ES2404136T3 - Ensamblajes micelares - Google Patents

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ES2404136T3 ES09747512T ES09747512T ES2404136T3 ES 2404136 T3 ES2404136 T3 ES 2404136T3 ES 09747512 T ES09747512 T ES 09747512T ES 09747512 T ES09747512 T ES 09747512T ES 2404136 T3 ES2404136 T3 ES 2404136T3
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English (en)
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Patrick S. Stayton
Allan S. Hoffman
Anthony J. Convertine
Craig L. Duvall
Danielle Benoit
Robert Overell
Paul Johnson
Anna Gall
Mary Prieve
Amber Paschal
Charbel Diab
Priyadarsi De
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PhaseRx Inc
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University of Washington
PhaseRx Inc
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Abstract

Un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes demembrana celular, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprendeuna pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana celular, en el que lacubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes demembrana celular, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana celular dependiente delpH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH 6,6 a 7,6, siendo el bloque de núcleo unbloque de copolímero, y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo a pH 6,6 a 7,6.

Description

Ensamblajes micelares
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/052.908, presentada el 13 de mayo de 2008, la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/052.914, presentada el 13 de mayo de 2008, la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/091.294, presentada el 22 de agosto de 2008, la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/112.048, presentada el 6 de noviembre de 2008, la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/140.774, presentada el 24 de diciembre de 2008 y la solicitud provisional de EE.UU. nº 61/171.369, presentada el 21 de abril de 2009.
Campo de la invención
[0002] Se describen en la presente memoria ensamblajes micelares formados a partir de polímeros y el uso de dichos ensamblajes micelares.
Antecedentes de la invención
[0003] En ciertos casos, es beneficioso proporcionar agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos) a células vivas. En algunos casos, el suministro de dichos polinucleótidos a una célula viva proporciona un beneficio terapéutico. El documento US 2007/0110709 da a conocer autoensamblajes supramoleculares de un polielectrolito para uso en combinación con ingredientes farmacológicos. El documento US 2007/0224241 da a conocer micelas que comprenden copolímeros en bloque y un fármaco terapéutico.
Sumario de la invención
[0004] Se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que la cubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, siendo el bloque de núcleo un bloque copolimérico, y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo a un pH aproximadamente neutro. En algunas realizaciones, el término “membrana” hace referencia a la membrana citoplasmática, a una membrana vesicular, a una membrana de depresión recubierta, a una membrana endosómica y/o a una membrana celular. Cuando el pH está a aproximadamente el pKa de la especie cargable, existirá una distribución en equilibrio de la especie cargable en ambas formas. En el caso de una especie aniónica, aproximadamente un 50% de la población será aniónica y aproximadamente un 50% estará no cargada cuando el pH esté al pKa de la especie aniónica. Cuanto más alejado esté el pH del pKa de la especie cargable, habrá un correspondiente desplazamiento de este equilibrio tal que, a valores de pH altos, predominará la forma aniónica y, a valores de pH bajos, predominará la forma no cargada. Las realizaciones descritas en la presente memoria incluyen la forma de los copolímeros a cualquier valor de pH.
[0005] Se proporciona en algunas realizaciones de la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que la cubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, estando la primera especie cargable apantallada hidrófobamente y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo a pH aproximadamente neutro.
[0006] Se proporciona en ciertas realizaciones de la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que la cubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es iónica a pH aproximadamente neutro y una segunda especie cargable que es catiónica a pH aproximadamente neutro, y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo a un pH aproximadamente neutro.
[0007] Se proporciona en algunas realizaciones de la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloques desestabilizantes de membrana, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que la cubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro, y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo independiente de la temperatura a pH aproximadamente neutro. En una realización, “hidrófilo independiente de la temperatura” hace referencia a un compuesto hidrófilo que tiene propiedades hidrófilas que son sustancialmente invariables dentro del intervalo de temperatura de 20 a 40ºC. Como resultado, las propiedades hidrófilas son sustancialmente invariables antes y después de la administración del ensamblaje micelar a un paciente humano. En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana que son desestabilizantes de membrana a un pH de aproximadamente 6,5 o menor, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 o de aproximadamente 6,2 o menor.
[0008] En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana utilizados en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria comprenden al menos dos bloques, o son copolímeros dibloque.
[0009] En ciertas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar comprende un grupo polietilenglicol. En realizaciones específicas, el bloque de cubierta del copolímero en bloque desestabilizante de membrana es o comprende polietilenglicol. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta comprende una pluralidad de unidades monoméricas de cubierta, y en el que una o más de la pluralidad de unidades monoméricas de cubierta está sustituida o funcionalizada con un grupo PEG.
[0010] En algunas realizaciones, la forma del ensamblaje micelar dentro del intervalo de pH de aproximadamente 6,2 a 7,5 es una micela, una seudomicela o una estructura de tipo micela. En realizaciones adicionales o alternativas, la forma del ensamblaje micelar dentro del intervalo de pH de aproximadamente 6,2 a 7,5 es una micela.
[0011] En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar en que al menos un bloque de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es un bloque en gradiente.
[0012] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende al menos un reactivo de investigación. En ciertas realizaciones, un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende al menos un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende al menos un agente terapéutico. En realizaciones específicas, el agente terapéutico está enlazado al bloque de cubierta de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en el ensamblaje micelar mediante un enlace covalente, una interacción no covalente o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende un primer agente terapéutico enlazado al bloque de cubierta de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana y al menos un segundo agente terapéutico dentro de la parte de núcleo del ensamblaje micelar. En algunas realizaciones, cada ensamblaje micelar comprende de media 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 50 agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, un agente terapéutico proporcionado en los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un polinucleótido, un oligonucleótido, un modulador de la expresión génica, un agente de silenciamiento génico, un ARNip, un agente de iARN, un sustrato de Dicer, un miARN, un ARNhc, un oligonucleótido anticodificante o un aptámero. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente terapéutico proteico (por ejemplo, una proteína, péptido, enzima, proteína dominante negativa, hormona, anticuerpo, molécula de tipo anticuerpo o fragmento de anticuerpo). En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un carbohidrato o una molécula pequeña con un peso molecular de más de aproximadamente 500 Da. En algunas realizaciones, uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana está enlazado a un agente terapéutico.
[0013] En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta es no peptídico. En ciertas realizaciones, al menos un nucleótido es un ribonucleótido. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido es un modulador de la expresión génica, un agente de silenciamiento génico, un ARNip, un agente de iARN, un sustrato de Dicer, un miARN, un ARNhc, un oligonucleótido anticodificante o un aptámero. En realizaciones específicas, el agente de silenciamiento génico es un ARNip, un oligonucleótido anticodificante, un miARN o un ARNhc.
[0014] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende al menos un resto orientador.
[0015] En ciertas realizaciones, el bloque de cubierta de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana está cargado o es cargable. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es policatiónico a un pH aproximadamente neutro. En ciertas realizaciones, el bloque de cubierta comprende unidades monoméricas catiónicas y no catiónicas. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta comprende al menos una unidad monomérica cargable catiónica y al menos una unidad monomérica no cargable.
[0016] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un bloque de cubierta que es un bloque homopolimérico. En una realización adicional o alternativa, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un bloque de cubierta que es un bloque heteropolimérico. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una unidad monomérica de etacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, una unidad monomérica de metacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, una unidad monomérica de acrilato de N,Ndialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6 o una combinación de las mismas.
[0017] En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende un núcleo con al menos una primera especie cargable y al menos una segunda especie cargable, en el que la primera especie cargable es cargable o está cargada como una especie aniónica, en el que la segunda especie cargable es cargable o está cargada como una especie catiónica, y en el que la relación de la primera especie cargable a la segunda especie cargable presente en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la relación de grupos cargados positivamente a grupos cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1 a un pH aproximadamente neutro. En ciertas realizaciones, la relación de grupos cargados positivamente a grupos cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a pH aproximadamente neutro. En algunas realizaciones, la relación de grupos cargados positivamente a grupos cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1 a pH aproximadamente neutro.
[0018] En algunas realizaciones, el copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies cargables que están cargadas o son cargables como especies aniónicas. En algunas realizaciones, el copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies cargables. En realizaciones específicas, cada primera especie cargable es cargable o está cargada como una especie aniónica. En algunas realizaciones, el copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 segundas especies cargables. En realizaciones específicas, cada segunda especie cargable está cargada o es cargable como una especie catiónica. En ciertas realizaciones, el copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies hidrófobas. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo de copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies cargables que están cargadas o son cargables como especies aniónicas. En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo de copolímero en bloque desestabilizante de membrana proporcionado en la presente memoria comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies cargables. En realizaciones específicas, cada primera especie cargable es cargable o está cargada como una especie aniónica. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 segundas especies cargables. En realizaciones específicas, cada segunda especie cargable está cargada o es cargable como una especie catiónica. En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizante de membrana proporcionado en la presente memoria comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies hidrófobas.
[0019] En algunas realizaciones, un bloque de núcleo de al menos un copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende una primera especie cargable (por ejemplo cargable aniónica) presente en una primera unidad monomérica y una segunda especie cargable (por ejemplo, cargable catiónica) en una segunda unidad monomérica. En realizaciones alternativas, la primera y segunda especies cargables están en la misma unidad monomérica (por ejemplo, una unidad monomérica cargable dipolarmente). En algunas realizaciones, la relación del número de primeras unidades monoméricas al número de segundas unidades monoméricas presentes en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1.
[0020] En ciertas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende al menos un copolímero en bloque desestabilizante de membrana con un bloque de núcleo que comprende al menos una primera unidad monomérica cargable y al menos una segunda unidad monomérica cargable. En algunas realizaciones, la primera unidad monomérica cargable es un ácido de Brønsted. En ciertas realizaciones, al menos un 80% de la primera unidad monomérica cargable está cargada, mediante la pérdida de un H+, como una especie aniónica a un pH de aproximadamente 7,4. En realizaciones adicionales o alternativas, menos de un 50% de la primera unidad monomérica cargable está cargada como una especie aniónica a un pH de aproximadamente 6. En algunas realizaciones, la primera unidad monomérica cargable es un ácido alquil C2-C8-acrílico. En ciertas realizaciones, la segunda unidad monomérica cargable es una base de Brønsted. En algunas realizaciones, al menos un 40% de la segunda unidad monomérica cargable está cargada, mediante la ganancia de un H+, como una especie catiónica a un pH de aproximadamente 7,4. En ciertas realizaciones, la segunda unidad monomérica cargable es etacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, metacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6
o acrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo comprende adicionalmente al menos una unidad monomérica no cargable. En ciertas realizaciones, la unidad monomérica no cargable es un etacrilato de alquilo C2-C8, un metacrilato de alquilo C2-C8 o un acrilato de alquilo C2-C8.
[0021] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es una partícula con un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm. En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm. En realizaciones más específicas, el ensamblaje micelar tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm.
[0022] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que está autoensamblado. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar se autoensambla en un medio acuoso a un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el autoensamblado ocurre en menos de 2 horas, en menos de 1 hora, en menos de 30 minutos o en menos de 15 minutos. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar es desestabilizante de membrana en un medio acuoso a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,4.
[0023] En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una carga catiónica neta mayor a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7. En algunas realizaciones, el valor absoluto de la carga del ensamblaje micelar es mayor a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7.
[0024] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana que tienen un bloque de núcleo y un bloque de cubierta, en el que la relación del peso molecular medio numérico del bloque de núcleo al peso molecular medio numérico del bloque de cubierta es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1, o de 1:1 a aproximadamente 5:1. En realizaciones más específicas, la relación del peso molecular medio numérico del bloque de núcleo al peso molecular medio numérico del bloque de cubierta es de aproximadamente 2:1.
[0025] En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un bloque de núcleo que tiene cualquier peso molecular medio numérico (Mn) adecuado, por ejemplo, mayor de 2.000 Da, de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 200.000 Da, de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 100.000 Da, de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 200.000 Da o de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 100.000 Da. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un bloque de cubierta que tiene cualquier peso molecular medio numérico (Mn) adecuado, por ejemplo, mayor de 5.000 Da o de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 50.000 Da.
[0026] En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana proporcionados en la presente memoria tienen un índice de polidispersidad de menos de 2, menos de 1,8, menos de 1,6, menos de 1,5, menos de 1,4 o menos de 1,3.
[0027] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que es estable a un pH de aproximadamente 7,4. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar es sustancialmente menos estable a un pH de aproximadamente 5,8 que a un pH de aproximadamente 7,4.
[0028] En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que es estable a una concentración de aproximadamente 10 μg/ml o mayor (por ejemplo, a pH aproximadamente neutro). En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que es estable a una concentración de aproximadamente 100 μg/ml o mayor (por ejemplo, a pH aproximadamente neutro).
[0029] En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se proporcionan cualquiera de los polímeros que constituyen los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria. Es decir, las subunidades poliméricas (por ejemplo, los copolímeros en bloque) o los polímeros individuales (en forma de un ensamblaje micelar o no) son también realizaciones descritas en la presente memoria. Para ser explícitos, todos y cada uno de los copolímeros en bloque que se presentan en la presente memoria están dentro del alcance de la invención descrita en la presente memoria, tanto como polímero individual como unidad/hebra/componente polimérico del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria.
Breve descripción de los dibujos
[0030] Se exponen los rasgos novedosos de la invención particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Se conseguirá una mejor comprensión de los rasgos y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada, que expone realizaciones ilustrativas en que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes, en los cuales:
[0031]
Figura 1A: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de polímeros sintetizados por RAFT.
[0032]
Figura 1B: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de copolímeros de PEGMA-DMAEMA.
[0033]
Figura 2: Ejemplo ilustrativo de la espectroscopia de RMN del copolímero en bloque PRx0729v6.
[0034]
Figura 3: Ejemplo ilustrativo de la determinación por dispersión de luz dinámica (DLS) del tamaño de
partícula del polímero PRx0729v6 complejado con ARNip.
[0035] Figura 4: Ejemplo ilustrativo del análisis de desplazamiento en gel de complejos de polímero PRx0729v6/ARNip a diferentes relaciones de carga. [0036] Figura 5: Ejemplo ilustrativo de la concentración de estabilización crítica (CSC) del polímero
PRx0729v6.
[0037] Figura 6: Ejemplo ilustrativo de la estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en disolventes orgánicos. [0038] Figura 7: Ejemplo ilustrativo de la actividad de silenciamiento génico de complejos de ARNip-micela en
células de mamífero cultivadas.
[0039] Figura 8: Demostración ilustrativa de la actividad desestabilizante de membrana de micelas poliméricas y sus complejos con ARNip. [0040] Figura 9: Análisis ilustrativo de microscopía electrónica de transmisión (TEM) del polímero PRx0729v6. [0041] Figura 10: Microscopía de fluorescencia ilustrativa de la captación celular y distribución intracelular de
complejos de polímero-ARNip. [0042] Figura 11: Ejemplo ilustrativo del efecto del pH sobre la estructura polimérica. [0043] Figura 12: Sumario ilustrativo de los datos de silenciamiento génico para complejos de ARNip-micela
en células de mamífero cultivadas.
[0044] Figura 13: Ejemplo ilustrativo del macroCTA de poli[DMAEMA] de extremo funcionalizado con galactosa.
[0045] Figura 14: Ejemplo ilustrativo de la síntesis de [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D].
[0046] Figura 15: Ejemplo ilustrativo de la copolimerización por RAFT de PEGMA y MAA-NHS.
[0047] Figura 16: Ejemplo ilustrativo de los copolímeros dibloque DMAEMA-MAA(NHS) o PEGMA-MAA(NHS) funcionalizados de galactosa.
[0048] Figura 17: Ejemplo ilustrativo de la estructuras de ARNip, péptidos y piridildisulfuramina conjugables.
Descripción detallada de la invención
[0049] El ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de copolímeros en bloque, comprendiendo los copolímeros en bloque un bloque de cubierta y un bloque de núcleo. El ensamblaje micelar comprende un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende un bloque de núcleo de polímero multibloque y en el que la cubierta comprende un bloque de cubierta de polímero multibloque. En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria se autoensamblan. En realizaciones específicas, los ensamblajes micelares se autoensamblan espontáneamente. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar es una micela.
[0050] El núcleo del ensamblaje micelar comprende una pluralidad de grupos hidrófobos, y los grupos hidrófobos pueden ser hidrófobos a un pH aproximadamente neutro. En realizaciones más específicas, el grupo hidrófobo es hidrófobo a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6 y/o un pH de aproximadamente 5). En ciertas realizaciones, están presentes dos o más grupos hidrófobos diferentes. En algunas realizaciones, un grupo hidrófobo tiene un valor de T de aproximadamente uno, o más. El valor de n de un compuesto es una medida de su valor hidrófilo-lipófilo relativo (véase, por ejemplo, Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45: 11-13 (1981)).
[0051] El núcleo del ensamblaje micelar comprende al menos una carga a pH aproximadamente neutro (por ejemplo aproximadamente 7,4) y al menos una carga es una carga negativa. En una realización específica, al menos una carga es al menos una carga negativa y al menos dos cargas positivas.
[0052] El bloque de cubierta es hidrófilo a pH neutro. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar se destruye o disocia a un pH de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 6,8.
[0053] En algunos casos, se proporcionan en la presente memoria ensamblajes micelares adecuados para el suministro de agentes terapéuticos (incluyendo, por ejemplo, oligonucleótidos o péptidos) a una célula viva. En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares comprenden una pluralidad de copolímero en bloque y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico. En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son biocompatibles, estables (incluyendo química y/o físicamente estables) y/o se sintetizan reproduciblemente. Adicionalmente, en algunas realizaciones los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son no tóxicos (por ejemplo, exhiben baja toxicidad), protegen la carga útil de agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) de la degradación, entran en las células vivas mediante un proceso de origen natural (por ejemplo, por endocitosis) y/o suministran la carga útil de agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) al citoplasma de una célula viva después de entrar en contacto con la célula. En ciertos casos, el polinucleótido (por ejemplo oligonucleótido) es un ARNip y/ otro agente “basado en nucleótidos” que altera la expresión de al menos un gen en la célula. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son útiles para suministrar ARNip o péptido a una célula. En ciertos casos, la célula está in vitro, y en otros casos la célula está in vivo. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de los ensamblajes micelares que comprenden un ARNip o péptido a un individuo necesitado de ello (por ejemplo, necesitado de silenciamiento de un gen, en el que el gen puede silenciarse por el ARNip administrado). En casos específicos, los ensamblajes micelares son útiles o se diseñan específicamente para el suministro de ARNip o péptido a células específicamente orientadas del individuo.
Definiciones
[0054] Se entiende que, con respecto a esta solicitud, el uso del singular incluye el plural y viceversa a menos que se afirme expresamente otra cosa. Es decir, “uno/a” y “el/la” hacen referencia a uno o más de aquello que modifique la palabra. Por ejemplo, “el polímero” o “un nucleótido” pueden hacer referencia a un polímero o nucleótido o una pluralidad de polímeros o nucleótidos. Por lo mismo, “polímeros” y “nucleótidos” harían referencia a un polímero o un nucleótido así como a una pluralidad de polímeros o nucleótidos a menos, de nuevo, que se afirme expresamente o sea obvio por el contexto que no se pretende.
[0055] Como se usa en la presente memoria, dos restos o compuestos están “enlazados” si se mantienen juntos mediante cualquier interacción incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, uno o más enlaces covalentes, una o más interacciones no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, fuerzas estáticas, interacciones de van der Waals, combinaciones de los mismos o similares) o una combinación de los mismos.
[0056] Alifático o grupo alifático: El término “alifático” o “grupo alifático”, como se usa en la presente memoria, significa un resto hidrocarburo que puede ser de cadena lineal (concretamente no ramificado), ramificado o cíclico (incluyendo policíclico fusionado, con puente y espirofusionado) y puede estar completamente saturado o puede contener una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático. A menos que se especifique otra cosa, los grupos alifáticos contienen 1-20 átomos de carbono.
[0057] Monómero aniónico: “Monómero aniónico” o “unidad monomérica aniónica”, como se usa en la presente memoria, es un monómero o unidad monomérica que porta un grupo que está presente en un estado cargado aniónico o en un estado no cargado, pero en estado no cargado puede volverse cargado aniónico, por ejemplo, tras la retirada de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+), por ejemplo de manera dependiente del pH). En ciertos casos, el grupo está sustancialmente cargado negativamente a un pH aproximadamente fisiológico, pero experimenta protonación y se vuelve sustancialmente neutro a un pH débilmente ácido. Los ejemplos no limitantes de dichos grupos incluyen grupos carboxilo, ácido barbitúrico y derivados del mismo, xantina y derivados de la misma, ácidos borónicos, ácidos fosfínicos, ácidos fosfónicos, ácidos sulfínicos, fosfatos y sulfonamidas.
[0058] Especie aniónica: “Especie aniónica”, como se usa en la presente memoria, es un grupo, residuo o molécula que está presente en un estado cargado aniónico o no cargado, pero en estado no cargado puede volverse cargado aniónico, por ejemplo, tras retirada de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+), por ejemplo de manera dependiente del pH). En ciertos casos, el grupo, residuo o molécula está sustancialmente cargado negativamente a un pH aproximadamente fisiológico, pero experimenta protonación y se vuelve sustancialmente neutro a un pH débilmente ácido.
[0059] Arilo o grupo arilo: Como se usa en la presente memoria, el término “arilo” o “grupo arilo” hace referencia a sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos que tienen un total de 5 a 14 miembros de anillo, en el que al menos un anillo en el sistema es aromático y en el que cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo.
[0060] Como se usa en la presente memoria, una “carga neutralizada” significa una partícula que tiene un potencial zeta que está entre ±10 y ±30 mV, y/o la presencia de una primera serie (z) de especies cargables que son cargables con una carga negativa (por ejemplo, especies ácidas que se vuelven aniónicas tras la desprotonación) y una segunda serie (0,5z) de especies cargables que son cargables con una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas tras la protonación).
[0061] Como se usa en la presente memoria, el pH fisiológico normal hace referencia al pH de los fluidos predominantes del cuerpo de mamíferos tales como sangre, suero, citosol de células normales, etc. En ciertos casos, el pH fisiológico normal es un pH aproximadamente neutro incluyendo, por ejemplo, un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4. El pH neutro es un pH de 6,6 a 7,6. Como se usa en la presente memoria, los términos pH neutro y pH fisiológico son sinónimos e intercambiables.
[0062] Como se usa en la presente memoria, un ensamblaje micelar está “destruido” si no funciona de manera idéntica, sustancialmente similar o similar y/o posee características físicas y/o químicas idénticas, sustancialmente similares o similares a un ensamblaje micelar estable. La “destrucción” de un ensamblaje micelar puede determinarse de cualquier manera adecuada. En un caso, un ensamblaje micelar está “destruido” si no tiene un tamaño de partícula hidrodinámica que sea menor de 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces, 1,8 veces, 1,6 veces, 1,5 veces, 1,4 veces, 1,3 veces, 1,2 veces o 1,1 veces el tamaño de partícula hidrodinámica de un ensamblaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque y formado en disolución acuosa a un pH de 7,4, o formado en suero humano. En un caso, un ensamblaje micelar está “destruido” si no tiene una concentración de ensamblaje que sea menor de 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces, 1,8 veces, 1,6 veces, 1,5 veces, 1,4 veces, 1,3 veces, 1,2 veces o 1,1 veces la concentración de ensamblaje de un ensamblaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque y formado en una disolución acuosa a un pH de 7,4 o formado en suero humano.
[0063] Heteroalquilo: el término “heteroalquilo” significa un grupo alquilo en el que al menos uno de los átomos de carbono del esqueleto está reemplazado por un heteroátomo.
[0064] Heteroarilo: el término “heteroarilo” significa un grupo arilo en el que al menos uno de los miembros de anillo es un heteroátomo.
[0065] Como se usa en la presente memoria, una “especie cargable”, “grupo cargable” o “unidad monomérica cargable” es una especie, grupo o unidad monomérica en estado cargado o no cargado. En ciertos casos, una “unidad monomérica cargable” es aquella que puede pasar a un estado cargado (un estado cargado aniónico o catiónico) mediante la adición o retirada de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+), por ejemplo de manera dependiente del pH). El uso de cualquiera de los términos “especie cargable”, “grupo cargable” o “unidad monomérica cargable” incluye la divulgación de cualquier otro de una “especie cargable”, “grupo cargable” o “unidad monomérica cargable”, a menos que se afirme otra cosa. Una “especie cargable” que “está cargada o es cargable como un anión” o “está cargada o es cargable como una especie aniónica”, es una especie o grupo que está en estado cargado aniónico o no cargado, pero en el estado no cargado puede convertirse en un estado cargado aniónico, por ejemplo, mediante la retirada de un electrófilo tal como un protón (H+). En realizaciones específicas, una especie cargable es una especie que se carga como un anión a pH aproximadamente neutro. Debe destacarse que no todas las especies cargables en un polímero serán aniónicas a un pH cercano al pKa (constancia de disociación ácida) de la especie cargable, sino que en lugar de ello coexistirá un equilibrio de especies aniónicas y no aniónicas. Una “especie cargable” que “está cargada o es cargable como un catión” o “está cargada o es cargable como una especie catiónica” es una especie o grupo que está en estado cargado catiónico o no cargado, pero en el estado no cargado puede convertirse en un estado cargado catiónico, por ejemplo, mediante la adición de un electrófilo tal como un protón (H+). En realizaciones específicas, una especie cargable es una especie que se carga como un catión a pH aproximadamente neutro. Debe destacarse que no todas las especies cargables en un polímero serán catiónicas a un pH cercano al pKa (constancia de disociación ácida) de la especie catiónica cargada, sino que en lugar de ello coexistirá un equilibrio de especies catiónicas y no catiónicas. Las “unidades monoméricas cargables” descritas en la presente memoria se usan intercambiablemente con los “residuos monoméricos cargables”.
[0066] Heteroátomo: el término “heteroátomo” significa un átomo distinto de hidrógeno o carbono, tal como átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, boro, arsénico, selenio o silicio.
[0067] Especie hidrófoba: “Especie hidrófoba” (usado intercambiablemente en la presente memoria con “resto potenciador de la hidrofobia”), como se usa en la presente memoria, es un resto tal como un sustituyente, residuo o grupo que, cuando se enlaza covalentemente con una molécula tal como un monómero o polímero, aumenta la hidrofobia de la molécula o sirve como resto potenciador de la hidrofobia. El término “hidrofobia” es un término de la materia que describe una propiedad física de un compuesto medida por la energía libre de transferencia del compuesto entre un disolvente no polar y agua (“Hydrophobicity regained”. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6: 13021307). La hidrofobia de un compuesto puede medirse por su valor de logP, el logaritmo del coeficiente de partición (P), que se define como la relación de concentraciones de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos disolventes inmiscibles, por ejemplo octanol y agua. Los procedimientos experimentales de determinación de la hidrofobia, así como los procedimientos de cálculo asistido informáticamente de los valores de logP, son conocidos por los expertos en la materia. Las especies hidrófobas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, grupos alifáticos, heteroalifáticos, arílicos y heteroarílicos.
[0068] Como se usa en la presente memoria, un “núcleo hidrófobo” comprende restos hidrófobos. En ciertos casos, un “núcleo hidrófobo” está sustancialmente no cargado (por ejemplo, la carga neta es sustancialmente neutra).
[0069] Inhibición: los términos “inhibición”, “silenciamiento” y “atenuación” como se usan en la presente memoria hacen referencia a una reducción medible de la expresión de un ARNm diana o la correspondiente proteína en comparación con la expresión del ARNm diana o la correspondiente proteína en ausencia del agente silenciador génico. El “silenciamiento génico”, o reducción de la expresión del ARNm diana o la correspondiente proteína, puede evaluarse midiendo los niveles de ARNm usando técnicas bien conocidas en la materia tales como amplificación por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCRc), hibridación en disolución de ARN, protección de nucleasa, transferencia Northern e hibridación, y monitorización de la expresión génica con una micromatriz; y en el caso de proteínas, mediante técnicas bien conocidas en la materia tales como PAGE-SDS, unión de anticuerpos, análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), análisis celular activado por fluorescencia e inmunocitoquímica.
[0070] Sin ligarse a teoría alguna no citada expresamente en las reivindicaciones, un polímero desestabilizante de membrana puede desencadenar directa o indirectamente un cambio (por ejemplo, un cambio de permeabilidad) en una estructura de membrana celular (por ejemplo, una membrana endosómica) para permitir que un agente (por ejemplo, un polinucleótido), en asociación con o independiente de un ensamblaje micelar o micela (o un polímero constituyente del mismo), pase a través de dicha estructura de membrana, por ejemplo, para entrar en una célula o salir a una vesícula celular (por ejemplo un endosoma). Un polímero desestabilizante de membrana puede ser (pero no necesariamente) un polímero destructor de membrana. Un polímero destructor de membrana puede desencadenar directa o indirectamente la lisis de una vesícula celular o la destrucción de una membrana celular (por ejemplo, observado para una fracción sustancial de una población de membranas celulares).
[0071] Generalmente, las propiedades desestabilizantes o destructoras de membrana de polímeros o micelas pueden evaluarse mediante diversos medios. En un enfoque no limitante, puede observarse un cambio en la estructura de la membrana celular mediante la evaluación en ensayos que miden (directa o indirectamente) la liberación de un agente (por ejemplo, un polinucleótido) desde membranas celulares (por ejemplo membranas endosómicas), por ejemplo determinando la presencia o ausencia de dicho agente, o una actividad de dicho agente, en un entorno externo a dicha membrana. Otro enfoque no limitante implica la medida de la lisis de glóbulos rojos (hemolisis), por ejemplo como ensayo vicario de una membrana celular de interés. Los ensayos se realizan opcionalmente a un solo valor de pH o a múltiples valores de pH.
[0072] Como se usa en la presente memoria, una “micela” incluye una partícula que comprende un núcleo y una cubierta hidrófila, en la que el núcleo se mantiene al menos parcial, predominante o sustancialmente mediante interacciones hidrófobas. En ciertos casos, como se usa en la presente memoria, una “micela” es una nanopartícula multicomponente que comprende al menos dos dominios, el dominio interno o núcleo y el dominio externo o cubierta. El núcleo se mantiene al menos parcial, predominante o sustancialmente mediante interacciones hidrófobas, y está presente en el centro de la micela. Como se usa en la presente memoria, la “cubierta de una micela” se define como la porción no nuclear de la micela.
[0073] Como se usa en la presente memoria, una partícula o ensamblaje es “de tipo micela” si se comporta sustancialmente como una micela: (1) se forma mediante autoasociación espontánea de copolímeros en bloque formando ensamblajes organizados (por ejemplo micelas) tras dilución desde un disolvente miscible con agua (tal como, pero sin limitación, etanol) con disolventes acuosos (por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4); (2) es estable a la dilución (por ejemplo, hasta una concentración polimérica de 100 μg/ml, 50 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml o 1 μg/ml, que constituye la concentración de estabilización crítica o la concentración micelar crítica (CMC));
(3) es estable a la alta fuerza iónica de los medios circundantes (por ejemplo, NaCl 0,5 M) y/o (4) tiene una inestabilidad creciente a medida que aumenta la concentración de disolvente orgánico, incluyendo dichos disolventes orgánicos, pero sin limitación, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y dioxano.
[0074] Un “hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH” es un grupo que es al menos parcial, predominante o sustancialmente hidrófobo y que es desestabilizante de membrana de manera dependiente del pH. En ciertos casos, un hidrófobo cargable desestabilizante de membrana dependiente del pH es un segmento polimérico hidrófobo de un copolímero en bloque y/o comprende una pluralidad de especies hidrófobas; y comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas. En algunas realizaciones, la especie cargable aniónica es aniónica a un pH aproximadamente neutro. En realizaciones adicionales o alternativas, la especie cargable aniónica no está cargada a un pH inferior, por ejemplo endosómico. En algunas realizaciones, el hidrófobo cargable desestabilizante de membrana comprende una pluralidad de especies catiónicas. El hidrófobo cargable desestabilizante de membrana dependiente del pH comprende un esqueleto polimérico no peptídico y no lipídico.
[0075] Como se usa en la presente memoria, un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es “estable” si el ensamblaje no se disocia no desestabiliza. En ciertos casos, un ensamblaje micelar estable es aquel que tiene un tamaño de partícula hidrodinámica que es aproximadamente un 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% del tamaño de partícula hidrodinámica de un ensamblaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque formado inicialmente en disolución acuosa a un pH de 7,4 (por ejemplo, una disolución salina tamponada con fosfato a pH 7,4). En algunos casos, un ensamblaje micelar estable es aquel que tiene una concentración de formación/ensamblado que es aproximadamente un 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de la concentración de formación/ensamblado de un ensamblaje micelar que comprende los mismos copolímeros en bloque inicialmente en disolución acuosa a un pH de 7,4 (por ejemplo, una disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4).
[0076] Nanopartícula: Como se usa en la presente memoria, el término “nanopartícula” hace referencia a cualquier partícula que tenga un diámetro de menos de 1.000 nanometros (nm). En general, las nanopartículas deberían tener dimensiones suficientemente pequeñas para permitir su captación por células eucarióticas. Típicamente, las nanopartículas tienen una dimensión recta mayor (por ejemplo diámetro) de 200 nm o menos. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de 100 nm o menos. Se usan en algunas realizaciones nanopartículas menores, por ejemplo que tienen diámetros de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, o de 50 nm o menos, por ejemplo de 5 nm-30 nm, o de 10 nm-30 nm.
