CN112858411B - 一种基于硫化银@二硫化物-氧化铜三元异质结的光电化学生物传感器检测5fdC的方法 - Google Patents

一种基于硫化银@二硫化物-氧化铜三元异质结的光电化学生物传感器检测5fdC的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于硫化银@二硫化物‑氧化铜三元异质结的光电化学生物传感器检测5fdC的方法。所述光电化学生物传感器以在表面依次修饰Ag2S@WS2复合纳米材料、聚乙烯亚胺、5fdC、4‑羧基苯硼酸和氨基功能化CuO的电极为工作电极。本发明利用Ag2S@WS2良好的光电活性和光催化性能，聚乙烯亚胺上胺基与5fdC上醛基的特异性共价反应，以Ag2S@WS2‑CuO三元异质结的协同作用为信号放大技术，以5fdC为靶标，构建了光电化学生物传感器，实现对5fdC的灵敏检测。本发明的检测方法操作简单，灵敏性强，便于实现小型化，仅对ITO电极表面进行修饰就可以实现对5fdC的快速灵敏检测。

Description

一种基于硫化银@二硫化物-氧化铜三元异质结的光电化学生 物传感器检测5fdC的方法
技术领域
本发明涉及光电化学分析领域，具体涉及一种基于Ag2S@WS2-CuO三元异质结的光电化学生物传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷(5fdC)的方法。
背景技术
5-醛基胞嘧啶(5fC)又称“5-甲酰基胞嘧啶”，是一个重要的表观遗传修饰物，是由5-甲基胞嘧啶(5mC)被TET(ten-eleven-translocation，10-11易位)家族的氧化酶催化氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)后进一步氧化形成，被称为DNA的第七碱基。2011年，慕尼黑大学Carell课题组首次在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中发现5-醛基胞嘧啶以一种重要的表观遗传修饰存在。之后，在许多细胞和组织(例如脑组织)中也发现了5-醛基胞嘧啶。研究表明5-醛基胞嘧啶作为一个重要的表观遗传标志物在许多生命活动中发挥作用，例如调节基因活性、基因重组、细胞分化等。最新报导，5-醛基胞嘧啶的存在与RNA的转录酶II的转录速率和底物特异性有着十分重要的联系。因此，5-醛基胞嘧啶的检测在遗传生物学上具有十分重要的意义。
目前针对5-醛基胞嘧啶相关化学反应的研究主要着眼于胞嘧啶环上5号位醛基。常用的检测方法有单分子实时测序法、薄层色谱法、高效液相-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用技术等，这些方法作为早期的5-醛基胞嘧啶检测方法，对5-醛基胞嘧啶的研究起到了推进作用。但是这些方法普遍存在仪器昂贵，操作复杂，成本较高等缺点。因此，实现对5-醛基胞嘧啶的快速、简单、灵敏检测十分重要。
光电化学分析是一种新兴的分析技术，具有电化学分析和光化学分析的优点。其利用光激发光电活性材料，产生光生电子和空穴。而光生电子则被电极捕获，产生电流。其激发光源和检测信号是完全不同的两种形式，这样可以有效地降低背景信号的干扰，从而极大地提高分析检测的灵敏度。
在基因组DNA中，5-醛基胞嘧啶可以有三种存在形式，即5-醛基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷(5fdC)、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。要实现DNA甲酰化的检测，可以以上述三种5-醛基胞嘧啶的存在形式来检测目标。但目前还未见有检测5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷(5fdC)的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于Ag2S@WS2-CuO三元异质结的光电化学生物传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的方法，实现了对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的快速、简单和灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种基于Ag2S@WS2-CuO三元异质结的光电化学生物传感器，所述光电化学生物传感器以在表面依次修饰Ag2S@WS2复合纳米材料、聚乙烯亚胺(PEI)、5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷(5fdC)、4-羧基苯硼酸(CPBA)和氨基功能化CuO的电极为工作电极。
优选的，所述电极为ITO电极。
进一步的，所述电化学传感器还包括：参比电极和辅助电极。
优选的，所述参比电极为饱和甘汞电极；所述辅助电极为铂电极。
本发明的第二方面，提供上述光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Ag2S@WS2复合纳米材料加入到去离子水中，超声分散，制备得到Ag2S@WS2分散液；将Ag2S@WS2分散液滴加到预处理后的电极表面，干燥，得到表面修饰Ag2S@WS2复合纳米材料的电极；
(2)通过静电吸附作用，将聚乙烯亚胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面；
(3)利用聚乙烯亚胺上的胺基与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷上醛基之间的共价反应，将5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷修饰到步骤(2)处理后的电极表面；
