CN110174451A - 一种基于硫化钨-黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测5fC的方法 - Google Patents

一种基于硫化钨-黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测5fC的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于硫化钨‑黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测5fC的方法，本发明首先构建了检测5fC的光电化学生物传感器，包括：电极，依次修饰在电极表面的薄层硫化钨纳米片、AuNPs、4‑氨基‑3‑肼基‑5‑巯基‑1，2，4‑三氮唑、5fC和黑色二氧化钛。本发明利用WS2良好的光电活性，AuNPs加速电子传递的作用，4‑氨基‑3‑肼基‑5‑巯基‑1,2,4‑三氮唑上联胺基团与5fC上醛基的特异性共价反应，黑色二氧化钛作为信号扩增分子，实现对5‑甲酰基胞嘧啶的灵敏检测。本发明的检测方法操作稳定性高，灵敏性强，检出限低，便于实现小型化，仅对ITO电极表面进行修饰就可以实现对5fC的快速灵敏检测。

Description

一种基于硫化钨-黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测 5fC的方法
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种基于硫化钨-黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测5fC的方法。
背景技术
在表观遗传学上，胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶(5mC)形式的DNA甲基化作为一种特殊的表观遗传修饰，在包括基因表达调控、组蛋白修饰、染色体重组、发育调节和疾病发病机制在内的一系列生命活动中扮演着十分关键的调控作用。维持DNA甲基化和去甲基化过程中DNA甲基化程度的动态平衡对哺乳动物的生长发育至关重要。2009年，研究人员报道了TET(ten-eleven-translocation，10-11易位)家族的氧化酶能够催化5-甲基胞嘧啶形成5-羟甲基胞嘧啶。羟甲基胞嘧啶作为去甲基化过程中的重要因素开始引起了越来越多的关注。
2011年，被称为第七碱基的5-醛基胞嘧啶(又称“5-甲酰基胞嘧啶”)被慕尼黑大学Carell课题组证实了在生物体内的存在。此后，5-醛基胞嘧啶(5fC)作为TET蛋白酶氧化5-甲基胞嘧啶形成的更高级别的氧化产物开始被发现和逐渐了解。研究人员发现，TET蛋白酶不仅能够催化甲基胞嘧啶形成羟甲基胞嘧啶，还能将甲基胞嘧啶氧化为醛基胞嘧啶的形式，而醛基胞嘧啶可以被胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)特异性地识别并切割。研究人员不仅在小鼠胚胎于细胞和小鼠器官中发现了醛基胞嘧啶，还通过TET蛋白表达调控和TDG酶敲除等实验证实了体内主动去甲基化进程的存在。最新报导，5fC的存在与RNA的转录酶II的转录速率和底物特异性有着十分重要的联系。因此，5-醛基胞嘧啶(5fC)的检测在遗传生物学上具有十分重要的意义。
目前针对5-醛基胞嘧啶(5fC)相关化学反应的研究主要着眼于胞嘧啶环上5号位醛基。常用的检测方法有单分子实时测序法、薄层色谱法、高效液相-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用技术等，这些方法作为早期的5fC检测方法，对5fC的研究起到了推进作用。但是这些方法普遍存在仪器昂贵，操作复杂，成本较高等缺点。因此，实现对5fC的快速、简单、灵敏检测十分重要。
光电化学分析是一种新兴的分析技术，具有电化学分析和光化学分析的优点。其利用光激发光电活性材料，产生光生电子和空穴。而光生电子则被电极捕获，产生电流。其激发光源和检测信号是完全不同的两种形式，这样可以有效地降低背景信号的干扰，从而极大地提高分析检测的灵敏度。但目前尚未有利用光电化学分析方法检测5fC的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于硫化钨-黑色二氧化钛异质结的光电化学分析检测5fC的方法，实现了对5fC的快速、简单和灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种检测5fC的光电化学生物传感器，包括：电极，依次修饰在电极表面的薄层硫化钨纳米片、AuNPs、4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑、5fC和黑色二氧化钛。
优选的，所述电极为ITO电极。
本发明的第二方面，提供上述光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将电极进行预处理；