[0077] Nucleótido: Como se usa en la presente memoria, el término “nucleótido”, en su sentido más amplio, hace referencia a cualquier compuesto y/o sustancia que sea o pueda incorporarse a una cadena polinucleotídica (por ejemplo oligonucleotídica). En algunas realizaciones, un nucleótido es un compuesto y/o sustancia que es o puede incorporarse a una cadena polinucleotídica (por ejemplo oligonucleotídica) mediante un ligamiento fosfodiéster. En algunas realizaciones, “nucleótido” hace referencia a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En ciertas realizaciones, “al menos un nucleótido” hace referencia a uno o más nucleótidos presentes; en diversas realizaciones, el uno o más nucleótidos son nucleótidos discretos, están enlazados no covalentemente entre sí o están enlazados covalentemente entre sí. Como tales, en ciertos casos, “al menos un nucleótido” hace referencia a uno o más polinucleótidos (por ejemplo oligonucleótidos). En algunas realizaciones, un polinucleótido es un polímero que comprende dos o más unidades monoméricas nucleotídicas.
[0078] Modulador de la expresión génica oligonucleotídico: Como se usa en la presente memoria, un “modulador de la expresión génica oligonucleotídico” es un agente oligonucleotídico capaz de inducir una modulación selectiva de la expresión génica en una célula viva mediante mecanismos que incluyen, pero sin limitación, un mecanismo anticodificante o mediante una ruta mediada por interferencia de ARN (iARN) que puede incluir (i) inactivación de la transcripción, (ii) degradación o secuestro del ARNm, (iii) inhibición o atenuación transcripcional o (iv) inhibición o atenuación de la traducción. Los moduladores de la expresión génica oligonucleotídicos incluyen ARN regulador (incluyendo virtualmente cualquier ARN regulador) tal como, pero sin limitación, oligonucleótidos anticodificantes, miARN, ARNip, iARN, ARNhs, aptámeros y cualquier análogo o precursor de los mismos.
[0079] Agente silenciador génico oligonucleotídico: Como se usa en la presente memoria, un “agente silenciador génico oligonucleotídico” es una especie oligonucleotídica que puede inhibir la expresión génica orientándose y uniéndose a un ácido nucleico intracelular de manera específica de secuencia. Los ejemplos no limitantes de agentes silenciadores génicos oligonucleotídicos incluyen ARNip, miARN, ARNhs, sustratos de Dicer, oligonucleótidos anticodificantes, ADN o ARN de degradación, oligonucleótidos antigénicos y cualquier análogo y precursor de los mismos.
[0080] Como se usa en la presente memoria, el término “oligonucleótido” hace referencia a un polímero que comprende 7-200 unidades monoméricas nucleotídicas. En algunas realizaciones, “oligonucleótido” engloba ARN mono- y/o bicatenario así como ADN mono- y/o bicatenario. Además, los términos “nucleótido”, “ácido nucleico”, “ADN”, “ARN” y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, concretamente análogos que tienen un esqueleto modificado incluyendo, pero sin limitación, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), fosfono-PNA, ácidos morfolinonucleicos o ácidos nucleicos con grupos fosfato modificados (por ejemplo, ligamientos fosforotioato, fosfonato, 5’-N-fosforamidita). Los nucleótidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinante y opcionalmente purificarse y sintetizarse químicamente, etc. Como se usa en la presente memoria, un “nucleósido” es el término que describe un compuesto que comprende un monosacárido y una base. El monosacárido incluye, pero sin limitación, monosacáridos de pentosa y hexosa. El monosacárido incluye también miméticos de monosacáridos y monosacáridos modificados sustituyendo los grupos hidroxilo por halógenos, grupos metoxilo, hidrógeno o amino, o mediante la esterificación de grupos hidroxilo adicionales. En algunas realizaciones, un nucleótido es o comprende un fosfato de nucleósido natural (por ejemplo, fosfato de adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas realizaciones, la base incluye cualquier base de origen natural en diversos ácidos nucleicos así como otras modificaciones que imitan o se parecen a dichas bases de origen natural. Los ejemplos no limitantes de bases modificadas o derivatizadas incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, �-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
�-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5oxiacético, wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N2-carboxipropil)uracilo, 2-aminoadenina, pirrolopirimidina y 2,6-diaminopurina. Las bases nucleosídicas incluyen también nucleobases universales tales como difluorotolilo, nitroindolilo, nitropirrolilo o nitroimidazolilo. Las bases nucleotídicas incluyen también nucleótidos que albergan un marcador o contienen un monómero abásico, concretamente que carece de base. La secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5’ a 3’ a menos que se indique otra cosa. Un nucleótido puede unirse a otro nucleótido de manera específica de secuencia mediante enlaces de puentes de hidrógeno por pares de bases de Watson-Crick. Dichos pares de bases se dice que son complementarias entre sí. Un oligonucleótido puede ser monocatenario, bicatenario o tricatenario.
[0081] Interferencia de ARN (iARN): Como se usa en la presente memoria, el término “interferencia de ARN” o “iARN” hace referencia a la inhibición específica de secuencia de la expresión génica y/o a la reducción de los niveles de ARNm diana y proteína mediada por al menos un ARN parcialmente bicatenario, que comprende también una parte que es sustancialmente complementaria de un ARN diana.
[0082] Agente de iARN: Como se usa en la presente memoria, el término “agente de iARN” hace referencia a un oligonucleótido que puede mediar la inhibición de la expresión génica mediante un mecanismo de iARN e incluye, pero sin limitación, ARNip, microARN (miARN), ARN de horquilla corta (ARNhc), ARN interferente asimétrico (ARNia), sustrato de Dicer y los precursores de los mismos.
[0083] ARN interferente pequeño (ARNip): Como se usa en la presente memoria, el término “ARN interferente pequeño” o “ARNip” hace referencia a un agente de iARN que comprende un dúplex nucleotídico que es de aproximadamente 15-50 pares de bases de longitud y que comprende además opcionalmente de 0 a 2 salientes monocatenarios. Una hebra del ARNip incluye una parte que hibrida con un ARN diana de manera complementaria. En algunas realizaciones, pueden existir uno o más desalineamientos entre el ARNip y la parte diana del ARN diana. En algunas realizaciones, los ARNip median la inhibición de la expresión génica causando la degradación de los transcritos diana.
[0084] ARN de horquilla corta (ARNhc): ARN de horquilla corta (ARNhc) hace referencia a un oligonucleótido que tiene al menos dos partes complementarias hibridadas o capaces de hibridar entre sí formando una estructura bicatenaria (dúplex) y al menos una porción monocatenaria.
[0085] Sustrato de Dicer: Un “sustrato de Dicer” es un ARN dúplex de más de aproximadamente 25 pares de bases que es un sustrato del miembro de la familia de ARNasa III Dicer en células. Los sustratos de Dicer se escinden produciendo ARN interferentes pequeños (ARNip) en dúplex de aproximadamente 21 pares de bases que provocan un efecto de interferencia de ARN que da como resultado el silenciamiento génico por silenciamiento génico de ARNm.
[0086] Inhibir la expresión génica: Como se usa en la presente memoria, “inhibir la expresión génica” significa causar cualquier reducción medible de la cantidad de producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un ARN transcrito a partir del gen (por ejemplo un ARNm) y/o un polipéptido transcrito a partir de un ARNm transcrito a partir del gen. El nivel de expresión puede determinarse usando técnicas estándares para medir ARNm o proteína.
[0087] Como se usa en la presente memoria, “sustancialmente no cargado” incluye un potencial zeta que está entre ±10 y ±30 mV, y/o la presencia de una primera serie (z) de especies cargables que son cargables con una carga negativa (por ejemplo, especies ácidas que se vuelven aniónicas tras la desprotonación) y una segunda serie (0,5z) de especies cargables que son cargables con una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas tras la protonación).
[0088] Agente terapéutico: Como se usa en la presente memoria, la frase “agente terapéutico” hace referencia a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, órgano, tejido o célula, tenga un efecto terapéutico y/o desencadene un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
[0089] Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se usa en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece de o es susceptible de una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retardar el inicio de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.
Estructura de ensamblaje micelar
[0090] Se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana. El ensamblaje micelar comprende un núcleo y una cubierta.
[0091] En algunas realizaciones, los bloques de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana son desestabilizantes de membrana. El bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana descritos en la presente memoria es hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH. El bloque de cubierta es hidrófilo a un pH aproximadamente neutro.
[0092] Como se usa en la presente memoria, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana incluyen copolímeros en bloque destructores de membrana (por ejemplo, polímeros que lisan una membrana endosómica) y copolímeros en bloque que desestabilizan localmente una membrana (por ejemplo, mediante una fisura temporal de una membrana endosómica). En algunas realizaciones, un copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende (i) una pluralidad de residuos monoméricos hidrófobos, (ii) una pluralidad de residuos monoméricos aniónicos que tienen una especie cargable, siendo la especie cargable aniónica al pH fisiológico del suero, y siendo sustancialmente neutros o no cargados a un pH endosómico y (iii) opcionalmente una pluralidad de residuos monoméricos catiónicos. En algunas realizaciones, la modificación de la relación de especies aniónicas a catiónicas en un copolímero en bloque permite la modificación de la actividad desestabilizante de membrana de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria. En algunas de dichas realizaciones, la relación de especies aniónicas:catiónicas en un copolímero en bloque está en el intervalo de aproximadamente 4:1 a aproximadamente
1:4 al pH fisiológico del suero. En algunas de dichas realizaciones, la modificación de la relación de especies aniónicas a catiónicas en un bloque hidrófobo de un copolímero en bloque permite la modificación de la actividad desestabilizante de membrana de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria. En algunas de dichas realizaciones, la relación de especies aniónicas:catiónicas en un bloque hidrófobo de un copolímero en bloque descrito en la presente memoria está en el intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 3:1, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 al pH fisiológico del suero.
[0093] En ciertas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana presentes en un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprenden una sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) que comprende una pluralidad de grupos hidrófobos. En realizaciones más específicas, la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) comprende una pluralidad de grupos hidrófobos y una pluralidad de unas primeras especies o grupos cargables. En realizaciones aún más específicas, dichas primeras especies o grupos cargables están cargados negativamente y/o son cargables como una especie o grupo cargado negativamente (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro, o a un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones específicas, la sección de núcleo (por ejemplo, el bloque de núcleo) comprende una pluralidad de grupos hidrófobos, una pluralidad de primeras especies o grupos cargables y una pluralidad de segundas especies o grupos cargables. En realizaciones más específicas, las primeras especies o grupos cargables están cargados negativamente y/o son cargables como una especie o grupo cargado negativamente, y las segundas especies o grupos cargables están cargados positivamente y/o son cargables como una especie o grupo cargado positivamente (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro o un pH de aproximadamente 7,4).
[0094] En ciertas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar y/o los bloques de cubierta de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana descritos en la presente memoria comprenden también una especie o grupo cargable. En algunas realizaciones, uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana presentes en un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene una sección de cubierta que comprende una pluralidad de especies o grupos cargables catiónicos. Dependiendo de la concentración de electrolitos en el medio circundante del ensamblaje micelar (por ejemplo, del pH), estas especies cargables catiónicamente están en un estado cargado catiónico o no cargado.
[0095] En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene una carga catiónica neta a un pH de aproximadamente 5. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria tiene una carga neutra neta a un pH aproximadamente neutro. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria tiene una carga catiónica neta a un pH aproximadamente neutro (aproximadamente a un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria tiene una carga catiónica neta mayor a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7. En realizaciones adicionales o alternativas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene una carga nominal (o valor absoluto de ella) que es mayor a un pH de aproximadamente 5 que a un pH de aproximadamente 7.
[0096] En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar en el que la forma del ensamblaje micelar es una micela, una seudomicela o una estructura de tipo micela en el intervalo de pH de aproximadamente 6 y mayor, de aproximadamente 6,5 y mayor, de aproximadamente 7 y mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 o mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 o mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9,5 o mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 o mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8,5 o mayor, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 o mayor, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 14 o mayor, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 10 o mayor, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 o mayor, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9 o mayor, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5 o mayor, de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 o mayor, de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 o mayor, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9,5 o mayor, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 o mayor, de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 o mayor, de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,5 o mayor, de 6,2 a 7,5 o de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4. En ciertas realizaciones, a un pH e aproximadamente 7 o menor, aproximadamente 6,8 o menor, aproximadamente 6,5 o menor, aproximadamente 6,2 o menor, aproximadamente 6 o menor, aproximadamente 5,8
o menor o aproximadamente 5,7 o menor, el ensamblaje micelar, micela, seudomicela o estructura de tipo micela proporcionado en la presente memoria se destruye o disocia sustancialmente, o al menos parcialmente. En realizaciones específicas, la forma del ensamblaje micelar en el intervalo de pH de aproximadamente 6,2 a 7,5 es una micela. Ha de entenderse que, como se usa en la presente memoria, los ensamblajes micelares tienen una forma al menos al pH descrito y pueden tener también la forma descrita a un pH fuera del intervalo de pH descrito.
[0097] Los “copolímeros en bloque” descritos en la presente memoria comprenden una sección de núcleo y una sección de cubierta. Como se discute en la presente memoria, la sección de núcleo es o comprende un bloque de núcleo y la sección de cubierta comprende o es un bloque de cubierta. En algunas realizaciones, al menos uno de dichos bloques es un bloque polimérico en gradiente. En realizaciones adicionales, el copolímero en bloque utilizado en la presente memoria está opcionalmente sustituido con un polímero en gradiente (concretamente, el polímero utilizado en el ensamblaje micelar es un polímero en gradiente que tiene una sección de núcleo y una sección de cubierta).
[0098] En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar es una nanopartícula. En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar es una micela. En otras realizaciones adicionales, el ensamblaje micelar es una nanopartícula o micela de un tamaño de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm o de aproximadamente 30-80 nm. El tamaño de partícula puede determinarse de cualquier manera, incluyendo pero sin limitación mediante cromatografía de permeación en gel (GPC), dispersión de luz dinámica (DLS), técnicas de microscopía electrónica (por ejemplo, TEM) y otros procedimientos.
[0099] En ciertas realizaciones, la cubierta y/o bloque de cubierta es hidrófilo y/o cargado (por ejemplo, no cargado, catiónico, policatiónico, aniónico, polianiónico o dipolar). En ciertas realizaciones, la cubierta y/o bloque de cubierta es hidrófilo y neutro (no cargado). En realizaciones específicas, la cubierta y/o bloque de cubierta comprende una carga positiva neta. En realizaciones específicas, la cubierta y/o bloque de cubierta comprende una carga negativa neta. En realizaciones específicas, la cubierta y/o bloque de cubierta comprende una carga neutra neta. En algunas realizaciones, el núcleo y/o bloque de núcleo es hidrófobo y/o comprende grupos, restos, unidades monoméricas, especies o similares hidrófobos. En realizaciones específicas, el núcleo y/o bloque de núcleo hidrófobo comprende una pluralidad de grupos, restos, unidades monoméricas, especies o similares hidrófobos y una pluralidad de especies o unidades monoméricas cargables. En realizaciones más específicas, la pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables comprende una pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables aniónicas. En realizaciones más específicas, la pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables comprende una pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables catiónicas. En realizaciones aún más específicas, la pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables comprende una pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables catiónicas y una pluralidad de unidades monoméricas o especies cargables aniónicas. En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque tienen cada uno (1) un bloque cargado hidrófilo (por ejemplo, aniónico o polianiónico, o catiónico o policatiónico, o dipolar, o no cargado) que forma la cubierta de los ensamblajes micelares (por ejemplo micelas), (2) un bloque hidrófobo y (3) una pluralidad de especies cargables aniónicas y son desestabilizantes de membrana (por ejemplo, se convierten en desestabilizantes de membrana de manera dependiente del pH). En algunas realizaciones, la pluralidad de especies cargables aniónicas está presente en el bloque hidrófobo. En ciertas realizaciones, el núcleo hidrófobo y/o el bloque de núcleo comprenden opcionalmente unidades monoméricas espaciadoras que pueden comprender o no grupos hidrófobos, grupos cargables o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un bloque polimérico que forma o está presente en el núcleo de los ensamblajes micelares (por ejemplo, micela) (por ejemplo, uno o más bloques de núcleo del copolímero) es cargable (por ejemplo, contiene especies catiónicas y/o aniónicas a un pH fisiológico). En algunos casos, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria se forman a partir de una pluralidad de copolímeros en bloque que se autoasocian. En ciertos casos, la autoasociación ocurre mediante interacciones de los bloques hidrófobos de los copolímeros en bloque y los ensamblajes micelares resultantes (por ejemplo, micelas) se estabilizan mediante interacciones hidrófobas de los bloques hidrófobos presentes en el núcleo de los ensamblajes micelares.
[0100] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria retienen una actividad (por ejemplo, la actividad del ensamblaje micelar para suministrar un agente terapéutico, por ejemplo, un polinucleótido) de un 50% en suero humano durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En realizaciones adicionales o alternativas, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria retienen una actividad (por ejemplo, la actividad del ensamblaje micelar para suministrar un polinucleótido) de al menos un 50% en plasma humano durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En realizaciones adicionales o alternativas, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria retienen una actividad (por ejemplo, la actividad del ensamblaje micelar para suministrar un polinucleótido) de un 50% en suero de ratón durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En otras realizaciones adicionales o alternativas, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria retienen una actividad (por ejemplo, la actividad del ensamblaje micelar para suministrar un agente terapéutico, por ejemplo un polinucleótido) de al menos un 50% en plasma de ratón durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En realizaciones específicas, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria retienen una actividad (por ejemplo, la actividad del ensamblaje micelar para suministrar un agente terapéutico, por ejemplo un polinucleótido) de un 50% en suero humano durante al menos 2 horas, de al menos un 50% en plasma humano durante al menos 2 horas, de un 50% en suero de ratón durante al menos 2 horas, de al menos un 50% en plasma de ratón durante al menos 2 horas, o una combinación de los mismos.
[0101] En diversas realizaciones, los copolímeros en bloque utilizados en los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) descritos en la presente memoria tienen o se seleccionan para tener influencia sobre cierto aspecto o funcionalidad de los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria incluyendo, pero sin limitación: (1) las propiedades biofísicas del ensamblaje micelar (por ejemplo, micelas) tales como, a modo de ejemplo no limitante, solubilidad, solubilidad acuosa, estabilidad, estabilidad en medio acuoso, hidrofilia, lipofilia, hidrofobia o similares; (2) la facilitación de la formulación del ensamblaje micelar en una forma administrable o con otros fines; (3) la capacidad del ensamblaje micelar de orientarse a un tipo de célula específico o seleccionado (por ejemplo, portando un resto orientador) y/o (4) la capacidad de aumentar la biocompatibilidad de los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente memoria se caracteriza por uno o más de los siguientes: (1) el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) se forma mediante autoasociación espontánea de copolímeros en bloque formando ensamblajes organizados (por ejemplo, micelas) tras dilución desde un disolvente miscible con agua (tal como, pero sin limitación, etanol) con disolventes acuosos (por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4); (2) el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) es estable a la dilución (por ejemplo, hasta una concentración polimérica de 100 μg/ml, 50 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml o 1 μg/ml, que constituye la concentración de estabilización crítica o la concentración micelar crítica (CMC)); (3) el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) es estable a la alta fuerza iónica de los medios circundantes (por ejemplo, NaCl 0,5) y/o (4) el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) tiene una inestabilidad creciente a medida que aumenta la concentración de disolvente orgánico, incluyendo dichos disolventes orgánicos, pero sin limitación, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y dioxano. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente memoria se caracteriza por tener al menos dos de las propiedades anteriormente mencionadas. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente memoria se caracteriza por tener al menos tres de las propiedades anteriormente mencionadas. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente memoria se caracteriza por tener todas las propiedades anteriormente mencionadas.
[0102] En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria se caracterizan adicionalmente o como alternativa por otros criterios: (1) el peso molecular de los bloques individuales y sus relaciones de longitud relativa se reducen o aumentan para controlar el tamaño del ensamblaje micelar formado y su estabilidad relativa y (2) el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la cubierta varía para proporcionar una eficaz formación de complejo con y/o sin neutralización de carga de un agente terapéutico aniónico (por ejemplo, un fármaco oligonucleotídico).
[0103] Además, en ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria captan selectivamente moléculas hidrófobas pequeñas, tales como compuestos de molécula pequeña hidrófobos (por ejemplo, fármacos de molécula pequeña hidrófobos) en el núcleo hidrófobo de los ensamblajes micelares. En realizaciones específicas, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria captan selectivamente moléculas hidrófobas pequeñas, tales como el compuesto de molécula pequeña hidrófobo pireno, en el núcleo hidrófobo de un ensamblaje micelar.
Núcleo
[0104] El núcleo del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de hidrófobos desestabilizantes de membrana dependientes del pH. En ciertas realizaciones, el núcleo del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria se mantiene al menos parcial, sustancial o predominantemente mediante interacciones hidrófobas.
[0105] El núcleo del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de primeras especies cargables y las primeras especies cargables están cargadas o son cargables como una especie aniónica. Ha de entenderse que algunas de, o todas, las primeras especies cargables en el núcleo están cargadas.
[0106] En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de primeras especies cargables y una pluralidad de segundas especies cargables. En algunos casos, la primera especie cargable está cargada o es cargable como una especie aniónica, y la segunda especie cargable está cargada o es cargable como una especie catiónica. En algunas realizaciones, el núcleo del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de primeras especies cargables, una pluralidad de segundas especies cargables y una pluralidad de especies hidrófobas.
[0107] En ciertas realizaciones, cuando el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicas y una pluralidad de especies cargables catiónicas, la relación del número de la pluralidad de especies cargables aniónicas al número de la pluralidad de especies cargables catiónicas es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicamente que están cargadas aniónicamente y una pluralidad de especies cargables catiónicamente que están cargadas catiónicamente, en el que la relación del número de especies cargadas aniónicamente al número de especies cargadas catiónicamente presentes en el núcleo es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1.
[0108] En algunas realizaciones, la relación a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4) del número de la pluralidad de especies cargables aniónicas al número de la pluralidad de especies cargables catiónicas es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1, o es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, el núcleo comprende una pluralidad de especies cargables aniónicamente que están cargadas aniónicamente y una pluralidad de especies cargables catiónicas que están cargadas catiónicamente, en el que la relación a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4) del número de especies cargadas aniónicamente al número de especies cargadas catiónicamente presentes en el núcleo es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1, o es de aproximadamente 1:1. En realizaciones específicas, la relación de especies cargadas positivamente presentes en el núcleo a especies cargadas negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1 a un pH aproximadamente neutro. En realizaciones más específicas, la relación de especies cargadas positivamente presentes en el núcleo a especies cargadas negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a pH aproximadamente neutro. En realizaciones específicas, la relación de especies cargadas positivamente presentes en el núcleo a especies cargadas negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1 a pH aproximadamente neutro.
[0109] En realizaciones específicas, la primera especie cargable es un ácido de Brønsted. En ciertos casos, como se usa en la presente memoria, una especie cargable incluye especies en las que la adición o retirada de un protón (por ejemplo, de manera dependiente del pH) proporciona una especie, grupo o unidad monomérica catiónico
o aniónico, respectivamente.
[0110] En algunas realizaciones, las primeras especies cargables presentes en el núcleo son especies que están cargadas negativamente al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas primeras especies cargables se cargan mediante la pérdida de un H+ como una especie aniónica a pH aproximadamente neutro. En realizaciones adicionales o alternativas, las primeras especies cargables presentes en el núcleo son especies que son neutras o no cargadas al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH ligeramente ácido (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6,5 o menos, de aproximadamente 6,2 o menos, de aproximadamente 6 o menos, de aproximadamente 5,9 o menos, de aproximadamente 5,8 o menos o aproximadamente a pH endosómico).
[0111] En algunas realizaciones, la primera especie cargable es, a modo de ejemplo no limitante, un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso o similares.
[0112] En algunas realizaciones, las segundas especies cargables presentes en el núcleo son especies que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas segundas especies cargables se cargan mediante la adición de un H+ como una especie catiónica. En realizaciones adicionales o alternativas, las segundas especies cargables presentes en el núcleo son especies que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,5 o menos, aproximadamente 6,2 o menos, aproximadamente 6 o menos, aproximadamente 5,9 o menos, aproximadamente 5,8
o menos o aproximadamente a pH endosómico).
[0113] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de restos desestabilizantes de membrana en el núcleo del ensamblaje micelar.
Cubierta
[0114] La cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es hidrófila. En realizaciones específicas, la cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de especies cargables. En realizaciones específicas, la especie cargable está cargada o es cargable como una especie catiónica. En otras realizaciones específicas, la especie cargable está cargada o es cargable como una especie aniónica. En otras realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar es hidrófila y no cargada (por ejemplo, sustancialmente no cargada). Ha de entenderse que dichos bloques de cubierta incluyen especies en las que ninguna, algunas o todas las especies cargables están cargadas.
[0115] En realizaciones específicas, la cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es policatiónica a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones, las especies cargables en la cubierta de un ensamblaje micelar son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas especies cargables en la cubierta del ensamblaje micelar se cargan mediante la adición de un H+ como una especie catiónica (por ejemplo, una base de Brønsted). En realizaciones adicionales o alternativas, las especies cargadas en la cubierta de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria son especies que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,5 o menos, aproximadamente 6,2 o menos, aproximadamente 6 o menos, aproximadamente 5,9
o menos, aproximadamente 5,8 o menos o pH aproximadamente endosómico).
[0116] En algunas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es catiónica a pH fisiológico o cercano (por ejemplo, el pH del plasma humano en circulación). En algunas realizaciones, el bloque de cubierta es policatiónico. En algunas realizaciones, la cubierta comprende uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, un polinucleótido tal como ARNip), en la que los agentes terapéuticos son polianiónicos. En algunas realizaciones, la pluralidad de agentes terapéuticos comprende un total de x aniones, y la cubierta policatiónica de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende aproximadamente 0,6x, aproximadamente 0,7x, aproximadamente 0,8x, aproximadamente 0,9x, aproximadamente 1,0x, aproximadamente 1,1x cationes o más.
[0117] En algunas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es hidrófila y no cargada. Las especies hidrófilas no cargadas útiles en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, polietilenglicol (PEG), poli(óxido de etileno) (PEO) o similares.
[0118] En ciertas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende una pluralidad de diferentes especies hidrófilas (por ejemplo, al menos una especie hidrófila no cargada y al menos una especie hidrófila cargada).
Tamaño de partícula
[0119] En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es una nanopartícula que tiene cualquier tamaño adecuado. El tamaño de las nanopartículas se ajusta para satisfacer necesidades específicas ajustando el grado de polimerización de las secciones de núcleo, secciones de cubierta, secciones adicionales o una combinación de las mismas. En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm. En realizaciones más específicas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm o similar en un medio acuoso. En realizaciones aún más específicas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 10 nm, a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm o similar en un medio acuoso de pH aproximadamente neutro (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria tiene un diámetro hidrodinámico medio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm o similar en suero humano. En realizaciones específicas, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm tanto en medio acuoso que tiene un pH de aproximadamente 7,4 como en suero humano.
Ensamblaje
[0120] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar se autoensambla o puede autoensamblarse en medio acuoso. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar se autoensambla o puede autoensamblarse en un medio acuoso que tiene aproximadamente pH neutro (por ejemplo, que tiene un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar se autoensambla o es capaz de autoensamblarse tras la dilución de una disolución orgánica de los copolímeros en bloque con un medio acuoso que tiene un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, que tiene un pH de aproximadamente 7,4). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar se autoensambla o puede autoensamblarse en suero humano. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla.
[0121] En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla en medio acuoso al menos a un valor de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar es desestabilizante de membrana en un medio acuoso a un valor de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,4. Ha de entenderse que, como se usa en la presente memoria, los ensamblajes micelares se autoensamblan al menos al pH descrito en la presente memoria, pero pueden autoensamblarse también a uno o más valores de pH fuera del intervalo de pH descrito.
[0122] En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla a cualquier concentración adecuada. En ciertas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla (por ejemplo, tiene una concentración de ensamblado crítica (CAC) o concentración mínima a la que se forma un ensamblaje micelar) a aproximadamente 2 μg/ml, aproximadamente 5 μg/ml, aproximadamente 8 μg/ml, aproximadamente 10 μg/ml, aproximadamente 20 μg/ml, aproximadamente 25 μg/ml, aproximadamente 30 μg/ml, aproximadamente 40 μg/ml, aproximadamente 50 μg/ml, aproximadamente 60 μg/ml, aproximadamente 70 μg/ml, aproximadamente 80 μg/ml, aproximadamente 90 μg/ml, aproximadamente 100 μg/ml o mayor. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria se autoensambla al menos a una concentración entre aproximadamente 1 μg/ml y aproximadamente 100 μg/ml.
[0123] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micelas) proporcionado en la presente memoria se prepara mediante autoensamblado espontáneo de los polímeros descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los polímeros descritos en la presente memoria se ensamblan en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria tras (a) la dilución de una disolución del polímero en disolvente orgánico miscible con agua con medios acuosos; o (b) la disolución directa en una disolución acuosa. En algunas realizaciones, los polímeros descritos en la presente memoria se ensamblan en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria en ausencia de polinucleótidos.
[0124] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) son estables a la dilución en disolución acuosa. En realizaciones específicas, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) son estables a la dilución a pH fisiológico (incluyendo el pH de la sangre en circulación en un ser humano) con una concentración de estabilización crítica (por ejemplo, una concentración micelar crítica (CMC)) de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 μg/ml, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 μg/ml, menos de 10 μg/ml, menos de 5 μg/ml o menos de 2 μg/ml. Como se usa en la presente memoria, “desestabilización de un ensamblaje micelar” significa que las cadenas poliméricas que forman un ensamblaje micelar se disgregan al menos parcialmente,se alteran estructuralmente (por ejemplo, aumentan de tamaño y/o cambian de forma) y/o pueden formar estructuras supramoleculares amorfas (por ejemplo, estructuras supramoleculares no micelares). Los términos concentración de estabilización crítica (CSC), concentración micelar crítica (CMC) y concentración de ensamblado crítica (CAC) se usan intercambiablemente en la presente memoria.
Estabilidad
[0125] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es estable en medio acuoso. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es estable en medio acuoso a un pH seleccionado, por ejemplo, pH aproximadamente fisiológico (por ejemplo, el pH del plasma humano en circulación). En realizaciones específicas, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es estable a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4) en un medio acuoso. En realizaciones específicas, el medio acuoso es suero animal (por ejemplo, humano) o plasma animal (por ejemplo, humano). En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es estable en suero humano y/o plasma humano. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es estable en plasma humano en circulación. Ha de entenderse que la estabilidad del ensamblaje micelar no está limitada al pH designado, sino que es estable a valores de pH que incluyen, como mínimo, el pH designado. En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es sustancialmente menos estable a pH ácido que a un pH que sea aproximadamente neutro. En realizaciones más específicas, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es sustancialmente menos estable a un pH de aproximadamente 5,8 que a un pH de aproximadamente 7,4.
[0126] En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar es estable a una concentración de aproximadamente 10 μg/ml o mayor (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro). En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar es estable a una concentración de aproximadamente 100 μg/ml o mayor (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro).
Copolímeros en bloque
[0127] En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana proporcionados en la presente memoria son desestabilizantes de membrana a cualquier pH adecuado. En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana son desestabilizantes de membrana (por ejemplo, en un medio acuoso) a un pH endosómico, un pH de aproximadamente 6,5 o menor, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 o de aproximadamente 6,2 o menor.
[0128] En realizaciones específicas, el bloque de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana proporcionado en la presente memoria comprende una pluralidad de primeros grupos, especies o unidades monoméricas cargables y una pluralidad de segundas especies, grupos o unidades monoméricas cargables. En ciertos casos, los primeros grupos, especies o unidades monoméricas cargables están cargados o son cargables negativamente como una especie, grupo o unidad monomérica negativo. En algunos casos, los segundos grupos, especies o unidades monoméricas están cargados o son cargables positivamente como especies, grupos o unidades monoméricas catiónicos. En ciertas realizaciones, a medida que aumenta el pH de un medio acuoso que comprende un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana y el núcleo del ensamblaje micelar se vuelven más cargados positivamente, dando como resultado la destrucción de la forma y/o tamaño del ensamblaje micelar, y causando una destrucción parcial o sustancial de la membrana (por ejemplo, una membrana endosómica que circunda el ensamblaje micelar).