(4)利用4-羧基苯硼酸和5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的邻二醇之间的共价反应，将4-羧基苯硼酸修饰到步骤(3)处理后的电极表面；
(5)利用4-羧基苯硼酸上的-COOH与氨基功能化CuO上的-NH2共价结合，将CuO修饰到步骤(4)处理后的电极表面，制备得到工作电极。
优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗20-60min，晾干。更优选的，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:5。
未经预处理的电极上一般会有较大的过电势，从而导致反应迟钝、能耗升高。为了发挥电极的优势，提高电极的活性，需要对电极表面进行预处理。采用本发明的电极预处理方法可以降低的电极过电势，从而有效提高电极的活性。
优选的，步骤(1)中，所述Ag2S@WS2复合纳米材料由如下方法制备而成：
将块状硫化钨加入到乙醇-去离子水混合液中，超声振荡5-10h，得到分散液；将分散液在1000-5000rpm离心10-30min，收集上清液；向上清液中加入硫脲和氨水，搅拌10-30min，再加入AgNO3溶液，搅拌10-30min，收集沉淀；将沉淀继续在9000-12000rpm离心10-30min，收集固体，洗涤，干燥。
优选的，步骤(2)中，将聚乙烯亚胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面的方法为：
将10-40μL浓度为0.05-5mM聚乙烯亚胺溶液滴加到步骤(1)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5h。
优选的，步骤(3)中，将5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将10-40μL包含5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的Tris-HCl缓冲液加到步骤(2)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-4h。
优选的，步骤(4)中，将4-羧基苯硼酸修饰于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：
将10-40μL浓度为1-20mM 4-羧基苯硼酸溶液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5h。
优选的，步骤(5)中，将氨基功能化CuO修饰于步骤(4)处理后的电极表面的方法为：
将氨基功能化CuO的分散液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。
优选的，步骤(5)中，所述氨基功能化CuO由如下方法制备而成：
将浓度为0.01-0.5M Cu(CH3COO)2水溶液与冰醋酸进行混合，剧烈搅拌下加热至125℃沸腾；随后将0.5-5mM NaOH迅速加入沸腾的溶液中，形成大量沉淀，最后将沉淀物进行离心，清洗，60℃干燥得到第一产物；
将第一产物溶解于醇水溶液中(醇：水＝19：1)，调节pH至4-6，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，超声20min后转移到高压反应釜中，75℃反应1-3h；自然冷却后将产物分别用去离子水和乙醇洗涤、干燥，即得。
本发明的第三方面，提供上述光电化学生物传感器在检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷中的应用。
本发明的第四方面，提供一种利用上述光电化学生物传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的方法，包括以下步骤：
将光电化学生物传感器中的工作电极、参比电极和辅助电极构成三电极体系，以pH为5.5-8.5的Tris-HCl缓冲溶液为检测液，进行光电化学信号检测，建立电流与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度之间的关系，对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷含量进行检测。
优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.5V。
优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.1-100mM。
需要说明的是，上述检测方法可以用在非疾病诊断方面，可以通过检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用Ag2S@WS2异质结的良好的光电性能及具有良好的光电性能及生物兼容性，实现光电信号的扩增，提高5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的检测灵敏度
(2)利用聚乙烯亚胺上胺基与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷上醛基的特异性共价反应，提高检测的特异性。
(3)利用CuO进行信号扩增，实现对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的灵敏检测。
(4)本发明的检测方法简单，成本低，实现了仪器小型化，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的检测。
附图说明
图1：本发明的5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷检测的原理图。
图2：WS2、Ag2S和CuO的能带结构。
