo a una variedad de procesos de conjugación mediante una reacción química que involucra uno o más de los grupos funcionales del agente terapéutico proteico (por ejemplo, un polipéptido) con uno o más de los grupos funcionales presentes en el montaje micelar (por ejemplo, en la envoltura del montaje micelar o sobre una unidad monomérica del bloque de envoltura) . Los grupos funcionales polipeptídicos que están usualmente involucrados incluyen, pero no están limitados a los grupos amino, hidroxilo, tiol, o carboxilo. Tales grupos pueden estar presentes como un grupo terminal o presentes sobre las cadenas laterales de aminoácidos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos proteicos son manipulados por ingeniería para contener aminoácidos no naturales que comprenden grupos funcionales especiales para la formación de conjugados específicos del sitio, por ejemplo, grupos azido para la conjugación vía la química "click" .
En ciertas modalidades, un conjugado de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido) con un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) , en donde el polímero es un unímero o está presente en un montaje i micelar ensamblado, proporcionado en la presente ; se prepara de acuerdo a un proceso que comprende los siguientes dos pasos: (1) la activación de un grupo extremo modificable (por ejemplo, 5'- o 31 -hidroxilo o ) de un oligonucleótido utilizando cualquiera de los reactivos de activación adecuados, tales como pero no limitados a 1-etil-3 , 3 -dimetilaminopropil-carbodiimida (EDAC) , imidázol, N-hidrosuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (Í)CC) , HOBt (1-hidroxibenzotriazol) , p-nitrofenilcloroformiato, carbonildiimidazol (CDI) , y carbonato de ?,?'-disuccinimidilo (DSC) ; y (2) enlazar covalentemente un copolímero en bloque al extremo del oligonucleótido. En algunas modalidades, los grupos modificables en el extremo 5'- o 3'- de un oligonucleótido son sustituidos por otros grupos funcionales antes de la conjugación con el copolímero en bloque. Por ejemplo, el grupo hidroxilo (-- OH) es opcionalmente sustituido con un ligador que posee un grupo sulfhidrilo (--SH), grupo carboxilo (--COOH), o grupo amina ( - -NH2) .
En otra modalidad más, un oligonucleótido que comprende un grupo funcional introducido dentro de una o más de las bases (por ejemplo, una 5-aminoalquilpirimidina) , es conjugado a un polímero (por ejemplo, el copolímero en bloque) , en donde el polímero es un unímero o está presente en un montaje micelar, proporcionado en la presente utilizando un agente de activación o un ligador bifuncional reactivo de acuerdo a cualquier procedimiento adecuado. Una variedad de tales agentes de activación y enlazadores bifuncionales es comercialmente disponible de proveedores tales como Sigma, Pierce, Invitrogen y otros.
En algunas modalidades, el montaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende un oligonucleótido o una pluralidad de oligonucleótidos es formado por un autoensamblaj e espontáneo. El autoensamblaj e espontáneo del montaje micelar es logrado, en algunas modalidades, en un solo recipiente. Por ejemplo, en algunas modalidades, un montaje micelar (por ejemplo, una micela) autoensamblado mediante la dilución de una solución de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) descrito en la presente en un solvente orgánico (por ejemplo, etanol) con un medio acuoso (por ejemplo, agua o PBS) es combinado con uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) , el montaje micelar que comprende los polímeros y uno o más agentes terapéuticos que se forman espontáneamente por éstos. En otras modalidades, el autoensamblaj e espontáneo ocurre mediante (1) la puesta en contacto de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) de interés con un polímero (por ejemplo, el copolímero en bloque desestabilizador de la membrana, un copolímero en bloque no desestabilizador de la membrana, o un polímero monobloque) descrito en la presente, para formar así un conjugado polímero-agente terapéutico; y (2) someter el conjugado polímero-agente terapéutico a condiciones adecuadas para proporcionar el autoensamblaj e de los conjugados polímero-^agente terapéutico dentro de un montaje micelar descrito en la presente. En algunas modalidades, el paso de proporcionar el autoensamblaj e de los conjugados polímero-agente terapéutico comprende además poner en contacto los conjugados polímero-agente terapéutico con un polímero adicional (por ejemplo, un copolímero en bloque no conjugado o un polímero monobloque, o un polímero diluyente, o similares, o una combinación de los mismos) .
En algunas modalidades, cualquier montaje micelar descrito en la presente comprende además un polímero adicional que no es enlazado á un agente terapéutico. En algunas modalidades, el polímero adicional es un polímero diluyente o un polímero portador de la porción de dirección i al objetivo. En ciertas modalidades, cualquier montaje micelar proporcionado en la presente comprende además un polímero adicional que es enlazado al menos a un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un segundo agente terapéutico) . En ciertas modalidades, al menos un segundo agente terapéutico (por ejemplo, el segundo agente terapéutico) es diferente de al menos un agente terapéutico i (por ejemplo, un primer agente terapéutico) . En algunas modalidades, la porción de núcleo (por ejemplo, los blóques de núcleo) de todos los polímeros presentes en el montaje micelar son similares o idénticos. En ciertas modalidades, uno o más polímeros diferentes en el montaje midelar comprenden porciones de núcleo similares o idénticas ; (por ejemplo, bloques de núcleo) , pero porciones no nucleares diferentes (por ejemplo, bloques de envoltura) . | Terapia 1 En algunas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente son útiles en el tratamiento de un sujeto en riesgo para o afectado con trastornos asociados con y/o provocados por altos niveles plasmáticos o colesterol, apolipoproteína b, y/o colesterol LDL, por ejemplo hipercolesterolemia . En ciertas modalidades, el tratamiento comprende la provisión de un montaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un agente oligonucleotídico) , en donde el agente terapéutico silencia (por ejemplo, mediante escisión) un gen o un producto génico que promueve tal condición. En algunas modalidades, el agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido o agente ARNi) silencia el gen de la proprotexna convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9) responsable de la regulación de los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y su función, y de este modo los montajes micelares que comprenden tal agente terapéutico son utilizados para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PCSK9 , por ejemplo, los trastornos asociados con y/o provocados por altos niveles plasmáticos o colesterol, apolipoproteína b, y/o colesterol LDL, por ejemplo hipercolesterolemia. En algunas modalidades, los montajes micelares distribuyen el agente polinucleotídico de silenciamiento de PCSK9 (por ejemplo, el AR si) a una célula que expresa PCSK9. En algunas modalidades, la célula es una célula hepática.
En algunas modalidades, los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente son útiles en el tratamiento de un sujeto en riesgo de o afectado con la proliferación celular no deseada (por ejemplo, proliferación de células malignas o no malignas) . El tratamiento comprende la provisión de un montaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un agente oligonucleotídico) , en donde el agente terapéutico puede silenciar (por ejemplo, mediante escisión) un gen o un producto génico que promueve la proliferación celular no deseada; y administrar una dosis terapéuticamente efectiva del montaje micelar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) . En algunas modalidades, el agente terapéutico es un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido) que es homólogo a y puede silenciar (por ejemplo, mediante escisión) un gen.
En ciertas modalidades, el gen no está sino limitado a un factor de crecimiento o a un gen del receptor del factor de crecimiento, una fosfatasa, una cinasa, por ejemplo, una tirosina proteica, gen de la cinasa de serina o de treonina, un gen de la proteína adaptadora, un gen que codifica para una molécula de la superfamilia de proteína G, o un gen que codifica para un factor de transcripción. En algunos casos, el montaje micelar comprende un polinucleótido que silencia un gen que es expresado en un tejido u órgano específico, incluyendo, pero no limitado a pulmón, páncreas, hígado, riñon, ovario, músculo, piel, mama, colon, estómago, y similar.
En algunas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia uno o más de los siguientes genes: el gen beta de PDGF, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por expresión no deseada de PDGF beta, por ejemplo, cánceres testiculares y pulmonares; un gen de Erb-B (por ejemplo, Erb-B-2 o Erb-B-3), y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Erb-B, por ejemplo, cáncer de mama o de pulmón; el gen Src, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Src, por ejemplo, cánceres de colon; el gene CRK, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de CRK, por ejemplo, cánceres de colon y de pulmón; el gen GRB2 , y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de GRB2, por ejemplo, carcinoma de células escamosas; el gen RAS, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAS, por ejemplo, cánceres pancreáticos, de colon y de pulmón, y leucemia crónica; el gen MEKK, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MEKK, por ejemplo, carcinoma de células escamosas, melanoma o leucemia; el gen JNK, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de JNK, por ejemplo, cánceres pancreáticos o de mama; el gen RAF, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAF, por ejemplo, cáncer pulmonar o leucemia; el gen Erkl/2, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Erkl/2, por ejemplo, cáncer pulmonar; el gen PCNA(p21) , y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PCNA, por ejemplo, cáncer pulmonar; el gen MYB, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MYB, por ejemplo, cáncer de colon o leucemia mielogénica crónica; el gen MYC-c, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MYC-c, por ejemplo, linfoma de Burkitt o neuroblastoma; el gen JUN, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de JUN, por ejemplo, cánceres de ovario, de próstata o de mama; el gen FOS, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de FOS, por ejemplo, cánceres de piel o de próstata; el gen BCL-2, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de BCL-2, por ejemplo, cánceres de pulmón o de próstata o linfoma No Hodgkin; el gen de la Ciclina D, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la Ciclina D, por ejemplo, cánceres de esófago y de colon; el gen VEGF, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de VEGF, por ejemplo, cánceres de esófago y de colon; el gen EGFR, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de EGFR, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de la Ciclina A, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la Ciclina A, por ejemplo, cánceres pulmonar y cervical; el gen de la Ciclina E, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la Ciclina E, por ejemplo, cánceres pulmonar y de mama; el gen WNT-1, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de WNT-1, por ejemplo, carcinoma de células básales; el gen de la beta-catenina, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de beta-catenina, por ejemplo, adenocarcinoma o carcinoma hepatocelular; el gen MET-c, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MET-c, por ejemplo, carcinoma hepatocelular; el gen PKC, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PKC, por ejemplo, cáncer de mama; el gen NFKB, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de NFKB, por ejemplo, cáncer de mama; el gen STAT3 , y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de STAT3 , por ejemplo, cáncer de próstata; el gen de la survivina, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la survivina, por ejemplo, cánceres cervical o pancreático; el gen Her2/Neu, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Her2/Neu, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de la topoisomerasa I, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la topoisomerasa I, por ejemplo, cánceres de ovario y de colon; el gen de la topoisomerasa II alfa, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la topoisomerasa II, por ejemplo, cánceres de mama y de colon.
En otras modalidades, el agente oligonucleotídico silencia las mutaciones en uno de los siguientes genes: el gen p73, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p73, por ejemplo, adenocarcinoma colorrectal ; el gen p21 (WAF1/CIP1) , y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p21 ( AF1/CIP1) , por ejemplo, cáncer hepático; el gen p27(KIPl), y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p27(KIPl), por ejemplo, cáncer hepático; el gen PPMID, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PPMID, por ejemplo, cáncer de mama; el gen RAS, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAS, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de la caveolina I, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de la caveolina I, por ejemplo, carcinoma de células escamosas esofágicas; el gen MIB I, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MIB I, por ejemplo, carcinoma de mama masculino (MBC) ; el gen MTAI, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MTAI, por ejemplo, carcinoma de ovario; el gen M68, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de M68, por ejemplo, adenocarcinomas humanos del esófago, el estómago, el colon, y el recto.
En algunas modalidades el agente oligonucleotídico silencia las mutaciones en los genes supresores de tumores, y de este modo puede ser utilizado como un método para promover la actividad apoptótica en combinación con agentes quimioterapéuticos . En algunas modalidades, el gen supresor del tumor es seleccionado de uno o más de los siguientes genes supresores de tumores: el gen supresor del tumor p53, el miembro DN-p63 de la familia p53, el gen supresor del tumor pRb, el gen supresor del tumor APC1, el gen supresor del tumor BRCA1, el gen supresor del tumor PTEN.
En algunas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia uno de los siguientes genes de fusión: los genes fusión mLL, por ejemplo, mLL-AF9 , y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión mLL, por ejemplo, leucemias agudas; el gen de fusión BCR/ABL, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión BCR/ABL, por ejemplo, leucemias agudas y crónicas; el gen de fusión TEL/AML1, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión TEL/AML1, por ejemplo, leucemia aguda de la niñez; el gen de fusión EWS/FLI1, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión E S/FLI1, por ejemplo, Sarcoma de Ewing; el gen de fusión TLS/FUS1, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión TLS/FUS1, por ejemplo, liposarcoma Mixoide; el gen de fusión PAX3/FKHR, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión PAX3/FKHR, por ejemplo, liposarcoma Mixoide; el gen de fusión AML1/ETO, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por expresión de genes no deseada AML1/ET0, por ejemplo, leucemia aguda.
En algunos aspectos de la presente, los montajes micelares proporcionan agentes terapéuticos para tratar a un sujeto, por ejemplo, a un humano, en riesgo de o afectado con una enfermedad o trastorno que puede beneficiarse por la inhibición de la angiogénesis , por ejemplo, la degeneración retinal o el cáncer. El tratamiento comprende proporcionar un montaje micelar que comprende un agente oligonucleotídico, en donde el agente oligonucleotídico es homólogo a y/o puede silenciar, por ejemplo, mediante escisión, un gen que es mediador de la angiogénesis (por ejemplo, VEGF-R1, VEGF-R2 o un gen que codifica para las proteínas de señalización para estas vías de los receptores) ; y la administración de una dosis terapéuticamente efectiva del montaje micelar, que comprende el agente oligonucleotídico a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano.