(2)将薄层硫化钨纳米片修饰到处理后的电极表面；
(3)将AuNPs修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
(4)将4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑修饰于步骤(3)处理后的电极表面；
(5)利用4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑上的联胺基团与5fC上醛基之间的共价反应，将5fC修饰到步骤(4)处理后的电极表面；
(6)利用5fC暴露在外侧的磷酸根与黑色二氧化钛的多配位连接作用，将黑色二氧化钛修饰到步骤(5)处理后的电极表面；即得到制备的生物传感器。
优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗20-60min，晾干。更优选的，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:5。
未经预处理的电极上一般会有较大的过电势，从而导致反应迟钝、能耗升高。为了发挥电极的优势，提高电极的活性，需要对电极表面进行预处理。采用本发明的电极预处理方法可以降低的电极过电势，从而有效提高电极的活性。
优选的，步骤(2)中，将薄层硫化钨纳米片修饰到预处理后的电极表面的方法为：
将薄层硫化钨纳米片加入到去离子水中，超声分散，制备得到硫化钨纳米片分散液；将硫化钨纳米片分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥。
更优选的，所述薄层硫化钨纳米片由如下方法制备而成：
将块状硫化钨和聚丙烯酸加入到水中，超声振荡，得到分散溶液；将分散溶液在3000-5000rpm离心10-20分钟，收集上清液；将上清液继续在9000-12000rpm离心10-40分钟，收集固体，洗涤，真空冷冻干燥。
优选的，步骤(3)中，将AuNPs修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将1-100mM AuNPs分散液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，红外灯照射下干燥。
优选的，步骤(4)中，将4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑修饰于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：
将浓度为1-100μg/mL 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑溶液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃、潮湿环境下孵化1-5h。
上述光电化学生物传感器在检测5fC中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学生物传感器检测5fC的方法，包括以下步骤：
以上述光电化学生物传感器作为工作电极，Pt丝作为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行光电化学信号检测，检测液为含有0.01-2M抗坏血酸(AA)的Tris-HCl缓冲溶液(pH为5.5-8.5)，建立电流与5fC浓度之间的关系，对5fC含量进行检测。
优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.3V。
优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.1-100mM。
需要说明的是，上述检测方法可以用在非疾病诊断方面，可以通过检测5fC的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用硫化钨纳米片和B-TiO2二者形成异质结，具有良好的光电性能及生物兼容性，实现光电信号的扩增，提高5fC的检测灵敏度。
(2)利用4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑上联胺与5fC醛基的特异性共价反应，提高5fC检测的特异性。
(3)利用黑色二氧化钛B-TiO2进行信号扩增，实现对5fC的灵敏检测。
(4)本发明的检测方法简单，成本低，实现了仪器小型化，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对5fC的检测。
附图说明
图1：本发明的5fC检测的原理图。
图2：不同浓度的5fC的光电化学响应曲线；曲线a-j代表的浓度分别为200、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01nM的5fC。
图3：光电流对数值与5fC浓度的线性拟合曲线。
图4：不同核苷酸条件下的光电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。