图3：不同浓度的5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的光电化学响应曲线；曲线a-k代表的浓度分别为0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200nM的5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷。
图4：光电流对数值与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度的线性拟合曲线。
图5：不同碱基条件下的光电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。
本发明中所使用的清洗液含有：2-20mM Tris-HCl和20-60mM KCl；pH为6.0-8.5。
本发明中所使用的检测液为：0.1-100mM Tris-HCl，pH为5.5-8.5。
正如背景技术部分所介绍的，5-醛基胞嘧啶可以有三种存在形式，即5-醛基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷(5fdC)、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。
其中，5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷(又称5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷，5fdC)，其结构式如下：
Figure BDA0002919159660000051
5fdC由于其含量低，并且DNA反应有其本身的要求，检测的反应条件要求温和，过热、过酸、过碱都会使DNA降解，因此5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷很难被检测，目前还未见有检测5fdC的报道。
基于此，本发明首次提出了一种基于Ag2S@WS2异质结的光电化学分析方法检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的方法。本发明首先构建了一种光电化学生物传感器，所述光电化学生物传感器包括：电极，依次修饰在电极表面的Ag2S@WS2复合纳米材料、聚乙烯亚胺、5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷、4-羧基苯硼酸和CuO。其中：
WS2具有良好的生物相容性，出色的可见光吸收能力和高电子迁移率，但是由于于其光生电子和空穴的高度复合，光电性能受到限制。本发明制备的Ag2S@WS2复合纳米材料，另WS2与能带匹配的Ag2S半导体材料形成异质结，通过减慢载流子向瞬态电子-空穴对复合的转移而提高光电活性。聚乙烯亚胺上的胺基可以与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷上的醛基发生特异性共价反应，而CuO能够作为信号扩增分子，实现对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的特异性识别。本发明的光电化学生物传感器中各物质协同作用，从而实现了对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的快速灵敏检测。
本发明的光电化学生物传感器构建和检测的原理如图1所示。首先将Ag2S@WS2纳米复合材料修饰于电极表面，利用Ag2S@WS2异质结优异的光电活性产生一个稳定的光电流。接着，利用聚乙烯亚胺上的胺基和5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷上的醛基发生特异性共价反应，成功的将5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷捕获在电极表面上。最后，利用氨基功能化CuO上形成的-NH2和4-羧基苯硼酸的-COOH之间形成酰胺键，在电极表面沉积了氨基功能化的CuO信号放大材料。利用Ag2S与WS2纳米片形成了异质结，加速了界面电子的传递，实现了信号的扩增，硫化钨纳米片本身是一种好的半导体，能产生稳定的初始光电流，从而提高检测灵敏度。而当CuO修饰在电极表面后，光电流会显著增大，这主要是Ag2S@WS2-CuO的形成，改善了电子传输的能力，实现了信号的扩增。因此，利用5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的浓度与光电流的线性关系，可实现对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的检测。
在0.005-200nM浓度范围内，随着5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度增加，在电极表面会修饰更多的CuO，以放大检测信号。
本发明的光电化学生物传感器中，Ag2S与WS2的紧密结合形成的Ag2S@WS2复合纳米材料，继承了Ag2S优异的光催化性能和WS2优异的光转换性能，并通过减少载流子对瞬态电子-空穴复合的转移来进一步提高光活性。
CuO作为信号扩增分子，但并非所有金属氧化物都可以用于信号放大。CuO之所以能够极大地提高Ag2S@WS2的光电活性，是因为Ag2S@WS2与CuO能够成功构建三元异质结。而为了证明三元异质结的成功构建，我们利用VB-XPS、motto-schottky曲线和紫外漫反射研究了WS2、Ag2S和CuO的能带结构。根据结果，我们将WS2、Ag2S和CuO的能带结构绘制如上。结果如图2所示，CuO的电子可以转移到Ag2S，并进一步转移到WS2。此外，由于这些材料的能级匹配，CuO可以增加Ag2S向WS2的电子转移量。因此，实现了光电化学生物传感器的信号放大。
聚乙烯亚胺是一种含有许多氨基的聚合物，因此一个分子的聚乙烯亚胺可以识别很多个5fdC，大大提高识别效率和识别量。