En algunas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia uno de los siguientes genes: el gen de la integrina alfa v-, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por la integrina j alfa V no deseada, por ejemplo, tumores de cerebro, o tumores de origen epitelial; el gen del receptor Flt-1, y de este modo puede ser utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por receptores no deseados Flt-1, por ejemplo, cáncer y artriitis reumatoide; el gen de la tubulina, y de este modo puede ser I utilizado para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de un trastorno caracterizado por tubulina no deseada, por ejemplo, cáncer y neovascularización retirial.
En algunos aspectos, los montajes micelarés que comprenden los agentes oligonucleotídicos proporcionados en la presente, se refieren a un método para tratar a un sujeto infectado con un virus o en riesgo de o afectado con I un trastorno o enfermedad asociada con una infección viral .
El método comprende proporcionar un montaje micelár que incluye un agente oligonucleotídico, en donde el agente I oligonucleotídico es homólogo a y/o puede silenciar,, por ejemplo, mediante escisión, a un gen viral o un gen celular i que es mediador de la función viral, por ejemplo, la I entrada o el crecimiento; y administrar una dosis terapéuticamente efectiva del agente oligonucleotídico : a un í sujeto, por ejemplo, un sujeto humano.
En algunas modalidades, los montajes micelarés que comprenden un agente oligonucleotídico son útiles en el tratamiento de sujetos infectados con el Virus del Papiloma Humano (HPV, por sus siglas en inglés) o en riesgo ;de o I afectados con un trastorno mediado por el HPV, por ejemplo, cáncer cervical.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico que silencia la expresión del gen HPV que está reducido. En algunas modalidades, el gen HPV es seleccionado del grupo de E2, E6, o E7.
En otra modalidad más, la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del HPV, es reducida .
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil en el tratamiento de pacientes infectados por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) o en riesgo de o afectado con un trastorno mediado por el VIH, por ejemplo, el Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA) . En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen del VIH. En otras modalidades, el gen del VIH es CCR5, Gag, o Rev. En algunas modalidades, la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del VIH, es reducida. En algunas modalidades, el gen es CD4 o TsglOl.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el Virus de la Hepatitis B (HBV) o en riesgo de o afectados con un trastorno mediado por el HBV, por ejemplo, cirrosis y carcinoma hepatocelular . En una modalidad, es reducida la expresión de un gen del HBV. En otra modalidad, el gen del HBV objetivo codifica para uno de los grupos de la región de cola de la proteína de núcleo del HBV, la región pre-cregious (pre-c) , o la región cregious (c) . En otras modalidades, una secuencia de HBV-ARN dirigida está comprendida de la cola poli (A) . ¡ En algunas modalidades es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del HBV.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados con, o en riesgo de o afectados con un trastorno mediado por un virus seleccionado de los siguientes virus: Virus de la Hepatitis A (HAV) ; Virus de la Hepatitis C (HCV) ; cualquiera del grupo de cepas Virales de la Hepatitis que comprenden a la hepatitis D, E, F, G, o H; el Virus Sincitial Respiratorio (RSV) ; , el Citomegalovirus del herpes (CMV) ; el Virus de Epstein Barr del herpes (EBV) ; el Virus del Herpes asociado al Sarcoma de Kaposi (KSHV) ; el Virus JC (JCV) ; mixovirus (por ejemplo, virus que provoca la influenza) , rinovirus 1 (por ejemplo, el virus que provoca el resfriado común) , o coronavirus (por ejemplo, el virus que provoca el resfriado común); el flavivirus de la Encefalitis de St. Louis; el flavivirus de la encefalitis llevada por las garrapatas; el flavivirus de la encefalitis del Valle Murray; el flavivirus del dengue; el Virus 40 de Simio (SV40) ; el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) ; el virus del sarampión (MV) ; el virus de la Varicela zoster (VZV) ; un adenovirus (por ejemplo el virus que provoca una infección del tracto respiratorio); el poliovirus; o un poxvirus (un poxvirus que provoca la viruela). En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicacion de estos virus.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el Virus del Herpes Simple (HSV) o en riesgo de o afectado con un trastorno mediado por el HSV, por ejemplo, herpes genital y herpes labial, así como trastornos que amenazan la vida o que deterioran la vista, por ejemplo, principalmente en pacientes inmunocomprometidos . En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen del HSV. En otra modalidad, el gen del HSV codifica para la ADN-polimerasa o la helicasa-primasa. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicacion del HSV.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el Virus del Nilo Occidental en riesgo de o afectado con un trastorno mediado por el Virus del Nilo Occidental. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen del Virus del Nilo Occidental. En otras modalidades preferidas, el gen del Virus del Nilo Occidental es seleccionado del grupo que comprende E, NS3, o NS5. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del Virus del Nilo Occidental. i En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el Virus Linfotrópico de Células T Humanas (HTLV) , o un trastorno o enfermedad asociada con este virus, por ejemplo, leucemia o mielopatía. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen del HTLV. En algunas modalidades, el gen HTLV1 es el activador transcripcional Tax. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del HTLV.
En algunos aspectos, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar a un sujeto infectado con un patógeno, por ejemplo, un patógeno bacteriano, amébico, parasitario, o fúngico. El método de tratamiento comprende proporcionar un montaje micelar que comprende un agente oligonucleotídico, en donde el oligonucleótido es homólogo a y/o puede silenciar, por ejemplo, mediante escisión de un gen patógeno o un gen involucrado en el crecimiento del patógeno; y la administración de una dosis terapéuticamente efectiva del agente oligonucleotídico a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. El gen objetivo puede ser seleccionado de un gen involucrado en el crecimiento de patógenos, la síntesis de la pared celular, la síntesis de proteínas, la transcripción, el metabolismo de la energía, por ejemplo, el ciclo de Krebs, o la producción de toxina.
De este modo, en algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar a pacientes infectados por un Plasmodium que provoca malaria. En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen del Plasmodium. En otras modalidades, el gen es antígeno 1 de la membrana apical (AMA1) . En algunas modalidades, es reducida la expresión de un gen humano que es requerido para la replicación del Plasmodium.
En algunas modalidades, el montaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por Mycobacterium ulcerans, Mycojacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, o un trastorno o enfermedad asociada con cualquiera de estos patógenos. En algunas modalidades, la expresión de un gen bacteriano y/o un gen humano que es requerido para la replicación de estas bacterias, es reducida .
En algunas modalidades, las enfermedades tratadas por los montajes micelares proporcionados en la presente, pueden ser sistémicas o estar presentes en un tejido específico, por ejemplo, el pulmón, la piel, el hígado, la mama, el riñon, el páncreas, el Sistema Nervioso Central, o similares. En ciertos aspectos, el oligonucleótido silencia a un gen que media o está involucrado en una enfermedad o trastorno metabólico, por ejemplo, diabetes, obesidad, y similares. En ciertas modalidades, el oligonucleótido silencia un gen que es mediador o está involucrado en una enfermedad o trastorno pulmonar, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis quística, o cáncer pulmonar. En algunos aspectos de la presente, los montajes micelares comprenden un agente oligonucleotídico útil para y/o relacionado a un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, a un humano, en riesgo de o afectado con una enfermedad o trastorno caracterizado por una respuesta inmunitaria no deseada/ por ejemplo, una enfermedad o trastorno inflamatorio o una enfermedad o trastorno autoinmunitario . El método comprende proporcionar un montaje micelar que comprende un agente oligonucleotídico, en donde el agente oligonucleotídico es homólogo a y/o puede silenciar, por ejemplo, mediante escisión, un gen que es mediador de una respuesta inmunitaria no deseada; y administrar el agente oligonucleotídico a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es daño por isquemia o reperfusión, por ejemplo, daño por isquemia o reperfusión asociado con infarto agudo, del miocardio, angina inestable, derivación cardiopulmonar, intervención quirúrgica por ejemplo, angioplastia, por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutánea, la respuesta a un órgano o tejido trasplantado, por ejemplo, tejido cardiaco o vascular trasplantado; o trombólisis. En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es la restenosis, por ejemplo, restenosis asociada con intervención quirúrgica por ejemplo, angioplastia, por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutánea. En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es Enfermedad Inflamatoria del Intestino, por ejemplo, Enfermedad de Crohn o Colitis Ulcerativa. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es inflamación asociada con una infección o daño. En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es asma, alergia, lupus, esclerosis múltiple, diabetes, por ejemplo, diabetes tipo II, artritis, por ejemplo, reumatoide o psoriática. En ciertas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia una integrina o co- ligando de la misma, por ejemplo, VLA4 , VCAM, ICAM. En otras modalidades, el agente oligonucleotídico silencia una selectina o co- ligando de la misma, por ejemplo, P-selectina, E-selectina (ELAM) , I-selectina, P-selectina-glicoproteína-1 (PSGL-1) . En ciertas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia un componente del sistema del complemento, por ejemplo, C3 , C5, C3aR, C5aR, convertasa C3 , y convertasa C5. En algunas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia una quimiocina o receptor de la misma, por ejemplo, TNFI, TNFJ, IL-1I, IL-1J, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11, y CCR3. En otras modalidades, el agente oligonucleotídico silencia GCSF, Grol, Gro2 , Gro3, PF4, MIG, Proteína Básica Pro-Plaquetaria (PPBP) , MIP-1I, MIP-1J, RA TES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, CMBKR1 , CMB R2 , CMBKR3, CMBKR5 , AIF-1, o 1-309.
En algunos aspectos, los montajes miceíares comprenden un agente oligonucleotídico útil para tratar a un sujeto, por ejemplo, a un humano, en riesgo de o afectado con una enfermedad o trastorno neurológico. El método comprende proporcionar un montaje micelar que comprende un agente oligonucleotídico, en donde el oligonucleótido es homólogo a y/o puede silenciar, por ejemplo, mediante escisión, un gen que es mediador de una enfermedad o trastorno neurológico; y la administración de una dosis terapéuticamente efectiva del agente oligonucleotídico a un sujeto, por ejemplo, a un humano. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es la Enfermedad de Alzheimer o la Enfermedad de Parkinson. En ciertas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia un gen de la familia amiloide, por ejemplo, APP; un gen de presenilina, por ejemplo, PSEN1 y PSEN2, o I-sinucleina . En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es un trastorno de repetición de trinucleótido neurodegenerativo, por ejemplo, la enfermedad de Huntington, atrofia palidoluisiana dentatorrubral o una ataxia espinocerebelar, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3 (enfermedad de achado-Joseph) , SCA7 o SCA8. En algunas modalidades, el agente oligonucleotídico silencia HD, DRPLA, SCA1, SCA2 , MJD1, CACNL1A4 , SCA7 , o SCA8.
En ciertos aspectos, los montajes micelares proporcionados en la presente comprenden un agente oligonucleotídico capaz de escindir o silenciar más de un gen. En estas modalidades, el agente oligonucleotídico se selecciona de modo que éste tenga suficiente homología a una secuencia encontrada en más de un gen, por ejemplo una secuencia conservada entre estos genes. De este modo, en algunas modalidades un agente oligonucleotídico dirigido a tales secuencias silencia de manera efectiva la colección completa de genes .
En algunos aspectos, los montajes micelares proporcionados en la presente comprenden dos o más tipos de agentes oligonucleotídicos , en donde los agentes oligonucleotídicos silencian diferentes genes de la misma enfermedad o diferentes enfermedades.
Cualquier agente descrito en la presente es enlazado al montaje micelar o a polímeros (por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana o polímeros adicionales) de cualquier manera adecuada, por ejemplo, de cualquier manera descrita en la presente.
Porciones de Dirección al Objetivo En ciertas modalidades, los montajes micelares descritos en la presente comprenden al menos una porción de dirección al objetivo (por ejemplo, una porción que se dirige a una célula o tipo de célula específica) . En algunas modalidades, la porción de dirección al objetivo está en el núcleo del montaje micelar, en la envoltura del montaje micelar, sobre la superficie del montaje micelar, enlazado a un bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana, enlazado a un bloque de envoltura de un copolímero en bloque desestabilizador de la membrana, es un bloque de envoltura de un agente desestabilizador de membrana, está presente sobré el polímero no desestabilizador de membrana, dentro , del montaje micelar, está enlazado a un agente terapéutico dentro del montaje micelar, o similar.
En casos específicos, los montajes micelares proporcionados en la presente son útiles para la distribución de agentes terapéuticos a células específicamente dirigidas de un individuo. En ciertos casos, la eficiencia de la absorción celular de los montajes micelares es aumentada por la incorporación de las porciones dirigidas al objetivo dentro o sobre la superficie de los montajes micelares. Una "porción de dirección al objetivo" (utilizada intercambiablemente con "agente de dirección al objetivo") es cualquier reactivo de afinidad que reconozca la superficie de una célula 1 (por ejemplo, una célula selecta) . En algunas modalidades, las porciones de dirección al objetivo reconocen un antígeno de la superficie celular o se enlazan a un receptor sobre la superficie de la célula objetivo. Las porciones de dirección al objetivo adecuadas incluyen, a manera de ejemplo no limitante, anticuerpos, moléculas similares a anticuerpos, o péptidos, tales como los péptidos de enlace a la integrina tales como los péptidos que contienen RGD, o moléculas pequeñas, tales como vitaminas, por ejemplo, folato, azúcares tal como lactosa y galactosa, u otras moléculas pequeñas. Los antígenos de la superficie celular incluyen una molécula de la superficie celular tal como una proteína, azúcar, lípido u otro antígeno sobre la superficie celular. En modalidades específicas, el antígeno de la superficie celular sufre internalización. Los ejemplos de antígenos de la superficie celular dirigidos por las porciones de dirección al objetivo de los montajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente incluyen, pero no están limitados a, el receptor de transferrina tipo 1 y 2, el receptor de EGF, HER2/Neu, receptores de VEGF, integrinas, NGF, CD2 , CD3 , CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69, y el receptor de asialoglicoproteína.