本发明中所使用的清洗液的成分为：2-20mM Tris-HCl和20-60mM KCl，pH为6.0-8.5。
本发明中所使用的检测液为：0.1-100mM Tris-HCl、0.01-2M AA，pH为5.5-8.5。
正如背景技术部分所介绍的，现有的5fC检测方法多数要利用到PCR、DNA测序、芯片等手段，普遍存在仪器昂贵，操作复杂，需专业人员操作等缺点，难以实现对5fC的快速、灵敏检测。
另外，5fC由于其含量低、反应惰性，并且DNA反应有其本身的要求，检测的反应条件要求温和，过热、过酸、过碱都会使DNA降解，因此5fC很难被检测。
基于此，本发明首次提出了一种基于WS2-B-TiO2异质结的光电化学分析方法检测5fC的方法。本发明首先构建了一种光电化学传感器，所述光电化学传感器包括：电极，依次修饰在电极表面的薄层硫化钨纳米片、AuNPs、4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑、5fC和黑色二氧化钛。其中：
WS2具有良好的生物相容性，二维纳米片形态产生的生物分子负载效率高，易于处理(如在水溶液中分散性高)。WS2的层状结构具有较强的平面内W-S键合和平面间较弱的范德瓦尔斯相互作用，因此很容易剥落成超薄纳米薄片；本发明制备的薄层硫化钨纳米片具有比表面积高，在极性介质中分散性好，导电性好，窄带隙，以及优异的光电电化学性能等诸多优点。AuNPs具有加速电子传递的作用。4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑上的联胺基团可以与5fC上的醛基发生特异性共价反应，而黑色二氧化钛能够作为信号扩增分子，实现对5fC的特异性识别。本发明的光电化学传感器中各物质协同作用，从而实现了对5fC的快速灵敏检测。
本发明的光电化学生物传感器构建和检测的原理图见图1。以ITO电极为基体电极，利用ITO电极表面的含氧集团与硫化钨之间的静电吸附力，将硫化钨纳米片修饰到电极表面。接着，将纳米金颗粒修饰在电极表面，利用Au-S键将4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑固定在电极上，其中，4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑上的联胺基团和5fC上的醛基发生特异性共价反应，成功的将5fC捕获在电极表面上，这引入了磷酸基团，能够与黑色二氧化钛发生反应，使黑色二氧化钛成功修饰在电极上。利用黑色二氧化钛与WS2纳米片形成了异质结，加速了界面电子的传递，实现了信号的扩增，硫化钨纳米片本身是一种良好的半导体，能产生稳定的初始光电流，从而提高检测灵敏度。而当黑色二氧化钛修饰在电极表面后，光电流会显著增大，这主要是WS2-B-TiO2的形成，改善了电子传输的能力，实现了信号的扩增。因此，利用5fC的浓度与光电流的线性关系，可实现对5fC的检测。
在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学生物传感器的构建过程为：
(1)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成1×5cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(比例为1:1-1:5)，丙酮和二次水分别超声清洗20-60分钟，并在室温下晾干，待用。
(2)薄层硫化钨纳米片的制备：取50-300mg块状硫化钨和20-100mg聚丙烯酸加入50-100mL的水中，超声振荡2-10h，将深绿色分散体在3000-5000rpm离心10-20分钟，收集上清液，将上清液继续在9000-12000rpm离心10-40分钟，收集固体，用去离子水洗涤几次，真空冷冻干燥。
(3)AuNPs的制备：将50-100毫升双蒸水装入双颈烧瓶中，加入50-100mM的HAuCl4溶液2-10mL，当溶液开始回流时，取下塞子。快速加入2-10毫升35-40mM柠檬酸钠，并更换塞子，让系统再回流20-40分钟。关闭加热，让系统在搅拌下冷却到室温(20-25℃)。将制备的纳米金颗粒放于4℃冰箱中保存，备用。
(4)黑色二氧化钛(B-TiO2)的制备：量取50-100mL乙醇和10-50mL乙腈于烧杯中，搅拌形成均匀溶液A。另取0.1-0.4mL浓度为28％的氨水和0.91mL去离子水加入溶液A搅拌均匀。取1-10mL钛酸四丁酯，加入溶液中搅拌6-15h，得到白色的TiO2球。用无水乙醇和去离子水水洗3次，离心机离心6000rpm/15min，真空冷冻干燥。备用。
分别称取适量的NaBH4和白色TiO2球，(控制质量比为1:1-1:4)，混合均匀研磨，而后铺至干净的磁舟中，在N2氛围下，300℃煅烧0.5-3h。升温和降温的速度均为5℃/min。将烧好后的粉末全部转移至烧杯中，加去离子水静置过夜以除去未反应的NaBH4。离心，10000rpm/10min，洗涤四次。60℃干燥，研磨备用。