4-羧基苯基硼酸(CPBA)主要是用于识别5fdC分子结构中的二醇结构，与之通过共价反应将CPBA修饰于电极表面。然后用于固定氨基修饰的CuO。
因此，本发明的光电化学生物传感器中，各修饰材料之间相辅相成，是一个有机的整体。
在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学生物传感器的构建过程为：
(1)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成1×5cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(体积比例1:1-1:5)，丙酮和二次水分别超声清洗20-60分钟，并在室温下晾干，待用。
(2)Ag2S@WS2的制备：取10-50mg块状硫化钨加入到乙醇和去离子水的混合溶液(v:v＝45:55)中，超声振荡5-10h得到分散溶液，将分散溶液在1000-5000rpm离心10-30min，收集上清液备用。
将0.1-0.5g硫脲和60-120μL氨水加入上清液中，室温磁搅拌10-30min后，继续加入10-50mL浓度为0.3M的AgNO3溶液搅拌10-30min，收集沉淀，将沉淀继续在9000-12000rpm离心10-30min，收集固体，用去离子水和乙醇洗涤3次后，60℃真空干燥。
(3)氨基功能化CuO的制备：将浓度为0.01-0.5M Cu(CH3COO)2水溶液与0.1-5mL冰醋酸进行混合。剧烈搅拌下加热至125℃沸腾。随后将0.5-5mM NaOH迅速加入沸腾的溶液中，形成大量沉淀。最后将沉淀物进行离心，清洗，60℃干燥得到第一产物；
将第一产物溶解于5-20mL醇水溶液中(醇：水＝19：1)。利用CH3COOH将溶液pH调至4-6，然后被加入200-800μL APTES。超声20min后转移到高压反应釜中，75℃反应1-3h。自然冷却后将产物分别用去离子水和乙醇洗涤、干燥，研磨备用。
(4)Ag2S@WS2分散液的制备：称取2-12mg Ag2S@WS2复合纳米材料，加入1-8mL去离子水中，超声分散1-2h。
(5)Ag2S@WS2复合纳米材料的固定：将10-40μL Ag2S@WS2复合纳米材料分散液滴加到预处理后的电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为Ag2S@WS2/ITO。
(6)聚乙烯亚胺的固定：将10-40μL浓度为0.05-5mM聚乙烯亚胺溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5h。制备的电极标记为PEI/Ag2S@WS2/ITO。
(7)5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的固定：将10-40μL包含5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的Tris-HCl缓冲液滴加到PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-5h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
(8)4-羧基苯硼酸的固定：将10-40μL浓度为1-20mM 4-羧基苯硼酸溶液滴加到5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5h。制备的电极标记为CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
(9)CuO分散液的制备：称取10-20mg CuO，加入到1-8mL去离子水中，超声分散1-2小时。
(10)CuO的固定：将10-40μL CuO分散液滴加到CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-5h。然后，将电极冲洗2-5次。制备的电极标记为CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
上述光电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。
在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学生物传感器检测5fdC的过程为：
(1)用不同浓度的5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷制备CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极，并以其作为工作电极，饱和甘汞电极、铂丝分别作为参比电极和辅助电极组成三电极体系。以500W氙灯作为光源，应用电位为-0.5-0.5V，检测液为0.1-100mM Tris-HCl(pH为5.5-8.5)进行光电流检测；
(2)建立电流与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中的5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的含量进行检测。
随着5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度的增加，电极表面的CuO数量增加，导致光电流信号减小。根据5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度与电流的线性关系，可实现对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的检测。
本发明的光电化学生物传感器对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的检测范围为0.005-200nM，检测限为3.38pM。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：Ag2S@WS2复合纳米材料的制备