Las porciones de dirección al objetivo son enlazadas, en diversas modalidades, a cualquier extremo de un polímero (por ejemplo, el copolímero en bloque) del montaje micelar, o a una cadena lateral de una unidad monomérica, o incorporadas dentro de un bloque polimérico. El enlace de la porción de dirección al objetivó al polímero es lograda de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante cualquiera de un número de procedimientos de química de conjugación que incluyen, pero no están limitados a enlazadores amino-carboxilo, enlazadores amino-sulfhidrilo, enlazadores amino-carbohidrato, enlazadores amino-hidroxilo, enlazadores amino-amina, enlazadores carboxilo-sulfhidrilo, enlazadores carboxilo-carbohidrato, enlazadores carboxilo-hidroxilo, enlazadores carboxilo-carboxilo, enlazadores sulfhidrilo-carbohidrato, enlazadores sulfhidrilo-hidroxilo, enlazadores sulfhidrilo-sulfhidrilo, enlazadores carbohidrato-hidroxilo, enlazadores carbohidrato-carbohidrato, y enlazadores hidroxilo-hidroxilo. En modalidades específicas, se utiliza la química "click" para acoplar el ligando de dirección al objetivo a los copolímeros en bloque que forman los montajes micelares proporcionados en la presente (por ejemplo de las reacciones "click", ver Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta 2007, 40, 7-17). Una amplia variedad de químicas de conjugación son opcionalmente utilizadas (ver, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds, Macmillan, 1998 y capítulos en ésta). En algunas modalidades, los ligandos de dirección al objetivo están enlazados a un monómero y el compuesto resultante es luego utilizado en la síntesis de polimerización de un polímero (por ejemplo, el copolímero en bloque) utilizado en un montaje micelar descrito en la presente. En algunas modalidades, las porciones de dirección al objetivo están enlazadas a un bloque de un primer copolímero en bloque, o a un bloque de un segundo copolímero en bloque en un montaje micelar mixto. En algunas modalidades, el ligando de dirección al objetivo es enlazado a la hebra en sentido o antisentido del AR si unido a un polímero del montaje micelar. En ciertas modalidades, el agente de dirección al objetivo es enlazado a un extremo 5' o un extremo 3' de la hebra en sentido o antisentido.
En modalidades específicas, los copolímeros en bloque que forman los montajes micelares proporcionados en la presente son biocompatibles . Como se utiliza én la presente, "biocompatible" se refiere a una propiedad de un polímero caracterizado por que éste, o sus productos de degradación in vivo, no es, o al menos es mínimamente y/o reparablemente, dañino para el tejido hepático; y/o, no o al menos mínimamente y de manera controlable, no provoca una reacción inmunitaria en el tejido viviente. Con respecto a las sales, se prefiere actualmente que las especies catiónicas y aniónicas sean biocompatibles. Como se utiliza en la presente, "fisiológicamente aceptablé" es intercambiable con biocompatible. En algunos casos,1 los montajes micelares y los polímeros utilizados en éstos1 (por ejemplo, los copolímeros en bloque) muestran baja toxicidad en comparación a los lípidos catiónicos.
En algunos casos, uno o más de los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque) utilizados en los montajes micelares descritos en la presente, comprenden cadenas de polietilenglicol (PEG) o bloques con pesos moleculares de aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 30,000. En algunas modalidades, el PEG es conjugado a los grupos extremos poliméricos, o a uno o más grupos modificábles sobresalientes presentes en un polímero de uno de los montajes micelares proporcionados en la presente. En algunas modalidades, los residuos de PEG son conjugados a grupos modificables dentro del segmento o bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) de un polímero (por ejemplo, el copolímero en bloque) de un montaje micelar proporcionado en la presente. En ciertas modalidades, un monómero que comprende un residuo de PEG de 2-20 unidades óxido de etileno es co-polimerizado para formar la porción hidrofílica del polímero que forma el montaje micelar proporcionado en la presente.
Absorción celular En algunas modalidades, los montajes micelares que comprenden agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos o ARNsi) son distribuidos a las células mediante endocitosis. Se utilizan vesículas intracelulares y endosomas intercambiablemente a todo lo largo de esta especificación. La distribución exitosa del agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) dentro del citoplasma tiene en general un mecanismo para el escape endosómico. En ciertos casos, los montajes micelares que comprenden agentes terapéuticos (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) proporcionados en la presente, son sensibles al pH más bajo en el compartimiento endosomal después de la endocitosis. En ciertos casos, la endocitosis dispara la protonacion o la o neutralización de carga de las especies aniónicamente cargables (por ejemplo, unidades de ácido propilacrílico) de los montajes micelares, dando como resultado una transición conformacional en los montajes micelares. En ciertos casos, esta transición conformacional da como resultado una forma de desestabilización de la membrana más hidrofóbica, la cual es mediadora de la liberación del agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) a partir de los endosomas hacia el citoplasma. En estos montajes micelares que comprenden ARNsi, la distribución del ARNsi hacia el citoplasma permite que ocurra el efecto de knockdown del ARNm. En aquellos montajes micelares que comprenden otros tipos de oligonucleótidos , la distribución hacia el citoplasma permite que ocurra su acción deseada.
Composiciones Farmacéuticas Los montajes micelares proporcionados en la presente (por ejemplo, aquellos enlazados a uno o más agentes terapéuticos, tales como uno o más oligonucleótidos) son opcionalmente proporcionados en una composición (por ejemplo, la composición farmacéuticamente aceptable) . En algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente pueden ser administrados a un paciente de cualquier manera adecuada, por ejemplo, con o sin estabilizadores, amortiguadores, y similares, para formar una composición farmacéutica. En algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente son formulados y utilizados como comprimidos, cápsulas o elixires para la administración oral, supositorios para la administración rectal, soluciones estériles, suspensiones para la administración inyectable, y cualesquiera otras composiciones adecuadas.
Se proporcionan las formulaciones farmacéuticamente aceptables de los montajes micelares que comprenden al menos un agente terapéutico descrito en la presente. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo, las sales por adición de ácido, por ejemplo, sales de los ácidos clorhídrico, bromhídrico, acético, y bencensulfónico . Una composición farmacéutica o formulación farmacéutica se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para la administración, por ejemplo, la administración sistémica, hacia una célula o un paciente, incluyendo por ejemplo a un humano. Las formas adecuadas, en parte, dependen del uso o de la ruta de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica, o mediante inyección. De este modo, en modalidades específicas en donde el montaje micelar comprende y está distribuyendo un polinucleotido, la formulación está en la forma que no previene que el montaje micelar y, más específicamente, el polinucleótido (por ejemplo, el oligonucleótido o el ARNsi) llegue a una célula objetivo con el polinucleótido intacto y/o funcional. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las composiciones farmacológicas inyectadas dentro de la corriente sanguínea son solubles y/o dispersables . Además, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente son, preferentemente, no tóxicas. En algunas modalidades, en donde un montaje micelar descrito en la presente es administrado para beneficio terapéutico, una cantidad terapéuticamente efectiva del montaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido, tal como un ARNsi) es administrada. En una modalidad ejemplar, una cantidad terapéuticamente efectiva incluye una cantidad suficiente del montaje micelar para proporcionar aproximadamente 10 mg o menos del ARNsi por kg de individuo.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden un montaje micelar, que comprenden un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido, tal como un ARNsi) , son administradas sistémicamente . Como se utiliza en la presente, "administración sistémica" significa la absorción o acumulación sistémica in vivo de fármacos en la corriente sanguínea, seguido por la distribución a todo lo largó del cuerpo completo. Las rutas de administración que conducen a la absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal , inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. En algunas modalidades, las composiciones del montaje micelar son administradas tópicamente .
En algunas modalidades, las composiciones son preparadas para el almacenamiento o la administración, e incluyen una cantidad farmacéuticamente efectiva del agente terapéutico que comprende el montaje micelar en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Cualesquiera portadores o diluyentes aceptables son opcionalmente utilizados en la presente. Los portadores y diluyentes específicos son descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro Ed., 1985. Por ejemplo, son opcionalmente agregados conservantes, estabilizadores, colorantes y agentes saborizantes . Éstos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico . Además, son opcionalmente utilizados antioxidantes y agentes suspensores. Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un rellenador, diluyente, material de encapsulamiento o auxiliar de formulación no tóxico, sólido inerte, semisólido o líquido, de cualquier tipo. Algunos ejemplos de materiales opcionalmente utilizados como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa, y sucrosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; maltosa; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorio; aceites tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón; aceite de semilla de girasol; aceite de ajonjolí; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soya; los glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como el oleato de etilo y el laurato de etilo; gar; detergentes tales como Tween 80; agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como el laurilsulfato de sodio y el estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, endulzantes, saborizantes y agentes perfumantes, conservadores y antioxidantes pueden también estar presentes en la composición, de acuerdo al juicio del formulador. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente son administradas a humanos y/o a animales, oral, rectal, parenteral, intracisternal , intravaginale, intranasal, intraperitoneal , tópica (como polvos, cremas, ungüentos, o gotas), subcutánea, bucal, o como un rocío oral o nasal.
En diversas modalidades, las formas de dosificación líquida para la administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos (por ejemplo, los complejos micela-oligonucleótido proporcionados en la presente) las formas de dosificación líquida contienen además opcionalmente diluyentes o excipientes inertes, tales como, a manera de ejemplo no limitante, agua u otros solventes, agentes solubilizadores y emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1, 3 -butilenglicol , dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuate, de maíz, de germen, de oliva, de ricino, y de ajonjolí) , glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ásteres de ácido graso de sorbitan, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales incluyen también opcionalmente adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsificantes y agentes suspensores, agentes endulzantes, saborizantes , y aromatizantes .
En algunas modalidades, las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, son formuladas de acuerdo a cualquier manera adecuada, por ejemplo, utilizando agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes suspensores. La preparación inyectable estéril es, opcionalmente, una solución, suspensión, o emulsión inyectable estéril, en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable, no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1 , 3 -butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que son opcionalmente empleados están el agua, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio U.S.P. e isotónica. Además, los aceites fijos, estériles son convencionalmente empleados como un solvente o medio suspensor. Para este propósito, cualquier mezcla de aceite fijo es opcionalmente empleada incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. En modalidades adicionales, los ácidos grasos tales como el ácido oleico son utilizados en la preparación de inyectables. En una modalidad específica, las partículas del montaje micelar son suspendidas en un fluido portador que comprende 1% (p/v) de carboximetilcelulosa de sodio y 0.1% (v/v) de Tween 80.
En algunas modalidades, las formulaciones inyectables son esterilizadas, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o mediante incorporación de agentes de esterilización en la forma de composiciones sólidas estériles que ! son opcionalmente disueltas o dispersas en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
En ciertas modalidades, las composiciones para la administración rectal o vaginal son supositorios. Los supositorios son preparados opcionalmente al mezclar el agente terapéutico que comprende los montajes micelares proporcionados en la presente, con excipientes o portadores no irritantes, adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol , o una cera para supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal, y por lo tanto se funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el agente terapéutico que comprende los montajes micelares proporcionados en la presente. Como se utiliza en la presente, un "agente terapéutico que comprende montajes micelares proporcionados en la presente" es utilizado intercambiablemente con uno o más montajes micelares proporcionados en la presente,1 que comprenden uno o más agentes terapéuticos.
Las formas de dosis sólida adecuada para la administración oral incluyen, a manera de ejemplo no limitante, cápsulas, comprimidos, pildoras, polvos, y gránulos . En tales formas de dosis sólida, los montajes micelares que comprenden un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido) son mezclados con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, inerte, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o a) rellenadores o extensores tales como almidones, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sucrosa, y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes i desintegradores tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes que retardan la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternarios, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos, y pildoras, la forma de dosis puede también comprender agentes amortiguadores .
Las composiciones sólidas de un tipo similar son también opcionalmente empleadas como rellenadotes en cápsulas de gelatina suave y dura utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular, y similares.
En algunas modalidades, las formas de dosis sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pildoras, y granulos son preparadas con recubrimientos y envolturas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos adecuados. Éstos contiene opcionalmente agentes opacificantes . En ciertas modalidades, éstos son de una composición de modo que liberan el o los ingredientes activos únicamente, o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones de incrustación adecuadas incluyen, a manera de ejemplo no limitante, substancias poliméricas y ceras.
Las composiciones sólidas de un tipo similar son opcionalmente empleadas como rellenadores en cápsulas de gelatina suave y dura utilizando excipientes tales lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto: peso molecular y similares.
Las formas de dosis para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen, a manera de ejemplo no limitante, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, rocíos, inhalantes, o parches. En algunas modalidades, el agente terapéutico que comprende los montajes micelares proporcionados en la presente son mezclados bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente , uno o más conservantes, uno o más amortiguadores, o una combinación de los mismos (por ejemplo, como se pueda requerir) . La formulación oftálmica, gotas óticas, y gotas oftálmicas son también contempladas por estar dentro del alcance de esta invención.
Los ungüentos, pastas, cremas, y geles proporcionados en la presente contienen opcionalmente, además del agente terapéutico que comprende los montajes micelares proporcionados en la presente, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles , siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y rocíos contienen opcionalmente, además del agente terapéutico que comprenden los montajes micelares proporcionados en la presente, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio, y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. En algunas modalidades, los rocíos contienen adicionalmente propelentes acostumbrados tales i como clorofluorohidrocarburos .
Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proporcionar distribución controlada de un compuesto hacia el cuerpo. Tales formas de dosis son elaboradas de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante disolución o surtido de las micropartículas o nanopartículas en un medio apropiado. Los aumentadores de la absorción son opcionalmente utilizados para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede ser controlada ya sea mediante la provisión de una membrana de control de la velocidad o mediante la dispersión del agente terapéutico que comprende montajes micelares proporcionados en la presente, en una matriz polimérica o gel.