[0129] En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria comprenden una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana que desestabilizan una membrana endosómica de manera dependiente del pH. En diversas realizaciones, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana desestabilizan una membrana cuando se ensamblan en los ensamblajes micelares y/o cuando están presentes independientes de la formación de ensamblajes micelares (por ejemplo, cuando los ensamblajes de micelas están disociados y/o desestabilizados). En algunas realizaciones, a pH fisiológico o cercano (por ejemplo, el pH de la sangre en circulación), los polímeros que constituyen los ensamblajes micelares son mínimamente desestabilizantes de membrana, pero tras exposición a pH reducido (por ejemplo, pH endosómico), el polímero es desestabilizante de membrana. En ciertos casos, esta transición a un estado desestabilizante de membrana ocurre mediante la protonación de residuos débilmente ácidos que se incorporan a los polímeros, conduciendo dicha protonación a un aumento de la hidrofobia de los polímeros. En ciertos casos, la hidrofobia aumentada del polímero da como resultado un cambio conformacional de los ensamblajes micelares, haciendo desestabilizantes de membrana a los ensamblajes micelares (por ejemplo, causando la desestabilización de la membrana). En algunas realizaciones, el mecanismo de desestabilización de membrana de los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria no se basa en un mecanismo de desestabilización de membrana puramente Sponge-proton de policationes tales como PEI u otros policationes. En algunas realizaciones, la combinación de dos mecanismos de destrucción de membrana, (a) un policatión (tal como DMAEMA) y (b) un polianión hidrofobizado (tal como poli(ácido acrílico)) actuando conjuntamente tiene un efecto aditivo o sinérgico sobre la potencia de desestabilización de membrana conferida por el polímero.
[0130] En algunas realizaciones, los bloques poliméricos se seleccionan opcionalmente, a modo de ejemplo no limitante, de polinucleótidos, oligonucleótidos, polietilenglicoles, bloques hidrófilos, bloques hidrófobos, bloques cargados o similares.
[0131] En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana, en los que los copolímeros en bloque son no peptídicos y/o no lipídicos. Se proporcionan en la presente memoria ensamblajes micelares que comprenden copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en los que el bloque de núcleo es no peptídico y/o no lipídico. En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en los que el bloque de cubierta es no peptídico y/o no lipídico. En algunas realizaciones, el esqueleto de los copolímeros en bloque que forman el ensamblaje micelar es no peptídico y/o no lipídico. En ciertas realizaciones, el esqueleto del bloque de núcleo es no peptídico y/o no lipídico. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta es no peptídico y/o no lipídico. Como se usa en la presente memoria, los lípidos son un grupo diverso de compuestos ampliamente definido como moléculas hidrófobas o anfífilas que se originan enteramente o en parte a partir de dos tipos distintos de subunidades bioquímicas: grupos cetoacilo e isopreno, por ejemplo, ácidos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos, policetidas, lípidos de esterol y lípidos de prenol.
[0132] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana que comprende una sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) y una sección de cubierta (por ejemplo, bloque de cubierta), en el que la relación del peso molecular medio numérico de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular medio numérico de la sección de cubierta (por ejemplo, bloque de cubierta) está presente en cualquier relación adecuada. Son realizaciones específicas copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en los que la relación del peso molecular medio numérico de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular medio numérico de la sección de cubierta (por ejemplo, bloque de cubierta) está presente a una relación de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 5:4 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:1, de aproximadamente 1,5:1, de aproximadamente 1,1:1, de aproximadamente 1,2:1, de aproximadamente 1,3:1, de aproximadamente 1,4:1, de aproximadamente 1,6:1, de aproximadamente 1,7:1, de aproximadamente 1,8:1, de aproximadamente 1,9:1 o de aproximadamente 2,1:1. Son algunas realizaciones copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en los que la relación del peso molecular medio numérico de la sección de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) al peso molecular medio numérico de la sección de cubierta (por ejemplo, bloque de cubierta) está presente a una relación de aproximadamente 2 (o más) a 1, de aproximadamente 1,5 (o más) a 1, de aproximadamente 1,1 (o más) a 1, de aproximadamente 1,2 (o más) a 1, de aproximadamente 1,3 (o más) a 1, de aproximadamente 1,4 (o más) a 1, de aproximadamente 1,6 (o más) a 1, de aproximadamente 1,7 (o más) a 1, de aproximadamente 1,8 (o más) a 1, de aproximadamente 1,9 (o más) a 1 o de aproximadamente 2,1 (o más) a 1. En realizaciones específicas, la relación de peso molecular medio numérico del bloque de núcleo al peso molecular medio numérico del bloque de cubierta es de aproximadamente 2:1.
[0133] En realizaciones específicas, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende al menos un tipo de polímero (por ejemplo, copolímeros en bloque y/o polímeros monobloque, incluyendo copolímeros monobloque) que tiene un segmento hidrófilo y un segmento hidrófobo. En ciertas realizaciones, el segmento hidrófilo es un bloque hidrófilo y el segmento hidrófobo es un bloque hidrófobo. En algunas realizaciones, estos polímeros son no peptídicos. En otras realizaciones, el segmento hidrófilo y el segmento hidrófobo son regiones diferentes de un copolímero en gradiente monobloque. En diversos casos, un “segmento polimérico” es una sección de polímero con una propiedad física dada (por ejemplo, una propiedad física de un bloque descrita en la presente memoria, por ejemplo, hidrofobia, hidrofilia, capacidad de carga, etc.) o que comprende uno o más bloques con propiedades físicas similares (por ejemplo, hidrofobia, hidrofilia, capacidad de carga, etc.).
[0134] En ciertas realizaciones, uno o más o todos los polímeros (incluyendo al menos una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana y, opcionalmente, copolímeros en bloque no desestabilizantes de membrana) de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria tienen cada uno (1) un segmento hidrófilo opcionalmente cargado (por ejemplo, un bloque de cubierta) que forma al menos una parte de la cubierta del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) y (2) un segmento sustancialmente hidrófobo (por ejemplo, un bloque de núcleo) que forma al menos una parte del núcleo hidrófobo del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) que se estabiliza mediante interacciones hidrófobas de los segmentos poliméricos formadores de núcleo. En algunas realizaciones, el segmento hidrófilo es neutro o no está cargado. En algunas realizaciones, el segmento hidrófilo está cargado y es catiónico o policatiónico. En algunas realizaciones, el segmento hidrófilo está cargado y es aniónico o polianiónico. En algunas realizaciones, el segmento hidrófilo está cargado y es dipolar. En algunos casos, el segmento hidrófilo puede servir al menos para tres funciones: (1) para formar la cubierta de la estructura micelar,
(2) para aumentar la dispersabilidad acuosa del ensamblaje micelar y (3) para enlazar (por ejemplo unir) uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, moléculas terapéuticas basadas en oligonucleótidos tales como ARNip). En algunas realizaciones, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana y/o el núcleo del ensamblaje micelar comprenden también especies cargables o cargadas (por ejemplo, especies/unidades monoméricas aniónicas y/o catiónicas a un pH fisiológico) y son desestabilizantes de membrana (por ejemplo, desestabilizantes de membrana de manera dependiente del pH). En algunas realizaciones, el bloque sustancialmente hidrófobo (por ejemplo, bloque de núcleo) y/o el núcleo del ensamblaje micelar comprenden una o más especies cargables (por ejemplo, una unidad monomérica, resto, grupo o similar). En realizaciones más específicas, el bloque y/o núcleo del ensamblaje micelar sustancialmente hidrófobo comprende una pluralidad de especies catiónicas y una pluralidad de especies aniónicas. En realizaciones aún más específicas, el bloque de núcleo de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana y/o el núcleo del ensamblaje micelar comprenden un número sustancialmente similar de especies catiónicas y aniónicas (concretamente, el bloque y/o núcleo hidrófobo son sustancialmente de carga neutra neta).
[0135] En ciertas realizaciones, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende un bloque de núcleo hidrófobo que comprende una primera y una segunda especies cargables. En algunas realizaciones, la primera especie cargable es como se describe en la presente memoria y la segunda especie cargable es cargable como una especie catiónica tras la protonación. En realizaciones específicas, la primera especie cargable no está cargada a un pH ácido (por ejemplo, un pH endosómico, un pH menor de aproximadamente 6,5, un pH menor de aproximadamente 6,0, un pH menor de aproximadamente 5,8, un pH de menor de aproximadamente 5,7 o similar). En realizaciones específicas, el pKa de la segunda especie cargable es de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5 o cualquier otro pKa adecuado. En ciertas realizaciones, al menos una de las primeras especies cargables y al menos una de las segundas especies cargables están presentes en una sola unidad monomérica. En algunas realizaciones, la primera especie cargable se encuentra en una primera unidad monomérica cargable y la segunda especie cargable está en una segunda unidad monomérica cargable. En ciertas realizaciones, la primera especie cargable es cargable como una especie aniónica tras desprotonación, la segunda especie cargable es cargable como una especie catiónica tras protonación, y la relación de especies aniónicas a especies catiónicas está entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:2 y 3:2, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente pH neutro. En algunas realizaciones, la relación de la primera unidad monomérica cargable a la segunda unidad monomérica cargable es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente
1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 1:2 a 3:2 o de aproximadamente 1:1.
[0136] El término “copolímero”, como se usa en la presente memoria, significa que el polímero es el resultado de la polimerización de dos o más monómeros diferentes. Un “polímero monobloque” o una “polímero de subunidades” de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es un producto sintético de una sola etapa de polimerización. El término polímero monobloque incluye un copolímero (concretamente, un producto de la polimerización de más de un tipo de monómeros) y un homopolímero (concretamente, un producto de la polimerización de un solo tipo de monómeros). Un copolímero “de bloque” hace referencia a una estructura que comprende una o más subcombinaciones de unidades constitutivas o monoméricas, usadas intercambiablemente en la presente memoria. Dichas unidades constitutivas o monoméricas comprenden residuos de monómeros polimerizados. En algunas realizaciones, un copolímero en bloque descrito en la presente memoria comprende unidades constitutivas o monoméricas no lipídicas. En algunas realizaciones, el copolímero en bloque es un copolímero dibloque. Un copolímero dibloque comprende dos bloques: se representa una generalización esquemática de dicho polímero a continuación: [AaBbCc ...]m-[XxYyZz ...]n, en la que cada letra representa una unidad constitutiva o monomérica y en la que cada subíndice de una unidad constitutiva representa la fracción molar de esa unidad en el bloque particular, los tres puntos indican que puede haber más (también puede haber menos) unidades constitutivas en cada bloque y m y n indican el peso molecular de cada bloque en el copolímero dibloque. Como se sugiere por el esquema, en algunos casos el número y naturaleza de cada unidad constitutiva está controlado separadamente para cada bloque. El esquema no pretende ni debe considerarse que se suponga relación alguna entre el número de unidades constitutivas o el número de tipos diferentes de unidades constitutivas en cada uno de los bloques. Tampoco el esquema pretende describir ningún número o disposición particular de las unidades constitutivas en un bloque particular. En cada bloque, las unidades constitutivas pueden estar dispuestas en configuración puramente al azar, alternadas al azar, alternadas regularmente, en bloque regular o bloque aleatorio a menos que se afirme expresamente otra cosa. Un configuración puramente al azar, por ejemplo, puede tener la forma no limitante: x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z... Una configuración alternada al azar ejemplar no limitante puede tener la forma no limitante: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z..., y una configuración alternada regular ejemplar puede tener la forma no limitante: x-y-z-x-y-z-x-y-z... Una configuración de bloque regular ejemplar puede tener la siguiente configuración no limitante: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x..., mientras que una configuración en bloque aleatorio ejemplar puede tener la configuración no limitante: ...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-... En un polímero en gradiente, el contenido de una
o más unidades monoméricas aumenta o se reduce en forma de gradiente desde el extremo a del polímero al extremo w. En ninguno de los ejemplos genéricos precedentes, ni la yuxtaposición particular de unidades constitutivas o bloques individuales ni el número de unidades constitutivas en un bloque ni el número de bloques pretende ni debe considerarse en modo alguno que soporte o limite la estructura real de los copolímeros en bloque que forman el ensamblaje micelar de esta invención. En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria cualquier polímero de subunidades o composición de polímeros de subunidades descrito en la presente memoria, independientemente de si dichos polímeros están ensamblados o no en un ensamblaje micelar.
[0137] Como se usa en la presente memoria, los corchetes que rodean las unidades constitutivas no pretenden ni ha de considerarse que pretendan que las unidades constitutivas mismas formen bloques. Es decir, las unidades constitutivas en los corchetes cuadrados pueden combinarse de cualquier manera con las demás unidades constitutivas del bloque, concretamente, con configuraciones puramente aleatoria, alternada aleatoria, alternada regular, bloque regular o bloque aleatorio. Los copolímeros en bloque descritos en la presente memoria son, opcionalmente, copolímeros en bloque alternados, en gradiente o aleatorios. En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque son copolímeros dendriméricos, estrellados o de injerto.
[0138] En ciertas realizaciones, los copolímeros en bloque (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) de los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria comprenden monómeros etilénicamente insaturados. El término “monómero etilénicamente insaturado” se define en la presente memoria como un compuesto que tiene al menos un doble enlace o triple enlace de carbono. Son ejemplos no limitantes de monómeros etilénicamente insaturados: un (alquil)acrilato de alquilo, un metacrilato, un acrilato, una alquilacrilamida, una metilacrilamida, una acrilamida, un estireno, una alilamina, un alilamonio, una dialilamina, un dialilamonio, una N-viniformamida, un viniléter, un sulfonato de vinilo, un ácido acrílico, una sulfobetaína, una carboxibetaína, una fosfobetaína o anhídrido maleico.
[0139] En diversas realizaciones, se usa cualquier monómero adecuado para proporcionar polímeros (incluyendo, por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) de los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, los monómeros adecuados para uso en la preparación de los polímeros (incluyendo, por ejemplo, los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) de los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, uno o más de los siguientes monómeros: monómeros de metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros), metacrilato de butilo (todos los isómeros), metacrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de isobornilo, ácido metacrílico, metacrilato de bencilo, metacrilato de fenilo, metacrilonitrilo, a-metilestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo (todos los isómeros), acrilato de butilo (todos los isómeros), acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de isobornilo, ácido acrílico, acrilato de bencilo, acrilato de fenilo, acrilonitrilo, estireno, acrilatos y estirenos seleccionados de metacrilato de glicidilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros), metacrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros), metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo, metacrilato de N,Ndietilaminoetilo, metacrilato de trietilenglicol, metacrilato de oligoetilenglicol, anhídrido itacónico, ácido itacónico, acrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros), acrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros), acrilato de N,N-dimetilaminoetilo, acrilato de N,N-dietilaminoetilo, acrilato de trietilenglicol, metacrilamida, N-metilacrilamida, N,N-dimetilacrilamida, N-terc-butilmetacrilamida, N-n-butilmetacrilamida, Nmetiloacrilamida, N-etiloacrilamida, ácido vinilbenzoico (todos los isómeros), dietilaminoestireno (todos los isómeros), ácido a-metilvinilbenzoico (todos los isómeros), dietillamino-a-metilestireno (todos los isómeros), ácido pvinilbencenosulfónico, sal de sodio del ácido p-vinilbencenosulfónico, metacrilato de trimetoxisililpropilo, metacrilato de trietoxisililpropilo, metacrilato de tributoxisililpropilo, metacrilato de dimetoximetilsililpropilo, metacrilato de dietoximetilsililpropilo, metacrilato de dibutoximetilsililpropilo, metacrilato de diisopropoximetilsililpropilo, metacrilato de dimetoxisililpropilo, metacrilato de dietoxisililpropilo, metacrilato de dibutoxisililpropilo, metacrilato de diisopropoxisililpropilo, acrilato de trimetoxisililpropilo, acrilato de trietoxisililpropilo, acrilato de tributoxisililpropilo, acrilato de dimetoximetilsililpropilo, acrilato de dietoximetilsililpropilo, acrilato de dibutoximetilsililpropilo, acrilato de diisopropoximetilsililpropilo, acrilato de dimetoxisililpropilo, acrilato de dietoxisililpropilo, acrilato de dibutoxisililpropilo, acrilato de diisopropoxisililpropilo, acetato de vinilo, butirato de vinilo, benzoato de vinilo, cloruro de vinilo, fluoruro de vinilo, bromuro de vinilo, anhídrido maleico, N-arilmaleimida, N-fenilmaleimida, N-alquilmaleimida, N-butilimaleimida, N-vinilpirrolidona, N-vinilcarbazol, butadieno, isopreno, cloropreno, etileno, propileno, 1,5-hexadienos, 1,4hexadienos, 1,3-butadienos, 1,4-pentadienos, alcohol vinílico, vinilamina, N-alquilvinilamina, alilamina, Nalquilalilamina, dialilamina, N-alquildialilamina, alquilenimina, ácidos acrílicos, acrilatos de alquilo, acrilamidas, ácidos metacrílicos, metacrilatos de alquilo, metacrilamidas, N-alquilacrilamidas, N-alquilmetacrilamidas, Nisopropilacrilamida, vinilnaftaleno, vinilpiridina, etilvinilbenceno, aminoestireno, vinilpiridina, vinilimidazol, vinilbifenilo, vinilanisol, vinilimidazol, vinilpiridinilo, vinilpolietilenglicol, dimetilaminometilestireno, etilmetacrilato de trimetilamonio, etilacrilato de trimetilamonio, dimetilaminopropilacrilamida, etilacrilato de trimetilamonio, etilmetacrilato de trimetilamonio, propilacrilamida de trimetilamonio, acrilato de dodecilo, acrilato de octadecilo o metacrilato de octadecilo, o combinaciones de los mismos.
[0140] En algunas realizaciones, se usan opcionalmente versiones funcionalizadas de estos monómeros. Un monómero funcionalizado, como se usa en la presente memoria, es un monómero que comprende un grupo funcional enmascarado o no enmascarado, por ejemplo, un grupo con el que pueden enlazarse otros restos después de la polimerización. Son ejemplos no limitantes de dichos grupos los grupos amino primarios, carboxilos, tioles, hidroxilos, azidas y ciano. Están disponibles varios grupos enmascarantes adecuados (véanse, por ejemplo, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis” (2ª edición) J. Wiley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, “Protecting Groups”, Georg Thieme Verlag, 1994).
[0141] Los polímeros aquí descritos se preparan de cualquier manera adecuada. Los procedimientos sintéticos adecuados usados para producir los polímeros proporcionados en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, polimerización catiónica, aniónica y por radicales libres. En algunos casos, cuando se usa un proceso catiónico, el monómero se trata con un catalizador para iniciar la polimerización. Opcionalmente, se usan uno o más monómeros para formar un copolímero. En algunas realizaciones, dicho catalizador es un iniciador que incluye, por ejemplo, ácidos protónicos (ácido de Brønsted) o ácidos de Lewis, en el caso de usar ácidos de Lewis, se usa también opcionalmente algún promotor tal como agua o alcoholes. En algunas realizaciones, el catalizador es, a modo de ejemplo no limitante, yoduro de hidrógeno, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, fluoruro de hidrógeno, ácido clorosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido trifluorometanosulfónico, tricloruro de aluminio, cloruros de alquilaluminio, complejos de trifluoruro de boro, tetracloruro de estaño, pentacloruro de antimonio, cloruro de cinc, tetracloruro de titanio, pentacloruro de fósforo, oxicloruro de fósforo u oxicloruro de cromo. En ciertas realizaciones, la síntesis polimérica se efectúa puro o en cualquier disolvente adecuado. Los disolventes adecuados incluyen, pero sin limitación, pentano, hexano, diclorometano, cloroformo o dimetilformamida (DMF). En ciertas realizaciones, la síntesis polimérica se efectúa a cualquier temperatura de reacción adecuada incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente -50 a aproximadamente 100ºC, o de aproximadamente 0 a aproximadamente 70ºC.
[0142] En ciertas realizaciones, los polímeros se preparan mediante polimerización por radicales libres. Cuando se usa un proceso de polimerización por radicales libres, se proporcionan (i) el monómero, (ii) opcionalmente el comonómero y (iii) una fuente opcional de radicales libres para desencadenar un proceso de polimerización por radicales libres. En algunas realizaciones, la fuente de radicales libres es opcional porque algunos monómeros pueden autoiniciarse tras calentamiento a alta temperatura. En ciertos casos, después de efectuar la mezcla de polimerización, se somete la mezcla a condiciones de polimerización. Las condiciones de polimerización son aquellas condiciones que causan que al menos un monómero forme al menos un polímero, como se discute en la presente memoria. Dichas condiciones se varían opcionalmente a cualquier nivel adecuado e incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, temperatura, presión, atmósfera, relaciones de compuestos de partida usados en la mezcla de polimerización y tiempo de reacción. La polimerización se lleva a cabo de cualquier manera adecuada incluyendo, por ejemplo, en disolución, dispersión, suspensión, emulsión o en bruto.
[0143] En algunas realizaciones, están presentes iniciadores en la mezcla de reacción. Se utiliza cualquier iniciador adecuado si es útil en los procesos de polimerización descritos en la presente memoria. Dichos iniciadores incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, uno o más de peróxidos de alquilo, peróxidos de alquilo sustituidos, peróxidos de arilo, peróxidos de arilo sustituidos, peróxidos de acilo, hidroperóxidos de alquilo, hidroperóxidos de alquilo sustituidos, hidroperóxidos de arilo, hidroperóxidos de arilo sustituidos, peróxidos de heteroalquilo, peróxidos de heteroalquilo sustituidos, hidroperóxidos de heteroalquilo, hidroperóxidos de heteroalquilo sustituidos, peróxidos de heteroarilo, peróxidos de heteroarilo sustituidos, hidroperóxidos de heteroarilo, hidroperóxidos de heteroarilo sustituidos, perésteres de alquilo, perésteres de alquilo sustituidos, perésteres de arilo, perésteres de arilo sustituidos o compuestos azoicos. En realizaciones específicas, se usan como iniciadores peróxido de benzoílo (BPO) y/o AIBN.
[0144] En algunas realizaciones, los procesos de polimerización se llevan a cabo en modo vivo, de cualquier manera adecuada, tal como, pero sin limitación, polimerización radicálica por transferencia de átomos (ATRP), polimerización por radicales libres vivos mediada por óxido de nitrógeno (NMP), polimerización con apertura de anillo (ROP), transferencia degenerativa (DT) o transferencia por adición-fragmentación reversible (RAFT). Usando procedimientos de polimerización convencional y/o viva/controlada, pueden producirse diversas arquitecturas poliméricas tales como, pero sin limitación, copolímeros en bloque, de injerto, estrellados y en gradiente, con lo que las unidades monoméricas se distribuyen estadísticamente o en forma de gradiente a lo largo de la cadena o se homopolimerizan en secuencia de bloque o injertos pendientes. En otras realizaciones, los polímeros se sintetizan por diseño macromolecular mediante transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible de xantatos (MADIX) (“Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton, y col., Macromolecular Rapid Communications, 22, nº 18, 1497-1503 (2001)).
[0145] En ciertas realizaciones, se usa la transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible o RAFT para sintetizar polímeros de esqueleto etilénico de esta invención. La RAFT es un proceso de polimerización viva. La RAFT comprende un proceso de transferencia de cadena degenerativo de radicales libres. En algunas realizaciones, los procedimientos de RAFT para preparar un polímero descrito en la presente memoria emplean compuestos de tiocarboniltio tales como, sin limitación, ditioésteres, ditiocarbamatos, tritiocarbonatos y xantatos para mediar la polimerización mediante un mecanismo de transferencia de cadena reversible. En ciertos casos, la reacción de un radical polimérico con el grupo C=S de cualquiera de los compuestos precedentes conduce a la formación de intermedios radicales estabilizados. Típicamente, estos intermedios radicales estabilizados no experimentan las reacciones de terminación típicas de la polimerización radicálica estándar sino que, en lugar de ello, reintroducen un radical capaz de reiniciación o propagación con monómero, reformando el enlace C=S en el proceso. En la mayoría de casos, este ciclo de adición al enlace C=S seguido de fragmentación del radical posterior continúa hasta que se ha consumido todo el monómero o se inactiva la reacción. Generalmente, la baja concentración de radicales activos en cualquier momento particular limita las reacciones de terminación normales.
[0146] En algunas realizaciones, los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) utilizados en los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria tienen un bajo índice de polidispersidad (PDI) o diferencias en la longitud de cadena. El índice de polidispersidad (PDI) puede determinarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, dividiendo el peso molecular medio ponderado de las cadenas poliméricas entre su peso molecular medio numérico. El peso molecular medio numérico es la suma de los pesos moleculares de cadena individuales dividido entre el número de cadenas. El peso molecular medio ponderado es proporcional al cuadrado del peso molecular dividido entre el número de moléculas de ese peso molecular. Puesto que el peso molecular medio ponderado es siempre mayor que el peso molecular medio numérico, la polidispersidad es siempre mayor o igual a 1. A medida que los valores se acercan al mismo, concretamente a medida que la polidispersidad se aproxima a un valor de 1, el polímero se acerca a la monodispersión, en la que cada cadena tiene exactamente el mismo número de unidades constitutivas. Son alcanzables valores de polidispersidad que se aproximan a 1 usando polimerización viva radicálica. Los procedimientos de determinación de la polidispersidad tales como, pero sin limitación, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz dinámica, desorción láser auxiliada por matriz/cromatografía de ionización y cromatografías de masas con electropulverización son bien conocidos en la materia. En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) de los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria tienen un índice de polidispersidad (PDI) de menos de 2,0, o de menos de 1,8, o de menos de 1,6 o de menos de 1,5, o de menos de 1,4, o de menos de 1,3,
o de menos de 1,2.
[0147] Los procesos de polimerización descritos en la presente memoria ocurren opcionalmente en cualquier disolvente adecuado o mezcla de los mismos. Los disolventes adecuados incluyen agua, alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, butanol), tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetona, acetonitrilo, hexametilfosforamida, ácido acético, ácido fórmico, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, dioxano, cloruro de metileno, éter (por ejemplo, dietiléter), cloroformo y acetato de etilo. En un aspecto, el disolvente incluye agua y mezclas de agua y disolventes orgánicos miscibles con agua tales como DMF.
[0148] En ciertas realizaciones, se preparan de cualquier manera adecuada poli(DMAEMA) y otras entidades poliméricas usadas en la presente memoria (por ejemplo, copolímeros o bloques copoliméricos de BMA, DMAEMA y PAA). En una realización, se prepara poli(DMAEMA) polimerizando DMAEMA en presencia de CTA de RAFT, ECT y un iniciador radicálico. En algunas realizaciones, se usa el macroCTA de poli(DMAEMA) en bloque para preparar una serie de copolímeros dibloque en el que el segundo bloque contenía BMA, DMAEMA y PAA. En otras realizaciones específicas, se invierte la orientación de los bloques en el polímero dibloque, de tal modo que tras el autoensamblado el extremo w del polímero se expone en el segmento hidrófilo de la micela o ensamblaje micelar. En diversas realizaciones, esto se consigue de cualquier manera adecuada, incluyendo una serie de vías sintéticas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la síntesis de los copolímeros en bloque descritos en la presente memoria empieza con la preparación del bloque hidrófobo formador de núcleo de PAA/BMA/DMAEMA, y se añade el bloque cargado hidrófilo formador de cubierta en la segunda etapa sintética sometiendo el macroCTA de PAA/BMA/DMAEMA resultante a una segunda etapa de polimerización por RAFT. Los enfoques alternativos incluyen reducir el macroCTA de PAA/BMA/DMAEMA formando un extremo tiol y enlazar entonces covalentemente un polímero cargado hidrófilo preformado con el tiol formado. Este enfoque sintético proporciona un procedimiento para la introducción de un grupo reactivo en el extremo w de la cadena polimérica expuesto en la superficie de la micela, proporcionando por tanto enfoques alternativos a la conjugación química con la micela.
[0149] En algunas realizaciones, se sintetizan copolímeros en bloque mediante la conjugación química de varios bloques poliméricos que se preparan mediante procesos de polimerización separados.
[0150] En algunos casos, los copolímeros en bloque (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana) comprenden monómeros que portan grupos reactivos que pueden usarse para la introducción postpolimerización de funcionalidades adicionales mediante químicas conocidas en la materia, por ejemplo, la química "clic" (para ejemplos de reacciones "clic" véase Wu, P.; Fokin, V. V. “Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications”. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17).
[0151] En casos específicos, se proporcionan en la presente memoria copolímeros en bloque que incluyen copolímeros en bloques desestabilizantes de membrana de las siguientes estructuras:
-
[Ds-Xl]b-[Bx-Py-Dz]a- [estructura1]
-[Bx-Py-Dz]a-[Ds-Xt]b- [estructura 2]
en las que x, y, z, s y t son la composición en % molar (generalmente 0-50%) de las unidades monoméricas individuales D (DMAEMA), B (BMA), P (PAA) y un monómero neutro hidrófilo (X) en el bloque polimérico, a y b son los pesos moleculares de los bloques, [Ds-Xt] es el bloque de núcleo hidrófilo y a y w designan los extremos opuestos del polímero. En ciertas realizaciones, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas realizaciones, x es 60%, y es 20% y z es 20%. En ciertas realizaciones, x es 70%, y es 15% y z es 15%. En ciertas realizaciones, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas realizaciones, x es 33%, y es 33% y z es 33%. En ciertas realizaciones, x es 50%, y es 20% y z es 30%. En ciertas realizaciones, x es 20%, y es 40% y z es 40%. En ciertas realizaciones, x es 30%, y es 40% y z es 30%. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende un bloque hidrófilo de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 30.000 Da, de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 20.000 Da, o de aproximadamente 7.000 Da a aproximadamente 15.000 Da. En realizaciones específicas, el bloque hidrófilo es de aproximadamente 7.000 Da, 8.000 Da, 9.000 Da, 10.000 Da, 11.000 Da, 12.000 Da, 13.000 Da, 14.000 Da o 15.000 Da. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende un bloque de núcleo hidrófobo de aproximadamente 2.000 Da a aproximadamente 50.000 Da, de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 50.000 Da, de aproximadamente 15.000 Da a aproximadamente 35.000 Da, o de aproximadamente 20.000 Da a aproximadamente 30.000 Da. En algunas realizaciones específicas, el polímero con un bloque hidrófilo de 12.500 Da y el bloque de núcleo hidrófobo de
25.000 Da (relación de longitud de 1:2) forma ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas). En algunas realizaciones específicas, el polímero con un bloque hidrófilo de 10.000 Da y un bloque de núcleo hidrófobo de
30.000 Da (relación de longitud 1:3) forma ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas). En algunas realizaciones específicas, el polímero con un bloque hidrófilo de 10.000 Da y un bloque de núcleo hidrófobo de 25.000 Da (relación de longitud 1:2,5) forma ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) de aproximadamente 45 nm (como se determina mediante medidas de dispersión de luz dinámica o microscopía electrónica). En algunas realizaciones específicas, las micelas son de 80 o 130 nm (como se determina mediante medidas de dispersión de luz dinámica o microscopía electrónica). Típicamente, a medida que aumenta el peso molecular (o longitud) de [Ds-Xt], que forma la cubierta de micela, respecto a [Bx-Py-Dz], el bloque de núcleo hidrófobo que forma el núcleo, aumenta el tamaño de la micela. En algunos casos, el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la cubierta [Ds-Xt] es importante para proporcionar una formación de complejo/neutralización de carga eficaz con el fármaco oligonucleotídico. Por ejemplo, en ciertos casos para ARNip de aproximadamente 20 pares de bases (concretamente, 40 cargas aniónicas), un bloque catiónico tiene una longitud adecuada para proporcionar una unión eficaz, por ejemplo, 40 cargas catiónicas. Para un bloque de cubierta que contiene 80 monómeros de DMAEMA (PM = 11.680) con un valor de pKa de 7,4, el bloque contiene 40 cargas catiónicas a pH 7,4. En algunos casos, se forman conjugados de polímero-ARNip estables (por ejemplo, complejos) mediante interacciones electrostáticas entre cargas opuestas de número similar. En ciertos casos, evitar un gran número de cargas positivas en exceso ayuda a evitar una toxicidad significativa in vitro e in vivo.
[0152] En realizaciones específicas, el bloque de núcleo hidrófobo del copolímero en bloque comprende una pluralidad de especies cargables catiónicas, por ejemplo, metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA). Por tanto, en algunas realizaciones, la estructura de dicho segmento polimérico está representada por la estructura 3:
Q1-[BMAx-PAAy-DMAEMAz]-Q2 [estructura 3]
en la que Q1 y Q2 en la denominación anterior denominan otros bloques poliméricos o funcionalidades de grupo terminal, y en la que x, y y z son la composición en % molar (generalmente, 0-50%) de las unidades monoméricas individuales. En ciertos casos, las unidades monoméricas individuales sirven para funciones individuales y sinérgicas. Por ejemplo, el poli(ácido propilacrílico), que comprende tanto especies aniónicas como hidrófobas con un valor de pKa de 6,7, es hidrófilo por encima de un pH de aproximadamente 6,7 y es crecientemente hidrófobo por
debajo de un pH de aproximadamente 6,7, en que los carboxilatos se protonan. En ciertos casos, aumentar la hidrofobia del entorno local, por ejemplo aumentando el % molar de la unidad monomérica BMA predominantemente hidrófoba en el bloque eleva el pKa de PAA y da como resultado la protonación de PAA a un pH mayor, es decir, el bloque que contiene PAA se vuelve más desestabilizante de membrana a un mayor pH y por tanto más sensible a 5 pequeños cambios ácidos a un pH por debajo del fisiológico pH 7,4. En algunos casos, la protonación de PAA da como resultado un gran aumento de la hidrofobia y un posterior cambio conformacional a una forma con propiedades desestabilizantes de membrana. Una tercera unidad monomérica en el bloque polimérico descrito anteriormente es la especie catiónica, por ejemplo DMAEMA, que, en algunos casos, sirve para múltiples funciones incluyendo, pero sin limitación, las siguientes. Cuando coinciden las cantidades molares equivalentes con la especie
10 aniónica de PAA, se crea neutralización de carga y el potencial de formación de interacciones electrostáticas que pueden contribuir a la estabilidad del núcleo hidrófobo de una estructura micelar en que Q1 o Q2 de la estructura anterior es un bloque homopolimérico hidrófilo, por ejemplo poli-DMAEMA.