取30mg块状硫化钨加入到10mL乙醇和去离子水(v:v＝45:55)的混合溶液中，超声振荡8h，将分散溶液在3000rpm离心20分钟，收集上清液备用。
将0.15g硫脲和100μL氨水加入上清液中，室温磁搅10分钟后，继续加入10mL浓度为0.3M的AgNO3溶液搅拌20分钟，将沉淀继续在10000rpm离心10分钟，收集固体，用去离子水和乙醇洗涤3次，60℃真空干燥。
实施例2：氨基功能化CuO的制备
将150mL浓度为0.02M Cu(CH3COO)2水溶液与0.5mL冰醋酸进行混合。剧烈搅拌下加热至125℃沸腾。随后将1mM NaOH迅速加入沸腾的溶液中，形成大量沉淀。最后将沉淀物进行离心，清洗，60℃干燥得到第一产物；
将第一产物溶解于10mL醇水溶液中(醇:水＝19:1，体积比)。利用CH3COOH将溶液pH调至5，然后加入600μL APTES。超声20min后转移到高压反应釜中，75℃反应1h。自然冷却后将产物分别用去离子水和乙醇洗涤、干燥，研磨备用。
实施例3：ITO电极预处理
将ITO导电玻璃分割成1×5cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(1:1)，丙酮和二次水分别清洗40分钟，并在室温下晾干，待用
实施例4：Ag2S@WS2复合纳米材料的固定
Ag2S@WS2分散液的制备：称取10mg Ag2S@WS2复合纳米材料，加入到5mL去离子水中，超声分散1小时，制备得到Ag2S@WS2复合纳米材料分散液。
将40μL Ag2S@WS2复合纳米材料分散液滴加到预处理后的电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为Ag2S@WS2/ITO。
实施例5：聚乙烯亚胺的固定
聚乙烯亚胺的固定：将40μL的0.1mM聚乙烯亚胺溶液滴加到Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1h。制备的电极标记为PEI/Ag2S@WS2/ITO。
实施例6：5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的固定
将20μL包含5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的Tris-HCl缓冲液滴加到PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
实施例7：4-羧基苯硼酸的固定
将40μL浓度为5mM 4-羧基苯硼酸溶液滴加到5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化2h。制备的电极标记为CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
实施例8：CuO的固定
氨基功能化CuO分散液的制备：称取10mg氨基功能化CuO，加入到5mL去离子水中，超声分散1h。
将40μL氨基功能化CuO分散液滴加到5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO。
实施例9：光电化学检测
以CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极，饱和甘汞电极，铂丝电极分别为工作电极，参比电极，辅助电极，10mMTris-HCl(pH＝7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)在电化学工作站上进行光电流信号采集。建立光电流与5fdC浓度之间的关系，光电流与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度的对数呈线性关系，当5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度从0.005nM增加到200nM时，光电流增加。线性回归方程可以表示为I(nA)＝362.3logc(nM)+1244.3，相关系数为0.9934，检测线为0.34pM。(图3和图4)。
实施例10：检测选择性实验
选择性是光电化学生物传感器性能的一个重要指标，因此我们选择5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟基胞嘧啶(5hmC)、m6A、m1A、A、T、G、C八种碱基作为干扰物对传感器的选择性进行研究。并对不同干扰试剂参与构建的传感器的光电流变化值(ΔI＝I2-I1，I1是PEI/Ag2S@WS2/ITO的电流值，I2是PEI/Ag2S@WS2/ITO经过不同干扰物处理后的电极继续经4-羧基苯硼酸和CuO处理后的电极的光电流值，干扰物和5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的浓度均为10nM)进行了对比。结果表明，干扰物参与构建传感器电流值变化明显低5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷，表明构建的传感器具有很好的特异性(图5)。
实施例11：稳定性实验
采用相同的方法制备10支CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO电极，然后在pH＝7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液中进行光电流信号检测，得到电流的相对标准偏差为2.37％，说明该方法有很好的重现性。将CuO/CPBA/5fdC/PEI/Ag2S@WS2/ITO传感器在4℃下存放2周，再进行光电流检测，得到电流响应为原始响应的95.59％，说明该方法有很好的稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种基于Ag2S@WS2-CuO三元异质结的光电化学生物传感器，其特征在于，所述光电化学生物传感器以在表面依次修饰Ag2S@WS2复合纳米材料、聚乙烯亚胺、5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷、4-羧基苯硼酸和氨基功能化CuO的电极为工作电极。