En algunos aspectos de la invención, el o los montajes micelares proporcionan algunas propiedades (por ejemplo mecánicas, térmicas, etc.) que son usualmente realizadas por los excipientes, disminuyendo de este modo la cantidad de tales excipientes requeridos por la formulación .
En algunas modalidades, los montajes micelares proporcionados en la presente tienen viabilidad cometcial superior con relación a otras tecnologías para la distribución de los agentes terapéuticos, incluyendo pero no limitados a: inmunogenicidad disminuida del portador después de la administración repetida in vivo; menos pasos necesarios para ensamblar los múltiples elementos del vehículo de distribución, dando como resultado costos más bajos de los artículos; y reproducibilidad de fabricación, como es juzgado por la habilidad para fabricar lotes repetidos del producto con menos del 5%, menos del 10%, o menos del 20% de variabilidad lote a lote en propiedades de ensayos biofísicos (incluyendo pero no limitados a tales como HPLC, GPC, DLS , y TEM) .
Ejemplos A todo lo largo de la descripción de la presente invención, se utilizan diversos acrónimos y abreviaturas conocidas para describir monómeros o residuos monoméricos derivados de la polimerización de tales monómeros. Sin limitación, a no ser que se indique de otro modo: "BMA" (o la letra "B" como notación abreviada equivalente) representa metacrilato de butilo o un residuo monomérico derivado de éste; "DMAEMA" (o la letra "D" como notación abreviada equivalente), representa metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo o el residuo monomérico derivado de éste; "Gal" se refiere a galactosa o un residuo de galactosa, que incluye opcionalmente porciones de protección de hidroxilo (por ejemplo, acetilo) o a un derivado pegilado del mismo (como se describe más adelante) ; HPMA representa metacrilato de 2-hidroxipropilo o el residuo monomérico derivado de éste; "MAA" representa ácido metilacrílico¡ o el residuo monomérico derivado de éste,- "MAA(NHS)" representa éster de N-hidroxil-succinimida del ácido metacrílico o el residuo monomérico derivado de éste; " PAA" (o la letra. "P" como notación abreviada equivalente) representa el ácido 2-propilacrílico o el residuo monomérico derivado de éste, "PEGMA" se refiere al monómero metacrílico pegilado, CH30 (CH20) v-sOC (O) C (CH3) CH2 o el residuo monomérico derivado de éste. En cada caso, cualquiera de tales indicaciones indica el monómero (incluyendo todas las sales, o: los j análogos iónicos de las mismas) , o un residuo monomérico derivado de la polimerización del monómero (incluyendo todas las sales o análogos iónicos de las mismas) , y la forma indicada específica es evidente por el contexto para una persona de experiencia en la técnica.
Ejemplo 1: Preparación de Copolímeros Los polímeros y copolímeros di-bloque de la siguiente fórmula general son preparados: [Alx-/-A2y] n - [Blx-/-B2y-/-B3z] 1-5n Donde [A1-A2] es el primer copolímero en bloque, compuesto de residuos de monómeros Al y A2 [B1-B2-B3] es el segundo copolímero en bloque, compuesto de residuos de monómeros Bl, B2, B3 x, y, z es la composición polimérica en residuo monomérico en % mol n es el peso molecular Copolímeros di-bloque ejemplares: [DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEG AJ - [B-/-P-/-D] [PEG AW-DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEGMAW-MAA ( HS) ] - [B-/-P-/-D] [DMAEMA- /-MAA(NHS) ] - [B- / -P-/ -D] [HPMA-/-PDSM] - [B-/-P-/-D] Donde : B es metacrilato de butilo P es ácido propilacrílico D es DMAEMA es metacrilato de dimetilaminoetilo PEGMA es metacrilato de polietilenglicol donde, por ejemplo, w = 4-5 o 7-8 unidades óxido de etileno MAA (NHS) es la N-hidroxisuccinamida del ácido metilacrílico j HPMA es N- ( 2 -hidroxipropil) metacrilamida PDSM es el metacrilato de disulfuro de piridilo Estos polímeros representan estructuras donde la composición del primer bloque del polímero o el copolímero es variada o químicamente tratada con el fin de crear polímeros donde el primer bloque es neutro (por ejemplo., PEGMA), catiónico (DMAEMA), aniónico (PEGMA-NHS , donde el NHS es hidrolizado al ácido) , anfolítico (DMAEMA- HS , donde el NHS es hidrolizado al ácido) , o zwiteriónico (por ejemplo, el fosfato de poli [2-metacriloiloxi- 21 trimetilamonioetilo] ) . Además, el polímero [PEGMA-PDSM] - [B-P-D] contiene un grupo funcional disulfuro de piridilo en el primer bloque, que se puede hacer reaccionar con un AR si tiolado para formar un conjugado polímero-ARNsi.
Ejemplo 1.1: Síntesis del copolímero en bloque utilizando polimerización RAFT.
A. Agente de transferencia de cadena RAFT.
La síntesis del agente de transferencia de cadena (CTA) , el ácido 4-Ciano-4- (etilsulfañil tiocarbonil) sulfanilpentanoico (ECT) , utilizado para las siguientes polimerizaciones tipo RAFT, fue adaptado a partir de un procedimiento por Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68. En resumen, el etanotiol (4.72 g, 76 mmol) fue agregado en 10 minutos a una suspensión agitada de hidruro de sodio (al 60% en aceite) (3.15 g, 79 mmol) en éter dietílico (150 mi) a 0°C. La solución se dejó luego en agitación por 10 minutos antes de la adición del disülfuro de carbono (6.0 g, 79 mmol). Se recolectó el tritiocarbonato de S-etilo sódico crudo (7.85 g, 0.049 mol) mediante filtración, se suspendió en éter dietílico (100 mi), y se hizo reaccionar con yodo (6.3 g, 0.025 mol) . Después de 1 hora, la solución se filtró, se levó con tiosulfato de sodio acuoso, y se secó sobre sulfato de sodio. El disulfuro de bis (etilsulfaniltiocarbonilo) crudo se aisló luego mediante evaporación rotatoria. Una solución del disulfuro de bis- (etilsulfaniltiocarbonilo) (1.37 g, 0.005 mol) y 4 , 41 -azobis (ácido 4 -cianopentanoico) (2.10 g, 0.0075 mol) en acetato de etilo (50 mi) se calentó a reflujo por 18 horas. Después de la evaporación rotatoria del solvente, el ácido 4-Ciano-4- (etilsulfaniltiocarbonil) sulfanilpentanoico crudo (ECT) se aisló mediante cromatografía en columna utilizando gél de sílice como la fase estacionaria y acetato de etilo-hexano 50:50 como el eluyente.
B. agente de transferencia de cadena macro poli (metacrilato de N, -dimetilaminoetilo) (poliDMAEMA macroCTA) .
La polimerización tipo RAFT de DMAEMA fué conducida en DMF a 30°C bajo una atmósfera de nitrógeno por 18 horas utilizando ECT y 2 , 2 ' -Azobis (4-metoxi-2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (V-70) (Wako chemicals) como el iniciador de radicales. El monómero inicial a la proporción de CTA ( [CTA] 0/ [M] 0 ) fue tal que el Mn teórico a una conversión del 100% fue de 10,000 (g/mol) . La proporción inicial CTA al iniciador ( [CTA] 0/ [I] o) ue de 10 a l. El agente de transferencia de cadena macro poliDMAEMA resultante, fue aislado mediante precipitación en éter dietílico/pentano 50:50 v:v. El polímero resultante fue disuelto nuevamente en acetona y subsecuentemente precipitado en pentano (x3) y secado toda la noche a vacío.
C. Copolimerización en bloque de DMAEMA, PAA, y BMA a partir de un poli (DMAMEA) macroCTA.
Las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA, y BMA fueron agregadas al poli (DMAEMA) macroCTA disuelto en N, -dimetilformamida (monómero al 25% en peso y macroCTA al solvente) . Para todas las polimerizaciones [M]0/[CTA]0 y [CTA]o/[I]0 fueron 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de V70 las soluciones fueron purgadas con nitrógeno por 30 minutos y se dejaron reaccionar a 30°C por 18 horas. Los copolímeros dibloque resultantes fueron aislados mediante precipitación en éter dietílico/pentano 50:50 v:v. Los polímeros precipitados fueron luego redisueltos en acetona y subsecuentemente precipitados en pentano (x3) y secados toda la noche a vacío. La cromatografía de permeación en gel (GPC) se utilizó para determinar los pesos moleculares y las polidispersiones (PDI, Mw/Mn) del poli (DMAEMA) macroCTA y las muestras del copolímero dibloque en DMF, con respecto a los estándares de metacrilato de polimetilo (columnas R-3000 y R-4000 de SEC Tosoh TSK-GEL (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) conectadas en serie a un Viscotek GPCmax VE2001 y al refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . La DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr se utilizó como la fase móvil. La Figura 1A resume los pesos moleculares, las composiciones y las proporciones de los bloques de algunos de los polímeros sintetizados por P7 RAFT.
Ejemplo 1.2. Preparación de la copolimerización del segundo bloque (B1-B2-B3) de DMAEMA, PAA, y BMA a partir de un poli(PEGMA) macroCTA.
Las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA, y BMA fueron agregadas al poli(PEGMA) macroCTA disuelto en N, -dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA al solvente) . Para todas las polimerizaciones [M]0/[CTA]0 y [CTA]0/[I]0 fueron 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de AIB las soluciones fueron purgadas con nitrógeno por 30 minutos y se dejaron reaccionar a 68°C por 6-12 horas. Los copolímeros dibloque resultantes fueron aislados mediante precipitación en éter dietílico/pentano 50:50 v:v. Los polímeros precipitados fueron luego disueltos nuevamente en acetona y subsecuentemente precipitados en pentano (x3) y secados toda la noche a vacío. Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC) para determinar los pesos moleculares y las polidispersiones (PDI, Mw/Mn) del poli(PEGMA) macroCTA y las muestras del copolímero dibloque en DMF, utilizando un Viscotek GPCmax VE2001 y el refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . La DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr se utilizó como la fase móvil. Se utilizó espectroscopia de RMN en CDC13 para confirmar la estructura del polímero y para calcular la composición del segundo bloque.
Ejemplo 1.3. Preparación y caracterización de los copolímeros de PEGMA-DMAEMA. · La síntesis polimérica fue llevada a cabo utilizando un procedimiento similar a aquel descrito en los Ejemplos 1.1 y 1.2. La proporción de PEGMA y DMAEMA en el primer bloque fue variada mediante el uso de diferentes proporciones de alimentación de los monómeros individuales para crear los copolímeros descritos en la Figura IB.
Ejemplo 1.4. Preparación y caracterización de los copolímeros PEGMA-MAA (NHS) .
La síntesis polimérica fue realizada como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2, utilizando proporciones de alimentación del monómero para obtener la composición deseada del primer copolímero en bloque. En algunos casos, el polímero [PEGMAW-MAA (NHS) - [B-P-D] es preparado donde la proporción del copolímero de los monómeros en el primer bloque es de 70:30. La Figura 14 resume la síntesis de los polímeros [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] donde la proporción del copolímero de los monómeros en el primer bloque es de 70:30. Las Figuras 15A, 15B y 15C resumen la caracterización de los polímeros sintetizados mediante Copolimerización de RAFT de PEGMA y MAA-NHS, donde la proporción del copolímero de los monómeros en el primer bloque es de 70:30. Los polímeros que contienen NHS pueden ser incubados en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 por 1-4 horas a temperatura ambiente o a 37°C para generar la forma hidrolizada (acida) .
Ejemplo 1.5. Preparación y caracterización de los copolímeros DMAEMA-MAA (NHS ) .
La síntesis polimérica fue realizada como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2, utilizando las proporciones de alimentación del monómero para obtener la I composición deseada del primer copolímero en bloque. En ciertos casos, el polímero [DMAEMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] es preparado donde la proporción del copolímero de los monómeros en el primer bloque es de 70:30. Los polímeros que contienen NHS pueden ser incubados en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 por 1-4 horas a temperatura ambiente o a 37 °C para generar la forma hidrolizada (acida) .
Ejemplo 2. Preparación y caracterización de los conjugados copoliméricos de HPMA-PDS (ARN) para la distribución de fármacos de ARNsi.
A. Síntesis del monómero de metacrilato de piridil-disulfuro (PDSMA) .
El Aldritiol-2™ (5 g, 22.59 ramol) se disolvió en i 40 mi de metanol y 1.8 mi de AcOH. La solución se agregó como una solución de 2-aminoetanotiol . HC1 (1.28 g, 11.30 mmol) en 20 mi de metanol en 30 minutos. La reacción se agitó bajo atmósfera de nitrógeno por 48 horas a temperatura ambiente. Después de la evaporación de los solventes, el aceite residual se lavó dos veces con 40 mi de éter dietílico. El compuesto crudo se disolvió en 10 mi de metanol y el producto se precipitó dos veces con 50 mi de éter dietílico para obtener el compuesto deseado 1 como un sólido amarillo claro. Rendimiento: 95 %.
La piridin-ditioetilamina (6.7 g, 30.07 mmol) y la trietilamina (4.23 mi, 30.37 mmol) se disolvieron en DMF (25 mi) y piridina (25 mi) y se agregó cloruro de metacriloilo (3.33 mi, 33.08 mmol) lentamente por medio de una jeringa a 0°C. La mezcla de reacción se agitó por 2 horas a temperatura ambiente. Después de la reacción, la reacción se apagó con NaHC03 saturado (350 mi) y se extrajo con acetato de etilo (350 mi) . La capa orgánica combinada se lavó adicionalmente con HC1 al 10% (100 mi, 1 vez) y agua pura (100 mi, 2 veces) y se secó con MaS04. El producto puro se purificó mediante cromatografía en columna (EA/Hex : 1/10 a 2/1) como un jarabe amarillo. Rf = 0.28 (EA/Hex = 1/1) . Rendimiento: 55 %.