[0153] En ciertas realizaciones, el copolímero en bloque (por ejemplo, copolímero en bloque desestabilizante 15 de membrana) tiene la fórmula química I:
[0154] En algunas realizaciones:
20 A0, A1, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo consistente en -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- y -O(C)bO-; en las que,
a es 1-4; 25 b es 2-4;
Y4 se selecciona del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, -O-alquilo C1-C10, -C(O)Oalquilo C1-C10, -C(O)NR6(C1-C10), heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10, cualquiera de los cuales está opcionalmente 30 sustituido con uno o más grupos flúor;
Y0, Y1 e Y2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, C(O)O-alquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo C1-C10, -O-alquilo C2-C10 y –S-alquilo C2-C10, -C(O)NR6-alquilo C2-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10;
35 Y3 se selecciona del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10; en los que
los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están totalmente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y4 se contemplan 40 con un número apropiado de átomos de hidrógeno;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor;
45 Q0 es un residuo seleccionado del grupo consistente en residuos que son hidrófilos a pH fisiológico y están al menos parcialmente cargados positivamente a pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo o similar); al menos parcialmente cargados negativamente a pH fisiológico, pero que experimentan protonación a pH inferior (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato o similar);
50 sustancialmente neutros (o no cargados) a pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol, polipropilenglicol, tiol o similar); al menos parcialmente dipolar a pH fisiológico (por ejemplo, un residuo monomérico que comprende un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico); residuos conjugables o funcionalizables (por ejemplo, residuos que comprenden un grupo reactivo, por ejemplo, azida, alquino, éster de succinimida, éster de tetrafluorofenilo, éster de pentafluorofenilo, éster de p-nitrofenilo, piridildisulfuro o similar) o hidrógeno;
Q1 es un residuo que es hidrófilo a pH fisiológico, y que está al menos parcialmente cargado positivamente a pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo o similar); al menos parcialmente cargado negativamente a pH fisiológico, pero que experimenta protonación a pH inferior (por ejemplo carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato o similar); sustancialmente neutro a pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol, polipropilenglicol, tiol o similar); o al menos parcialmente dipolar a pH fisiológico (por ejemplo, que comprende un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico);
Q2 es un residuo que está cargado positivamente a pH fisiológico incluyendo, pero sin limitación, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y piridilo;
Q3 es un residuo que está cargado negativamente a pH fisiológico, pero que experimenta protonación a pH inferior incluyendo, pero sin limitación, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato;
m es aproximadamente 0 a menos de 1,0 (por ejemplo, de 0 a aproximadamente 0,49);
n es mayor de 0 a aproximadamente 1,0 (por ejemplo, de aproximadamente 0,51 a aproximadamente 1,0); en el que
m+n= 1
p es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,9 (por ejemplo, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5);
q es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,9 (por ejemplo, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5); en el que:
r es de 0 a aproximadamente 0,8 (por ejemplo, de 0 a aproximadamente 0,6); en el que
p+q+r= 1
v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y,
w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
[0155] En algunas realizaciones, el número o relación de residuos monoméricos representado por p y q están en el intervalo de aproximadamente 30% entre sí, aproximadamente 20% entre sí, aproximadamente 10% entre sí, o similar. En realizaciones específicas, p es sustancialmente igual que q. En ciertas realizaciones, al menos parcialmente cargado incluye generalmente más de una cantidad traza de especies cargadas incluyendo, por ejemplo, al menos un 20% de los residuos cargados, al menos un 30% de los residuos cargados, al menos un 40% de los residuos cargados, al menos un 50% de los residuos cargados, al menos un 60% de los residuos cargados, al menos un 70% de los residuos cargados, o similar.
[0156] En ciertas realizaciones, m es 0 y Q1 es un residuo que es hidrófilo y sustancialmente neutro (o no cargado) a pH fisiológico. En algunas realizaciones, sustancialmente no cargado incluye, por ejemplo, menos de 5% cargado, menos de 3% cargado, menos de 1% cargado o similar. En ciertas realizaciones, m es 0 y Q1 es un residuo que es hidrófilo y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, m es 0 y Q1 es un residuo que es hidrófilo y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, m es >0 y n es >0 y uno de Q0 o Q1 es un residuo que es hidrófilo y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y el otro de Q0
o Q1 es un residuo que es hidrófilo y sustancialmente neutro a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, m es >0 y n es >0 y uno de Q0 o Q1 es un residuo que es hidrófilo y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico y el otro de Q0 o Q1 es un residuo que es hidrófilo y sustancialmente neutro a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, m es >0 y n es >0 y Q1 es un residuo que es hidrófilo y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico, y Q0 es un residuo que es conjugable o funcionalizable. En ciertas realizaciones, m es >0 y n es >0 y Q1 es un residuo que es hidrófilo y sustancialmente neutro a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es conjugable o funcionalizable.
[0157] En ciertas realizaciones, un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende un copolímero en bloque de fórmula II:
5 [0158] En algunas realizaciones, A0, A1, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo consistente en -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- y -O(C)bO-;
en los que, 10 a es 1-4;
b es 2-4;
15 Y0 e Y4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, O-alquilo C1-C10, -C(O)O-alquilo C1-C10, -C(O)NR6(C1-C10), heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor;
Y1 e Y2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, -C(O)O20 alquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo C1-C10, -O-alquilo C2-C10, –S-alquilo C2-C10, -C(O)NR6-alquilo C2-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10;
Y3 se selecciona del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10; en los que
25 los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están totalmente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y4 se completan con un número apropiado de átomos de hidrógeno;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, -CN, alquilo, 30 alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor;
Q1 y Q2 son residuos que están cargados positivamente a pH fisiológico incluyendo, pero sin limitación, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y piridilo.
35 Q3 es un residuo que está cargado negativamente a pH fisiológico, pero que experimenta protonación a pH inferior incluyendo, pero sin limitación, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato.
m es de 0 a aproximadamente 0,49; 40 n es de aproximadamente 0,51 a aproximadamente 1,0; en el que
m+n= 1
45 p es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; q es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; en el que:
p es sustancialmente igual a q; r es de 0 a aproximadamente 0,6; en el que
5 p+q+r= 1 v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y, w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
10 [0159] En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende un copolímero en bloque (por ejemplo, a pH fisiológico normal) de fórmula III:
15 [0160] En ciertas realizaciones, A0, A1, A2, A3 y A4, sustituidos como se indica, comprenden las unidades constitutivas (usadas intercambiablemente en la presente memoria con “unidades monoméricas” y “residuos monoméricos”) del polímero de fórmula III. En realizaciones específicas, las unidades monoméricas constitutivas de los grupos A de fórmula III son compatibles de polimerización en condiciones apropiadas. En ciertos casos, se
20 polimeriza un esqueleto etilénico o unidad constitutiva, polímero de -(C-C-)m-, en el que cada C está disustitudo con H y/o cualquier otro grupo adecuado, usando monómeros que contienen un doble enlace carbono-carbono, >C=C<. En ciertas realizaciones, cada grupo A (por ejemplo, cada uno de A0, A1, A2, A3 y A4) puede ser (concretamente, se selecciona independientemente de) -C-C- (concretamente, una unidad monomérica etilénica o esqueleto polimérico), -C(O)(C)aC(O)O- (concretamente, una unidad monomérica o esqueleto polimérico de polianhídrido), -O(C)aC(O)-
25 (concretamente, una unidad polimérica o esqueleto polimérico de poliéster), -O(C)bO- (concretamente, una unidad monomérica o esqueleto polimérico de polialquilenglicol) o similar (en el que cada C está disustituido con H y/o cualquier otro grupo adecuado tal como se describe en la presente memoria, incluyendo R12 y/o R13 como se describe anteriormente). En realizaciones específicas, el término “a” es un entero de 1 a 4 y “b” es un entero de 2 a
4. En ciertos casos, cada grupo "Y" y "R" enlazado con el esqueleto de fórmula III (concretamente, uno cualquiera de
30 Y0, Y1, Y2, Y3, Y4, R1, R2, R3, R4, R5) está unido a cualquier “C” (incluyendo cualquier (C)a o (C)b) de la unidad monomérica específica. En realizaciones específicas, ambos Y y R de una unidad monomérica específica están enlazados con el mismo “C”. En ciertas realizaciones específicas, ambos Y y R de una unidad monomérica específica están enlazados con el mismo “C”, estando “C” en a al grupo carbonilo de la unidad monomérica, si está presente.
35 [0161] En realizaciones específicas, R1-R11 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, alquilo C1-C5), cicloalquilo (por ejemplo, cicloalquilo C3-C6) o fenilo, en los que cualquiera de R1-R11 está opcionalmente sustituido con uno o más de flúor, cicloalquilo o fenilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más grupos alquilo.
40 [0162] En ciertas realizaciones específicas, Y0 e Y4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, alquilo C1-C10), cicloalquilo (por ejemplo, cicloalquilo C3-C6), -O-alquilo (por ejemplo, -O-alquilo C2-C10), -C(O)O-alquilo (por ejemplo, -C(O)O-alquilo C2-C10) o fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor.
45 [0163] En algunas realizaciones, Y1 e Y2 se seleccionan independientemente de un enlace covalente, alquilo, preferiblemente ahora alquilo C1-C10, -C(O)O-alquilo, preferiblemente ahora -C(O)O-alquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo, preferiblemente ahora -OC(O)-alquilo C2-C10, -O-alquilo, preferiblemente ahora –O-alquilo C2-C10 y -S-alquilo, preferiblemente ahora -S-alquilo C2-C10. En ciertas realizaciones, Y3 se selecciona de un enlace covalente, alquilo,
50 preferiblemente ahora alquilo C1-C5 y fenilo.
[0164] En algunas realizaciones, Z-está presente o ausente. En ciertas realizaciones en las que R3 y/o R4 son hidrógeno, Z- es OH-. En ciertas realizaciones, Z- es cualquier contraión (por ejemplo, uno o más contraiones), preferiblemente un contraión biocompatible tal como, a modo de ejemplo no limitante, cloruro, fosfato inorgánico u orgánico, sulfato, sulfonato, acetato, propionato, butirato, valerato, caproato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmitato, estearato, palmitolato, oleato, linolato, araquidato, gadolato, vacenato, lactato, glicolato, salicilato, desaminofenilalanina, desaminoserina, desaminotreonina, E-hidroxicaproato, 3-hidroxibutirato, 4-hidroxibutirato o 3hidroxivalerato. En algunas realizaciones, cuando cada Y, R y flúor opcional está unido covalentemente a un carbono del esqueleto seleccionado, cualquier carbono que no esté completamente sustituido está completado con el número apropiado de átomos de hidrógeno. Los números m, n, p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en su bloque y v y w proporcionan el peso molecular de cada bloque.
[0165] En ciertas realizaciones,
A0, A1, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo consistente en -C-, -C-C-, -C(O)(CR12R13)aC(O)O-, -O(CR12R13)aC(O)- y -O(CR12R13)bO; en el que,
a es 1-4;
b es 2-4;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 y R13 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6, arilo C5-C10, heteroarilo C4-C10, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor;
Y0 e Y4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, O-alquilo C1-C10, -C(O)O-alquilo C1-C10 y fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor;
Y1 e Y2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, -C(O)Oalquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo C1-C10, -O-alquilo C2-C10 y –S-alquilo C2-C10;
Y3 se selecciona del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C5 y fenilo; en los que los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están completamente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y4 se completan con el número apropiado de átomos de hidrógeno;
Z es uno o más contraiones fisiológicamente aceptables,
m es de 0 a aproximadamente 0,49;
n es de aproximadamente 0,51 a aproximadamente 1,0; en el que
m+n= 1 p es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; q es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; en el que: p es sustancialmente igual a q; r es de 0 a aproximadamente 0,6; en el que
p+q+r= 1 v es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y, w es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa. [0166] En una realización específica,
A0, A1, A2, A3 y A4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, - O(C)aC(O)- y -O(C)bO-; en los que a es 1-4;
b es 2-4; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 y R11 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6 y fenilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor;
Y0 e Y4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, Oalquilo C1-C10, -C(O)O-alquilo C1-C10 y fenilo, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor;
Y1 e Y2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, -C(O)Oalquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo C1-C10, -O-alquilo C2-C10 y –S-alquilo C2-C10;
Y3 se selecciona del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C5 y fenilo; en los que los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están completamente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y4 están completados con el número apropiado de átomos de hidrógeno;
Z es un contraión fisiológicamente aceptable, m es de 0 a aproximadamente 0,49; n es de aproximadamente 0,51 a aproximadamente 1,0; en el que m + n = 1 p es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; q es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5; en el que: p es sustancialmente igual a q; r es de 0 a aproximadamente 0,6; en el que
p+q+r= 1
v es de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y w es de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa. [0167] En algunas realizaciones, A1 es -C-C-; Y1 es -C(O)OCH2CH2-; R6 es hidrógeno; R7 y R8 son cada uno -CH3; y, R2 es -CH3. [0168] En algunas realizaciones,
A2 es -C-C-; Y2 es -C(O)OCH2CH2-; R9 es hidrógeno; R10 y R11 son cada uno -CH3; y, R3 es -CH3. [0169] En algunas realizaciones, A3 es -C-C-; R4 es CH3CH2CH2-; Y3 es un enlace covalente; y Z- es un anión fisiológicamente aceptable. [0170] En algunas realizaciones, A4 es -C-C-; R5 se selecciona del grupo consistente en hidrógeno y -CH3; e, Y4 es -C(O)O(CH2)3CH3. [0171] En algunas realizaciones, A0 es -C-C-; R1 se selecciona del grupo consistente en hidrógeno y alquilo C1-C3; e Y0 se selecciona del grupo consistente en -C(O)O-alquilo C1-C3.
[0172]
En algunas realizaciones, m es 0.
[0173]
En algunas realizaciones, r es 0.
[0174]
En algunas realizaciones, m y r son ambos 0.
[0175]
En diversas realizaciones descritas en la presente memoria, las unidades constitutivas que están
cargadas catiónica o positivamente a pH fisiológico (incluyendo, por ejemplo, ciertas unidades constitutivas hidrófilas) descritas en la presente memoria comprenden uno o más grupos amino, grupos alquilamino, grupos guanidina, grupos imidazolilo, grupos piridilo o similares, o las formas protonadas, alquiladas o cargadas de otro modo de los mismos. En algunas realizaciones, las unidades constitutivas que son catiónicas a pH fisiológico normal que se utilizan en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de metacrilatos de dialquilaminoalquilo (por ejemplo, DMAEMA). En diversas realizaciones descritas en la presente memoria, las unidades constitutivas que están cargadas aniónica o negativamente a pH fisiológico (incluyendo, por ejemplo, ciertas unidades constitucionales hidrófilas) descritas en la presente memoria comprenden uno o más grupos ácidos o bases conjugadas con los mismos incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, carboxilato, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato o similar. En algunas realizaciones, las unidades constitutivas que están cargadas aniónica o negativamente a pH fisiológico normal que se utilizan en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de ácido acrílico, ácido alquilacrílico (por ejemplo, ácido metilacrílico, ácido etilacrílico, ácido propilacrílico, etc.) o similar. En diversas realizaciones descritas en la presente memoria, las unidades constitutivas hidrófilas que son neutras a pH fisiológico comprenden uno o más grupos hidrófilos, por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxilado, polietilenglicol, polipropilenglicol, tiol o similar. En algunas realizaciones, las unidades constitutivas hidrófilas que son neutras a pH fisiológico normal que se utilizan en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, residuos monoméricos de ácido acrílico PEgilado, ácido metacrílico PEgilado, ácido hidroxialquilacrílico, ácido hidroxialquilalquilacrílico (por ejemplo, HPMA) o similar. En diversas realizaciones descritas en la presente memoria, las unidades constitutivas hidrófilas que son dipolares a pH
5 fisiológico comprenden un grupo cargado aniónica o negativamente a pH fisiológico y un grupo cargado catiónica o positivamente a pH fisiológico. En algunas realizaciones, las unidades constitutivas hidrófilas que son dipolares a pH fisiológico normal que se utilizan en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, residuos monoméricos que comprenden un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico, tales como los expuestos en el documento US 7.300.990.
10 [0176] En ciertas realizaciones, los polímeros proporcionados en la presente memoria comprenden adicionalmente una o más unidades constitutivas que comprenden una cadena lateral conjugable o funcionalizable (por ejemplo, un grupo pendiente de un residuo monomérico). En algunos casos, un cadena lateral conjugable o funcionalizable es un grupo que porta uno o más grupos reactivos que pueden usarse para la introducción
15 postpolimerización de funcionalidades adicionales mediante químicas conocidas en la materia, por ejemplo, la química “clic” (para ejemplos de reacciones “clic”, véase Wu, P.; Fokin, V. V. “Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications”. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17). En ciertas realizaciones, las cadenas laterales conjugables o funcionalizables proporcionadas en la presente memoria comprenden uno o más grupos activados adecuados tales como, pero sin limitación, éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), éster de HOBt (1
20 hidroxibenzotriazol), éster de p-nitrofenilo, éster de tetrafluorofenilo, éster de pentafluorofenilo, un grupo piridildisulfuro o similar. Se proporciona en ciertas realizaciones un copolímero en bloque que es un copolímero dibloque que tiene la fórmula química (a pH fisiológico normal o aproximadamente neutro) de fórmula IV1:
25 [0177] En ciertos casos, las unidades constitutivas del compuesto IV1 son como se muestran en los corchetes cuadrados a la izquierda y los corchetes curvos a la derecha y derivan de los monómeros:
[0178] Las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en su bloque. Las letras v y
w representan el peso molecular (medio numérico) de cada bloque en el copolímero dibloque. [0179] Se proporciona en algunas realizaciones un compuesto proporcionado en la presente memoria que es un compuesto que tiene la estructura:
[0180] Como se discute anteriormente, las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en su bloque. Las letras v y w representan el peso molecular (medio numérico) de cada bloque en el copolímero dibloque.
10 [0181] En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria los siguientes polímeros:
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV3
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV4
15 [PEGMAm-/-DMAEMAn]v-Bp-/-Pq-/-Dr]w IV5 [PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV6 [DMAEMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV7 [HPMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV8 [PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV9
20 [0182] En algunas realizaciones, B es un residuo de metacrilato de butilo; P es un residuo de ácido propilacrílico; D y DMAEMA son un residuo de metacrilato de dimetilaminoetilo; PEGMA es un residuo de metacrilato de polietilenglicol (por ejemplo, con 1-20 unidades de óxido de etileno, tal como se ilustra en el compuesto IV2, o 4-5 unidades de óxido de etileno o 7-8 unidades de óxido de etileno); MAA(NHS) es un residuo de N-hidroxisuccinamida
25 del ácido metilacrílico; HPMA es un residuo de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida y PDSM es un residuo de metacrilato de piridildisulfuro. En ciertas realizaciones, los términos m, n, p, q, r, w y v son como se describen en la presente memoria. En realizaciones específicas, w es de aproximadamente 1x a aproximadamente 5xv.
[0183] Los compuestos de fórmulas IV1-IV9 son ejemplos de polímeros proporcionados en la presente
30 memoria que comprenden una variedad de unidades constitutivas que constituyen el primer bloque del polímero. En algunas realizaciones, las unidades constitutivas del primer bloque se varían o tratan químicamente para crear polímeros en que el primer bloque es o comprende una unidad constitutiva que es neutra (por ejemplo, PEGMA), catiónica (por ejemplo, DMAEMA), aniónica (por ejemplo, PEGMA-NHS, en que el NHS se hidroliza al ácido, o ácido acrílico), anfolítica (por ejemplo, DMAEMA-NHS, en que el NHS se hidroliza al ácido) o dipolar (por ejemplo, fosfato
35 de poli-[2-metacriloiloxi-2’-trimetilamoniometilo]). En algunas realizaciones, los polímeros comprenden una funcionalidad piridildisulfuro en el primer bloque, por ejemplo [PEGMA-PDSM]-[B-P-D], que puede hacerse reaccionar y se hace opcionalmente con un ARNip tiolado, formando un conjugado de polímero-ARNip.
[0184] En una realización específica, un compuesto de fórmula IV3 es un polímero de clase P7, como se 5 describe en la presente memoria, y tiene el peso molecular, polidispersidad y composición monomérica como se expone en la Tabla 1.
Tabla 1: Pesos moleculares, polidispersidades y composiciones monoméricas de una especie de polímero P7
Clase de polímero
P7
Mn del bloquea “v”
9100
Mn del bloquea “w”
11300
PDI
1,45
% de residuo de BMA teórico del bloque “w”
40
% de residuo de PPA teórico del bloque “w”
30
% de residuo de DMAEMA del bloque teórico “w”
30
% de residuo de BMA experimental del bloqueb “w”
48
% de residuo de PPA experimental del bloqueb “w”
29
% de residuo de DMAEMA experimental del bloqueb “w”
23
a Determinado por columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Mongomeryville, PA) conectadas en serie a un Viscotek GPCmax VE2001 y un refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX). Se usó como fase móvil DMF de pureza HPLC que contenía 0,1% en peso de LiBr. Se determinaron los pesos moleculares de los copolímeros sintetizados usando una serie de patrones de poli(metacrilato de metilo). b Determinado mediante espectroscopia de RMN-1H (3% en peso en CDCl3; Bruker DRX 499)
[0185] En algunas realizaciones específicas, un polímero de fórmula IV3 es un polímero de clase P7 según la 10 Tabla 2. En algunas realizaciones específicas, un polímero de fórmula IV3 es un polímero de clase P7 denominado P7v6. PRx0729v6 se usa intercambiablemente con P7v6 en esta solicitud y en diversas solicitudes de prioridad.
Tabla 2
Polímero
Estructura Relación de bloques (p/v) Tamaño de partícula (nm)
PRx-1
[D]11,3K-[B50-P30-D20]20,7K 1,83 41
PRx-2
[D]14,5K-[B57-P23-D20]26,4K 1,82 49
PRx-3
[D]11,5K-[B35-P27-D38]33,4K 2,92 60
PRx-4
[D]10,7K-[B50-P27-D23]33,8K 3,16 50
PRx-5
[D]10,7K-[B40-P31-D29]32,2K 3,00 59
PRx-6
[D]14,5K-[B53-P31-D16]67,0K 4,62 115
Bloque de núcleo
[0186] El bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria es o comprende un hidrófobo desestabilizante de membrana dependiente del pH. En ciertas realizaciones,
20 el bloque de núcleo del copolímero en bloque desestabilizante de membrana es al menos parcial, sustancial o predominantemente hidrófobo.
[0187] El bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro. El bloque de 25 núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende una primera especie cargada que es aniónica a pH aproximadamente neutro, siendo el bloque de núcleo un bloque copolimérico. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende una primera especie cargable que es aniónica a un pH aproximadamente neutro, estando la primera especie cargable apantallada hidrófobamente (por ejemplo, al estar en
30 la proximidad del esqueleto polimérico de un bloque polimérico que comprende restos hidrófobos pendientes). En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH aproximadamente neutro y una segunda especie cargable que es catiónica a pH aproximadamente neutro.
[0188] En algunas realizaciones, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende al menos una primera especie, grupo o unidad monomérica cargable. En realizaciones específicas, la primera especie, grupo o unidad monomérica cargable está cargada o es cargable como una especie, grupo o unidad monomérica aniónico. Ha de entenderse que dichos bloques de núcleo incluyen especies, grupos y/o unidades monoméricas en los que ninguna, alguna o todas las especies, grupos o unidades monoméricas cargables están cargados.
[0189] En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende al menos una primera especie, grupo o unidad monomérica cargable y al menos una segunda especie, grupo o unidad monomérica cargable. En algunos casos, la primera especie, grupo o unidad monomérica cargable es como se describe anteriormente y la segunda especie, grupo o unidad monomérica cargable está cargada o es cargable como una especie, grupo o unidad monomérica catiónico. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria comprende al menos una primera especie, grupo o unidad monomérica cargable, al menos una segunda especie, grupo o unidad monomérica cargable y al menos una especie, grupo o unidad monomérica adicional. En realizaciones específicas, la especie, grupo o unidad monomérica adicional es una especie, grupo o unidad monomérica no cargable. En ciertas realizaciones, la especie, grupo o unidad monomérica adicional es una especie, grupo o unidad monomérica hidrófobo.
[0190] En ciertas realizaciones, cuando el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable aniónico y al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable catiónico, la relación del número de al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable aniónica al número de al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable catiónica es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable aniónico que está cargado aniónicamente y al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable catiónico que está cargado catiónicamente, en el que la relación del número de especies, grupos o unidades monoméricas cargados aniónicamente al número de especies, grupos o unidades monoméricas cargados catiónicamente presentes en el bloque de núcleo es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 3:2 a aproximadamente 2:3, o es de aproximadamente 1:1.
[0191] En algunas realizaciones, la relación a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4) del número de al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable aniónico al número de al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable catiónico es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1, o es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, el bloque de núcleo comprende al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable aniónico que está cargado aniónicamente y una especie, grupo o unidad monomérica cargable catiónico que está cargado catiónicamente, en el que la relación a un pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4) del número de especie, grupos o unidades monoméricas cargados aniónicamente al número de especies, grupos o unidades monoméricas cargados catónicamente presentes en el bloque de núcleo es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:3 a aproximadamente 3:2, de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1, o es de aproximadamente 1:1. En realizaciones específicas, la relación de especies, grupos o unidades monoméricas cargados positivamente presentes en el bloque de núcleo a especies, grupos o unidades monoméricas cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1 a pH aproximadamente neutro. En realizaciones más específicas, la relación de especies, grupos o unidades monoméricas cargados positivamente presentes en el bloque de núcleo a las especies, grupos o unidades monoméricas cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1 a pH aproximadamente neutro. En realizaciones específicas, la relación de especies, grupos o unidades monoméricas cargados positivamente presentes en el bloque de núcleo a especies, grupos o unidades monoméricas cargados negativamente en el núcleo es de aproximadamente 1:1,1 a aproximadamente 1,1:1 a pH aproximadamente neutro.
[0192] En realizaciones específicas, la primera unidad monomérica cargable es un ácido de Brønsted. En ciertos casos, como se usa en la presente memoria, una especie, grupo o unidad monomérica cargable incluye especies, grupos y/o unidades monoméricas en los que la adición o retirada de un protón (por ejemplo, de manera dependiente del pH) proporciona una especie, grupo o unidad monomérica catiónico o aniónico, respectivamente.
[0193] En algunas realizaciones, las primeras especies, grupos o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargadas negativamente al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85%, o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas primeras especies, grupos o unidades monoméricas cargables se cargan mediante la pérdida de un H+ como una especie aniónica a pH aproximadamente neutro. En realizaciones adicionales o alternativas, las primeras especies, grupos o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos o unidades monoméricas que son neutras o no cargadas al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85%, o al menos al 95% a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,5 o menos, de aproximadamente 6,2 o menos, de aproximadamente 6 o menos, de aproximadamente 5,9 o menos, de aproximadamente 5,8 o menos o un pH aproximadamente endosómico).
[0194] En algunas realizaciones, la primera especie o grupo cargable es, a modo de ejemplo no limitante, un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso o similar. De forma similar, en ciertas realizaciones es una primera unidad monomérica cargable útil en la presente memoria una unidad monomérica que comprende un ácido carboxílico, anhídrido, sulfonamida, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido bórico, ácido fosforoso o similar. En realizaciones específicas, es una primera unidad monomérica cargable útil en la presente memoria un ácido alquil C2-C8-acrílico.
[0195] En algunas realizaciones, las segundas especies, grupos o unidades monoméricas cargable presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas segundas especies, grupos o unidades monoméricas cargables se cargan mediante la adición de un H+ como una especie catiónica. En realizaciones adicionales o alternativas, las segundas especies, grupos o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de núcleo son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,5 o menos, de aproximadamente 6,2 o menos, de aproximadamente 6 o menos, de aproximadamente 5,9 o menos, de aproximadamente 5,8 o menos o pH aproximadamente endosómico).
[0196] En realizaciones específicas, la segunda unidad monomérica cargable es una base de Brønsted. En ciertas realizaciones, la segunda especie o grupo cargable es una amina (incluyendo, por ejemplo, aminas no cíclicas y cíclicas). En algunas realizaciones, la segunda unidad monomérica cargable es una unidad monomérica que comprende una amina tal como, a modo de ejemplo no limitante, etacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, metacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6 o acrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6. En algunas realizaciones, la segunda unidad monomérica cargable comprende un heterociclo nitrogenado, por ejemplo, un imidazol, piridina, piperidina, pirimidina o similar.
[0197] En ciertas realizaciones, el segmento de núcleo (por ejemplo, bloque de núcleo) de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria es hidrófobo y comprende uno o más tipos de especies cargables. En realizaciones específicas, la especie cargable es cargable como una especie catiónica. Los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria que comprenden especies cargables incluyen ensamblajes micelares en los que cada una de las especies cargables está presente individualmente en el ensamblaje micelar en estado cargado o estado no cargado. Además, cuando los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden una población de una primera especie cargable, una población de una segunda especie cargable y/o una población de cualquier especie cargable adicional, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria incluyen ensamblajes micelares en los que cada una de las poblaciones cargables primera, segunda y cualquiera adicional está presente cada una individualmente en el ensamblaje micelar en un estado completamente cargado, un estado parcialmente cargado o un estado completamente no cargado.
[0198] En algunas realizaciones, la especie cargada aniónica es cualquier residuo ácido orgánico o inorgánico que esté opcionalmente presente como especie protegida, por ejemplo un éster, o como ácido libre en el proceso de polimerización seleccionado. En algunas realizaciones, la especie cargable aniónica es un ácido débil tal como, pero sin limitación, los siguientes grupos: ácido borónico, sulfonamida, ácido fosfónico, ácido arsónico, ácido fosfínico, fosfato, ácido carboxílico, xantenos, tetrazol o sus derivados (por ejemplo, ésteres). En ciertas realizaciones, se usan monómeros tales como anhídrido maleico (Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S. Stayton “pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery”. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414) para la introducción de la primera especie cargable mediante hidrólisis postpolimerización de las unidades monoméricas de anhídrido maleico. En realizaciones específicas, son especies cargables que son aniónicas a pH fisiológico normal ácidos carboxílicos tales como, pero sin limitación, ácido 2-propilacrílico o, más exactamente, la unidad constitutiva derivada del ácido 2propilpropiónico, -CH2C((CH2)2CH3)(COOH) (PAA).
[0199] En algunas realizaciones, la especie cargable es catiónica. En ciertas realizaciones, la especie cargable es catiónica a pH fisiológico. En realizaciones específicas, son especies catiónicas a pH fisiológico especies nitrogenadas tales como amonio, -NRR’R", guanidinio (-NRC(=NR’H)+NR"R"’, incluyendo formas canónicas), en el que los grupos R son independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo o dos grupos R unidos al mismo átomo de nitrógeno o adyacentes pueden unirse también entre sí formando una especie heterocíclica tal como, pero sin limitación, pirrol, imidazol, pirimidina o indol.
[0200] En algunas realizaciones, la especie cargable está presente en unidades monoméricas dipolares (concretamente, en las que están presentes una especie aniónica y otra catiónica en la misma unidad monomérica).
[0201] En ciertas realizaciones, el bloque de núcleo comprende al menos una unidad, grupo o especie monomérico no cargable. En algunas realizaciones, la unidad monomérica no cargable es hidrófoba o comprende un grupo o especie hidrófobo. En ciertas realizaciones, el grupo hidrófobo tiene un valor de T de aproximadamente 1 o más, aproximadamente 2 o más, aproximadamente 3 o más, aproximadamente 4 o más, aproximadamente 5 o más
o similar. En realizaciones específicas, la unidad monomérica no cargable es, a modo de ejemplo no limitante, un etacrilato de alquilo C1-C8, un metacrilato de alquilo C2-C8 o un acrilato de alquilo C2-C8.
[0202] En algunas realizaciones, los copolímeros en bloque comprenden una pluralidad de especies hidrófobas. En algunas realizaciones, el copolímero en bloque comprende unidades monoméricas hidrófobas. En ciertas realizaciones, la unidad monomérica hidrófoba es un compuesto aromático o heteroaromático sustituido con vinilo. En realizaciones específicas adicionales, son monómeros hidrófobos los (alquil)acrilatos de alquilo. En realizaciones específicas, el monómero hidrófobo es un derivado de estireno.