2.根据权利要求1所述的光电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学传感器还包括：参比电极和辅助电极。
3.根据权利要求2所述的光电化学生物传感器，其特征在于，所述参比电极为饱和甘汞电极；所述辅助电极为铂电极。
4.权利要求1或2所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将Ag2S@WS2复合纳米材料加入到去离子水中，超声分散，制备得到Ag2S@WS2分散液；将Ag2S@WS2分散液滴加到预处理后的电极表面，干燥，得到表面修饰Ag2S@WS2复合纳米材料的电极；
（2）通过静电吸附作用，将聚乙烯亚胺修饰于步骤（1）处理后的电极表面；
（3）利用聚乙烯亚胺上的胺基与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷上醛基之间的共价反应，将5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷修饰到步骤（2）处理后的电极表面；
（4）利用4-羧基苯硼酸和5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的邻二醇之间的共价反应，将4-羧基苯硼酸修饰到步骤（3）处理后的电极表面；
（5）利用4-羧基苯硼酸上的-COOH与氨基功能化CuO上的-NH2共价结合，将CuO修饰到步骤（4）处理后的电极表面，制备得到工作电极。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Ag2S@WS2复合纳米材料由如下方法制备而成：
将块状硫化钨加入到乙醇-去离子水混合液中，超声振荡5-10 h，得到分散液；将分散液在1000-5000 rpm离心10-30 min，收集上清液；向上清液中加入硫脲和氨水，搅拌10-30min，再加入AgNO3溶液，搅拌10-30 min，收集沉淀；将沉淀继续在9000-12000 rpm离心10-30 min，收集固体，洗涤，干燥。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将聚乙烯亚胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面的方法为：
将10-40 μL浓度为0.05-5 mM聚乙烯亚胺溶液滴加到步骤(1)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5 h。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将10-40 μL包含5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的Tris-HCl缓冲液加到步骤(2)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-4 h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将4-羧基苯硼酸修饰于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：
将10-40 μL浓度为1-20 mM 4-羧基苯硼酸溶液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-5 h。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将氨基功能化CuO修饰于步骤(4)处理后的电极表面的方法为：
将氨基功能化CuO的分散液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。
10.根据权利要求4或9所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述氨基功能化CuO由如下方法制备而成：
将浓度为0.01-0.5 M Cu(CH3COO)2水溶液与冰醋酸进行混合，剧烈搅拌下加热至125°C沸腾；随后将0.5-5 mM NaOH迅速加入沸腾的溶液中，形成大量沉淀，最后将沉淀物进行离心，清洗，60°C干燥得到第一产物；
将第一产物溶解于醇水溶液中，调节pH至4-6，然后加入APTES，超声20 min后转移到高压反应釜中，75°C反应1-3 h；自然冷却后将产物分别用去离子水和乙醇洗涤、干燥，即得。
11.利用权利要求1或2所述的光电化学生物传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将光电化学生物传感器中的工作电极、参比电极和辅助电极构成三电极体系，以pH为5.5 - 8.5的Tris-HCl缓冲溶液为检测液，进行光电化学信号检测，建立电流与5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷浓度之间的关系，对5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷含量进行检测；
所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.5V；
所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.1-100 mM。
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