B. Síntesis del copolímero HPMA-PDSMA La polimerización RAFT de la N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) y el metacrilato de piridil-disulfuro (típicamente a una 70:30 proporción de monómero) se conduce en DMF (50 por ciento en peso de monómero: solvente) a 68°C bajo una atmósfera de nitrógeno por 8 horas utilizando 2 , 2 ' -azo-jbis- isobutirilnitrilo (AIBN) como el iniciador de radicales libres. La proporción molar de CTA al AIBN es de 10 a 1 y la proporción del monómero a CTA es ajustada de modo que un peso molecular de 25,000 g/mol podría ser alcanzado si se alcanza una conversión del 100%. El macro-CTA de poli (HPMA-PDS) fue aislado mediante precipitación repetida en éter dietílico a partir de metanol.
El macro-CTA es secado a vacío por 24 horas y luego utilizado para bloquear la copolimerización del metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA) , el ácido propilacrílico (PAA) , y metacrilato de butilo (BMA) . Se agregan cantidades equimolares de DMAEMA, PAA, y BMA ([M] o/ [CTA] o = 250) al macroCTA de HPMA-PDS disuelto en N,N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA al solvente) . El iniciador de radicales AIBN es agregado con una proporción de CTA a iniciador de 10 a 1. La polimerización se deja proceder bajo una atmósfera de nitrógeno por 8 horas a 68°C. Después de esto, el polímero dibloque resultante es aislado mediante precipitación de 4 veces en el éter dietílico/pentano 50:50, redisolviendo en etanol entre precipitaciones . El producto es luego lavado 1 vez con éter dietílico y secado toda la noche a vacío.
C. Conjugación de AR si al copolímero de HPMA-PDSMA Se obtuvo el ARNsi tiolado comercialmente (Agilent, Boulder, CO) como un ARN dúplex con una hebra en sentido 5' modificada con disulfuro. La forma de tiol libre para la conjugación es preparada mediante la disolución del compuesto liofilizado en agua y tratado por 1 hora con el agente reductor de disulfuro, TCEP, inmovilizado dentro de un gel de agarosa. El ARN reducido (400 µ?) se hizo luego reaccionar por 24 horas con el polímero funcionalizado con disulfuro de piridilo en el amortiguador fosfato (pH 7) que contenía el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM.
La reacción del polímero de disulfuro de piridilo con el tiol de ARN crea la 2-piridintiona, la cual puede ser espectrofotométricamente medida para caracterizar la eficiencia de la conjugación. Para validad adicionalmente el intercambio de disulfuro, los conjugados son corridos sobre un gel de tricina de 16.5% de SDS-PAGE. En paralelo, alícuotas de las reacciones de conjugación se tratan con TCEP inmovilizado antes de SDS-PAGE para verificar la liberación del ARN desde el polímero en un ambiente reductor. Las reacciones de conjugación son conducidas a estequiometrías de polímero/AR de 1, 2, y 5. Las mediciones de absorbancia espectrofotométricas de UV a 343 nm para la liberación de 2-piridintiona se utilizan para medir las eficiencias de conjugación.
Ejemplo 3: Síntesis de los polímeros con agentes de dirección a las células: reacción Click del polímero terminado azido con folato de propargilo.
Se utiliza una combinación de la polimerización controlada por radicales y la química click de azida-alquino, para preparar las micelas del copolímero en bloque conjugadas con ligandos biológicos (por ejemplo, folato) con el potencial para activar la dirección al objetivo de tejidos específicos/células que contienen el receptor específico de interés (por ejemplo, folato) . , Los copolímeros en bloque son sintetizados mediante la polimerización de transferencia de cadena con fragmentación de adición reversible (RAFT) como se describe en Ejemplo 1, excepto que se utiliza un agente de transferencia de cadena tipo azido (CTA) . El extremo azido del polímero se hace luego reaccionar con el derivado de alquino del agente de dirección al objetivo (por ejemplo, folato) para producir el polímero que contiene el agente de dirección al objetivo.
Síntesis del agente RAFT.
El agente de transferencia de cadena RAFT (CTA) éster 3 -azidopropílico del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2 -metil-propiónico (C12-CTA 3) es preparado como sigue: ! Síntesis de 3 -Azidopropanol . El 3 -Cloro- 1-propanol (5.0 g, 53 mmol, 1.0 equiv) y la azido de sodio (8.59 g, 132 mmol, 2.5 equiv) se hacen reaccionar en DMF (26.5 mi) a 100°C por 48 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se vacía dentro de éter etílico (200 mi) , y se extrae con una solución acuosa saturada de NaCl (500 mi) . La capa orgánica se separa, se seca sobre gS04, y se filtra. El sobrenadante se concentra para obtener el producto (5.1 g, 95% de rendimiento) .
Síntesis del cloruro del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2 -metilpropiónico (DMP-Cl) . El ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfaníl-2-metil-propiónico (DMP, Noveon >95%) (1.0 g, 2.7 mmol, 1.0 equiv) se disuelve en cloruro de metileno (15 mi) en un matraz de fondo redondo de 50 mi, y la solución se enfría hasta aproximadamente 0°C. Se agrega lentamente cloruro de oxalilo (0.417 g, 3.3 mmol, 1.2 equiv) bajo una atmósfera de nitrógeno, y la solución se deja alcanzar la temperatura ambiente y se agita por un total de 3 horas. La solución resultante se concentra bajo presión reducida para producir el producto de cloruro de ácido (1.0 g, 99% rendimiento) . Punto de fusión 63°C.
Síntesis del ácido 3 -azidopropílico del éster 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metilpropiónico. El 3 -Azidopropanol (265 mg, 2.62 mmol, 1.0 equiv) se disuelve en cloruro de metileno (5 mi) en un matraz de fondo redondo de 50 mi, y la solución se enfría hasta aproximadamente 0°C. Una solución de trietilamina (0.73 mi) en cloruro de metileno (5 mi) se agrega gota a gota en 10 minutos. Se agrega gota a gota una solución de DMP-C1 (1.0 g, 2.6 mmol) en cloruro de metileno (5 mi), y la solución se deja alcanzar la temperatura ambiente mientras que se agita por 3 horas. La solución se concentra bajo presión reducida, se diluye con éter etílico (100 mi) , y se lava con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 mi) , agua (50 mi) , y solución saturada de NaCl (50 mi) , sucesivamente. La capa orgánica se separa, se seca sobre MgS04 (1.0 g) , y se filtra. El sobrenadante se concentra bajo presión reducida para producir el producto (1.05 g, 90% rendimiento) como un aceite residual.
Síntesis del folato de propargilo.
El ácido fólico (1.0 g, 0.0022 mol) se disuelve en DMF (10 mi) y se enfría en un baño de agua/hielo. Se agregan N-Hidroxisuccinimida (260 mg, 0.0025 mol) y EDC (440 mg, 0.0025 mol), y la mezcla resultante se agita en un baño de hielo por 30 minutos para dar un precipitado blanco. Se agrega una solución de propargilamina (124 mg, 2.25 mmol) en DMF (5.0 mi), la mezcla resultante se deja calentar hasta la temperatura ambiente y se agita por 24 horas. La mezcla de reacción se vacía en agua (100 mi) y se agita por 30 minutos para formar un precipitado. El precipitado naranja-amarillo se filtra, se lava ¡ con acetona, y se seca a vacío por 6 horas para producir 1.01 g del producto (93% rendimiento) .
Reacción Click de los polímeros terminados en azido con folato de propargilo.
El polímero terminado en azido se hace reaccionar con folato de propargilo mediante el siguiente procedimiento ejemplar. Una solución de N3-a- [Dg-Xt] b- [Bx-Py-D2]a-G) (0.0800 mmol) en DMF (7 mi), y pentametildietilentriamina (PMDETA, Aldrich, 99%), (8.7 mg, 0.050 mmol) se purga con nitrógeno por 60 minutos ' se transfiere vía una jeringa a un frasco equipado con una barra de agitación magnética que contiene CuBr (7.2 mg, 0.050 mmol) y folato de propargilo (42 mg, 0.088 mmol,) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a 26 °C por 22 horas en ausencia de oxígeno. La mezcla de reacción se expone a aire, y la solución se pasa a través de una columna de alúmina neutra. La DMF se elimina a vacío, y el producto se precipita en hexanos . El copolímero en bloque resultante terminado en folato, folato- - [Da-Xt] b- [Bx-Py-Dz] 3-? se disuelve en THF y se filtra para eliminar el folato de propargilo en exceso. El THF se elimina, y luego el polímero se disuelve en agua desionizada (DI) y se dializa por 6 horas utilizando una membrana con un corte de peso molecular de 1000 Da. El polímero se aisla mediante liofilización . | Ejemplo 4: espectroscopia de RMN del copolímero en bloque PRx0729v6., (Figuras 2A y 2B) Este ejemplo proporciona evidencia, utilizando espectroscopia de RMN, de que el polímero PRx0729v6 forma una estructura en forma de micela en solución acuosa.
Los espectros de RMN ?? fueron registrados sobre un aparato Bruker AV301 en cloroformo deuterado (CDC13) y agua deuterada (D20) a 25°C. Se utilizó un candado de deuterio (CDC13, D20) , y los desplazamiento químicos fueron determinados en ppm a partir de tetrametilsilano (para CDC13) y la sal sódica del ácido 3- (trimetilsilil) propiónico-2 , 2 , 3 , 3-d4 , (para D20) . La concentración del polímero fue de 6 mg/ml.
La espectroscopia de RMN del polímero sintetizado, utilizando el polímero PRx0729v6 como un ejemplo, en amortiguador acuoso proporcionó evidencia de que los polímeros dibloque de la presente invención forman micelas en solución acuosa. La formación de micelas da como resultado la formación de un núcleo interno viscoso, protegido, que restringe el movimiento de los protones que forman los segmentos del núcleo, y previene el intercambio de deuterio entre el solvente y los protones del núcleo. Esto es reflejado por una supresión de la significancia o desaparición de la señales de RMN de los protones correspondientes . Se utilizó esta propiedad inherente de la espectroscopia de RMN en solución para mostrar que el bloque hidrofóbico del núcleo de la micela es efectivamente blindado. Si las micelas son formadas en medios acuosos, debería ocurrir una desaparición de las señales debidas a los protones del bloque copolimérico hidrofóbico.
Las Figuras 2A y 2B muestran los experimentos de RMN XH del polímero PRx0729v6 en CDC13 (solvente orgánico) y D20 (solvente acuoso) . El espectro de RMN 1H del polímero en CDC13 a temperatura ambiente (Fig. 1A) muestra las señales atribuidas a todos los protones del polímero que indican que las cadenas poliméricas permanecen dispersas (no agregadas) en CDC13 y preservan su movimiento de modo que sus protones pueden intercambiarse con el solvente. Esto Índica que las micelas estables con los núcleos blindados no son formadas a partir de PRx0729v6 en solvente orgánico. La Figura 2B muestra los espectros de RMN XH de PRx0729v6 en D20. Las señales que representan los protones del bloque hidrofóbico (BMA, PAA, DMAEMA) desaparecen del espectro. Esto indica que las micelas estables con núcleos blindados son formadas a partir de PRx0729v6 en solución acuosa. Además, en el mismo espectro, la señal atribuida a la resonancia de los protones de los dos grupos metilo del DMAEMA (2.28 ppm) sufre una supresión significativa, lo que implica que únicamente el primer bloque poliDMAEMA que constituye la envoltura es expuesto al agua, por ejemplo, principalmente el grupo cargado de DMAEMA. Un cálculo simple indica que el porcentaje integrado de PAA, DMAEMA del bloque hidrofóbico (2900) substraído de la señal del CDCI3 (5600) da el valor aproximado para la misma señal en D20 (2811) , consistente con esta conclusión.
Tomados conjuntamente, los resultados de los experimentos de RMN indican que el polímero PRx0729v6 forma micelas con una estructura del núcleo-envoltura ordenada, donde el primer bloque poliDMAEMA forma i una envoltura externa hidratada que rodea un núcleo compuesto de unidades hidrofóbicas (BMA) y que estabiliza electrostáticamente las unidades de carga opuesta (PAA, DMAEMA) .
Ejemplo 5: Determinación de la dispersión dinámica de luz (DLS) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 formado en complejo con el ARNsi. (Figura 3) .
El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 forma partículas uniformes de un tamaño de 45 nm ya sea solas o de tamaño de 47 nm después del enlace al ARNsi. ' Los tamaños de partícula del polímero solo o de los complejos polímero/ARNsi fueron medidos mediante dispersión dinámica de luz utilizando un aparato Malvern Zetasizer Nano ZS. Los polímeros fueron medidos en solución salina amortiguada con fosfato, de pH 7.4 (PBS) a 1 mg/ml para PRx0729v6 solo o a 0.7 mg/ml de PRx0729v6 formado en complejo con el mer-ARNsi 21 específico de GAPDH 1 µ? (Ambion) , con una proporción de carga teórica de 4:1, cargas positivas sobre el polímero: cargas negativas sobre ARNsi. PRx0729v6 solo (45 nm) y PRx0729v6 formado en complejo con ARNsi (47 nm) (Figura 3) muestran tamaños de partícula similares con una distribución casi uniforme, PDI <0.1.
Ejemplo 6: Análisis de desplazamiento en gel de los complejos polímero PRx0729v6 / ARNsi a diferentes proporciones de carga. (Figura 4) El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 se enlaza al ARNsi a diversas proporciones de carga, dando como resultado un complejo con movilidad electroforética reducida.
El enlace del ARNsi polimérico fue analizado mediante electroforesis en gel (Figura 4) y demuestra que el ARNsi completo que se enlaza al polímero ocurre a una proporción de carga polímero/ARNsi de 4:1 y mayor.