[0203] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un bloque de núcleo de copolímero en bloque desestabilizante de membrana que tiene un peso molecular medio numérico (Mn) de aproximadamente
2.000 Da a aproximadamente 250.000 Da; de 2.000 Da a aproximadamente 100.000 Da, de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 100.000 Da, de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 50.000 Da o de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 50.000 Da.
Bloque de cubierta
[0204] El bloque de cubierta de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria es hidrófilo. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria es hidrófilo y no cargado a un pH aproximadamente fisiológico, por ejemplo, pH 7,4. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de un polímero desestabilizante de membrana descrito en la presente memoria es hidrófilo y está cargado a un pH aproximadamente fisiológico, por ejemplo, pH 7,4. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta del polímero desestabilizante de membrana comprende al menos una especie, grupo o unidad monomérica hidrófilo (por ejemplo, no cargado, catiónico, aniónico o dipolar). En realizaciones específicas, el bloque de cubierta del polímero desestabilizante de membrana comprende al menos una especie, grupo o unidad monomérica cargable. En realizaciones específicas, la especie, grupo o unidad monomérica cargable está cargado o es cargable como una especie, grupo o unidad monomérica catiónico. En otras realizaciones específicas, la especie, grupo o unidad monomérica cargable está cargada o es cargable como una especie, grupo o unidad monomérica aniónico. En realizaciones específicas, la especie, grupo o unidad monomérica cargable está cargado o es cargable como una especie, grupo o unidad monomérica dipolar. Ha de entenderse que dichos bloques de cubierta incluyen especies, grupos y/o unidades monoméricas en los que ninguna, alguna o todas las especies, grupos o unidades monoméricas están cargados.
[0205] En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de un polímero desestabilizante de membrana es independiente de la temperatura.
[0206] En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana no está cargado a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana está también no cargado a pH aproximadamente endosómico.
[0207] En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es policatiónico a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es también policatiónico a pH aproximadamente endosómico.
[0208] En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es policatiónico a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es también polianiónico a pH aproximadamente endosómico.
[0209] En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es dipolar a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es también dipolar a pH aproximadamente endosómico.
[0210] En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es un bloque homopolimérico. En ciertas realizaciones, un bloque de cubierta homopolimérico comprende unidades monoméricas cargables catiónicas, en las que algunas de las unidades monoméricas cargables catiónicas son catiónicas y en las que otras de las unidades monoméricas cargables catiónicas no están cargadas. En realizaciones adicionales o alternativas, el bloque de cubierta de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es heteropolimérico. En realizaciones específicas, un bloque de cubierta heteropolimérico comprende unidades monoméricas cargables catiónicas y unidades monoméricas no cargables. En ciertas realizaciones, un bloque de cubierta homopolimérico comprende unidades monoméricas cargables aniónicas, en las que algunas de las unidades monoméricas cargables aniónicas son aniónicas y en las que otras de las unidades monoméricas cargables aniónicas no están cargadas. En realizaciones adicionales o alternativas, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es heteropolimérico. En realizaciones específicas, un bloque de cubierta heteropolimérico comprende unidades monoméricas cargables aniónicas y unidades monoméricas no cargadas. Las unidades monoméricas no cargadas incluyen, por ejemplo, residuos de olefinas polioxiladas tales como PEGMA, residuos de hidroxialquilolefinas tales como HPMA, residuos de tiolalquilolefinas o similares.
[0211] En algunas realizaciones, las especies, grupos o unidades monoméricas cargables presentes en el bloque de cubierta de uno o más de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargadas positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En realizaciones específicas, estas especies, grupos o unidades monoméricas cargables en el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana se cargan mediante la adición de un H+ a una especie catiónica. En realizaciones adicionales o alternativas, las especies, grupos o unidades monoméricas cargables en el bloque de cubierta de uno
o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana son especies, grupos o unidades monoméricas que están cargados positivamente al menos al 20%, al menos al 30%, al menos al 40%, al menos al 50%, al menos al 60%, al menos al 70%, al menos al 80%, al menos al 85% o al menos al 95% a pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,5 o menos, aproximadamente 6,2 o menos, aproximadamente 6 o menos, aproximadamente 5,9 o menos, aproximadamente 5,8 o menos o pH aproximadamente endosómico).
[0212] En algunas realizaciones, la especie cargable aniónica es cualquier residuo ácido orgánico o inorgánico que esté opcionalmente presente como especie protegida, por ejemplo un éster, o como ácido libre, en el proceso de polimerización seleccionado. En algunas realizaciones, la especie cargable aniónica es un ácido débil tal como, pero sin limitación, los siguientes grupos: ácido borónico, sulfonamida, ácido fosfónico, ácido arsónico, ácido fosfínico, fosfato, ácido carboxílico, xantenos, tetrazol o sus derivados (por ejemplo, ésteres). En ciertas realizaciones, se usan monómeros tales como anhídrido maleico (Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman y Patrick S. Stayton “pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery”. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414) para la introducción de la primera especie cargable mediante hidrólisis postpolimerización de las unidades monoméricas de anhídrido maleico. En realizaciones específicas, son especies cargables que son aniónicas a pH fisiológico normal ácidos carboxílicos tales como, pero sin limitación, ácido 2-propilacrílico o, más exactamente, la unidad constitutiva derivada del ácido 2-propilpropiónico, -CH2C((CH2)2CH3)(COOH) (PAA).
[0213] En algunas realizaciones, el bloque de cubierta es catiónico a pH fisiológico o cercano (por ejemplo, el pH de plasma humano en circulación). En algunas realizaciones, el bloque de cubierta comprende un policatión. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta se enlaza con un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido tal como ARNip) que es un polianión que comprende x aniones, y el bloque de cubierta policatiónico comprende aproximadamente 0,6x, aproximadamente 0,7x, aproximadamente 0,8x, aproximadamente 0,9x, aproximadamente 1,0x, aproximadamente 1,1x cationes o más. En realizaciones específicas, el agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido tal como ARNip) es polianiónico y comprende x aniones, y el bloque de cubierta policatiónico comprende aproximadamente 0,7x cationes o más.
[0214] En algunas realizaciones, la especie cargable es catiónica. En ciertas realizaciones, la especie cargable es catiónica a pH fisiológico. En realizaciones específicas, las especies catiónicas a pH fisiológico son especies nitrogenadas tales como amonio, -NRR’R", guanidinio (-NRC(=NR’H)+NR"R"’, incluyendo formas canónicas) en los que los grupos R son independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo o dos grupos R unidos al mismo átomo de nitrógeno o adyacentes pueden unirse también entre sí formando una especie heterocíclica tal como, pero sin limitación, pirrol, imidazol, pirimidina o indol. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta es una poliamida de unión a ácido nucleico, un intercalante o un oligonucleótido formador de dúplex o tríplex. En ciertos casos, el bloque de cubierta es opcionalmente el bloque del extremo a o el bloque del extremo w del copolímero en bloque (por ejemplo, copolímero en bloque desestabilizante de membrana). Igualmente, el bloque de núcleo es opcionalmente el bloque del extremo a o el bloque del extremo w del copolímero en bloque (por ejemplo, copolímero en bloque desestabilizante de membrana).
[0215] En algunas realizaciones, la especie cargable está presente en unidades monoméricas dipolares (concretamente, en las que están presentes una especie cargable aniónica y catiónica en la misma unidad monomérica).
[0216] En realizaciones específicas, la unidad monomérica cargable del bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es una base de Brønsted. En ciertas realizaciones, la especie o grupo cargable del bloque de cubierta es una amina (incluyendo, por ejemplo, aminas no cíclicas y cíclicas). En algunas realizaciones, la unidad monomérica cargable del bloque de cubierta es una unidad monomérica que comprende una amina tal como, a modo de ejemplo no limitante, etacrilato de N,N-dialquil C1-C6aminoalquilo C1-C6, metacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, o acrilato de N,N-dialquil C1-C6aminoalquilo C1-C6. En algunas realizaciones, la unidad monomérica cargable del bloque de cubierta es una unidad monomérica que comprende un heterociclo nitrogenado, por ejemplo, un imidazol o piridina.
[0217] En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de copolímero en bloque desestabilizante de membrana proporcionado en la presente memoria tiene un peso molecular medio numérico (Mn) de aproximadamente 1.000 Da a aproximadamente 200.000 Da, de 1.000 Da a aproximadamente 100.000 Da, de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 100.000 Da, de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente
50.000 Da, de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 25.000 Da o de aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente 20.000 Da.
[0218] En realizaciones específicas, el bloque de cubierta del copolímero en bloque desestabilizante de membrana no está cargado y es hidrófilo a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7,4). En ciertas realizaciones, el bloque de cubierta hidrófilo está exento o sustancialmente exento de grupos cargables. En algunas realizaciones, un bloque de cubierta hidrófilo no cargado comprende o es polietilenglicol (PEG), poli(óxido de etileno) o similar.
[0219] En ciertas realizaciones, el bloque de cubierta del copolímero en bloque desestabilizante de membrana comprende un grupo funcionalizante (por ejemplo, un grupo solubilizante). En realizaciones específicas, el grupo funcionalizante es un grupo de polietilenglicol (PEG). En ciertas realizaciones, el bloque de cubierta comprende grupos, cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 30.000. En algunas realizaciones, el PEG es una parte de (por ejemplo se incorpora a) la cadena de bloque de cubierta. En ciertas realizaciones, se incorpora PEG a la cadena de bloque de cubierta durante la polimerización. En algunas realizaciones, el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana es PEG. En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria ensamblajes micelares que comprenden un primer copolímero en bloque desestabilizante de membrana con un bloque de cubierta policatiónico y un segundo copolímero en bloque desestabilizante de membrana con un bloque de cubierta de PEG. En ciertas realizaciones, se sustituyen por o funcionalizan con PEG una o más unidades monoméricas del bloque de cubierta. En algunas realizaciones, se conjuga PEG con grupos terminales de copolímero en bloque, o con uno o más grupos pendientes modificables presentes en el ensamblaje micelar presente en la presente memoria. En algunas realizaciones, se conjugan residuos de PEG con grupos modificables en el segmento o bloque hidrófilo (por ejemplo, un bloque de cubierta) de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria. En ciertas realizaciones, se copolimeriza un monómero que comprende un residuo de PEG formando la parte hidrófila del polímero que forma el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria.
Apantallamiento del bloque/segmento hidrófilo
[0220] En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden uno
o más agentes apantallantes. En algunas realizaciones, el bloque/segmento portador de polinucleótido comprende una unidad monomérica sustituida con PEG (por ejemplo, el PEG es una cadena lateral y no comprende el esqueleto del bloque portador de polinucleótido). En algunos casos, uno o más de los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque) utilizados en los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a aproximadamente
30.000. En algunas realizaciones, se conjuga PEG con grupos terminales poliméricos o con uno o más grupos modificables pendientes presentes en un polímero de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria. En algunas realizaciones, se conjugan los residuos de PEG con grupos modificables en el segmento o bloque hidrófilo (por ejemplo, un bloque de cubierta) de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria. En ciertas realizaciones, se copolimeriza un monómero que comprende un residuo de PEG de 2-20 unidades de óxido de etileno formando la parte hidrófila del polímero que forma el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria.
[0221] En algunos casos, un agente apantallante potencia la estabilidad del agente terapéutico (por ejemplo, polinucleótido o péptido, etc.) frente a la digestión enzimática en el plasma. En algunos casos, un agente apantallante reduce la toxicidad de los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria (por ejemplo, copolímero en bloque enlazado con polinucleótidos). En algunas realizaciones, un agente apantallante comprende una pluralidad de residuos monoméricos hidrófilos neutros. En algunos casos, se acopla covalentemente un polímero apantallante con un copolímero en bloque desestabilizante de membrana mediante un grupo terminal del polímero. En algunas realizaciones, se acopla covalentemente un agente apantallante con un resto pendiente enlazado con uno o más residuos monoméricos del polímero. En algunas realizaciones, una pluralidad de residuos monoméricos en un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende especies apantallantes pendientes (por ejemplo, un oligómero (por ejemplo, que tiene 20 o menos unidades repetidas) o polímero (por ejemplo, que tiene más de 20 unidades repetidas) de polietilenglicol (PEG)) acopladas covalentemente a través de un grupo funcional con el oligómero o polímero de polietilenglicol. En algunos casos, un copolímero en bloque comprende un oligómero o polímero de polietilenglicol (PEG) acoplado covalentemente con el extremo a o el extremo w del bloque desestabilizante de membrana del copolímero.
[0222] En ciertas realizaciones, el bloque/segmento portador de polinucleótido comprende una unidad monomérica que sirve para apantallar, al menos en parte, la carga (por ejemplo, cargas catiónicas) en el bloque/segmento portador de polinucleótido. En realizaciones particulares, el apantallamiento surge, al menos en parte, de un resto pendiente en la unidad monomérica que comprende, al menos en parte, el bloque/segmento portador de polinucleótido. Dicho apantallamiento reduce opcionalmente la toxicidad celular por cargas excesivas en este segmento.
Agentes terapéuticos
[0223] Se proporciona en ciertas realizaciones de la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende al menos un agente de investigación, al menos un agente de diagnóstico, al menos un agente terapéutico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, dichos agentes terapéuticos están presentes en la cubierta del ensamblaje micelar, en el núcleo del ensamblaje micelar, en la superficie del ensamblaje micelar o en una combinación de los mismos.
[0224] En diversas realizaciones, los agentes de investigación, agentes de diagnóstico y/o agentes terapéuticos se enlazan con el ensamblaje micelar o copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana del mismo de cualquier manera adecuada. En realizaciones específicas, se consigue el enlazamiento mediante enlaces covalentes, interacciones no covalentes, interacciones estáticas, interacciones hidrófobas o similares o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los agentes de investigación, agentes de diagnóstico y/o agentes terapéuticos enlazan con un bloque de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana. En ciertas realizaciones, los reactivos de investigación, agentes de diagnóstico o agentes terapéuticos forman el bloque de cubierta de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana. En algunas realizaciones, los reactivos de investigación, agentes de diagnóstico o agentes terapéuticos están en la cubierta del ensamblaje micelar.
[0225] En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende un primer agente terapéutico en la cubierta del ensamblaje micelar y un segundo agente terapéutico en el núcleo del ensamblaje micelar. En realizaciones específicas, el primer agente terapéutico es un polinucleótido y el segundo agente terapéutico es un fármaco hidrófobo. En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende un fármaco hidrófobo (por ejemplo, fármaco hidrófobo de molécula pequeña) en el núcleo del ensamblaje micelar.
[0226] En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende al menos 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 50 agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una composición que comprende una pluralidad de ensamblajes micelares descritos en la presente memoria, en los que los ensamblajes micelares en la misma comprenden, de media al menos 1-5, 5-250, 5-1000, 250-1000, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 50 agentes terapéuticos.
[0227] En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, etc. se seleccionan, a modo de ejemplo no limitante, de al menos un nucleótido (por ejemplo, un polinucleótido), al menos un carbohidrato
o al menos un aminoácido (por ejemplo, un péptido). En realizaciones específicas, el agente terapéutico es un polinucleótido, un oligonucleótido, un modulador de la expresión génica, un agente silenciador génico, un ARNip, un agente de iARN, un sustrato de Dicer, un miARN, un ARNhc, un oligonucleótido anticodificante o un aptámero. En otras realizaciones específicas, el agente terapéutico es un ARNia (“Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells”. Xiangao Sun, Harry A Rogoff, Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379-1382 (2008)). En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es una proteína, péptido, proteína negativa dominante, enzima, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un carbohidrato o una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Da.
[0228] En ciertas realizaciones, se enlaza uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un agente terapéutico. En algunas realizaciones, se enlaza uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un primer agente terapéutico, y uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana se enlaza con un segundo agente terapéutico. En ciertas realizaciones, se enlaza uno o más de la pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana con un primer agente terapéutico y se enlaza uno o más de los polímeros adicionales con un segundo agente terapéutico.
[0229] En algunas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar y/o el bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana comprende al menos un nucleótido, al menos un carbohidrato o al menos un aminoácido. En ciertas realizaciones, la cubierta del ensamblaje micelar y/o bloque de cubierta de uno o más copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana comprende un polinucleótido, un oligonucleótido, un modulador de la expresión génica, un agente silenciador génico, un ARNip, un agente de iARN, un sustrato de Dicer, un miARN, un ARNhc, un oligonucleótido anticodificante, un aptámero, un agente terapéutico proteico, una proteína, un péptido, una enzima, una hormona, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un carbohidrato, una molécula pequeña con un peso molecular mayor de aproximadamente 500 Da o una combinación de los mismos.
[0230] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden un polinucleótido, en los que el polinucleótido es un vector de expresión de mamífero. En otra realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden un polinucleótido que se diseña para recombinarse con y corregir una secuencia génica endógena en un ser humano. En algunas realizaciones, un polinucleótido proporcionado en un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es un modulador de la expresión génica.
[0231] Un vector de expresión de mamífero comprende una secuencia de ADN complementaria (un “ADNc” o minigén) que está ligado funcionalmente con una región promotora tal que el promotor active la expresión del ADNc. En ciertos casos, los vectores de expresión de mamífero comprenden también una señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ADNc. Una región promotora es un segmento nucleotídico que se reconoce por una molécula de ARN polimerasa para iniciar la síntesis de ARN (concretamente, transcripción) y puede incluir también otros elementos reguladores transcripcionales tales como potenciadores. Puede usarse cualquier número de secuencias reguladoras transcripcionales para mediar la expresión de genes ligados en vectores de expresión de mamífero. Los promotores incluyen, pero sin limitación, promotores retrovíricos, otros promotores víricos tales como los derivados de HSV o CMV y promotores de genes celulares endógenos. Los vectores de expresión de mamífero tienen típicamente también un origen de replicación de E. coli para posibilitar la propagación como plásmidos en bacterias.
[0232] En ciertos casos, es deseable poder introducir vectores de expresión de mamífero en células de mamífero en cultivo o in vivo. En algunas realizaciones, los vectores de expresión se transfectan a células de mamífero usando los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria.
[0233] Como se describe en la presente memoria, se usan los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria, en algunas realizaciones, para el suministro de polinucleótidos a una célula o un individuo necesitado de ello. En ciertas realizaciones, se unen bloques policatiónicos del ensamblaje micelar (por ejemplo, los bloques de cubierta de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana descritos en la presente memoria) a ADN de vector de expresión de mamífero y complejan el ADN con el ensamblaje micelar. En ciertos casos, se unen policationes y se complejan con ADN de vector de expresión de mamífero. En algunas realizaciones, se neutraliza la carga de un ensamblaje micelar que comprende un complejo polinucleotídico (por ejemplo, se neutraliza sustancialmente la carga de la cubierta del ensamblaje micelar o el bloque de cubierta de un polímero del ensamblaje micelar y el polinucleótido). Dependiendo de la longitud del polinucleótido, se ajusta opcionalmente la longitud del bloque policatiónico para proporcionar la neutralización de carga para el polinucleótido. En algunos casos, se consigue la neutralización de carga mediante la adición de cationes y/o policationes a la formulación. En algunas realizaciones, se diluye entonces un ensamblaje micelar que comprende un polímero y un polinucleótido (por ejemplo, de más de 200 unidades) según sea necesario en un tampón apropiado y se añade directamente a células en cultivo. La expresión del gen o ADNc transfectado en las células resultantes puede medirse fácilmente incluyendo en el vector de expresión de mamífero un módulo de expresión que active un gen indicador tal como luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa o GFP. Estos genes están fácilmente disponibles y se describen ensayos informativos.
[0234] En algunas realizaciones, se usan los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria para terapia génica. El tratamiento de enfermedades y trastornos por terapia génica implica generalmente la transferencia de nueva información genética a células. “Vectores de terapia génica” comprende el nuevo material genético para suministrar que está, opcionalmente, en un vector de expresión de mamífero. Los usos de ensamblajes micelares incluyen el suministro de secuencias de ADN para sustitución génica, inhibición de la expresión génica, corrección génica o aumento génico, o la introducción de genes que tienen algún otro efecto deseado, tal como la modulación de respuestas inmunitarias. La inhibición de la expresión génica se alcanza de cualquier manera adecuada incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, mediante la expresión de módulos génicos en células que expresan ARNhc u otros agentes de iARN.
[0235] En algunas realizaciones, se mezclan ensamblajes micelares que tienen un bloque de cubierta policatiónico con vectores de terapia génica, de tal modo que se unan al ensamblaje micelar. Se administra entonces el complejo ensamblaje micelar-vector de terapia génica en un excipiente adecuado (véase a continuación) a un sujeto vivo por vías que incluyen, pero sin limitación, intravenosa, intraarticular, intratecal, intracraneal, por inhalación, subcutánea o intraocular.
[0236] En realizaciones específicas, un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido). En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son útiles para suministrar polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a un individuo necesitado de ello. En realizaciones específicas, se proporciona en la presente memoria un ensamblaje micelar que comprende al menos 2, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100 polinucleótidos. En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende 2-50 polinucleótidos, 5-40 polinucleótidos, 5-30 polinucleótidos, 5-25 polinucleótidos, 20-40 polinucleótidos o similares. En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un modulador de la expresión génica oligonucleotídico. En realizaciones adicionales, el polinucleótido es un agente de silenciamiento génico oligonucleotídico. En realizaciones específicas, el polinucleótido es un agente de iARN, sustrato de Dicer o ARNip. En ciertas realizaciones, el ensamblaje micelar es una nanopartícula (por ejemplo, una micela) que comprende un núcleo, una cubierta y uno o más polinucleótidos, en la que el polinucleótido no está en el núcleo del ensamblaje micelar. En realizaciones específicas, el polinucleótido se incorpora a (por ejemplo, está presente en y/o forma una parte de) la cubierta del ensamblaje micelar. En algunas realizaciones, se enlaza uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) con el bloque de cubierta del polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque desestabilizante de membrana o un polímero diluyente/portador no desestabilizante de membrana) del ensamblaje micelar. En diversas realizaciones, se consigue el enlazamiento a través de uno o más enlaces covalentes, una o más interacciones no covalentes o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNip se enlaza covalentemente con un bloque hidrófobo del copolímero en bloque desestabilizante de membrana (por ejemplo, un bloque de núcleo). En realizaciones específicas, el ARNip se enlaza covalentemente con un bloque hidrófobo (por ejemplo, un bloque de núcleo) del copolímero en bloque y forma al menos una parte de la cubierta del ensamblaje micelar. En realizaciones más específicas, el ARNip es un bloque hidrófilo (por ejemplo, un bloque de cubierta) del copolímero en bloque. En otras realizaciones, el ARNip se enlaza con el bloque hidrófilo de un copolímero en bloque
o a un bloque polimérico opcional (por ejemplo, un bloque espaciador).
[0237] En algunas realizaciones, se enlaza uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) con un copolímero en bloque proporcionado en la presente memoria de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante asociación no covalente. La asociación no covalente entre (i) un polímero y/o un ensamblaje de polímeros proporcionado en la presente memoria (por ejemplo, una micela formada por una pluralidad de polímeros) y (ii) uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido) se consigue de cualquiera manera adecuada incluyendo, pero sin limitación, por interacción electrostática (incluyendo interacción electrostática con un polímero que tiene grupos catiónicos y un agente terapéutico que tiene grupos aniónicos), interacción hidrófoba, interacción por afinidad o una combinación de las mismas. En ciertas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos y/o polímeros del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) se modifican con restos químicos que proporcionan uno o más agentes terapéuticos y/o polímeros que tienen afinidad entre sí, tales como ácido arilborónico-ácido sailicilhidroxámico, cremallera de leucina u otros motivos peptídicos, interacciones iónicas entre cargas positivas y negativas en la micela y el agente terapéutico u otros tipos de ligamientos por afinidad química no covalentes. Adicionalmente, en algunas realizaciones se asocia un polinucleótido bicatenario (por ejemplo, se compleja) con un polímero o ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) descrito en la presente memoria. En algunas realizaciones, se asocia (por ejemplo, se compleja) un polímero o ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) con un agente de unión al surco menor del ácido nucleico o un agente intercalante que se enlaza (por ejemplo, covalentemente) con un componente (por ejemplo, un polímero) del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela).
[0238] En algunas realizaciones, el agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido) comprende al menos una carga negativa (por ejemplo, comprende un esqueleto cargado negativamente) y está asociado con una cubierta catiónica del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) y/o un bloque de cubierta catiónico de un copolímero en bloque del ensamblaje micelar. En realizaciones específicas, la cubierta o bloque de cubierta catiónico neutraliza al menos parcialmente las cargas negativas presentes en el uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos) enlazados con o presentes en el ensamblaje micelar. En ciertas realizaciones, uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, uno o más oligonucleótidos, uno o más ARNip o una combinación de los mismos) forman una asociación (por ejemplo, un complejo) con los bloques de cubierta policatiónicos del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela). En algunas realizaciones, la asociación (por ejemplo, complejo) entre el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) y el agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) se forma a cualquier relación de carga deseada de copolímero en bloque que forma en ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) a agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip), por ejemplo, entre 1:1 y 16:1. En realizaciones específicas, el complejo entre micela y ARNip se forma a una relación de carga de 2:1, 4:1 u 8:1. En otras palabras, en algunas realizaciones la relación del número de cargas catiónicas presentes en la cubierta del ensamblaje micelar al número de cargas aniónicas presentes en el agente terapéutico es cualquier valor deseado, por ejemplo, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 16:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 2:1, de aproximadamente 4:1 o de aproximadamente 8:1. En algunas realizaciones, se neutraliza la carga del ARNip mediante un bloque policatiónico de un copolímero en bloque que forma el ensamblaje micelar. Por ejemplo, en algunas realizaciones específicas, se asocia (por ejemplo, se compleja) un polinucleótido de 20 pares de bases (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) que comprende 40 cargas negativas a pH fisiológico con un ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende un bloque de cubierta de poli-DMAEMA (80 unidades monoméricas de longitud, PM= 11.680) con un pKa de aproximadamente 7,4. A este pH, el poli-DMAEMA contiene 40 cargas negativas, dando así como resultado una asociación de polinucleótido-bloque de cubierta (por ejemplo, complejo) que es de carga neta sustancialmente neutra. En ciertos casos, evitar un gran número de cargas positivas en exceso ayuda a reducir la toxicidad in vitro e in vivo. En algunas realizaciones, se asocia espontáneamente un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) con una cubierta cargada positivamente de un ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente memoria.
[0239] En algunas realizaciones, se conjuga químicamente un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) con el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) y/o con uno o más polímeros del ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) mediante cualquier técnica de conjugación química adecuada. Los agentes terapéuticos se conjugan opcionalmente con un extremo del polímero, o con una cadena lateral pendiente del polímero. En algunas realizaciones, se forman ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) que contienen un agente de iARN mediante conjugación del agente de iARN con un ensamblaje micelar ya formado (por ejemplo, micela) que comprende una pluralidad de polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque). En otras realizaciones, se forman ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) que contienen un agente de iARN mediante conjugación del agente de iARN con un polímero (por ejemplo, un copolímero en bloque desestabilizante de membrana) y posteriormente se forma el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante autoensamblado de los conjugados resultantes en un ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende el agente de iARN. En diversas realizaciones, dicho ensamblaje micelar comprende opcionalmente además polímeros no conjugados (por ejemplo, copolímeros en bloque) que son similares, idénticos o diferentes que los conjugados con el agente de iARN. El enlace covalente entre un polímero y un agente terapéutico de un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria es, opcionalmente, no escindible o escindible. En ciertas realizaciones, se enlaza un precursor de uno o más agentes de iARN (por ejemplo, un sustrato de Dicer) con el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) o con unidades poliméricas del ensamblaje micelar (por ejemplo, la micela por un enlace no escindible). En algunas realizaciones, se enlaza uno o más agentes de iARN a través de un enlace escindible. En ciertas realizaciones, los enlaces escindibles utilizados en los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria incluyen, a modo de ejemplo no limitante, enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro que se disocian en el entorno reductor del citoplasma). En algunas realizaciones, se consigue la asociación covalente entre un ensamblaje micelar (incluyendo los componentes del mismo) y un agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNip o péptido) mediante cualquier procedimiento de conjugación química adecuado incluyendo, pero sin limitación, ligadores amina-carboxilo, ligadores amina-sulfhidrilo, ligadores amina-carbohidrato, ligadores amina-hidroxilo, ligadores amina-amina, ligadores carboxilo-sulfhidrilo, ligadores carboxilo-carbohidrato, ligadores carboxilo-hidroxilo, ligadores carboxilo-carboxilo, ligadores sulfhidrilo-carbohidrato, ligadores sulfhidrilo-hidroxilo, ligadores sulfhidrilo-sulfhidrilo, ligadores carbohidrato-hidroxilo, ligadores carbohidrato-carbohidrato y ligadores hidroxilo-hidroxilo. En algunas realizaciones, se efectúa también la conjugación con enlaces y ligadores sensibles al pH incluyendo, pero sin limitación, ligamientos hidrazona y acetal. Se utiliza opcionalmente también cualquier otro procedimiento de conjugación adecuado, por ejemplo, está disponible una gran variedad de químicas de conjugación (véanse, por ejemplo, Bioconjugation. Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998 y capítulos del mismo).
[0240] En realizaciones específicas, el agente suministrado mediante el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria es un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el agente de diagnóstico es un agente de diagnóstico por imágenes, por ejemplo, un agente útil en la formación de imágenes del sistema vascular de mamífero que incluye, pero sin limitación, agentes de tomografía por emisión de positrones (TEP), agentes de tomografía axial computerizada (TAC), agentes de formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN), agentes de formación de imágenes por medicina nuclear (IMN), agentes de fluoroscopia y agentes de contraste de ultrasonidos. Dichos agentes de diagnóstico incluyen radioisótopos de elementos tales como yodo (I), incluyendo123I, 125I, 131I, etc., bario (Ba), gadolinio (Gd), tecnecio(Tc), incluyendo 99Tc, fósforo (P), incluyendo 31P, hierro (Fe), manganeso (Mn), talio (Tl), cromo (Cr), incluyendo 51Cr, carbono (C), incluyendo 14C, o similares, compuestos marcados fluorescentemente o sus complejos, quelatos, aductos y conjugados. En otras realizaciones, el agente de diagnóstico es un gen marcador que codifica proteínas que son fácilmente detectables cuando se expresan en una célula (incluyendo, pero sin limitación, �-galactosidasa, proteína fluorescente verde, luciferasa y similares) y sondas de ácido nucleico marcadas (por ejemplo, sondas radiomarcadas o marcadas fluorescentemente). En algunas realizaciones, se consigue la conjugación covalente de los agentes de diagnóstico con los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria según una variedad de procesos de conjugación. En otras realizaciones, el agente de diagnóstico está asociado no covalentemente con el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria complejando con un residuo quelante (por ejemplo, un residuo de ácido carboxílico) incorporado a los copolímeros en bloque que forman el ensamblaje micelar. En algunas realizaciones, se incorpora un monómero radiomarcado (por ejemplo, un monómero marcado con 14C) al esqueleto polimérico del ensamblaje micelar (por ejemplo, el bloque de cubierta o el bloque de núcleo de la micela). En algunas realizaciones, un ensamblaje micelar asociado con un agente de diagnóstico comprende un resto orientador.
[0241] En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente proteico. La conjugación de agentes terapéuticos proteicos (por ejemplo, un polipéptido) con ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria se consigue según una variedad de procesos de conjugación mediante una reacción química que implica uno o más grupos funcionales del agente terapéutico proteico (por ejemplo, un polipéptido) con uno o más de los grupos funcionales presentes en el ensamblaje micelar (por ejemplo, en la cubierta del ensamblaje micelar o en una unidad monomérica del bloque de cubierta). Los grupos funcionales polipeptídicos que están habitualmente implicados incluyen, pero sin limitación, grupos amino, hidroxilo, tiol o carboxilo. Dichos grupos pueden estar presentes como grupo terminal o presentes en las cadenas laterales aminoacídicas. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos proteicos se modifican por ingeniería genética para contener aminoácidos no naturales que comprenden grupos funcionales especiales para la formación de conjugados específicos de sitio, por ejemplo, grupos azido para conjugación mediante química de “clic”.
[0242] En ciertas realizaciones, se prepara un conjugado de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido) con un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque), en el que el polímero es un monómero o está presente en un ensamblaje micelar ensamblado proporcionado en la presente memoria, según un proceso que comprende las dos etapas siguientes: (1) activar un grupo terminal modificable (por ejemplo, 5’- o 3’-hidroxilo) de un oligonucleótido usando cualquier reactivo de activación adecuado tal como, pero sin limitación, 1-etil-3,3dimetilaminopropilcarbodiimida (EDAC), imidazol, N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC), HOBt (1-hidroxibenzotriazol), cloroformiato de p-nitrofenilo, carbonildiimidazol (CDI) y carbonato de N,N’disuccinimidilo (DSC) y (2) ligar covalentemente un copolímero en bloque con el extremo del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el grupo modificable del extremo 5’ o 3’ de un oligonucleótido se sustituye por otros grupos funcionales antes de la conjugación con el copolímero en bloque. Por ejemplo, el grupo hidroxilo (--OH) se sustituye opcionalmente con un ligador que porta un grupo sulfhidrilo (--SH), un grupo carboxilo (--COOH) o un grupo amina (-N-H2).
[0243] En aún otra realización, se conjuga un oligonucleótido que comprende un grupo funcional introducido en una o más de las bases (por ejemplo, una 5-aminoalquilpirimidina) con un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque), en el que el polímero es un monómero o está presente en un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria, usando un agente activador o un ligador bifuncional reactivo según cualquier procedimiento adecuado. Está disponible comercialmente una variedad de dichos agentes activadores y ligadores bifuncionales de suministradores tales como Sigma, Pierce, Invitrogen y otros.
[0244] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar (por ejemplo, micela) que comprende un oligonucleótido o una pluralidad de oligonucleótidos se forma mediante un autoensamblado espontáneo. El autoensamblado espontáneo del ensamblaje micelar se consigue, en algunas realizaciones, en un solo recipiente. Por ejemplo, en algunas realizaciones se combina un ensamblaje micelar (por ejemplo, una micela), autoensamblado diluyendo una disolución de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) descrito en la presente memoria en un disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) con un medio acuoso (por ejemplo, agua o PBS), con uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip), formándose así espontáneamente el ensamblaje micelar que comprende los polímeros y uno o más agentes terapéuticos. En otras realizaciones, ocurre el autoensamblado espontáneo (1) poniendo en contacto uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) de interés con un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque desestabilizante de membrana, copolímero en bloque no desestabilizante de membrana o polímero monobloque) descrito en la presente memoria para formar un conjugado de polímero-agente terapéutico y (2) sometiendo los conjugados de polímeroagente terapéutico a condiciones adecuadas para proporcionar el autoensamblado de los conjugados de polímeroagente terapéutico en un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria. En algunas realizaciones, la etapa de proporcionar el autoensamblado de los conjugados de polímero-agente terapéutico comprende adicionalmente poner en contacto los conjugados de polímero-agente terapéutico con un polímero adicional (por ejemplo, un copolímero en bloque no conjugado o polímero monobloque, o un polímero diluyente o similar, o una combinación de los mismos).
[0245] En algunas realizaciones, cualquier ensamblaje micelar descrito en la presente memoria comprende adicionalmente un polímero adicional que no está enlazado con un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el polímero adicional es un polímero diluyente o un polímero portador de resto orientador. En ciertas realizaciones, cualquier ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria comprende adicionalmente un polímero adicional que está enlazado con al menos un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un segundo agente terapéutico). En ciertas realizaciones, el al menos un segundo agente terapéutico (por ejemplo, segundo agente terapéutico) es diferente del al menos un agente terapéutico (por ejemplo, un primer agente terapéutico). En algunas realizaciones, la parte de núcleo (por ejemplo, bloques de núcleo) de todos los polímeros presentes en el ensamblaje micelar es similar o idéntica. En ciertas realizaciones, uno o más polímeros diferentes del ensamblaje micelar comprenden partes de núcleo similares o idénticas (por ejemplo, bloques de núcleo) pero partes no de núcleo diferentes (por ejemplo, bloques de cubierta).
Terapia
[0246] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria son útiles para tratar un sujeto con riesgo o aquejado de trastornos asociados a y/o causados por altos niveles plasmáticos de colesterol, apolipoproteína b y/o LDL-colesterol, por ejemplo, hipercolesterolemia. En ciertas realizaciones, el tratamiento comprende proporcionar un ensamblaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un agente oligonucleotídico) en el que el agente terapéutico silencia (por ejemplo, mediante escisión) un gen o producto génico que promueve dicha afección. En algunas realizaciones, el agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido o agente de iARN) silencia el gen de proproteína convertasa subtilisina/quexina de tipo 9 (PCSK9) responsable de la regulación de los niveles y función de lipoproteína de baja densidad (LDLR), y por tanto se usan ensamblajes micelares que comprenden dicho agente terapéutico para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de PCSK9, por ejemplo, trastornos asociados a y/o causados por altos niveles plasmáticos de colesterol, apolipoproteína b y/o LDLcolesterol, por ejemplo, hipercolesterolemia. En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares suministran agente polinucleotídico silenciador de PCSK9 (por ejemplo, ARNip) a una célula que expresa PCSK9. En algunas realizaciones, la célula es una célula hepática.
[0247] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria son útiles para tratar un sujeto con riesgo o aquejado de una proliferación celular indeseada (por ejemplo, proliferación de células malignas o no malignas). El tratamiento comprende proporcionar un ensamblaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un agente oligonucleotídico), en el que el agente terapéutico puede silenciar (por ejemplo, por escisión) un gen o producto génico que promueve la proliferación celular indeseada, y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del ensamblaje micelar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano). En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido) que es homólogo de y puede silenciar (por ejemplo, por escisión) un gen.
[0248] En ciertas realizaciones, el gen es, pero sin limitación, un gen de factor de crecimiento o de receptor de factor de crecimiento, un gen de fosfatasa, cinasa, por ejemplo proteína cinasa, serina o treonina cinasa, un gen de proteína adaptadora, un gen que codifica una molécula de la superfamilia de la proteína G o un gen que codifica un factor de transcripción. En algunos casos, el ensamblaje micelar comprende un polinucleótido que silencia un gen que se expresa en un tejido u órgano específico incluyendo, pero sin limitación, pulmón, páncreas, hígado, riñón, ovario, músculo, piel, mama, colon, estómago y similares.
[0249] En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia uno o más de los siguientes genes: el gen de PDGF �, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de PDGF �, por ejemplo, cánceres de testículo y pulmón; un gen Erb-B (por ejemplo, Erb-B-2 o Erb-B-3), y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de Erb-B, por ejemplo, cáncer de mama o pulmón; el gen Src, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de Src, por ejemplo cánceres de colon; el gen CRK, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de CRK, por ejemplo, cánceres de colon y pulmón; el gen GRB2, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de GRB2, por ejemplo, carcinoma espinocelular; el gen RAS, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de RAS, por ejemplo, cánceres pancreático, de colon y pulmón y leucemia crónica; el gen MEKK, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de MEKK, por ejemplo, carcinoma espinocelular, melanoma o leucemia; el gen JNK, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de JNK, por ejemplo, cánceres pancreático o de mama; el gen RAF, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de RAF, por ejemplo, cáncer de pulmón o leucemia; el gen Erk1/2, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de Erk1/2, por ejemplo, cáncer de pulmón; el gen PCNA(p21), y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de PCNA, por ejemplo, cáncer de pulmón; el gen MYB, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de MYB, por ejemplo, cáncer de colon o leucemia mielogenosa crónica; el gen c-MYC, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de c-MYC, por ejemplo, linfoma de Burkitt o neuroblastoma; el gen JUN, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de JUN, por ejemplo, cáncer de ovario, próstata o mama; el gen FOS, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de FOS, por ejemplo, cánceres de piel o próstata; el gen BCL-2, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de BCL-2, por ejemplo, cánceres de pulmón o próstata o linfoma no de Hodgkin; el gen de ciclina D, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de ciclina D, por ejemplo, cánceres de esófago y colon; el gen VEGF, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de VEGF, por ejemplo, cánceres de esófago y colon; el gen EGFR, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de EGFR, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de ciclina A, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de ciclina A, por ejemplo, cánceres de pulmón y cervicouterino; el gen de ciclina E, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de ciclina E, por ejemplo, cánceres de pulmón y mama; el gen WNT-1, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de WNT-1, por ejemplo, carcinoma de células basales; el gen de catenina, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de �-catenina, por ejemplo, adenocarcinoma o carcinoma hepatocelular; el gen c-MET, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de c-MET, por ejemplo, carcinoma hepatocelular; el gen PKC, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de PKC, por ejemplo, cáncer de mama; el gen NFKB, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de NFKB, por ejemplo, cáncer de mama; el gen STAT3, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de STAT3, por ejemplo, cáncer de próstata; el gen de survivina, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene
o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de survivina, por ejemplo, cánceres cervicouterino o pancreático; el gen Her2/Neu, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de Her2/Neu, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de topoisomerasa I, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de topoisomerasa I, por ejemplo, cánceres de ovario y colon; el gen de topoisomerasa IIa, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de topoisomerasa IIa, por ejemplo, cánceres de mama y colon.
[0250] En otras realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia mutaciones en uno de los siguientes genes: el gen p73, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de p73, por ejemplo, adenocarcinoma colorrectal; el gen p21(WAF1/CIP1), y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de p21(WAF1/CIP1), por ejemplo, cáncer hepático; el gen p27(KIP1), y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de p27(KIP1), por ejemplo, cáncer hepático; el gen PPM1D, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de PPM1D, por ejemplo, cáncer de mama; el gen RAS, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de RAS, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de caveolina I, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de caveolina I, por ejemplo, carcinoma epidermoide esofágico; el gen MIB I, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de MIB I, por ejemplo, carcinoma de mama masculino (MBC); el gen MTAI, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de MTAI, por ejemplo, carcinoma de ovario; el gen M68, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por una expresión indeseada de M68, por ejemplo, adenocarcinomas de esófago, estómago, colon y recto humanos.
[0251] En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia mutaciones en genes supresores tumorales, y por tanto puede usarse como procedimiento para promover la actividad apoptótica en combinación con quimioterapia. En algunas realizaciones, el gen supresor tumoral se selecciona de uno o más de los siguientes genes supresores tumorales: el gen supresor tumoral p53, el miembro de la familia p53 DN-p63, el gen supresor tumoral pRb, el gen supresor tumoral APC1, el gen supresor tumoral BRCA 1 y el gen supresor tumoral PTEN.
[0252] En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia uno de los siguientes genes de fusión: genes de fusión de mLL, por ejemplo, mLL-AF9, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión de mLL, por ejemplo, leucemias agudas; el gen de fusión BCR/ABL, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión BCR/ABL, por ejemplo, leucemias agudas y crónicas; el gen de fusión TEL/AML1, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión TEL/AML1, por ejemplo, leucemia infantil aguda; el gen de fusión EWS/FLI1, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión EWS/FLI1, por ejemplo, sarcoma de Ewing; el gen de fusión TLS/FUS1, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión de TLS/FUS1, por ejemplo, liposarcoma mixoide; el gen de fusión PAX3/FKHR, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión de PAX3/FKHR, por ejemplo, liposarcoma mixoide; el gen de fusión AML1/ETO, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por la expresión indeseada de un gen de fusión de AML1/ETO, por ejemplo, leucemia aguda.
[0253] En algunos aspectos de la presente memoria, los ensamblajes micelares proporcionan agentes terapéuticos para tratar un sujeto, por ejemplo, un ser humano con riesgo o aquejado de una enfermedad o trastorno que puede beneficiarse de la inhibición de la angiogénesis, por ejemplo, cáncer o degeneración de retina. El tratamiento comprende proporcionar un ensamblaje micelar que comprende un agente oligonucleotídico, en el que dicho agente oligonucleotídico es homólogo de y/o puede silenciar, por ejemplo por escisión, un gen que media la angiogénesis (por ejemplo, VEGF-R1, VEGF-R2 o un gen que codifique proteínas de señalización de rutas de estos receptores) y administrar una dosificación terapéuticamente eficaz de dicho ensamblaje micelar que comprende el agente oligonucleotídico a un sujeto, por ejemplo un sujeto humano.
[0254] En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia uno de los siguientes genes: el gen de a v-integrina, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por a v-integrina indeseada, por ejemplo, tumores cerebrales o tumores de origen epitelial; el gen de receptor de Flt-1, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por receptores de Flt-1 indeseados, por ejemplo, cáncer y artritis reumatoide; el gen de tubulina, y por tanto puede usarse para tratar un sujeto que tiene o con riesgo de un trastorno caracterizado por tubulina indeseada, por ejemplo, cáncer y neovascularización de retina.
[0255] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares que comprenden un oligonucleótido son útiles en el tratamiento de sujetos infectados con papilomavirus humano (HPV) o con riesgo o aquejados de un trastorno mediado por HPV, por ejemplo, cáncer cervicouterino.
[0256] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico que silencia la expresión de un gen de HPV que se reduce. En algunas realizaciones, el gen de HPV se selecciona del grupo de E2, E6 o E7.
[0257] En otra realización, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de HPV.
[0258] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil en el tratamiento de pacientes infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o con riesgo o aquejado de un trastorno mediado por el VIH, por ejemplo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen de VIH. En otras realizaciones, el gen de VIH es CCR5, Gag o Rev. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de VIH. En algunas realizaciones, el gen es CD4 o Tsg101.
[0259] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el virus de la hepatitis B (HBV) o con riesgo o aquejados de un trastorno mediado por HBV, por ejemplo, cirrosis y carcinoma hepatocelular. En una realización, se reduce la expresión del gen de HBV. En otra realización, el gen de HBV orientado codifica uno de los grupos de la región de cola de la proteína de núcleo de HBV, la región pre-cregious (pre-c) o la región cregious (c). En otras realizaciones, una secuencia de ARN de HBV orientada consta de la cola de poli(A). En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de HBV.
[0260] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados con, o con riesgo o aquejados de un trastorno mediado por un virus seleccionado de los siguientes virus: el virus de la hepatitis A (HAV); el virus de la hepatitis C (HCV); cualquiera del grupo de las cepas víricas de hepatitis que comprende hepatitis D, E, F, G o H; el virus respiratorio sincitial (RSV); el citomegalovirus de herpes (CMV); el virus de Epstein-Barr (EBV); el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV); el virus JC (JCV); mixovirus (por ejemplo, el virus que causa la gripe), rinovirus (por ejemplo, virus que causa el resfriado común) o coronavirus (por ejemplo, virus que causa el resfriado común); flavivirus de encefalitis de San Luis; flavivirus de encefalitis transmitida por garrapatas; flavivirus de encefalitis del valle de Murray; flavivirus del dengue; el virus de simio 40 (SV40); el virus de encefalomiocarditis (EMCV); el virus del sarampión (MV); el virus de la varicela zóster (VZV); un adenovirus (por ejemplo, virus que causa infección en el tracto respiratorio); poliovirus o poxvirus (poxvirus que causa la viruela). En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de estos virus.
[0261] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por herpesvirus simple (HSV) o con riesgo o aquejados de un trastorno mediado por HSV, por ejemplo, herpes genital y herpes labial, así como enfermedades con peligro mortal o que dañan la vista, por ejemplo, en paciente inmunocomprometidos. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen de HSV. En otra realización, el gen de HSV orientado codifica ADN polimerasa o helicasa-primasa. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de HSV.
[0262] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el virus del Nilo occidental o con riesgo o aquejados de un trastorno mediado por el virus del Nilo occidental. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen del virus del Nilo occidental. En otras realizaciones preferidas, el gen del virus del Nilo occidental se selecciona del grupo que comprende E, NS3 o NS5. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación del virus del Nilo occidental.
[0263] En algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por el virus linfotrófico de linfocitos T humano (HTLV), o una enfermedad o trastorno asociado a dicho virus, por ejemplo, leucemia o mielopatía. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen de HTLV. En algunas realizaciones, el gen de HTLV1 es el activador transcripcional de Tax. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de HTLV.
[0264] En algunos aspectos, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar un sujeto infectado por un patógeno, por ejemplo, un patógeno bacteriano, amébico, parasitario o fúngico.
[0265] Por tanto, en algunas realizaciones, el ensamblaje micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por un Plasmodium que causa la malaria. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen de Plasmodium. En otras realizaciones, el gen es el antígeno 1 de membrana apical (AMA1). En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen humano que es necesario para la replicación de Plasmodium.
[0266] En algunas realizaciones, el ensamblado micelar comprende un agente oligonucleotídico útil para tratar pacientes infectados por Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, o una enfermedad o trastorno asociado a cualquiera de estos patógenos. En algunas realizaciones, se reduce la expresión de un gen bacteriano y/o un gen humano que es necesario para la replicación de estas bacterias.
[0267] En algunas realizaciones, las enfermedades tratadas con los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria pueden ser sistémicas o estar presentes en un tejido específico, por ejemplo, pulmón, piel, hígado, mama, riñón, páncreas, SNC o similar. En ciertos aspectos, el oligonucleótido silencia un gen que media o está implicado en una enfermedad o trastorno metabólico, por ejemplo, diabetes, obesidad y similares. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido silencia un gen que media o está implicado en una enfermedad o trastorno pulmonar, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística o cáncer de pulmón. En algunos aspectos de la presente memoria, los ensamblajes micelares comprenden un agente oligonucleotídico útil para tratar un sujeto, por ejemplo un ser humano, con riesgo o aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por una respuesta inmunitaria indeseada, por ejemplo, una enfermedad o trastorno inflamatorio o una enfermedad o trastorno autoinmunitario. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es una isquemia o lesión por reperfusión, por ejemplo, isquemia o lesión por reperfusión asociada a infarto de miocardio agudo, angina inestable, derivación cardiopulmonar, intervención quirúrgica, por ejemplo, angioplastia, por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutánea, la respuesta a un órgano o tejido transplantado, por ejemplo, tejido cardiaco o vascular transplantado, o trombolisis. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno es reestenosis, por ejemplo, reestenosis asociada a intervención quirúrgica, por ejemplo, angioplastia, por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutánea. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno es enfermedad inflamatoria intestinal, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es inflamación asociada a infección o lesión. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno es asma, alergia, lupus, esclerosis múltiple, diabetes, por ejemplo, diabetes de tipo II, artritis, por ejemplo reumatoide o psoriásica. En ciertas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia una integrina o coligando de la misma, por ejemplo, VLA4, VCAM, ICAM. En otras realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia una selectina o coligando de la misma, por ejemplo, P-selectina, E-selectina (ELAM), I-selectina o glucoproteína 1 de P-selectina (PSGL-1). En ciertas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia un componente del sistema de complemento, por ejemplo, C3, C5, C3aR, C5aR, convertasa C3 y convertasa C5. En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia una quimiocina o receptor de la misma, por ejemplo, TNFI, TNFJ, IL-1I, IL-1J, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11 y CCR3. En otras realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia GCSF, Gro1, Gro2, Gro3, PF4, MIG, proteína básica pro-plaquetas (PPBP), MIP-1I, MIP-1J, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, CMBKR1, CMBKR2, CMBKR3, CMBKR5, AIF-1 o I-309.
[0268] En algunos aspectos, los ensamblajes micelares comprenden un agente oligonucleotídico útil para tratar un sujeto, por ejemplo un ser humano, con riesgo o aquejado de una enfermedad o trastorno neurológico. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson. En ciertas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia un gen de la familia amiloide, por ejemplo, APP, un gen de presenilina, por ejemplo, PSEN1 y PSEN2, o l-sinucleina. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno es un trastorno neurodegenerativo por trinucleótido repetido, por ejemplo, enfermedad de Huntington, atrofia dentatorubralpalidolusiana o una ataxia espinocerebelosa, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3 (enfermedad de Machado-Joseph), SCA7 o SCA8. En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico silencia HD, DRPLA, SCA1, SCA2, MJD1, CACNL1A4, SCA7 o SCA8.
[0269] En ciertos aspectos, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria comprenden un agente oligonucleotídico capaz de escindir o silenciar más de un gen. En estas realizaciones, el agente oligonucleotídico se selecciona de modo que tenga suficiente homología con una secuencia encontrada en más de un gen, por ejemplo, una secuencia conservada entre estos genes. Por tanto, en algunas realizaciones, un agente oligonucleotídico orientado a dichas secuencias silencia eficazmente la colección entera de genes.
[0270] En algunos aspectos, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria comprenden dos o más tipos de agentes oligonucleotídicos, en los que los agentes oligonucleotídicos silencian diferentes genes de la misma enfermedad o enfermedades diferentes.
[0271] Cualquier agente descrito en la presente memoria se enlaza con el ensamblaje micelar o polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana o polímeros adicionales) de cualquier manera adecuada, por ejemplo, cualquier manera descrita en la presente memoria.
Restos orientadores
[0272] En ciertas realizaciones, los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden al menos un resto orientador (por ejemplo, un resto que orienta a una célula o tipo de célula específico). En algunas realizaciones, el resto orientador está en el núcleo del ensamblaje micelar, en la cubierta del ensamblaje micelar, en la superficie del ensamblaje micelar, enlazado con un bloque de núcleo de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana, enlazado con un bloque de cubierta de un copolímero en bloque desestabilizante de membrana, es un bloque de cubierta de un agente desestabilizante de membrana, está presente en un polímero no desestabilizante de membrana en el ensamblaje micelar, enlazado con un agente terapéutico en el ensamblaje micelar o similar.
[0273] En casos específicos, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son útiles para el suministro de agentes terapéuticos a células diana específicas de un individuo. En ciertos casos, la eficacia de la captación celular de los ensamblajes micelares se potencia mediante la incorporación de restos orientadores en o sobre la superficie de los ensamblajes micelares. Un “resto orientador” (usado intercambiablemente con “agente orientador”) es cualquier reactivo de afinidad que reconozca la superficie de una célula (por ejemplo, una célula seleccionada). En algunas realizaciones, los restos orientadores reconocen un antígeno de superficie celular o se unen a un receptor sobre la superficie de la célula diana. Los restos orientadores adecuados incluyen, a modo de ejemplo no limitante, anticuerpos, moléculas de tipo anticuerpo o péptidos tales como péptidos de unión a integrina, tales como péptidos que contienen RGD, o moléculas pequeñas tales como vitaminas, por ejemplo, folato, azúcares tales como lactosa y galactosa, u otras moléculas pequeñas. Los antígenos de superficie celular incluyen una molécula de superficie celular tal como una proteína, azúcar, lípido u otro antígeno sobre la superficie celular. En realizaciones específicas, el antígeno de superficie celular experimenta internalización. Los ejemplos de antígenos de superficie celular orientados por los restos orientadores de los ensamblajes micelares (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, el receptor de transferrina de tipo 1 y 2, el receptor de EGF, los receptores de HER2/Neu, VEGF, integrinas, NGF, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69 y el receptor de asialoglucoproteína.
[0274] Los restos orientadores se enlazan, en diversas realizaciones, con cualquier extremo de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) del ensamblaje micelar, o con una cadena lateral de una unidad monomérica, o se incorporan a un bloque polimérico. El enlazamiento del resto orientador con el polímero se consigue de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante cualquiera de una serie de enfoques de química de conjugación incluyendo, pero sin limitación, ligadores de amina-carboxilo, ligadores de amina-sulfhidrilo, ligadores de aminacarbohidrato, ligadores de amina-hidroxilo, ligadores de amina-amina, ligadores de carboxilo-sulfhidrilo, ligadores de carboxilo-carbohidrato, ligadores de carboxilo-hidroxilo, ligadores de carboxilo-carboxilo, ligadores de sulfhidrilocarbohidrato, ligadores de sulfhidrilo-hidroxilo, ligadores de sulfhidrilo-sulfhidrilo, ligadores de carbohidrato-hidroxilo, ligadores de carbohidrato-carbohidrato y ligadores de hidroxilo-hidroxilo. En realizaciones específicas, se usa la química de “clic” para enlazar el ligando orientador con los copolímeros en bloque que forman los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria (para ejemplos de reacciones de “clic”, véase Wu, P.; Fokin, V. V. “Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications”. Aldrichim. Acta 2007, 40, 7-17). Se utilizan opcionalmente una gran variedad de químicas de conjugación (véase, por ejemplo, “Bioconjugation”, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998 y capítulos en el mismo). En algunas realizaciones, se enlazan los ligandos orientadores con un monómero y se usa entonces el compuesto resultante en la síntesis de polimerización de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) utilizado en un ensamblaje micelar descrito en la presente memoria. En algunas realizaciones, se enlazan los restos orientadores con un bloque de un primer copolímero en bloque, o con un bloque de un segundo copolímero en bloque, en un ensamblaje micelar mixto. En algunas realizaciones, se enlaza el ligando orientador con la hebra codificante o anticodificante de ARNip unido a un polímero del ensamblaje micelar. En ciertas realizaciones, se enlaza el agente orientador con el extremo 5’ o 3’ de la hebra codificante o anticodificante.
[0275] En realizaciones específicas, los copolímeros en bloque que forman los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria son biocompatibles. Como se usa en la presente memoria, “biocompatible” hace referencia a una propiedad de un polímero caracterizado porque su producto o productos de degradación in vivo no son, o al menos mínima y/o reparablemente, dañinos para el tejido vivo, y/o no causan, al menos mínima y controlablemente, una reacción inmunológica en el tejido vivo. Con respecto a sales, actualmente se prefiere que tanto la especie catiónica como la aniónica sean biocompatibles. Como se usa en la presente memoria, “fisiológicamente aceptable” es intercambiable con biocompatible. En algunos casos, los ensamblajes micelares y polímeros usados en la presente memoria (por ejemplo copolímeros en bloque) exhiben baja toxicidad en comparación con lípidos catiónicos.
[0276] En algunos casos, uno o más de los polímeros (por ejemplo, copolímeros en bloque) utilizados en los ensamblajes micelares descritos en la presente memoria comprenden cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 30.000. En algunas realizaciones, el PEG se conjuga con grupos terminales poliméricos o con uno o más grupos modificables pendientes presentes en un polímero de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria. En algunas realizaciones, los residuos de PEG se conjugan con grupos modificables en el segmento o bloque hidrófilo (por ejemplo, un bloque de cubierta) de un polímero (por ejemplo, copolímero en bloque) de un ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria. En ciertas realizaciones, se copolimeriza un monómero que comprende un residuo de PEG de 2-20 unidades de óxido de etileno formando la parte hidrófila del polímero que forma el ensamblaje micelar proporcionado en la presente memoria.
Captación celular
[0277] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares que comprenden agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos o ARNip) se suministran a células mediante endocitosis. Vesículas intracelulares y endosomas se usan intercambiablemente a lo largo de esta memoria descriptiva. El suministro exitoso de agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) al citoplasma tiene generalmente un mecanismo de escape endosómico. En ciertos casos, los ensamblajes micelares que comprenden agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) proporcionados en la presente memoria son sensibles al menor pH del compartimento endosómico tras la endocitosis. En ciertos casos, la endocitosis desencadena la protonación o neutralización de carga de especies cargables aniónicamente (por ejemplo, unidades de ácido propilacrílico) de los ensamblajes micelares, dando como resultado una transición conformacional en los ensamblajes micelares. En ciertos casos, esta transición conformacional da como resultado una forma desestabilizante de membrana más hidrófoba que media la liberación del agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip) desde los endosomas al citoplasma. En aquellos ensamblajes micelares que comprenden ARNip, el suministro de ARNip al citoplasma permite que ocurra su efecto silenciador génico de ARNm. En aquellos ensamblajes micelares que comprenden otros tipos de oligonucleótidos, el suministro al citoplasma permite que ocurra su acción deseada.
Composiciones farmacéuticas
[0278] Los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria (por ejemplo, aquellos enlazados con uno o más agentes terapéuticos, tales como uno o más oligonucleótidos) se proporcionan opcionalmente en una composición (por ejemplo, composición farmacéuticamente aceptable). En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria pueden administrarse a un paciente de cualquier manera adecuada, por ejemplo, con o sin estabilizantes, tampones y similares, formando una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria se formulan y usan como comprimidos, cápsulas o elixires para administración oral, supositorios para administración rectal, disoluciones o suspensiones estériles para administración inyectable y cualquier otra composición adecuada.
[0279] Se proporcionan formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ensamblajes micelares que comprenden al menos un agente terapéutico descrito en la presente memoria. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo, sales de adición de ácido, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencenosulfónico. Una composición o formulación farmacológica hace referencia a una composición o formulación en una forma adecuada para administración, por ejemplo administración sistémica, a una célula o paciente, incluyendo por ejemplo un ser humano. Las formas adecuadas dependen en parte del uso o la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica o por inyección. Por tanto, en realizaciones específicas en las que el ensamblaje micelar comprende y suministra un polinucleótido, la formulación está en una forma que no evita que el ensamblaje micelar, y más específicamente el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNip), alcance una célula diana con el polinucleótido intacto y/o funcional. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones farmacológicas inyectadas en la corriente sanguínea son solubles y/o dispersables. Además, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria son, preferiblemente, no tóxicas. En algunas realizaciones, en las que el ensamblaje micelar descrito en la presente memoria se administra para beneficio terapéutico, se administra una cantidad terapéutica eficaz del ensamblaje micelar que comprende un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido tal como ARNip). En una realización ejemplar, una cantidad terapéuticamente eficaz incluye una cantidad suficiente de ensamblaje micelar para proporcionar aproximadamente 10 mg o menos de ARNip por kg de individuo.
[0280] En algunas realizaciones, se administran sistémicamente las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido tal como un ARNip). Como se usa en la presente memoria, “administración sistémica” significa la absorción sistémica in vivo o acumulación de fármacos en la corriente sanguínea seguida de distribución por todo el cuerpo. Las vías de administración que conducen a la absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. En algunas realizaciones, las composiciones de ensamblaje micelar se administran por vía tópica.
[0281] En algunas realizaciones, las composiciones se preparan para almacenamiento o administración e incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz del agente terapéutico comprendido en el ensamblaje micelar en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se utilizan opcionalmente en la presente memoria cualquier portador o diluyente aceptable. Se describen portadores y diluyentes específicos, por ejemplo, en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro Ed., 1985. Por ejemplo, se añaden opcionalmente conservantes, estabilizantes, tintes y agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además, se usan opcionalmente antioxidantes y agentes de suspensión. Como se usa en la presente memoria, el término “portador farmacéuticamente aceptable” significa una carga, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico e inerte. Son algunos ejemplos de materiales usados opcionalmente como portadores farmacéuticamente aceptables azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y celulosa acetato; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tales como Tween 80; agentes de tamponación tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico, agua exenta de pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico y disoluciones tamponadas con fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes pueden estar también presentes en la composición, según el criterio del formulador. En algunas realizaciones, se administran las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria a seres humanos y/o animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intranasal, intraperitoneal, tópica (como por polvos, cremas, pomadas o gotas), subcutánea, bucal o como pulverizador oral o nasal.
[0282] En diversas realizaciones, las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos (concretamente, complejos de micela-oligonucleótido proporcionados en la presente memoria), las formas de dosificación líquida contienen además opcionalmente diluyentes o excipientes inertes tales como, a modo de ejemplo no limitante, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales incluyen también opcionalmente coadyuvantes tales como agentes humidificantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.
[0283] En algunas realizaciones, se formulan preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según cualquier manera adecuada, por ejemplo, usando agentes de dispersión, agentes humidificantes y/o agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril es, opcionalmente, una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se emplean opcionalmente están agua, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio USP e isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles como disolvente o medio de suspensión. Con este fin, se emplea opcionalmente cualquier aceite no volátil insípido incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. En realizaciones adicionales, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. En una realización específica, las partículas de ensamblaje micelar se suspenden en un fluido portador que comprende 1% (p/v) de carboximetilcelulosa de sodio y 0,1% (v/v) de Tween 80.
[0284] En algunas realizaciones, las formulaciones inyectables se esterilizan, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro con retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que opcionalmente se disuelven o dispersan en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
[0285] En ciertas realizaciones, son composiciones para administración rectal o vaginal los supositorios. Los supositorios se preparan opcionalmente mezclando el agente terapéutico comprendido en ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o cera de supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal, y por lo tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el agente terapéutico comprendido en ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, un “agente terapéutico comprendido en ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria” se usa intercambiablemente con uno o más ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria que comprenden uno o más agentes terapéuticos.
[0286] Las formas de dosificación sólidas adecuadas para administración oral incluyen, a modo de ejemplo no limitante, cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, se mezclan los ensamblajes micelares que comprenden un agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido) con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable e inerte tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) cargas o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la disolución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humidificantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles líquidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede comprender también agentes de tamponación.
[0287] Se emplean opcionalmente también composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura rellenas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[0288] En algunas realizaciones, las formas de dosificación sólida de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se preparan con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos adecuados. Contienen opcionalmente agentes opacificantes. En ciertas realizaciones, son una composición que libera el ingrediente o ingredientes activos solo, o preferiblemente, en cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones embebidas adecuadas incluyen, a modo de ejemplo no limitante, sustancias poliméricas y ceras.
[0289] Se emplean opcionalmente composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura rellenas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[0290] Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen, a modo de ejemplo no limitante, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizadores, inhalantes o parches. En algunas realizaciones, el agente terapéutico comprendido en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más conservantes, uno o más tampones o una combinación de los mismos (por ejemplo, según sea necesario). Se contemplan también que las formulaciones oftálmicas, gotas auriculares y gotas oculares están dentro del alcance de esta invención.
[0291] Las pomadas, pastas, cremas y geles proporcionados en la presente memoria contienen opcionalmente, además del agente terapéutico comprendido en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
[0292] Los polvos y pulverizadores contienen opcionalmente, además del agente terapéutico comprendido en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. En algunas realizaciones, los pulverizadores contienen adicionalmente propelentes habituales tales como clorofluorohidrocarburos.
[0293] Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación se preparan de cualquier manera adecuada, por ejemplo, disolviendo o distribuyendo las micropartículas o nanopartículas en un medio apropiado. Se usan opcionalmente potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana controladora de la velocidad o dispersando el agente terapéutico comprendido en los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria en una matriz o gel polimérico.