Ejemplo 7. Concentración de estabilidad crítica (CSC) del polímero PRx0729v6. (Figura 5) El siguiente ejemplo demuestra que la propiedad de la partícula micelar del polímero PRx0729v6 es estable a una dilución de 100 veces.
El polímero PRx0729v6 se disolvió en amortiguador PBS de pH 7.4 a una concentración de 1 mg/ml ± NaCl 0.5 M. El tamaño de partícula fue medido mediante dispersión dinámica de luz sobre un intervalo de 5 veces de las diluciones en serie desde 1 mg/ml hasta 1.6 µq/tl con PBS ± NaCl 0.5 M. La Figura 5 muestra que un tamaño de partícula de aproximadamente 45 nm es estable hasta una concentración de aproximadamente 10 yg/ml. El polímero PRx0729v6 parece ser inestable por debajo de aproximadamente 5 g/ml (la concentración de estabilidad crítica o CMC) , donde las cadenas poliméricas individuales se disocian y forman agregados no específicos.
Ejemplo 8. Estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en solventes orgánicos. (Figura 6) ¡ Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6 es disociada en solventes orgánicos, consistente con la naturaleza hidrofóbica del núcleo de la micela .
El polímero PRx0729v6 se disolvió en diversos solventes orgánicos a una concentración de 1 mg/ml y el tamaño de partícula fue medido mediante dispersión dinámica de luz. La Figura 6 muestra que la concentración cada vez mayor de la dimetilformamida (DMF) da como resultado disociación micelar a las cadenas agregadas .
Ejemplo 9: Conjugación de ARNsi con un montaje micelar.
A. Conjugación del ARNsi de doble hebra con el copolímero en bloque que contiene tiol.
El ARNsi -piridildisulfuro fue preparado mediante la disolución del amino-ARNsi a 10 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.2 u otros amortiguadores no aminados, por ejemplo, borato, Hepes, bicarbonato con el pH en el intervalo apropiado para la modificación del éster del NHS (pH 7-9) . SPDP se disolvió a una concentración de 6.2 rag/ml en DMSO (solución de reserva de 20 mM) , y 25 µ? de la solución de reserva de SPDP se agregaron a cada mi del amino-AR si que va a ser modificado. La solución se mezcló y se hizo reaccionar por al menos 30 minut s a temperatura ambiente. Tiempos de reacción más prolongados (incluyendo toda la noche) no afectaron de manera adversa la modificación. El ARN modificado (disulfuro de piridilo) fue purificado a partir de los subproductos de reacción mediante diálisis (o filtración en gel) utilizando fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.15 M, EDTA 10 mM, pH 7.2. El ARNsi-piridildisulfuro preparado se hace reaccionar a una proporción molar 1:5 con el polímero PRx0729v6 ; (que contiene un tiol libre en el extremo ?) en presencia de EDTA 10-50 mM en PBS, pH 7.2. El grado de la reacción fue monitorizado espectrofotométricamente por la liberación de la piridin-2-tiona y mediante electroforesis en gel.
B. Conjugación del ARN de una sola hebra con el polímero, seguido por el recocido de la segunda hebra.
El conjugado de ARN-piridildisulfuro de una sola hebra fue preparado utilizando el procedimiento del ejemplo anterior, comenzando con un ARN modificado con amino, de una sola hebra. Después del acoplamiento del ARN-piridildisulfuro con la micela del copolímero en bloque, la hebra de ARN complementaria es agregada a la mezcla de reacción, y las dos hebras se dejan recocer por 1 hora a una temperatura de aproximadamente 20 °C por debajo de la Tm del ARN dúplex.
Ejemplo 10: Actividad de knockdown de los complejos ARNsi -montaje micelar en las células de mamífero cultivadas. (Figuras 7A-7C y Figuras 12A y 12B) .
La actividad de knockdown (KD) de los complejos ARNsi/polímero PRx0729v6 fue evaluada en el formato de 96 pocilios mediante la medición de la expresión específica del gen después de 24 horas de tratamiento con los complejos PRx0729v6 : ARNsi . El polímero y ARNsi que se dirige a GAPDH o el ARNsi control negativo (Ambion) fueron mezclados en 25 µ? para obtener diversas proporciones de carga y diversas concentraciones a 5 veces sobré la concentración de transfección final y se dejaron formar un complejo por 30 minutos antes de la adición a las células HeLa en 100 µ? de medio normal que contenía 10% de FBS . Las concentraciones de ARNsi finales fueron evaluadas a 100, 50, 25, y 12.5 nM. El polímero se agregó ya sea a las proporciones de carga 4:1, 2:1 o 1:1, o a concentraciones de polímero fijas de 18, 9, 4.5, y 2.2 pg/ml, para determinar cuáles condiciones dan como resultado la actividad KD más alta. Para las proporciones de carga (Figura 7A) , los complejos fueron preparados a concentraciones más altas, incubados por 30 minutos, y luego diluidos en serie a 5 veces sobre la concentración mostrada sobre las gráficas, justo antes de la adición a las células. Para la concentración fija de polímero (Figura 7B) , el ARNsi y el polímero fueron formados en complejo a concentraciones 5 veces superiores mostradas en la gráfica, incubados por 30 minutos y luego agregados a las células para las concentraciones finales mostradas. La Figura 7C es el control negativo. El AR total fue aislado 24 horas después del tratamiento y la expresión de GAPDH fue medida con relación a los 2 genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados en las Figuras 7A-7C y en la Figura 12A y en la Figura 12B indican una actividad >60% de KD (sombreado) obtenida con PRx0729v6 a 9 yg/ml y concentraciones más altas a todas las concentraciones de ARNsi probadas. Esta concentración fue coincidente con la formación de micelas estables a partir de los análisis del tamaño de partícula. La alta actividad de KD fue observada con 4.5 yg/ml de PRx0729v6/ ARNsi 12.5 nM únicamente cuando los complejos fueron preparados a alta concentración y diluidos en serie (proporción de carga 4:1) en comparación a la formación del complejo a concentración más baja (concentración fija de polímero de 4.5 yg/ml). Adicionalmente, únicamente el ARNsi 100 nM con 4.5 yg/ml de PRx0729v6 mostró alta actividad de KD, mientras que las concentraciones más bajas del ARNsi no lo hicieron. En resumen, las micelas de PRx0729v6 fueron estables a una dilución hasta ~10 y la actividad de KD se pierde por debajo de ~5 pg/ml, indicando que se requieren micelas estables para la buena actividad de KD.
Ejemplo 11: Actividad de knockdown de los complejos ARNsi de GAPDH-polímero de sustrato portador, en células de mamífero cultivadas.
La actividad de knockdown (KD) de los complejos AR si/polímero de sustrato portador, específicos de GAPDH es evaluada en un formato de 96 pocilios mediante la medición de la expresión del gen de GAPDH después de 24 horas de tratamiento con el polímero: Complejos de ARNsi cortadores de GAPDH. La secuencia de ARNsi cortadora de GAPDH es: hebra en sentido: rGrGrUrCrArUrCrCrArürGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC , hebra antisentido : rGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrU . El polímero y el ARNsi que se dirige a GAPDH o el ARNsi control negativo (IDT) son mezclados en 25 µ? para obtener diversas proporciones de carga y concentraciones a 5 veces sobre la concentración de transfección final y se deja formar en complejo por 30 minutos antes de la adición a las células HeLa en 100 µ? de medio normal que contiene 10% de FBS . Las concentraciones de AR si finales son examinadas a 100, 50, 25, y 12.5 nM. El polímero es agregado a cualquiera de las proporciones de carga de 4:1, 2:1 o 1:1, o concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10, y 5 g/ml para determinar cuál condición da como resultado la más alta actividad de KD. El ARN total es aislado 24 horas después del tratamiento y la expresión del GAPDH es medida con relación a 2 genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados müejstran >60% de actividad de KD obtenida con el polímero ja 10 g/ml, y concentraciones más altas a todas las concentraciones de ARNsi probadas. Esta concentración del polímero es coincidente con la formación estable de micelas a partir de los análisis del tamaño de partícula.
Ejemplo 12: Actividad de knockdown de los complejos ARNsi del ApoBlOO -polímero en células de mamífero cultivadas.
La actividad de knockdown (KD) del ARNsi específico de ApoBlOO o el ARNsi del sustrato portador formado en complejo con el polímero, es evaluada en un formato de 96 pocilios mediante la evaluación de la expresión del gen de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con el polímero: complejos de ARNsi de ÁpoB. La secuencia de ARNsi de ApoBlOO es: hebra en sentido: 5 ' -rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-3 ' , hebra antisentido : 5 ' -rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3 ' . La secuencia del ARNsi de sustrato portador de ApoBlOO es: hebra en sentido: 5'-rGrArArUrGrürGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA, hebra antisentido : 5 ' -rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-31. El polímero y el ARNsi que se dirige a ApoB o el ARNsi control negativo (IDT) son mezclados en 25 µ? para obtener diversas proporciones de carga y concentraciones a 5 veces sobre la concentración de transfección final y se deja formar en complejo por 30 minutos antes de la adición a las células HepG2 en 100 µ? de medio normal que contiene 10% de FBS . Las concentraciones de ARNsi finales son examinadas a 100, 50, 25, y 12.5 nM. El polímero es agregado a cualquiera de las proporciones de carga de 4:1, 2:1 o; 1:1, o concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10, y 5 g/ml para determinar cuál condición da como resultado la más alta actividad de KD. El ARN total es aislado 24 horas después del tratamiento y la expresión del ApoBlOO es medida con relación a 2 genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados muestran >60% de actividad de KD obtenida con el polímero a 10 yg/ml, y concentraciones más altas a todas las concentraciones de ARNsi probadas. Esta concentración del polímero es coincidente con la formación estable de micelas a partir de los análisis del tamaño de partícula.
Ejemplo 13: Actividad de knockdown de los complejos ARNsi de ApoBlOO - polímero en un modelo de ratón La actividad de knockdown de los complejos de ARNsi específica de ApoBlOO/polímero es determinada en un modelo de ratón mediante la medición de la expresión ApoBlOO en tejido hepático y los niveles de colesterol en suero. Los ratones Balb/C son dosificados intravenosamente vía la vena de la cola con 1, 2 o 5 mg/kg de ARNsi específico de ApoB formado en complejo con el polímero a una proporción de carga de 1:1, 2:1 o 4:1 (polímero: ARNsi) o control salino. 48 horas después de la dosis final los ratones son sacrificados y se aislan muestras de sangre y de hígado. Los niveles de colesterol se miden en suero.
El ARN total es aislado del hígado y se mide la expresión de ApoBlOO con relación a 2 genes normalizadores , HPRT y GAPDH mediante PCR cuantitativa. i Ejemplo 14. Actividad de knockdown de los complejos oligonucleótidos de ADN antisentido de ApoBlOO - polímero en células de mamífero cultivadas.
La capacidad de knockdown (KD) del oligonucleótido de ADN antisentido específico de ApoBlOO, formado en complejo con el polímero, es evaluada en un formato de 96 pocilios mediante la medición de la expresión del gen de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con el polímero: complejos del oligonucleótido de ADN antisentido de ApoB. Dos oligonucleótidos antisentido de ApoBlOO específicos para ApoB de ratón son: 5 ' -GTCCCTGAAGATGTCAATGC- 31 , posición 541 de la región de codificación y 5 ' -ATGTCAATGCCACATGTCCA-31 , posición 531 de la región de codificación El polímero y un oligonucleótido de ADN antisentido que se dirige a ApoB o el oligonucleótido de ADN control negativo (secuencia revuelta) se mezclan en 25 µ? para obtener diversas proporciones de carga y concentraciones a 5 veces sobre la concentración de transfección final, y se deja formar un complejo por 30 minutos después de la adición a las células HepG2 en 100 µ? de medio normal que contiene 10% de FBS . Las concentraciones finales del oligonucleótido son examinadas a 100, 50, 25, y 12.5 nM. El polímero es agregado a proporciones de carga ya sea de 4:1, 2:1 o 1:1, o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10, y 5 µ?/t??, para determinar cuál condición da como resultado la actividad de KD más alta. El ARN total es aislado 24 horas después del tratamiento y se mide la expresión de ApoBlOO con relación a 2 genes normalizadores internos, RPL13 A y HPRT, mediante PCR cuantitativa.
Ejemplo 15: Demostración de la actividad de desestabilización de la membrana de los montajes micelares y sus complejos de AR si (Figuras 8A-8B) . 1 La actividad de desestabilización de membrana que responde al pH, fue evaluada mediante la titulación del polímero solo o los complejos de PRx0729v6 : ARNsi en preparaciones de células sanguíneas rojas humanas (RBC) y determinando la actividad lítica de la membrana medíante liberación de la hemoglobina (lectura de absorbancia a 540 nm) . Se utilizaron tres diferentes condiciones de pH para imitar los ambientes de pH endosomales (pH extracelular = 7.4, endosoma temprano = 6.6, endosoma tardío = 5.8) . Las células sanguíneas rojas humanas (RBC) fueron aisladas mediante la centrifugación a partir de sangre completa recolectada en recipientes a vacío (vaccutainers) que contienen EDTA. El RBC fue lavado 3 veces en solución salina normal, y llevadas a una concentración final de 2% de RBC en PBS a pH específico (5.8, 6.6 o 7.4). PRx0729v6 sola o el complejo de PRx0729v6/ARNsi fue probada a concentraciones justo por arriba y por debajo dé la concentración de estabilidad crítica (CSC) como se muestra (Figura 5) . Para el complejo polimero/ARNsi , se agregó ARNsi 25 nM a PRx0729v6 a proporciones de carga de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 (mismas concentraciones del polímero para el polímero solo) . Las soluciones del polímero solo o dé los complejos del polímero-ARNsi fueron formadas a una concentración evaluada final de 20X por 30 minutos, y diluidas en cada preparación de RBC. Dos preparaciones diferentes de la reserva del polímero PRx0729v6 fueron comparadas para estabilidad de actividad a 9 y 15 días después de la preparación, almacenadas a 4°C desde el día i de la preparación. Las RBC con el polímero solo o el complejo polímero/AR si fueron incubadas a 37 °C por 60 minutos y centrifugadas para eliminar las RBC intactas. Los sobrenadantes fueron transíectados a cubetas y se determinó la absorbancia a 540 nm. El porcentaje de hemolisis es expresado como A540 de la muestra/A540 de RBC tratadas con Tritón X-100 al 1% (control para 100% de Lisis) . Los resultados muestran que PRx0729v6 solo (Figura 8A) o el complejo PRxO729v6/ARNsi (Figura 8B) es no hemolítico a un pH 7.4 , y se vuelve cada vez más hemolítico a valores de pH más bajos asociados con endosomas y a más altas concentraciones de polímero.