[0294] En algunos aspectos de la invención, el ensamblaje o ensamblajes micelares proporcionan algunas propiedades (por ejemplo, mecánicas, térmicas, etc.) que se efectúan habitualmente por los excipientes, reduciendo así la cantidad de dichos excipientes necesaria para la formulación.
[0295] En algunas realizaciones, los ensamblajes micelares proporcionados en la presente memoria tienen una viabilidad comercial superior respecto a otras tecnologías para el suministro de agentes terapéuticos incluyendo, pero sin limitación: inmunogenicidad reducida del portador después de administración in vivo repetida; menos etapas necesarias para ensamblar los múltiples elementos del vehículo de suministro, dando como resultado un menor coste de los productos y reproducibilidad de la fabricación, a juzgar por la capacidad de fabricar lotes repetidos de producto con menos de un 5%, menos de un 10% o menos de un 20% de variabilidad entre lotes en las propiedades de ensayo biofísico (incluyendo, pero sin limitación, aquellas tales como HPLC, GPC, DLS y TEM).
Ejemplos
[0296] A lo largo de la descripción de la presente invención, se usan diversos acrónimos y abreviaturas conocidos para describir monómeros o residuos monoméricos derivados de la polimerización de dichos monómeros. Sin limitación, a menos que se observe otra cosa: "BMA" (o la letra "B" como notación abreviada equivalente) representa metacrilato de butilo o un residuo monomérico derivado del mismo; "DMAEMA" (o la letra "D" como notación abreviada equivalente) representa metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo o un residuo monomérico derivado del mismo; “Gal” hace referencia a galactosa o un residuo de galactosa, incluyendo opcionalmente restos protectores de hidroxilo (por ejemplo, acetilo) o un derivado pegilado del mismo (como se describe a continuación); HPMA representa metacrilato de 2-hidroxipropilo o un residuo monomérico derivado del mismo; “MAA” representa ácido metacrílico un residuo monomérico derivado del mismo; "MAA(NHS)" representa éster N-hidroxisuccinimida del ácido metacrílico o un residuo monomérico derivado del mismo; "PAA" (o la letra “P” como notación abreviada equivalente) representa ácido 2-propilacrílico o un residuo monomérico derivado del mismo; "PEGMA" hace referencia a un monómero metacrílico pegilado, CH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2 o un residuo monomérico derivado del mismo. En cada caso, cualquiera de dichas denominaciones indica el monómero (incluyendo todas las sales o análogos iónicos del mismo) o un residuo monomérico derivado de la polimerización del monómero (incluyendo todas las sales o análogos iónicos del mismo), y la forma específica indicada es evidente por el contexto para un experto en la materia.
Ejemplo 1: Preparación de copolímeros
[0297] Se preparan polímeros y copolímeros dibloque de la siguiente fórmula general:
[Alx-/-A2y]n -[B1x-/-B2y-/-B3z]1-5n
en la que [A1-A2] es el primer copolímero en bloque, compuesto por residuos de los monómeros A1 y A2; [B1-B2-B3] es el segundo copolímero en bloque, compuesto por residuos de los monómeros B1, B2, B3; x, y, z son la composición polimérica en % molar de residuos monoméricos, n es el peso molecular.
[0298] Copolímeros dibloque ejemplares:
[DMAEMA]-[B-/-P-/-D] [PEGMAw]-[B-/-P-/-D] [PEGMAw-DMAEMA]-[B-/-P-/-D] [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D] [DMAEMA-/-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D] [HPMA-/-PDSM]-[B-/-P-/-D]
en los que:
B es metacrilato de butilo
P es ácido propilacrílico
D es DMAEMA que es metacrilato de dimetilaminoetilo
PEGMA es metacrilato de polietilenglicol en el que, por ejemplo, w = 4-5 o 7-8 unidades de óxido de etileno
MAA(NHS) es N-hidroxisuccinamida del ácido metacrílico HPMA es N-(2-hidroxipropil)metacrilamida
PDSM es metacrilato de piridildisulfuro.
[0299] Estos polímeros representan estructuras en que la composición del primer bloque de polímero o copolímero se varía o trata químicamente para crear polímeros en que el primer bloque es neutro (por ejemplo, PEGMA), catiónico (DMAEMA), aniónico (PEGMA-NHS, en que se hidroliza NHS al ácido), anfolítico (DMAEMA-NHS, en que se hidroliza NHS al ácido) o dipolar (por ejemplo, fosfato de poli-[2-metacriloiloxi-2’trimetilamoniometilo]). Además, el polímero de [PEGMA-PDSM]-[B-P-D] contiene una funcionalidad piridildisulfuro en el primer bloque que puede hacerse reaccionar con un ARNip tiolado formando un conjugado de polímero-ARNip.
Ejemplo 1.1: Síntesis de copolímero en bloque usando polimerización por RAFT
A. Agente de transferencia de cadena de RAFT
[0300] Se adaptó la síntesis del agente de transferencia de cadena (CTA) ácido 4-ciano-4(etilsulfaniltiocarbonil)sulfanilpentanoico (ECT), utilizado para las siguientes polimerizaciones por RAFT, de un procedimiento de Moad y col., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68. Brevemente, se añadió etanotiol (4,72 g, 76 mmol) durante 10 minutos a una suspensión agitada de hidruro de sodio (al 60% en aceite) (3,15 g, 79 mmol) en dietiléter (150 ml) a 0ºC. Se dejó agitar entonces la disolución durante 10 min antes de la adición de disulfuro de carbono (6,0 g, 79 mmol). Se recogió S-etiltritiocarbonato de sodio bruto (7,85 g, 0,049 mol) mediante filtración, se suspendió en dietiléter (100 ml) y se hizo reaccionar con yodo (6,3 g, 0,025 mol). Después de 1 hora, se filtró la disolución, se lavó con tiosulfato de sodio acuoso y se secó sobre sulfato de sodio. Se aisló entonces el disulfuro de bis(etilsulfaniltiocarbonilo) bruto mediante rotavapor. Se calentó a reflujo durante 18 h una disolución de disulfuro de bis(etilsulfaniltiocarbonilo) (1,37 g, 0,005 mol) y ácido 4,4’-azobis(4-cianopentanoico) (2,10 g, 0,0075 mol) en acetato de etilo (50 ml). Después de evaporación en rotavapor del disolvente, se aisló el ácido 4-ciano-4(etilsulfaniltiocarbonil)sulfanilpentanoico (ECT) bruto mediante cromatografía en columna usando gel de sílice como fase estacionaria y acetato de etilo:hexano 50:50 como eluyente.
B. Agente de transferencia de cadena macromolecular de poli(metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo) (macroCTA de poli-DMAEMA)
[0301] Se realizó la polimerización por RAFT de DMAEMA en DMF a 30ºC en atmósfera de nitrógeno durante 18 horas usando ECT y 2,2’-azobis-(4-metoxi-2,4-dimetilvaleronitrilo) (V-70) (Wako Chemicals) como iniciador radicálico. La relación inicial de monómero a CTA ([CTA]0/[M]0 era tal que la Mn teórica a 100% de conversión fuera
10.000 (g/mol). La relación inicial de CTA a iniciador ([CTA]0/[I]0) era de 10 a 1. Se aisló el agente de transferencia de cadena macromolecular poli-DMAEMA resultante mediante precipitación con dietiléter/pentano 50:50 v/v. Se redisolvió el polímero resultante en acetona, se precipitó posteriormente con pentano (x3) y se secó durante una noche a vacío.
C. Copolimerización de bloque de DMAEMA, PAA y BMA a partir del macroCTA de poli(DMAMEA).
[0302] Se añadieron las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA y BMA al macroCTA de poli(DMAEMA) disuelto en N,N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA a disolvente). Para todas las polimerizaciones, las [M]0/[CTA]0 y [CTA]0/[I]0 eran de 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de V70, se purgaron las disoluciones con nitrógeno durante 30 min y se dejaron reaccionar a 30ºC durante 18 h. Se aislaron los copolímeros dibloque resultantes mediante precipitación con dietiléter/pentano 50:50 v:v. Se redisolvieron entonces los polímeros precipitados en acetona, se precipitaron posteriormente con pentano (x3) y se secaron durante una noche a vacío. Se usó cromatografía por permeación en gel (GPC) para determinar los pesos moleculares y polidispersidades (PDI, Mw/Mn) de muestras tanto de macroCTA de poli(DMAEMA) como de copolímero dibloque en DMF con respecto a patrones de poli(metacrilato de metilo) (columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) conectadas en serie a un Viscotek GPCmax VE2001 y refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX). Se usó DMF de pureza HPLC que contenía 1,0% en peso de LiBr como fase móvil. La Figura 1A resume los pesos moleculares, composiciones y relaciones de bloques de algunos de los polímeros sintetizados por P7 RAFT.
Ejemplo 1.2. Preparación de copolimerización del segundo bloque (B1-B2-B3) de DMAEMA, PAA y BMA a partir del macroCTA de poli(PEGMA)
[0303] Se añadieron las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA y BMA al macroCTA de poli(PEGMA) disuelto en N,N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA a disolvente). Para todas las polimerizaciones, las [M]0/[CTA]0 y [CTA]0/[I]0 fueron de 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de AIBN, se purgaron las disoluciones con nitrógeno durante 30 min y se dejaron reaccionar a 68ºC durante 6-12 h. Se aislaron los copolímeros dibloque resultantes mediante precipitación con dietiléter/pentano 50:50 v:v. Se redisolvieron entonces los polímeros precipitados en acetona, se precipitaron posteriormente con pentano (x3) y se secaron durante una noche a vacío. Se usó cromatografía de permeación en gel (GPC) para determinar los pesos moleculares y polidispersidades (PDI, Mw/Mn) de muestras tanto de macroCTA de poli(PEGMA) como de copolímero dibloque en DMF usando un Viscotek GPCmax VE2001 y un refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX). Se usó DMF de pureza HPLC que contenía 1,0% en peso de LiBr como fase móvil. Se usó espectroscopia de RMN en CDCl3 para confirmar la estructura de polímero y calcular la composición del 2º bloque.
Ejemplo 1.3. Preparación y caracterización de copolímeros de PEGMA-DMAEMA
[0304] Se llevó a cabo la síntesis de polímero usando un procedimiento similar al descrito en los ejemplos 1.1 y 1.2. Se varió la relación de PEGM y DMAEMA en el primer bloque usando diferentes relaciones de alimentación de los monómeros individuales, creando los copolímeros descritos en la Figura 1B.
Ejemplo 1.4. Preparación y caracterización de copolímeros de PEGMA-MAA(NHS)
[0305] Se efectuó la síntesis de polímero como se describe en los ejemplos 1.1 y 1.2, usando relaciones de alimentación de monómero para obtener la composición deseada del 1º copolímero en bloque. En algunos casos, se prepara un polímero de [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D] en el que la relación de monómeros del copolímero en el 1º bloque es de 70:30. La Figura 14 resume la síntesis de polímeros de [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] en los que la relación de monómeros del copolímero en el 1º bloque es de 70:30. Las Figuras 15A, 15B y 15C resumen la caracterización de polímeros sintetizados por copolimerización por RAFT de PEGMA y MAA-NHS en los que la relación de monómeros del copolímero en el 1º bloque es de 70:30. Los polímeros que contienen NHS pueden incubarse en tampón acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7,4 y 8,5 durante 1-4 horas a temperatura ambiente o 37ºC para generar la forma hidrolizada (ácida).
Ejemplo 1.5. Preparación y caracterización de copolímeros de DMAEMA-MAA(NHS)
[0306] Se efectuó la síntesis de polímero como se describe en los ejemplos 1.1 y 1.2, usando relaciones de alimentación de monómero para obtener la composición deseada del 1º copolímero en bloque. En ciertos casos, se prepara un polímero de [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] en el que la relación de monómeros del copolímero en el 1º bloque es de 70:30. Los polímeros que contienen NHS pueden incubarse en tampón acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7,4 y 8,5 durante 1-4 horas a temperatura ambiente o 37ºC para generar la forma hidrolizada (ácida).
Ejemplo 2. Preparación y caracterización de conjugados de copolímero de HPMA-PDS(ARN) para el suministro del fármaco de ARNip
A. Síntesis del monómero metacrilato de piridildisulfuro (PDSMA)
[0307] Se disolvió Aldrithiol-2™ (5 g, 22,59 mmol) en 40 ml de metanol y 1,8 ml de AcOH. Se añadió la disolución en forma de una disolución de 2-aminoetanotiol·HCl (1,28 g, 11,30 mmol) a 20 ml de metanol durante 30 min. Se agitó la reacción en atmósfera de N2 durante 48 h a TA. Después de la evaporación de los disolventes, se lavó el aceite residual dos veces con 40 ml de dietiléter. Se disolvió el compuesto bruto en 10 ml de metanol y se precipitó el producto dos veces con 50 ml de dietiléter, consiguiéndose el compuesto 1 deseado en forma de un sólido amarillo claro. Rendimiento: 95%.
[0308] Se disolvieron piridinditioetilamina (6,7 g, 30,07 mmol) y trietilamina (4,23 ml, 30,37 mmol) en DMF (25 ml) y piridina (25 ml) y se añadió lentamente cloruro de metacriloílo (3,33 ml, 33,08 mmol) por jeringuilla a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción durante 2 h a TA. Después de la reacción, se inactivó la reacción con NaHCO3 sat. (350 ml) y se extrajo con acetato de etilo (350 ml). Se lavó adicionalmente la fase orgánica combinada con HCl al 10% (100 ml, 1 vez) y agua pura (100 ml, 2 veces) y se secó con MaSO4. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna (AE/Hex: 1/10 a 2/1) en forma de un jarabe amarillo. Rf= 0,28 (AE/Hex= 1/1).
Rendimiento: 55%.
B. Síntesis del copolímero de HPMA-PDSMA
[0309] Se realiza la polimerización por RAFT de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) y metacrilato de piridildisulfuro (típicamente a una relación monomérica de 70:30) en DMF (50% en peso de monómero:disolvente) a 68ºC en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas usando 2,2’-azobisisobutirilnitrilo (AIBN) como iniciador de radicales libres. La relación molar de CTA a AIBN es de 10 a 1 y la relación de monómero a CTA se ajusta para conseguir un peso molecular de 25.000 g/mol a un 100% de conversión. Se aisló el macroCTA de poli(HPMA-PDS) mediante precipitación repetida con dietiléter en metanol.
[0310] Se seca el macroCTA a vacío durante 24 horas y se usa entonces para copolimerización de bloque de metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA), poli(ácido propílico) (PAA) y metacrilato de butilo (BMA). Se añaden cantidades equimolares de DMAEMA, PAA y BMA ([M]0/[CTA]0= 250) al macroCTA de HPMA-PDS disuelto en N,Ndimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA a disolvente). Se añade el iniciador radicálico AIBN con un CTA a una relación de iniciador de 10 a 1. Se deja proceder la polimerización en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas a 68ºC. Después de ello, se aísla el polímero dibloque resultante mediante precipitación 4 veces con dietiléter/pentano 50:50, redisolviendo en etanol entre las precipitaciones. Se lava entonces el producto 1 vez con dietiléter y se seca durante una noche a vacío.
C. Conjugación de ARNip con copolímero de HPMA-PDSMA
[0311] Se obtuvo comercialmente ARNip tiolado (Agilent, Boulder, CO) en forma de ARN dúplex con una hebra 5’ codificante modificada con disulfuro. Se prepara la forma de tiol libre para conjugación disolviendo el compuesto liofilizado en agua y se trata durante 1 hora con el agente reductor de disulfuro TCEP inmovilizado en gel de agarosa. Se hizo reaccionar entonces el ARN reducido (400 μM) durante 24 horas con el polímero funcionalizado con piridildisulfuro en tampón fosfato (pH 7) que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM.
[0312] La reacción del polímero de piridildisulfuro con el ARN-tiol crea 2-piridintiona, que puede medirse espectrofotométricamente para caracterizar la eficacia de conjugación. Para validar adicionalmente el intercambio de disulfuro, se procesan los conjugados en un gel de tricina al 16,5% en PAGE-SDS. En paralelo, se tratan alícuotas de las reacciones de conjugación con TCEP inmovilizado antes de la PAGE-SDS para verificar la liberación del ARN del polímero en un entorno reductor. Se realizan las reacciones de conjugación a estequiometrías de polímero/ARN de 1, 2 y 5. Se usan las medidas de absorbancia espectrofotométrica UV a 343 nm para la liberación de 2piridintiona para medir las eficacias de conjugación.
Ejemplo 3: Síntesis de polímeros con agentes orientadores celulares: reacción de clic de polímeros terminados en azido con folato de propargilo
[0313] Se usa una combinación de polimerización radicálica controlada y química de clic de azida-alquino para preparar micelas de copolímero en bloque conjugadas con ligados biológicos (por ejemplo, folato) con potencial para orientación activa a tejidos/células específicos que contienen el receptor específico de interés (por ejemplo, folato). Se sintetizan los copolímeros en bloque mediante polimerización por transferencia de cadena por adiciónfragmentación reversible (RAFT) como se describe en el ejemplo 1, excepto porque se usa un agente de transferencia de cadena (CTA) azido. Se hace reaccionar entonces el extremo azido del polímero con el derivado alquino del agente orientador (por ejemplo, folato), produciendo el polímero que contiene el agente orientador.
Síntesis del agente de RAFT
[0314] Se prepara como sigue el agente de transferencia de cadena (CTA) de RAFT éster 3-azidopropílico del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metilpropiónico (C12-CTAN3):
[0315] Síntesis de 3-azidopropanol. Se hacen reaccionar 3-cloro-1-propanol (5,0 g, 53 mmol, 1,0 eq.) y azida de sodio (8,59 g, 132 mmol, 2,5 eq.) en DMF (26,5 ml) a 100ºC durante 48 h. Se enfría la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se vierte en etiléter (200 ml) y se extrae con una disolución acuosa saturada de NaCl (500 ml). Se separa la fase orgánica, se seca sobre MgSO4 y se filtra. Se concentra el sobrenadante, obteniéndose el producto (5,1 g, 95% de rendimiento).
[0316] Síntesis de cloruro del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metilpropiónico (DMP-Cl). Se disuelve ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metilpropiónico (DMP, Noveon >95%) (1,0 g, 2,7 mmol, 1,0 eq.) en cloruro de metileno (15 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se enfría la disolución aproximadamente a 0ºC. Se añade lentamente cloruro de oxalilo (0,417 g, 3,3 mmol, 1,2 eq.) en atmósfera de nitrógeno, se deja a la disolución alcanzar la temperatura ambiente y se agita durante un total de 3 h. Se concentra la disolución resultante a presión reducida, proporcionando el producto cloruro de ácido (1,0 g, 99% de rendimiento). Punto de fusión: 63ºC.
[0317] Síntesis de éster 3-azidopropílico del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metilpropiónico. Se disuelve 3-azidopropanol (265 mg, 2,62 mmol, 1,0 eq.) en cloruro de metileno (5 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se enfría la disolución aproximadamente a 0ºC. Se añade gota a gota una disolución de trietilamina (0,73 ml) en cloruro de metileno (5 ml) durante 10 min. Se añade gota a gota una disolución de DMP-Cl (1,0 g, 2,6 mmol) en cloruro de metileno (5 ml) y se deja a la disolución alcanzar la temperatura ambiente con agitación durante 3 h. Se concentra la disolución a presión reducida, se diluye con dietiléter (100 ml) y se lava con disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 ml), agua (50 ml) y disolución saturada de NaCl (50 ml) sucesivamente. Se separa la fase orgánica, se seca sobre MgSO4 (1,0 g) y se filtra. Se concentra el sobrenadante a presión reducida, proporcionando el producto (1,05 g, 90% de rendimiento) en forma de aceite residual.
[0318] Síntesis de folato de propargilo. Se disuelve ácido fólico (1,0 g, 0,0022 mol) en DMF (10 ml) y se enfría en un baño de agua/hielo. Se añaden N-hidroxisuccinimida (260 mg, 0,0025 mol) y EDC (440 mg, 0,0025 mol) y se agita la mezcla resultante en un baño de hielo durante 30 min, dando un precipitado blanco. Se añade una disolución de propargilamina (124 mg, 2,25 mmol) en DMF (5,0 ml), se deja calentar la mezcla resultante a temperatura ambiente y se agita durante 24 h. Se vierte la mezcla de reacción en agua (100 ml) y se agita durante 30 min, formando un precipitado. Se filtra el precipitado naranja-amarillo, se lava con acetona y se seca a vacío durante 6 h, proporcionando 1,01 g de producto (93% de rendimiento).
Reacción de clic de polímeros terminados en azido con folato de propargilo
[0319] Se hace reaccionar el polímero terminado en azido con folato de propargilo mediante el siguiente procedimiento ejemplar. Se purga con nitrógeno durante 60 min una disolución de N3-a-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-Dz]a-w (0,0800 mmol) en DMF (7 ml) y pentametildietilentriamina (PMDETA, Aldrich, 99%), (8,7 mg, 0,050 mmol) y se transfiere por jeringuilla a un vial equipado con una barra magnética de agitación que contiene CuBr (7,2 mg, 0,050 mmol) y folato de propargilo (42 mg, 0,088 mmol) en atmósfera de nitrógeno. Se agita la mezcla de reacción a 26ºC durante 22 h en ausencia de oxígeno. Se expone la mezcla de reacción al aire y se pasa la disolución a través de una columna de alúmina neutra. Se retira la DMF a vacío y se precipita el producto con hexanos. Se disuelve el copolímero en bloque terminado en folato resultante folato-a-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-D]a-w en THF y se filtra para retirar el folato de propargilo en exceso. Se retira el THF y se disuelve entonces el polímero en agua desionizada (DI) y se dializa durante 6 h usando una membrana con un corte de peso molecular de 1.000 Da. Se aísla el polímero mediante liofilización.
Ejemplo 4: Espectroscopia de RMN del copolímero en bloque PRx0729v6. (Figura 2)
[0320] Este ejemplo proporciona evidencias, usando espectroscopia de RMN, de que el polímero PRx0729v6 forma una estructura de tipo micela en disolución acuosa.
[0321] Se registraron los espectros de RMN-1H en Bruker AV301 en cloroformo deuterado (CDCl3) y agua deuterada (D2O) a 25ºC. Se usó un bloqueo de deuterio (CDCl3, D2O) y se determinaron los desplazamientos químicos en ppm a partir de tetrametilsilano (para CDCl3) y de sal de sodio del ácido 3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3d4 (para D2O). La concentración de polímero era de 6 mg/ml.
[0322] La espectroscopia de RMN del polímero sintetizado, usando el polímero PRx0729v6 como ejemplo, en tampón acuoso proporcionó evidencias de que los polímeros dibloque de la presente invención forman micelas en disolución acuosa. La formación de micelas da como resultado la formación de un núcleo interno viscoso apantallado que limita el movimiento de los protones que forman los segmentos de núcleo y evita el intercambio de deuterio entre el disolvente y los protones del núcleo. Esto se refleja por una significativa supresión o desaparición de las señales de RMN-1H de los correspondientes protones. Se usó esta propiedad inherente de la espectroscopia de RMN en disolución para mostrar que el bloque hidrófobo del núcleo de la micela está apantallado eficazmente. Si se forman micelas en medios acuosos, debería ocurrir la desaparición de las señales debido a los protones del bloque copolimérico hidrófobo.
[0323] La Figura 2 muestra los experimentos de RMN-1H del polímero PRx0729v6 en CDCl3 (disolvente orgánico) y D2O (disolvente acuoso). El espectro de RMN-1H del polímero en CDCl3 a temperatura ambiente (Fig. 1A) muestra las señales atribuidas a todos los protones poliméricos, indicando que las cadenas poliméricas permanecen dispersadas (no agregadas) en CDCl3 y conservan su movimiento, de modo que sus protones pueden intercambiarse con el disolvente. Esto indica que no se forman micelas estables con núcleos apantallados a partir de PRx0729v6 en disolvente orgánico. La Figura 2B muestra los espectros de RMN-1H de PRx0729v6 en D2O. Las señales que representan los protones del bloque hidrófobo (BMA, PAA, DMAEMA) desaparecen del espectro. Esto indica que se forman micelas estables con núcleos apantallados a partir de PRx0729v6 en disolución acuosa. Además, en el mismo espectro, la señal atribuida a la resonancia de los protones de los dos grupos metilo de DMAEMA (2,28 ppm) experimenta una supresión significativa, lo que implica que solo el primer bloque de poli-DMAEMA constitutivo de la cubierta está expuesto a agua, concretamente, principalmente el grupo cargado de DMAEMA. Un cálculo sencillo indica que el porcentaje integrado de PAA, DMAEMA del bloque hidrófobo (2900) restado de la señal en CDCl3 (5600) da el valor aproximado para la misma señal en D2O (2811), consistente con esta conclusión.
[0324] Tomados en conjunto, los resultados de los experimentos de RMN-1H indican que el polímero PRx0729v6 forma micelas con una estructura de núcleo-cubierta ordenada en la que el primer bloque de poli-DMAEMA forma una cubierta externa hidratada que rodea el núcleo compuesto por unidades hidrófobas (BMA) y unidades estabilizantes electrostáticamente de carga opuesta (PAA, DMAEMA).
Ejemplo 5: Determinación por dispersión de luz dinámica (DLS) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 complejado con ARNip (Figura 3)
[0325] El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 forma partículas uniformes de 45 nm de tamaño solo o de 47 nm de tamaño después de unión a ARNip.
[0326] Se midieron los tamaños de partícula de polímero solo o complejos polímero/ARNip mediante dispersión de luz dinámica usando un Malvern Zetasizer Nano ZS. Se midieron los polímeros en disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS) a 1 mg/ml para PRx0729v6 solo o a PRx0729v6 0,7 mg/ml complejado con ARNip de 21 unidades específico de GAPDH 1 μM (Ambion), con una relación de carga teórica de 4:1, cargas positivas en el polímero:cargas negativas en ARNip. El PRx0729v6 solo (45 nm) y el PRx0729v6 complejado con ARNip (47 nm) (Figura 3) muestran tamaños de partícula similares con una distribución casi uniforme, PDI <0,1.
Ejemplo 6: Análisis de desplazamiento en gel de complejos de polímero PRx0729v6/ARNip a diferentes relaciones de carga (Figura 4)
[0327] El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 se une a ARNip a diversas relaciones de carga, dando como resultado un complejo con movilidad electroforética reducida.
[0328] Se analizó la unión de polímero-ARNip mediante electroforesis en gel (Figura 4) y demuestra que ocurre una unión completa de ARNip a polímero a una relación de carga de polímero/ARNip de 4:1 y mayor.
Ejemplo 7. Concentración de estabilización crítica (CSC) del polímero PRx0729v6. (Figura 5)
[0329] El siguiente ejemplo demuestra que la propiedad de partícula micelar del polímero PRx0729v6 es estable a una dilución de 100 veces.
[0330] Se disolvió el polímero PRx0729v6 en tampón PBS a pH 7,4 a una concentración de 1 mg/ml ± NaCl 0,5 M. Se midió el tamaño de partícula mediante dispersión de luz dinámica en un intervalo de 5 veces de diluciones en serie desde 1 mg/ml a 1,6 μg/ml con PBS ± NaCl 0,5 M. La Figura 5 muestra que un tamaño de partícula de aproximadamente 45 nm es estable hasta una concentración de aproximadamente 10 μg/ml. El polímero PRx0729v6 parece ser inestable por debajo de aproximadamente 5 μg/ml (la concentración de estabilización crítica o CMC), cuando las cadenas poliméricas individuales se disocian y forman agregados no específicos.
Ejemplo 8. Estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en disolventes orgánicos (Figura 6)
[0331] Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6 se disocia en disolventes orgánicos, consistentemente con la naturaleza hidrófoba del núcleo micelar.
[0332] Se disolvió el polímero PRx0729v6 en diversos disolventes orgánicos a una concentración de 1 mg/ml y se midió el tamaño de partícula mediante dispersión de luz dinámica. La Figura 6 muestra que aumentar la concentración de dimetilformamida (DMF) da como resultado la disociación de micelas a cadenas agregadas.
Ejemplo 9: Conjugación de ARNip con ensamblaje micelar
A. Conjugación de ARNip bicatenario con copolímero en bloque que contiene tiol
[0333] Se preparó ARNip-piridildisulfuro disolviendo amino-ARNip 10 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,2 u otros tampones no aminados, por ejemplo, borato, Hepes, bicarbonato, con el pH en el intervalo apropiado para la modificación del éster de NHS (pH 7-9). Se disolvió SPDP a una concentración de 6,2 mg/ml en DMSO (disolución madre 20 mM) y se añadieron 25 μl de disolución madre de SPDP a cada ml de amino-ARNip para modificar. Se mezcló la disolución y se hizo reaccionar durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Tiempos de reacción más largos (incluyendo durante una noche) no afectaron adversamente la modificación. El ARN modificado (piridildisulfuro) se purificó de los subproductos de reacción mediante diálisis (o filtración en gel) usando fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 10 mM, pH 7,2. Se hizo reaccionar el ARNip-piridildisulfuro preparado a una relación molar de 1:5 con el polímero PRx0729v6 (que contiene un tiol libre en el extremo w) en presencia de EDTA 10-50 mM en PBS, pH 7,2. Se controló espectrofotométricamente la extensión de la reacción mediante la liberación de piridin-2-tiona y mediante electroforesis en gel.
B. Conjugación de ARN monocatenario con polímero seguido de asociación de la segunda hebra.
[0334] Se preparó conjugado de ARN monocatenario-piridildisulfuro usando el procedimiento del ejemplo anterior, partiendo de un ARN monocatenario modificado con amino. Después de acoplar el ARN-piridildisulfuro con la micela de copolímero en bloque, se añade la cepa de ARN complementaria a la mezcla de reacción, y se dejan asociar las dos hebras durante 1 h a una temperatura aproximadamente 20ºC menor que la Tm del ARN dúplex.
Ejemplo 10: Actividad silenciadora génica de complejos de ARNip-ensamblaje micelar en células de cultivo de mamífero (Figura 7 y Figura 12).
[0335] Se ensayó la actividad silenciadora génica (KD) de complejos de ARNip/polímero PRx0729v6 en formato de 96 pocillos midiendo la expresión génica específica después de 24 horas de tratamiento con complejos de PRx0729v6:ARNip. Se mezclaron ARNip orientado a polímero y GAPDH o ARNip de control negativo (Ambion) en 25 μl, obteniéndose diversas relaciones de carga y concentraciones 5 veces superiores a la concentración de transfección final, y se dejaron complejar durante 30 minutos antes de la adición a células HeLa en 100 μl de medios normales que contienen 10% de FBS. Se evaluaron las concentraciones finales de ARNip a 100, 50, 25 y 12,5 nM. Se añadió polímero a relaciones de carga de 4:1, 2:1 o 1:1, o a concentraciones de polímero fijas de 18, 9, 4,5 y 2,2 μg/ml para determinar cuáles condiciones daban como resultado la mayor actividad KD. Para las relaciones de carga (Figura 7A), se prepararon complejos a mayores concentraciones, se incubaron durante 30 minutos y se diluyeron entonces en serie a concentraciones 5 veces la mostrada en los gráficos justo antes de la adición a células. Para la concentración de polímero fija (Figura 7B), se complejaron ARNip y polímero a concentraciones 5 veces superiores a la mostrada en la gráfica, se incubaron durante 30 minutos y se añadieron entonces a células a las concentraciones finales mostradas. La Figura 7C es el control negativo. Se aisló el ARN total 24 horas después del tratamiento y se midió la expresión de GAPDH respecto a 2 genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados de la Figura 7, la Figura 12A y la Figura 12B indican >60% de actividad KD (sombreado) obtenida con PRx0729v6 a 9 μg/ml y concentraciones superiores a todas las concentraciones de ARNip ensayadas. Esta concentración coincidía con la formación de micelas estables a partir del análisis del tamaño de partícula. Se observó una alta actividad KD con PRx0729v6 4,5 μg/ml/ARNip 12,5 nM solo cuando los complejos se prepararon a alta concentración y se diluyeron en serie (relación de carga 4:1) en comparación con la formación de complejo a concentración menor (concentración de polímero fija de 4,5 μg/ml). Adicionalmente, solo ARNip 100 nM con PRx0729v6 4,5 μg/ml mostró alta actividad Kd, mientras que las concentraciones menores de ARNip no lo hicieron. En resumen, las micelas de PRx0729v6 eran estables a la dilución hasta ~10 μg/ml y la actividad KD se pierde por debajo de 5 μg/ml, indicando que son necesarias micelas estables para una buena actividad KD.
Ejemplo 11: Actividad de silenciamiento génico de complejos de ARNip de GAPDH sustrato de Dicerpolímero en células de mamífero cultivadas
[0336] Se ensaya la actividad de silenciamiento génico (KD) de complejos de ARNip sustrato de Dicer específico de GAPDH/polímero en un formato de 96 pocillos midiendo la expresión del gen de GAPDH después de 24 horas de tratamiento con polímero:
Complejos de ARNip de GAPDH Dicer. La secuencia de ARNip de GAPDH Dicer es:
hebra codificante: rGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC,
hebra anticodificante: rGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrU.
Se mezclan ARNip orientado a polímero y GAPDH o ARNip de control negativo (IDT) en 25 μl, obteniéndose diversas relaciones de carga a concentraciones 5 veces superiores a la concentración de transfección final, y se deja complejar durante 30 minutos antes de la adición a células HeLa en 100 μl de medios normales que contienen 10% de FBS. Se examinan las concentraciones finales de ARNip a 100, 50, 25 y 12,5 nM. Se añade polímero a relaciones de carga de 4:1, 2:1 o 1:1 o a concentraciones de polímero fijas de 40, 20, 10 y 5 μg/ml para determinar cuál condición da como resultado la mayor actividad KD. Se aísla el ARN total 24 horas después del tratamiento y se mide la expresión de GAPDH respecto a dos genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados muestran una actividad KD >60% obtenida con polímero a 10 μg/ml y concentraciones mayores a todas las concentraciones de ARNip ensayadas. Esta concentración de polímero coincide con la formación de micelas estables a partir del análisis del tamaño de partícula.
Ejemplo 12: Actividad de silenciamiento génico de complejos de ARNip de ApoB100-polímero en células de mamífero cultivadas
[0337] Se ensaya la actividad de silenciamiento génico (KD) de ARNip específico de ApoB100 o ARNip sustrato de Dicer complejado con polímero en un formato de 96 pocillos evaluando la expresión del gen ApoB100 después de 24 horas de tratamiento con complejos de polímero:ARNip de ApoB. La secuencia de ARNip de ApoB100 es:
hebra codificante: 5’-rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-3’,
hebra anticodificante: 5’-rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3’.
La secuencia de ARNip sustrato de Dicer de ApoB100 es:
hebra codificante: 5’- rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA,
hebra anticodificante: 5’-rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3’.
Se mezclan ARNip orientado a polímero y ApoB o ARNip de control negativo (IDT) en 25 μl obteniéndose diversas relaciones de carga a concentraciones 5 veces superiores a la concentración de transfección final, y se deja complejar durante 30 minutos antes de la adición a células HepG2 en 100 μl de medios normales que contienen 10% de FBS. Se examinan las concentraciones finales de ARNip a 100, 50, 25 y 12,5 nM. Se añade polímero a relaciones de carga de 4:1, 2:1 o 1:1 o a concentraciones de polímero fijas de 40, 20, 10 y 5 μg/ml para determinar cuál condición da como resultado la mayor actividad KD. Se aísla el ARN total 24 horas después del tratamiento y se mide la expresión de ApoB100 respecto a dos genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa. Los resultados muestran una actividad KD >60% obtenida con polímero a 10 μg/ml y concentraciones mayores a todas las concentraciones de ARNip ensayadas. Esta concentración de polímero coincide con la formación de micelas estables a partir del análisis del tamaño de partícula.
Ejemplo 13: Actividad de silenciamiento génico de complejos de ARNip de ApoB100-polímero en un modelo de ratón
[0338] Se determina la actividad de silenciamiento génico de complejos de ARNip/polímero en un modelo de ratón midiendo la expresión de ApoB100 en tejido hepático y los niveles séricos de colesterol. Se dosifica por vía intravenosa a ratones Balb/C por la vena de la cola ARNip específico de ApoB 1, 2 o 5 mg/kg complejado con polímero a una relación de carga de 1:1, 2:1 o 4:1 (polímero:ARNip) o control salino. 48 horas después de la dosis final, se sacrifican los ratones y se aíslan muestras de sangre e hígado. Se miden los niveles de colesterol en suero. Se aísla el ARN total del hígado y se mide la expresión de ApoB100 respecto a dos genes normalizadores, HPRT y GAPDH, mediante PCR cuantitativa.
Ejemplo 14. Actividad de silenciamiento génico de complejos de oligonucleótido de ADN anticodificante de ApoB100-polímero en células de mamífero cultivadas
[0339] Se ensaya la capacidad de silenciamiento génico (KD) por un oligonucleótido de ADN anticodificante específico de ApoB100 complejado con polímero en un formato de 96 pocillos midiendo la expresión del gen ApoB100 después de 24 horas de tratamiento con complejos de polímero:oligonucleótido de ADN anticodificante de ApoB. Son dos oligonucleótidos anticodificantes de ApoB100 específicos de ApoB de ratón:
5’-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3’, posición 541 de la región de codificación y
5’-ATGTCAATGCCACATGTCCA-3’, posición 531 de la región de codificación.
[0340] Se mezclan oligonucleótido de ADN anticodificante orientado a polímero o ApoB u oligonucleótido de ADN de control negativo (secuencia desordenada) en 25 μl, obteniéndose diversas relaciones de carga a concentraciones 5 veces superiores a la concentración de transfección final, y se deja complejar durante 30 minutos antes de la adición a células HepG2 en 100 μl de medios normales que contienen 10% de FBS. Se examinan las concentraciones finales de oligonucleótido a 100, 50, 25 y 12,5 nM. Se añade polímero a relaciones de carga de 4:1,
2:1 o 1:1 o a concentraciones de polímero fijas de 40, 20, 10 y 5 μg/ml para determinar cuál condición da como resultado la mayor actividad KD. Se aísla el ARN total 24 horas después del tratamiento y se mide la expresión de ApoB100 respecto a dos genes normalizadores internos, RPL13A y HPRT, mediante PCR cuantitativa.
Ejemplo 15: Demostración de la actividad desestabilizante de membrana de ensamblajes micelares y sus complejos con ARNip (Figura 8)
[0341] Se ensayó la actividad desestabilizante de membrana dependiente del pH titulando polímero solo o complejos de PRx0729v6:ARNip en preparaciones de glóbulos rojos humanos (RBC) y determinando la actividad lítica de membrana mediante la liberación de hemoglobina (lectura de absorbancia a 540 nm). Se usaron tres condiciones de pH diferentes para imitar los entornos de pH endosómico (pH extracelular= 7,4, endosoma temprano= 6,6, endosoma tardío= 5,8). Se aislaron glóbulos rojos humanos (RBC) mediante centrifugación de sangre entera recogida en Vaccutainers que contienen EDTA. Se lavaron los RBC 3 veces con disolución salina normal y se llevaron a una concentración final de 2% de RBS en PBS a un pH específico (5,8, 6,6 o 7,4). Se ensayó PRx0729v6 solo o complejo de PRx0729v6/ARNip a concentraciones justo por encima y por debajo de la concentración de estabilización crítica (CSC) como se muestra (Figura 5). Para el complejo de polímero/ARNip, se añadió ARNip 25 nM a PRx0729v6 a relaciones de carga de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 (mismas concentraciones poliméricas que para polímero solo). Se formaron disoluciones de polímero solo o complejos de polímero-ARNip a una concentración ensayada final de 20x durante 30 minutos y se diluyeron en cada preparación de RBC. Se comparó la estabilidad de la actividad de dos preparaciones diferentes de disolución madre de polímero PRx0729v6 9 y 15 días después de la preparación y se almacenaron a 4ºC desde el día de la preparación. Se incubaron RBC con polímero solo o complejo de polímero/ARNip a 37ºC durante 60 minutos y se centrifugaron para retirar los RBC intactos. Se transfirieron los sobrenadantes a cubetas y se determinó la absorbancia a 540 nm. Se expresa el porcentaje de hemólisis como A540 de muestra/A540 de RBC tratados con 1% de Triton X-100 (control para 100% de lisis). Los resultados muestran que PRx0729v6 solo (Figura 8A) o complejo de PRx0729v6/ARNip (Figura 8B) son no hemolíticos a pH 7,4 y se vuelven cada vez más hemolíticos a los valores de pH menores asociados a endosomas y a las concentraciones mayores de polímero.
Ejemplo 16: Análisis de microscopía de transmisión electrónica (TEM) del polímero PRx0729v6. (Figura 9)
[0342] Este ejemplo proporciona evidencias, usando espectroscopia electrónica, de que el polímero PRx0729v6 forma partículas esféricas de tipo micela.
[0343] Se aplicó una disolución de polímero PRx0729v6 0,5 mg/ml en PBS a una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 30 minutos. Se fijó la rejilla en disolución de Karnovsky y se lavó con tampón cacodilato una vez y entonces con agua 8 veces. Se tiñó la rejilla con una disolución de acetato de uranilo al 6% durante 15 minutos y se secó entonces hasta el análisis. Se llevó a cabo la microscopía de transmisión electrónica (TEM) en un microscopio JEOL. La Figura 9 muestra una microfotografía electrónica típica del polímero PRx0729v6 que demuestra partículas esféricas con dimensiones aproximadamente similares a las determinadas en disolución por dispersión de luz dinámica.
Ejemplo 17. Microscopía de fluorescencia de la captación celular y distribución intracelular de complejos de polímero-ARNip. (Figura 10)
[0344] Este ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 puede mediar una captación celular de ARNip marcado fluorescente y su liberación endosómica más eficaces que un reactivo de transfección basado en lípido.
[0345] Se sembraron células HeLa en un cubreobjetos con cámara Lab-Tek II. Después de una noche de incubación, se transfectaron las células con FAM-ARNip/lipofectamina 2000 100 nM o con FAM-ARNip 100 nM a una relación de carga de polímero-ARNip de 4:1. Se formaron complejos en PBS a pH 7,4 durante 30 minutos a una concentración 5x, se añadieron a células a una concentración final 1x y se incubaron durante una noche. Se tiñeron las células con DAPI (para la visualización del núcleo) durante 10 minutos, se fijaron entonces con 3,7% de formaldehído-1x PBS durante 5 minutos y se lavaron con PBS. Se tomaron imágenes de las muestras con un microscopio fluorescente Zeiss Axiovert. La Figura 10B muestra la microscopía de fluorescencia de la captación celular y la distribución intracelular de polímero-ARNip en comparación con lipofectamina (Figura 10A). La tinción particulada de los complejos de lipofectamina-ARNip sugiere una localización endosómica, mientras que la tinción citoplasmática difusa de los complejos de polímero-ARNip indica que se han liberado a partir de endosomas en el citoplasma.
Ejemplo 18. Captación de moléculas hidrófobas pequeñas en ensamblajes micelares de polímero PRx0729v6.
[0346] Este ejemplo demuestra que se captan moléculas hidrófobas pequeñas por el núcleo micelar predominantemente hidrófobo del polímero PRx0729v6.
[0347] Se confirma la formación de micelas poliméricas con o sin ARNip mediante una técnica de sonda fluorescente que usa pireno (C16H10, PM= 202), en que podía determinarse el reparto de pireno en el núcleo micelar usando la relación de 2 máximos de emisión del espectro de pireno. Se mide el espectro de emisión de fluorescencia de pireno en la disolución micelar polimérica de 300 a 360 nm usando una longitud de onda de excitación fija de 395 nm con una concentración constante de pireno de 6 x 10-7 M. El polímero varía de 0,001% a 20% (p/p) con o sin ARNip 100 nM. Se adquieren los datos espectrales usando un espectrómetro de fluorescencia Varian. Se llevaron a cabo todos los experimentos de fluorescencia a 25ºC. Se determina la concentración micelar crítica (CMC) representando la relación de intensidad I336/I333 en función de la concentración polimérica.
[0348] De forma similar, se incorpora un fármaco de molécula pequeña, el dipiridamol (2-{[9-(bis(2hidroxietil)amino)-2,7-bis(1-piperidil)-3,5,8,10-tetrazabiciclo[4.4.0]deca-2,4,7,9,11-pentaen-4-il]-(2-hidroxietil)amino}- etanol; C24H40N8O4, PM= 505) al núcleo micelar de PRx0729v6 como sigue. Se disuelven polímero (1,0 mg) y dipiridamol (DIP) (0,2 mg) en THF (0,5 ml). Se añade gota a gota agua desionizada (10 ml) y se agita la disolución a 50ºC durante 6 h para incorporar el fármaco al núcleo hidrófobo de la micela. Se divide la disolución (2,5 ml) y se mide la absorbancia del dipiridamol a 415 nm mediante espectroscopia UV a 25 y 37ºC. Se realizan también medidas de control midiendo la reducción dependiente del tiempo de la absorbancia del dipiridamol en agua desionizada en ausencia de copolímero. Se mide la absorbancia tanto a 25 como a 37ºC para cada punto temporal, y se resta el valor del observado en disolución.
Ejemplo 19. Efecto del pH sobre la estructura polimérica (Figura 11)
[0349] Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6.2 se disocia tras bajar el pH de 7,4 a 4,7.
[0350] Se midió el tamaño de partícula del polímero PRx0729v6.2 mediante dispersión de luz dinámica a pH 7,4 y a una serie de valores de pH ácidos de hasta pH 4,7 en PBS a diluciones en serie de 5 veces de 0,5 mg/ml0,004 mg/ml. La Figura 11A muestra que, a pH 7,4, el polímero es estable a la dilución hasta 4 μg/ml, cuando empieza a disociarse a una forma que produce agregados. La Figura 11B muestra que aumentando los valores de pH ácido hasta pH 4,7, se potencia la disociación polimérica de una estructura micelar, es decir, ocurre a altas concentraciones poliméricas y produce niveles crecientes de monómeros poliméricos de 1-8 nm de tamaño.
Ejemplo 20: Procedimientos para la conjugación de ligandos orientadores y polinucleótidos con un copolímero
[0351] Los siguientes ejemplos demuestran procedimientos para conjugar un ligando orientador (por ejemplo, galactosa) o un polinucleótido terapéutico (por ejemplo, ARNip) con un copolímero dibloque. (1) Se prepara el polímero usando transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT) (Chiefari y col. Macromolecules. 1998; 31(16): 5559-5562) formando un copolímero dibloque funcionalizado terminalmente con galactosa, usando un agente de transferencia de cadena con galactosa como sustituyente del grupo R. (2) Se prepara el primer bloque de un copolímero dibloque como copolímero que contiene N-hidroxisuccinamida del ácido metacrílico (MAA(NHS)) en el que se conjuga una galactosa-PEG-amina con los grupos NHS o en el que se conjuga un aminodisulfuro-ARNip con el NHS, o en el que se hace reaccionar piridildisulfuramina con los grupos NHS formando un piridildisulfuro que se hace reaccionar posteriormente con ARN tiolado formando un conjugado polímero-ARN.
Ejemplo 20.1: Preparación de galactosa-PEG-amina y CTA de galactosa
[0352] El Esquema 1 ilustra el esquema de síntesis de galactosa-PEG-amina (compuesto 3) y CTA de galactosa (agente de transferencia de cadena) (compuesto 4).
[0353] Compuesto 1: Se disolvieron pentaacetato de galactosa (10 g, 25,6 mmol) y 2-[2-(2cloroetoxi)etoxi]etanol (5,6 ml, 38,4 mmol) en CH2Cl2 seco (64 ml) y se agitó la mezcla de reacción a TA durante 1 h. Se añadió gota a gota BF3.OEt2 (9,5 ml, 76,8 mmol) a la mezcla anterior durante 1 h en baño de hielo. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente (TA) durante 48 h. Después de la reacción, se añadieron 30 ml de CH2Cl2 para diluir la reacción. Se neutralizó la fase orgánica con NaHCO3 (ac) saturado, se lavó con salmuera y se secó entonces con MgSO4. Se retiró el CH2Cl2 a presión reducida, consiguiéndose el producto bruto. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida, consiguiéndose el producto final 1 en forma de un aceite amarillo claro. Rendimiento: 55% TLC (I2 y p-anisaldehído): AE/Hex: 1/1 (Rf: �= 0,33; a= 0,32; S.M no reaccionado 0,30).
[0354] Compuesto 2: Se disolvió el compuesto 1 (1,46 g, 2,9 mmol) en DMF seca (35 ml) y se añadió NaN3 (1,5 g, 23,2 mmol) a la mezcla a TA. Se calentó la mezcla de reacción a 85-90ºC durante una noche. Después de la reacción, se añadió AE (15 ml) a la disolución y se usó agua (50 ml) para lavar la fase orgánica 5 veces. Se secó la fase orgánica con MgSO4 y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida, consiguiéndose el compuesto 2 en forma de un aceite incoloro. Rendimiento: 80 %, TLC (I2 y p-anisaldehído: AE/Hex: 1/1 (Rf: 0,33).
[0355] Compuesto 3: Se disolvió el compuesto 2 (1,034 g, 2,05 mmol) en MeOH (24 ml), se burbujeó con N2 durante 10 min y se añadieron entonces Pd/C (10%) (90 mg) y TFA (80 μl) a la disolución anterior. Se burbujeó de nuevo la mezcla de reacción con H2 durante 30 min y se agitó entonces la reacción a TA en atmósfera de H2 durante otras 3 h. Se retiró el Pd/C con Celite y se evaporó el MeOH, consiguiéndose el compuesto 3 en forma de un gel pegajoso. El compuesto 3 puede usarse sin purificación adicional. Rendimiento: 95%. TLC (p-anisaldehído): MeOH/CH2Cl2: 1/4 (Rf: 0,05).
[0356] Compuesto 4: Se disolvieron ECT (0,5 g, 1,9 mmol), NHS (0,33 g, 2,85 mmol) y DCC (0,45 g, 2,19 mmol) en CHCl3 (15 ml) a 0ºC. Se agitó continuamente la mezcla de reacción a TA durante una noche. Se añadieron lentamente el compuesto 3 (1,13 g, 1,9 mmol) y TEA (0,28 ml, 2,00 mmol) en CHCl3 (10 ml) a la reacción anterior a 0ºC. Se agitó continuamente la mezcla de reacción a TA durante una noche. Se retiró el CH3Cl a presión reducida y se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida, consiguiéndose el compuesto 4 en forma de un gel amarillo. Rendimiento (35%). TLC: MeOH/CH2Cl2: 1/9 (Rf: 0,75)
Esquema 1: Síntesis de galactosa-PEG-amina (com 3) y CTA de galactosa (com 4)
5 Ejemplo 20.2: Síntesis de [DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]
A. Síntesis de macroCTA de DMAEMA
[0357] Polimerización: Se añadieron 33,5 mg de ECT (CTA de RAFT), 2,1 mg de AIBN (recristalizado dos
10 veces con metanol), 3,0 g de DMAEMA (Aldrich, 98%, se pasó a través de una columna de alúmina pequeña justo antes del uso para retirar el inhibidor) y 3,0 g de DMF (de alta pureza sin inhibidor) a un vial de vidrio de 20 ml (con tapón perforable). Se cerró el vial de vidrio con el tapón perforable y se purgó con nitrógeno seco (llevado a cabo en un baño de hielo con agitación) durante 30 min. Se dispuso el vial de reacción en un bloque de reacción precalentado a 70ºC. Se agitó la mezcla de reacción durante 2 h y 40 min. Se abrió el tapón perforable y se agitó la
15 mezcla en el vial en un baño de hielo durante 2-3 minutos para detener la reacción de polimerización.
[0358] Purificación: Se añadieron 3 ml de acetona a la mezcla de reacción. Se añadieron 240 ml de hexano y
60 ml de éter (80/20 (v/v)) a un vaso de precipitados de 300 ml y se añadió gota a gota con agitación la mezcla de
reacción al vaso de precipitados. Inicialmente, esto produce un aceite que se recoge centrifugando la disolución
20 turbia; rendimiento= 1,35 g (45%). Se efectuaron varias precipitaciones (por ejemplo, 6 veces) en disolventes mixtos de hexano/éter (80/20 (v/v)) de la disolución de acetona. Finalmente, se secó el polímero a vacío durante 8 h a TA, rendimiento, 1 g. Resumen: (Mn teórico= 11.000 g/mol a 45% de conv.).
Nombre
PF (g/mol) Eq. Mol Peso Peso real
DMAEMA ECT AIBN
157,21 263,4 164,21 150 1 0,1 0,0191 1,2722 x 10-4 1,2722 x 10-5 3,0 g 33,5 mg 2,1 mg 3,01 g 33,8 mg 2,3 mg
DMF= 3,0 g; purga con N2: 30 min; se realiza la polimerización a 70ºC durante 2 h y 45 min
25 B. Síntesis de [BMA-PAA-DMAEMA] a partir del macroCTA de DMAEMA
[0359] Se adquirieron todos los productos químicos y reactivos en Sigma-Aldrich Company a menos que se especifique otra cosa. Se pasaron metacrilato de butilo (BMA) (al 99%) y metacrilato de 2-(dimetilamino)etilo (DMAEMA) (al 98%) a través de una columna de alúmina básica (malla 150) para retirar el inhibidor de la 30 polimerización. El ácido 2-propilacrílico (PAA) (>99%) se adquirió sin inhibidor y se usó como se recibió. Se recristalizó azobisisobutironitrilo (AIBN) (al 99%) con metanol y se secó a vacío. Se sintetizó el macroCTA de DMAEMA y se purificó como se describe anteriormente (Mn-10.000; PDI-1,3; >98%). La N,N-dimetilformamida
(DMF) (al 99,99%) (adquirida en EMD) era de pureza de reactivo y se usó como se recibió. Se adquirieron hexano, pentano y éter en EMD y se usaron como se recibieron para la purificación polimérica.
[0360] Polimerización: Se añadieron BMA (2,1 g, 14,7 mmol), PAA (0,8389 g, 7,5 mmol), DMAEMA (1,156 g, 7,35 mmol), macroCTA (0,8 g, 0,0816 mmol), AIBN (1,34 mg, 0,00816 mmol; CTA:AIBN 10:1) y DMF (5,34 ml) en atmósfera de nitrógeno a un vial sellado. La relación de CTA:monómeros usada fue de 1:360 (suponiendo un 50% de conversión). La concentración de monómeros era de 3 M. Se desgasificó entonces la mezcla burbujeando nitrógeno en la mezcla durante 30 minutos y disponiéndola entonces en un bloque calentador (termómetro: 67ºC; pantalla: 70-71; velocidad de agitación: 300-400 rpm). Se dejó la reacción durante 6 h y entonces se detuvo disponiendo el vial en hielo y exponiendo la mezcla al aire.
[0361] Purificación: Se realizó la purificación de polímero con acetona/DMF 1:1 a hexano/éter 75/25 (tres veces). Se secó el polímero resultante a vacío durante al menos 18 h. El espectro de RMN mostró una alta pureza del polímero. No se observaron grupos vinilo. Se dializó el polímero con etanol frente a agua doblemente desionizada durante 4 días y entonces se liofilizó. Se analizó el polímero mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) usando las siguientes condiciones: disolvente: DMF/LiBr al 1%. Caudal: 0,75 ml/min. Volumen de inyección: 100 ml.
[0362] Temperatura de columna: 60ºC. Se usó poliestireno para calibrar los detectores. Análisis de GPC del polímero resultante: Mn= 40.889 g/mol. PDI=1.43. dn/dc= 0,049967.
Ejemplo 20.3. Síntesis de gal-[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]
[0363] Se llevó a cabo la síntesis como se describe en el ejemplo 20.2. En primer lugar, se preparó un macro-CTA de galactosa-DMAEMA (ejemplo 20.2.A.) excepto porque se usó CTA de galactosa (ejemplo 20.1, com 4) en lugar de ECT como agente de transferencia de cadena. Esto dio como resultado la síntesis de un poli-DMAEMA con galactosa funcionalizada terminal (Figura 13). Se usó entonces el macroCTA de galactosa-[DMAEMA] para sintetizar el segundo bloque [BMA-PAA-DMAEMA] como se describe en el ejemplo 20.2.B. Después de la síntesis, se retiraron los grupos protectores de acetilo de la galactosa mediante incubación en tampón bicarbonato de sodio 100 mM, pH 8,5, durante 2 horas, seguido de diálisis y liofilización. Se usó espectroscopia de RMN para confirmar la presencia de galactosa desprotegida en el polímero.
Ejemplo 20.4. Preparación y caracterización de los copolímeros dibloque [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] y DMAEMA-MMA(NHS)-[B-P-D]
[0364] Se efectuó la síntesis polimérica como se describe en el ejemplo 20.2 (y resume en la Figura 14) usando relaciones de alimentación de monómero para obtener la composición deseada del 1º copolímero en bloque. La Figura 15 resume la síntesis y caracterización del polímero [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] en el que la relación de monómeros de copolímero en el 1º bloque es de 70:30.
Ejemplo 20.5. Conjugación de galactosa-PEG-amina con PEGMA-MAA(NHS) produciendo el polímero [PEGMA-MAA(Gal)]-[BP-D]
[0365] La Figura 16 ilustra la preparación de los copolímeros dibloque DMAEMA-MAA(NHS) o PEGMA-MAA(NHS) funcionalizados con galactosa. Se disolvió el polímero [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] o [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] en DMF a una concentración entre 1 y 20 mg/ml. Se neutralizó la galactosa-PEG-amina preparada como se describe en el ejemplo 20.1 (com 3) con 1-2 equivalentes de trietilamina y se añadió a la mezcla de reacción a una relación de 5:1 de amina a polímero. Se llevó a cabo la reacción a 35ºC durante 6-12 horas, seguido de la adición de un volumen igual de acetona, diálisis frente a agua desionizada durante 1 día y liofilización.
Ejemplo 20.6. Conjugación de ARNip con PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] produciendo el polímero [PEGMA-MAA(RNA)]-[B-P-D]
[0366] Las Figuras 17A y B muestran las estructuras de dos ARNip modificados que pueden conjugarse con polímeros que contienen NHS preparados como se describe en el ejemplo 20.4. Se obtuvieron los ARNip en Agilent (Boulder, CO). La Figura 17C muestra la estructura de la piridildisulfuramida usada para derivatizar los polímeros que contienen NHS, proporcionando un grupo reactivo disulfuro para conjugación de ARN tiolado (Figura 17B).
[0367] Reacción de polímero que contiene NHS con aminodisulfuro-ARNip. Se lleva a cabo la reacción en condiciones estándar consistentes en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMF o DMSO, o un disolvente mixto DMSO/tampón a pH 7,8.) a 35ºC durante 4-8 horas, seguido de la adición de un volumen igual de acetona, diálisis frente a agua desionizada durante 1 día y liofilización.
[0368] Reacción de polímero que contiene NHSO con piridildisulfuramina y reacción con ARNip tiolado. La reacción de piridildisulfuramina con polímeros que contienen NHS se lleva a cabo como se describe en el ejemplo
20.5. Posteriormente, se disuelve el polímero liofilizado en etanol a 50 mg/ml y se diluye 10 veces en tampón de bicarbonato de sodio a pH 8. Se hace reaccionar el ARNip tiolado (Figura 17B) a un exceso molar de 2-5 veces frente a los grupos NHS poliméricos a 35ºC durante 4-8 horas, seguido de diálisis frente a tampón fosfato a pH 7,4.
Ejemplo 20.7. Conjugación de un péptido terapéutico con un polímero modificado con piridildisulfuro
[0369] El polímero modificado con piridildisulfuro descrito en el ejemplo 20.6, PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D], puede usarse también para conjugación con un péptido terapéutico (Figura 17 D). Se sintetiza el péptido, se prepara para conjugación y se lleva a cabo la reacción de conjugación como se describe a continuación, produciendo el polímero [PEGMA-MAA(péptido)]-[B-P-D].
[0370] Se utiliza la fusión con el péptido con dominio de transducción peptídica transportina (también conocido como la secuencia peptídica Antennapedia (Antp)) para sintetizar una forma de internalización celular del péptido Bak-BH3 (Antp-BH3) que contiene un residuo de cisteína carboxiterminal (NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSC-COOH). Para asegurar tioles libres para conjugación, se reconstituye el péptido en agua y se trata durante 1 hora con el agente reductor de disulfuro TCEP inmovilizado en gel de agarosa. Se hace reaccionar entonces el péptido reducido (400 μM) durante 24 horas con el polímero funcionalizado terminalmente con piridildisulfuro en tampón fosfato (pH 7) que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM.
[0371] La reacción del grupo terminal piridildisulfuro con el péptido de cisteína crea 2-piridintiona, que puede medirse espectrofotométricamente para caracterizar la eficacia de conjugación. Para validar adicionalmente el intercambio de disulfuro, se procesan los conjugados en un gel de tricina al 16,5% en PAGE-SDS. En paralelo, se tratan alícuotas de las reacciones de conjugación con TCEP inmovilizado antes de la PAGE-SDS para verificar la liberación del péptido del polímero en entorno reductor.
[0372] Se realizan las reacciones de conjugación a estequiometrías de polímero/péptido de 1, 2 y 5. Las medidas de absorbancia espectrofotométrica UV a 343 nm para la liberación de 2-piridintiona indican la eficacia de conjugación. Se utiliza un gel de PAGE-SDS para caracterizar adicionalmente los conjugados de péptido-polímero. A una relación molar de polímero/péptido de 1, una cantidad detectable de péptido forma dímeros mediante puentes disulfuro a través de la cisteína terminal. Sin embargo, la reacción del tiol con el piridildisulfuro se favorece, y la banda de péptido libre no es ya visible a relaciones de polímero/péptido iguales o mayores a 2. Al tratar los conjugados con el agente reductor TCEP, es posible escindir los ligamientos disulfuro de polímero-péptido, como se indica por la aparición de la banda de péptido en esas muestras.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un ensamblaje micelar que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana celular, comprendiendo el ensamblaje micelar un núcleo y una cubierta, en el que el núcleo comprende una pluralidad de bloques de núcleo de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana celular, en el que la cubierta comprende una pluralidad de bloques de cubierta de copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana celular, en el que el bloque de núcleo es hidrófobo desestabilizante de membrana celular dependiente del pH que comprende una primera especie cargable que es aniónica a pH 6,6 a 7,6, siendo el bloque de núcleo un bloque de copolímero, y en el que el bloque de cubierta es hidrófilo a pH 6,6 a 7,6.
  2. 2.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1, en el que los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana son copolímeros dibloque.
  3. 3.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana celular comprenden un tercer bloque.
  4. 4.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que la cubierta comprende un grupo polietilenglicol.
  5. 5.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que la forma del ensamblaje micelar en el intervalo de pH de 6,2 a 7,5 es una micela, una seudomicela o una estructura de tipo micela.
  6. 6.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que el ensamblaje micelar comprende al menos un agente terapéutico.
  7. 7.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 6, en el que el agente terapéutico se enlaza con el bloque de cubierta de al menos uno de los copolímeros en bloque desestabilizantes de membrana en el ensamblaje micelar mediante un enlace covalente, una interacción no covalente o una combinación de los mismos.
  8. 8.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 6, en el que el agente terapéutico es un polinucleótido, un olignucleótido, un modulador de la expresión génica, un agente de silenciamiento génico, un ARNip, un agente de iARN, un sustrato de Dicer, un miARN, un ARNhc, un oligonucleótido anticodificante o un aptámero.
  9. 9.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 2, en el que el ensamblaje micelar comprende al menos un resto orientador.
  10. 10.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que el bloque de cubierta comprende unidades monoméricas cargables catiónicas y no catiónicas.
  11. 11.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 10, en el que el bloque de cubierta comprende una unidad monomérica de etacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, una unidad monomérica de metacrilato de N,Ndialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, una unidad monomérica de acrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, o una combinación de las mismas.
  12. 12.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, en el que el bloque de núcleo comprende al menos una primera unidad monomérica cargable y al menos una segunda unidad monomérica cargable.
  13. 13.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 12, en el que la primera unidad monomérica cargable es un ácido alquil C2-C8-acrílico.
  14. 14.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 13, en el que la segunda unidad monomérica cargable es etacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6, metacrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6 o acrilato de N,N-dialquil C1-C6-aminoalquilo C1-C6.
  15. 15.
    El ensamblaje micelar de la reivindicación 1 o 2, que comprende una pluralidad de copolímeros en bloque de fórmula I:
    A0, A1, A2, A3 y A4 se seleccionan del grupo consistente en -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- y -O(C)bO-; en las que, a es 1-4;
    b es 2-4; Y4 se selecciona del grupo consistente en hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, -O-alquilo C1-C10, -C(O)Oalquilo C1-C10, -C(O)NR6(C1-C10), heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10, cualquiera de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor;
    Y0, Y1 e Y2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, C(O)O-alquilo C2-C10, -OC(O)-alquilo C1-C10, -O-alquilo C2-C10 y –S-alquilo C2-C10, -C(O)NR6-alquilo C2-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10;
    Y3 se selecciona del grupo consistente en un enlace covalente, alquilo C1-C10, heteroarilo C4-C10 y arilo C6-C10; en
    los que los átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que no están totalmente sustituidos con R1-R5 e Y0-Y4 se completan con un número apropiado de átomos de hidrógeno;
    R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de flúor;
    Q0 es un residuo seleccionado del grupo consistente en residuos que son hidrófilos a pH fisiológico; residuos conjugables o funcionalizables o hidrógeno; Q1 es un residuo que es hidrófilo a pH fisiológico; Q2 es un residuo que está cargado positivamente a pH fisiológico; Q3 es un residuo que está cargado negativamente a pH fisiológico, pero que experimenta protonación a pH inferior; m es de 0 a menos de 1,0 n es de más de 0 a 1,0, en el que:
    m+n= 1 p es de 0,1 a 0,9; q es de 0,1 a 0,9; en el que: r es de 0 a 0,8; en el que:
    p+q+r= 1
    v es de 5 a 25 kDa; y, wes de 5 a 50 kDa.
  16. 16. El ensamblaje micelar de cualquier reivindicación precedente, para uso en la inhibición de la expresión 5 génica o para uso en el suministro intracelular de un polinucleótido.
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