Ejemplo 16: Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) del polímero PRx0729v6. (Figura 9) Este ejemplo proporciona evidencia, utilizando espectroscopia de electrones, que el polímero PRx0729v6 forma partículas en forma de micelas esféricas.
Una solución a 0.5 mg/ml del polímero PRx0729v6 en PBS se aplicó a una rejilla de cobre recubierta con carbono, por 30 minutos. La rejilla fue fijada en solución de Karnovsky y lavada en amortiguador de cacodilato^ una vez, y luego en agua 8 veces. La rejilla fue teñida con una solución al 6% de acetato de uranilo por 15 minutos, y luego se secó hasta el análisis. Fue llevada a cabo la microscopía electrónica de transmisión (TEM) sobré un microscopio JEOL. La Figura 9 muestra una micrografía electrónica típica del polímero PRx0729v6 que demuestra las partículas esféricas con dimensiones aproximadas similares a aquellas determinadas en solución mediante dispersión dinámica de luz. í Ejemplo 17. Microscopía de fluorescencia de la absorción celular y distribución intracelular de los complejos polímero-ARNsi . (Figuras 10A y 10B) Este ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 puede mediar una absorción celular más eficiente del ARNsi marcado fluorescentemente, y la liberación endosomal que un reactivo de transfección basado en lípido.
Las células HeLa fueron sembradas en placa sobre un cubreobjetos con cámara. Después de la incubación toda la noche, las células fueron transíectadas ya sea con FAM-AR si 100 nM/lipofectamina 2000 o con FAM 100 nM-ARNsi a una proporción de carga de Polímero-AR si de 4:1. Los Complejos fueron formados en PBS pH 7.4 por 30 minutos a una concentración 5X, agregados a las células para la concentración final IX, e incubados toda la noche. Las células fueron teñidas con DAPI (para la visualización de los núcleos) por 10 minutos y luego fijadas en 3.7% de formaldehído-?? PBS por 5 minutos, y lavadas con PBS. Las muestras fueron formadas en imagen con un microscopio fluorescente Zeiss Axiovert. La Figura 10B muestra la microscopía de fluorescencia de la absorción celular y la distribución intracelular del polímero-ARNsi , en comparación a la lipofectamina (Figura 10A) . La tinción de las partículas de los complejos de lipofectamina-AR si sugiere una localización endosomal, mientras que la tinción citoplásmica difusa de los complejos polímero-ARNsi indican que éstos han sido liberados de los endosomas hacia el citoplasma.
Ejemplo 18. Absorción de las moléculas hidrofóbicas pequeñas dentro de los montajes micelares del polímero PRx0729v6.
Este ejemplo demuestra que las moléculas hidrofóbicas pequeñas son recogidas por el núcleo micelar predominantemente hidrofóbico del polímero PRx0729v6.
La formación de las micelas poliméricas con o sin AR si es confirmada mediante una técnica de sonda de fluorescencia utilizando pireno (Ci6Hi0, MW = 202) , en la cual la división del pireno dentro del núcleo micelar podría ser determinada utilizando la proporción de 2 máximos de emisión del espectro del pireno. El espectro de emisión de fluorescencia del pireno en la solución micelar del polímero es medida desde 300 hasta 360 nm utilizando una longitud de onda de excitación física de 395 nm con una concentración constante de pireno de 6 x 10"7 . El polímero varía de 0.001% hasta 20% (p/p) con o sin ARNsi 100 nM. Los datos espectrales son adquiridos utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Varían. Todos los experimentos de fluorescencia son llevados a cabo a 25 °C.
La concentración micelar crítica (CMC) es determinada mediante el trazado gráficamente de la proporción de intensidad I336/I333 como una función de la concentración del polímero .
Similarmente , un fármaco de molécula pequeña modelo, el dipiridamol (2- { [9- (bis (2-hidroxietil) amino) -2 , 7-bis (1-piperidil) -3,5,8, 10-tetrazabiciclo [4.4.0] deca-2,4,7,9, ll-penten-4 -il] - (2-hidroxietil) amino}etanol ; C24H4o 80 , PM = 505) es incorporado dentro del núcleo de la micela de PRx0729v6 como sigue. El polímero (1.0 mg) y el dipiridamol (DIP) (0.2 mg) se disuelven en THF (0.5 ml) . Se agrega gota a gota agua desionizada (10 ml) y la solución se agita a 50 °C por 6 horas para incorporar el fármaco dentro del núcleo hidrofóbico de la micela. La solución (2.5 ml) se divide, y la absorbancia¡ del dipiridamol se mide a 415 nm mediante espectroscopia de UV-vis a 25 y 37°C. Las mediciones control también son conducidas mediante la medición de la reducción dependiente del tiempo en la absorbancia del dipiridamol en agua desionizada en ausencia del copolímero. La absorbancia a 25 y 37°C se mide para cada punto de tiempo, y el valor se sustrae de aquel observado en la solución.
Ejemplo 19. Efecto del pH sobre la estructura del polímero. (Figuras 11A y 11B) Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6.2 es disociada después de disminuir el pH de 7.4 a 4.7.
El tamaño de partícula del polímero PRx0729v6.2 fue medido mediante dispersión dinámica de luz a un pH 7.4 y una serie de valores de pH ácido hasta pH 4.7 en PBS, a diluciones seriales de 5 veces desde 0.5 mg/ml - 0.004 mg/ml .
La Figura 11A muestra que a un pH 7.4, el polímero es estable a la dilución hasta 4 µg/ml donde éste comienza a disociarse a una forma que produce agregados . La Figura 11B muestra que a valores de pH cada vez más ácidos hasta pH 4.7, la disociación del polímero desde una estructura micelar es aumentada, es decir, ocurre a más altas concentraciones del polímero, y produce niveles cada vez mayores de monómeros poliméricos de un tamaño de 1-8 nm . ¡ Ejemplo 20: Métodos por conjugar los ligandos de dirección al objetivo y los polinucleótidos a un copolímero Los siguientes ejemplos demuestran los métodos para conjugar un ligando de dirección al objetivo (por ejemplo, galactosa) o un agente terapéutico polinucleotídico (por ejemplo ARNsi) a un copolímero dibloque. (1) El polímero es preparado utilizandp la transferencia de cadena de fragmentación de adición reversible (RAFT) (Chiefari et al. Macromolecules . 1998 ; 31 (16) : 5559-5562 ) para formar un copolímero dibloque, funcionalizado en el extremo con galactosa, utilizando un agente de transferencia de cadena con galactosa como el sustituyente del grupo R. (2) El primer bloque de un copolímero dibloque es preparado como un copolímero que contiene la N-hidroxisuccinamida del ácido metilacrílico (MAA(NHS) ) donde una galactosa-PEG-amina es conjugada a los grupos NHS, o donde un ARNsi amino-disulfuro es conjugado al NHS, o donde la piridil-disulfuro-amina se hace reaccionar con los grupos NHS para formar un disulfuro de piridilo que se hace reaccionar subsecuentemente con el ARN tiolado para formar un conjugado polímero-ARN.
Ejemplo 20.1: Preparación de galactosa-PEG-amina y galactosa-CTA El esquema de reacción 1 ilustra el esquema de síntesis para la galactosa-PEG-amina (compuesto 3) y la galactosa-CTA (agente de transferencia de cadena) (compuesto 4) .
Compuesto 1: Pentaacetato-galactosa (10 g, 25.6 mmol) y 2- [2- (2-Cloroetoxi) etoxi] etanol (5.6 mi, 38.4 mmol) se disolvieron en CH2C12 anhidro (64 mi) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora.| Se agregó el BF3.OEt2 (9.5 mi, 76.8 mmol) a la mezcla previa gota a gota en 1 hora en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (TA) por 48 horas. Después de la reacción, se agregaron 30 mi de CH2C12 para diluir la reacción. La capa orgánica se neutralizó con NaHC03(ac) saturado, se lavó con salmuera y luego se secó con MgS04. El CH2C12 se eliminó bajo presión reducida para obtener el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea en columna para obtener el producto final 1 como un aceite amarillo claro.
Rendimiento: 55% TLC (I2 y p-Anisaldehído) : EA/Hex : 1/1 (Rf: ß = 0.33; = 0.32; S.M sin reaccionar 0.30) .
Compuesto 2 : El compuesto 1 (1.46 g, 2.9 mmol) se disolvió en DMF seco (35 mi) y se agregó NaN3 (1.5 g, 23.2 mmol) a la mezcla a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 85-90°C toda la noche. Después de la reacción, se agregó EA (15 mi) a la solución, y se utilizó agua (50 mi) para lavar la capa orgánica 5 veces. La capa orgánica se secó sobre MgS0 y se purificó mediante cromatografía instantánea en columna para obtener el compuesto 2 como un aceite incoloro. Rendimiento: 80%, TLC (I2 y p-Anisaldehído): EA/Hex : 1/1 (Rf: 0.33).
Compuesto 3 : El Compuesto 2 (1.034 g, 2.05 mmol) se disolvió en MeOH (24 mi) y se burbujeó con N2 por 10 minutos y luego se agregaron Pd/C (10%) (90 mg) y TFA (80 µ?) a la solución previa. La mezcla de reacción se burbujeó nuevamente con H2 por 30 minutos, y luego la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno por otras 3 horas. El Pd/C se eliminó con celite y el MeOH se evaporó para obtener el compuesto 3 como un gel pegajoso. El compuesto 3 puede ser utilizado sin purificación adicional. Rendimiento: 95%. TLC (p- Anisaldehído) : MeOH/CH2Cl2 : 1/4 (Rf: 0.05).
Compuesto 4: ECT (0.5 g, 1.9 mmol), NHS (0.33 g, 2.85 mmol) y DCC (0.45 g, 2.19 mmol) se disolvieron en CHCI3 (15 mi) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó continuamente a temperatura ambiente toda la noche . El Compuesto 3 (1.13 g, 1.9 mmol) y TEA (0.28 mi, 2.00 mmol) en CHCI3 (10 mi) se agregaron lentamente a la reacción previa a 0°C. La mezcla de reacción se agitó continuamente a temperatura ambiente toda la noche. El CH3C1 se eliminó bajo presión reducida y el producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea en columna para obtener el compuesto 4 como un gel amarillo. Rendimiento (35%) . TLC : MeOH/ CH2C12 : 1/9 (Rf : 0.75) Esquema 1. Síntesis de galactosa-PEG-amina (cpd 3) y galactosa- CTA (cpd 4) Ejemplo 20.2: Síntesis de [DMAEMA] - [BMA-PAA-DMAEMA] A. Síntesis de DMAEMA macroCTA.
Polimerización: en un frasco de vidrio de 20 mi (con un Septa Cap) se agregó 33.5 mg de ECT (RAFT CTA) , 2.1 mg de AIBN (recristalizado dos veces a partir de metanol) , 3.0 g de DMAE A (Aldrich, 98%, se hizo pasar a través de una columna de alúmina pequeña justo antes del uso para eliminar el inhibidor) y 3.0 g de DMF (alta pureza sin inhibidor) . El frasco de vidrio se cerró con el Septa Cap y purgó con nitrógeno anhidro (llevado a cabo en un baño de hielo bajo agitación) por 30 min. El frasco de reacción se colocó en un bloque de reacción precalentado a 70°C. La mezcla de reacción se agitó por 2 horas 40 minutos. El Septa Cap Se abrió y la mezcla se agitó en el frasco en un baño de hielo por 2-3 minutos para detener la reacción de polimerización.
Purificación: 3 mi de acetona se agregaron a la mezcla de reacción. En un recipiente de 300 mi se agregaron 240 mi de hexano y 60 mi de éter (80/20 (v/v) ) y bajo agitación la mezcla de reacción se agregó gota a gota al recipiente. Inicialmente , esto produce un aceite que se recolecta mediante centrifugación de la solución turbia; rendimiento = 1.35 g (45%). Se realizaron varias precipitaciones (por ejemplo, 6 veces) en los solventes mixtos de hexano/éter (80/20 (v/v)) a partir de la solución de acetona. Finalmente, el polímero se secó a vacío por 8 horas a temperatura ambiente; rendimiento aproximadamente 1 g. Resumen: (Mn, teórico = 11,000 g/mol a 45% de conv.) Nombre FW (g/mol) Equiv. mol Peso Peso Efectivo DMAEMA 157.21 150 0.0191 3.0 g 3.01 g ECT 263.4 1 1.2722x10"" 33.5 mg 33.8 mg AIBN 164.21 0.1 1.2722xl0"5 2.1 mg 2.3 mg DMF = 3.0 g; se purga con N2 : 30 minutos; Conducir polimerización a 70°C por 2 horas 45 minutos.
B. Síntesis de [BMA-PAA-DMAEMA] de DMAEMA macroCTA Todos los productos químicos y reactivos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich Company a no ser que se especifique de otro modo. El metacrilato de butilo (BMA) (99%), metacrilato de 2 - (Dimetilamino) etilo (DMAEMA) (98%) se hicieron pasar a través de una columna de alúmina básica (malla 150) para eliminar el inhibidor de la polimerización. El ácido 2 -propilacrílico (PAA) (>99%) fue adquirido sin el inhibidor y utilizado tal cual se recibió. El azobisisobutironitrilo (AIBN) (99%) se recristalizó a partir de metanol y se secó a vacío. El DMAEMA macroCTA fue sintetizado y purificado como se describe anteriormente (Mn -10000; PDI-1.3; > 98%). La N, -dimetilformamida (DMF) (99.99%) (Adquirida de EMD) fue grado reactivo y se utilizó tal cual se recibió. El hexano, pentano y éter fueron adquiridos de EMD y éstos fueron utilizados tal cual se recibieron para la purificación del polímero.
Polimerización: BMA (2.1 g, 14.7 mmoles), PAA (0.8389 g, 7.5 mmoles), DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmoles), MacroCTA (0.8 g, 0.0816 mmoles), AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmoles; CTA : AIBN 10:1) y DMF (5.34 mi) fueron agregados bajo atmósfera de nitrógeno en un frasco sellado. La proporción CTA: onómeros utilizada fue de 1:360 (asumiendo 50% de conversión) . La concentración de monómeros fue 3 M. La mezcla fue luego desgasificada mediante burbujeo del nitrógeno dentro de la mezcla por 30 minutos y luego colocada en un bloque calentador (Termómetro: 67 °C; visualización: 70-71; velocidad de agitación 300-400 rpm) . La reacción se dejó por 6 horas, luego se detuvo mediante la colocación del frasco en hielo y exponiendo la mezcla al aire .
Purificación: La purificación del polímero fue realizada a partir de acetona/DMF 1:1 en hexano/éter 75/25 (tres veces) . El polímero resultante fue secado a vacío por al menos 18 horas. El espectro de NMR mostró una alta pureza del polímero. No se observaron grupos vinilo. El polímero fue dializado a partir de etanol contra agua doblemente desionizada por 4 días, y luego liofilizadOi El polímero fue analizado mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) utilizando las siguientes condiciones: Solvente: DMF/LiBr 1%. Velocidad de flujo: 0.75 ml/min. Volumen de inyección: 100 µ?.
Temperatura de la columna: 60°C. Se utilizó poli (estireno) para calibrar los detectores. El análisis de GPC del Polímero resultante: Mn=40889 g/mol . PDI=1.43. dn/dc= 0.049967.
Ejemplo 20.3. Síntesis de gal- [DMAEMA] - [BMA-PAA-DMAEMA] La síntesis fue llevada a cabo como se describe en el ejemplo 20.2. Primeramente, se preparó la galactosa-DMAEMA-macro-CTA (ejemplo 20.2. A.) excepto que la galactosa-CTA (ejemplo 20.1, cpd 4) se utilizó en lug r de ECT como el agente de transferencia de cadena. Esto dio como resultado la síntesis de poliDMAEMA con una galactosa funcionalizada en el extremo (Figura 13) . La galactosa- [DMAEMA] -macro-CTA se utilizó luego para sintetizar el segundo bloque [BMA-PAA-DMAEMA] como se describe en el ejemplo 20.2. B. Después de la síntesis, los grupos protectores de acetilo sobre la galactosa fueron eliminados I mediante incubación en amortiguador de bicarbonato de sodio 100 mM, pH 8.5 por 2 horas, seguido por diálisis y liofilización. La espectroscopia de RMN fue utilizada para confirmar la presencia de la galactosa desprotegida, sobre el polímero.
Ejemplo 20.4. Preparación y caracterización de ' los copolímeros dibloques [PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] y DMAEMA- MMA(NHS) - [B-P-D] .
La síntesis poliraérica fue realizada como se describe en el ejemplo 20.2 (y resumida en la Figura 14) utilizando proporciones de alimentación del monómero para obtener la composición deseada del primer copolímero en bloque. Las Figuras 15A-15C resumen la síntesis y caracterización del polímero [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] donde la proporción del copolímero de los monómeros en el primer bloque es de 70:30.
Ejemplo 20.5. Conjugación de galactosa-PEG-amina a PÉGMA-MAA(NHS) para producir el polímero [PEGMA-MAA (Gal) ] - [B-P-D] La Figura 16 ilustra la preparación de los copolímeros di-bloque DMAEMA -MAA(NHS) o PEGMA-MAA (NHS) funcionalizado con galactosa. El polímero [DMAEMA-MAA(NHS) ] - [B-P-D] o [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] se disolvió en DMF a una concentración entre 1 y 20 mg/ml. La galactosa-PEG-amina, preparada como se describe en el ejemplo 20.1 (cpd 3) se neutralizó con 1-2 equivalentes de trietilamina y se agregó a la mezcla de reacción a una proporción de 5 a 1 de la amina al polímero. La reacción se llevó a cabo a 35°C por 6-12 horas, seguida por la adición de un volumen igual de acetona, la diálisis contra agua desionizada por 1 día y liofilización.
Ejemplo 20.6. Conjugación de AR si a PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] para producir el polímero [PEGMA-MAA (ARN) ]- [B-P-D] Las Figuras 17 A y B muestran las estructuras de 2 ARNsi modificados que pueden ser conjugados a los polímeros que contienen NHS, preparados como se describe en el ejemplo 20.4. Los ARNsi fueron obtenidos de Agilent (Boulder, CO) . La Figura 17 C muestra la estructura de la piridil-disulfuro-amina utilizada para derivatizar los polímeros que contienen NHS, para proporcionar un grupo reactivo con disulfuro para la conjugación del ARN tibiado (Figura 17 B) .
Reacción del polímero que contiene NHS con amino-disulfuro-ARNsi . La reacción es llevada a cabo bajo condiciones estándares que consisten de un solvente orgánico (por ejemplo, DMF o DMSO, o solvente mixto de DMSO/amortiguador pH 7.8.) a 35°C por 4-8 horas, seguido i por la adición de un volumen igual de acetona, diálisis contra agua desionizada por 1 día y liofilización.
Reacción del polímero que contiene NHS con piridil-disulfuro-amina, y reacción con ARNsi tiolado. La reacción de la piridil-disulfuro-amina con los polímeros que contienen NHS se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 20.5. Subsecuentemente, el polímero liofilizado se disuelve en etanol a 50 mg/ml y se diluye 10 veces en amortiguador de bicarbonato de sodio a un pH 8. El ARNsi tiolado (Figura 17 B) se hace reaccionar a un exceso molar de 2-5 sobre los grupos NHS del polímero a 35°C por 4-8 horas, seguido por diálisis contra amortiguador de fosfato, PH 7.4.
Ejemplo 20.7. Conjugación de un péptido terapéutico a un polímero modificado con piridil-disulfuro .
El polímero modificado con piridil-disulfuro descrito en el Ejemplo 20.6, PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] , puede ser también utilizado para la conjugación a un péptido terapéutico (Figura 17 D) . El péptido es sintetizado, preparado para la conjugación, y la reacción de conjugación llevada a cabo como se describe más adelante, para producir el polímero [PEGMA-MAA (Péptido) ]- [B-P-D] .
La fusión con el péptido transportina, del dominio de transducción de péptido (también conocido como la secuencia peptídica Antennapedia (Antp) se utiliza para sintetizar una forma de internalización a la célula del péptido Bak-BH3 (Antp-BH3) que contiene un residuo de cisteína carboxilo-terminal (NH2- RQIKIWFQNRRMKWKKMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSC-COOH) . Para asegurar los tioles libres para la conjugación, el péptido es reconstituido en agua y tratado por 1 hora con el agente reductor de disulfuro, TCEP inmovilizado dentro de un gel de agarosa. El péptido reducido (400 pm) se hace luego reaccionar por 24 horas con el polímero funeionalizado en el extremo con piridil-disulfuro en amortiguador fosfato (pH 7) que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM.
La reacción del grupo extremo del piridil-disulfuro-polímero con la cisteína peptídica crea la 2-piridintiona, la cual puede ser espectrofotométricamente medida para caracterizar la eficiencia de conjugación. Para validar adicionalmente el intercambio de disulfuro, los conjugados son corridos sobre un gel de tricina al 16.5% de SDS-PAGE. En paralelo, las alícuotas de las reacciones de conjugación son tratadas con TCEP inmovilizado, antes de SDS-PAGE, para verificar: la liberación del péptido desde el polímero en un ambiente reductor.
Las reacciones de conjugación son conducidas a estequiometrías polímero/péptido de 1, 2, y 5. Las mediciones de absorbancia espectrofotométrica de UV a 343 nm para la liberación de 2-piridintiona indican la eficiencia de conjugación. Se utiliza un gel de SDS i PAGE para caracterizar adicionalmente los conjugados péptido-polímero. A una proporción molar de polímero/péptido de 1, una cantidad detectable del péptido forma dímeros por medio de puentes disulfuro a través de la cisteína terminal. No obstante, la reacción del tiol al piridil-disulfuro es favorecida, y la banda peptídica libre ya no es visible a proporciones de polímero/péptido iguales a o mayores de 2. Mediante el tratamiento de los conjugados con el agente reductor TCEP, es posible escindir los enlaces disulfuro polímero-péptido como es indicado por la aparición de la banda peptídica en éstas muestras .

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. Un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadorés de la membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabiliizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, el bloque de núcleo es un bloque copolimérico, y en donde el bloque de envoltura es hidrofílico aproximadamente a un pH neutro.
2. Un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, la primera especie cargable es hidrofóbicamente protegida, y en donde el bloque de envoltura es hidrofílico aproximadamente a un pH neutro.
3. Un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo, de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en i donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y una segunda especie cargable que es catiónica a pH aproximadamente neutro, y en donde el bloque de envoltura es hidrofílico aproximadamente a un pH neutro.
4. Un montaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, el montaje micelar comprende un núcleo y una envoltura, en donde el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo, de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde la envoltura comprende una pluralidad de bloques de envoltura de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana, en donde el bloque de núcleo es un hidrófobo desestabilizador de membrana, dependiente del pH, que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y en donde el bloque de envoltura es un hidrófilo independiente de la temperatura aproximadamente a un pH neutro .
5. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son desestabilizadores de la membrana a un pH de aproximadamente 6.5, o menor, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5, o aproximadamente 6.2, o menor .
6. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana son copolímeros dibloque.
7. El montaje micelar según las reivindicaciones 1-6, en donde los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana tienen un índice de i polidispersión menor de 2.0, menor de 1.8, menor de 1.6, menor de 1.5, menor de 1.4, menor de 1.3 , o menor de 1.2.
8. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana comprenden un tercer bloque .
9. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la envoltura comprende un grupo polietilenglicol .
10. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el bloque de envoltura del copolímero en bloque desestabilizador de la membrana es o comprende polietilenglicol.
11. El montaje micelar según la reivindicación 10, en donde el bloque de envoltura comprende una pluralidad de unidades monoméricas de envoltura, y en donde una o más de la pluralidad de unidades monoméricas de envoltura están sustituidas o funcionalizadas con un grupo PEG.
12. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la forma del montaje micelar sobre el intervalo de pH de aproximadamente 6.2 a 7.5 es una micela, una pseudo-micela, o una estructura similar a micela.
13. El montaje micelar según la reivindicación 12, en donde la forma del montaje micelar sobre el intervalo de pH de aproximadamente 6.2 a 7.5 es una micela.
14. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde al menos un bloque de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana es un bloque en gradiente.
15. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el montaje micelar comprende al menos un reactivo de investigación.
16. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el montaje micelar comprende al menos un agente de diagnóstico.
17. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el montaje micelar comprende al menos un agente terapéutico.
18. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde el agente terapéutico está en la envoltura del montaje micelar.
19. El montaje micelar según la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico es enlazado al bloque de envoltura de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana en el montaje micelar, por un enlace covalente, una interacción no covalente, o una combinación de los mismos.
20. El montaje micelar según la reivindicación 19, en donde un agente terapéutico adicional está dentro de la porción de núcleo del montaje micelar.
21. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde cada montaje micelar comprende en promedio 1-5,, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 50 agentes terapéuticos.
22. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde el agente terapéutico comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido .
23. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde el agente terapéutico es un polinucleótido , un oligonucleótido, un modulador de la expresión de genes, un agente de knockdown, un AR si, en agente de AR i, un substrato cortador, un ARNmi, un AR sh, un oligonucleótido antisentido, o un aptámero.
24. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde el agente terapéutico es una proteína, péptido, enzima, anticuerpo, o fragmento de anticuerpo.
25. El montaje micelar según la reivindicación 17, en donde el agente terapéutico es un carbohidrato, o una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Daltones.
26. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde una o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana está enlazado a un agente terapéutico.
27. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde una o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana está enlazado a un primer agente terapéutico, y en donde una o más de la pluralidad de copolíraeros en bloque desestabilizadores de la membrana está enlazado a un segundo agente terapéutico.
28. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde una o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana está enlazado a un primer agente terapéutico, y en donde una o más de los polímeros adicionales está enlazado a un segundo agente terapéutico.
29. El montaje micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el bloque de envoltura de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizadores de la membrana comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato, o al menos un aminoácido.
30. El montaje micelar según la reivindicación 29, en donde al menos un nucleótido es al menos un ribonucleótido.
31. El montaje micelar según la reivindicación 30, en donde al menos un nucleótido es un modulador de la expresión de genes, un agente de knockdown, un AR si, un agente de AR i, un substrato cortador, un ARNmi, un ARNsh, un oligonucleótido antisentido, o un aptamero .
32. El montaje micelar según la reivindicación 31, en donde el agente de knockdown es un ARNsi, un oligonucleótido antisentido, un ARNmi, o un ARNsh.
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