(5)薄层WS2纳米片的制备：取100mg块状硫化钨和50mg聚丙烯酸加入80mL的水中，超声振荡4小时，将深绿色分散体在4000rpm离心20分钟，收集上清液，将上清液继续离心9000rpm，收集固体，用去离子水洗涤几次，真空冷冻干燥。
(6)硫化钨分散液的制备：称取2-12mg薄层WS2纳米片，加入到2mL去离子水中，超声分散1-2小时。
(7)硫化钨纳米片的固定：将10-40μL硫化钨纳米片分散液滴加到预处理后的电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为WS2/ITO。
(8)AuNPs的固定：将10-40μL1-100mM的AuNPs滴加到WS2/ITO电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为AuNPs/WS2/ITO。
(9)4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑的固定：将10-40μL 1-100μg/mL 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑分散液滴加到AuNPs/WS2/ITO电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为AHM/AuNPs/WS2/ITO。
(10)5fC的固定：将10-40μL包含5fC的Tris-HCl缓冲液滴加到AHM/AuNPs/WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-5h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO。
(11)B-TiO2分散液的制备：称取10-20mg黑色二氧化钛微球，加入到1-8mL去离子水中，超声分散1-2小时。
(12)B-TiO2的固定：将10-40μL B-TiO2分散液滴加到5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-5h。然后，将电极冲洗2-5次。制备的电极标记为B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO。
上述光电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。
在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学生物传感器检测5fC的过程为：
(1)用不同浓度的5fC制备B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO电极，并以其作为工作电极，饱和甘汞电极、铂丝分别作为参比电极和辅助电极组成三电极体系。以500W氙灯作为光源，应用电位为-0.5-0.3V，检测液为0.1-100mM Tris-HCl、0.01-2M AA(pH为5.5-8.5)进行光电流检测；
(2)建立电流与5fC浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中的5fC的含量进行检测。
随着5fC浓度的增加，电极表面的B-TiO2数量增加，导致光电流信号增加。根据5fC浓度与电流的线性关系，可实现对5fC的检测。
本发明的光电化学生物传感器对5fC的检测范围为0.01-200nM，检测限为3.35pM。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：薄层WS2纳米片的制备
取100mg块状硫化钨和50mg聚丙烯酸加入80mL的水中，超声振荡4小时，将深绿色分散体在4000rpm离心20分钟，收集上清液，将上清液继续离心9000rpm，收集固体，用去离子水洗涤几次，真空冷冻干燥。
实施例2：AuNPs的制备
将80毫升双蒸水装入双颈烧瓶中，加入60mM的HAuCl4溶液5mL，当溶液开始回流时，取下塞子。快速加入5毫升38.8mM柠檬酸钠，并更换塞子，让系统再回流20分钟。关闭加热，让系统在搅拌下冷却到室温(20-25℃)。将制备的纳米金颗粒放于4℃冰箱中保存，备用。
实施例3：黑色二氧化钛的制备
量取100mL乙醇和50mL乙腈于烧杯中，搅拌形成均匀溶液A。另取0.38mL浓度为28％的氨水和0.91mL去离子水加入溶液A搅拌均匀。取9mL钛酸四丁酯，加入溶液中搅拌12h，得到白色的TiO2球。用无水乙醇和去离子水水洗3次，离心机离心6000rpm/15min，真空冷冻干燥。备用。
分别称取干燥的NaBH4和白色TiO2球各为1.5g(控制质量比为1:2)，混合均匀研磨，而后铺至干净的磁舟中，在N2氛围下，300℃煅烧2h。升温和降温的速度均为5℃/min。将烧好后的粉末全部转移至烧杯中，加去离子水静置过夜以除去未反应的NaBH4。离心，10000rpm/10min，洗涤四次。60℃干燥，研磨备用。
实施例4：ITO电极预处理
将ITO导电玻璃分割成1×5cm2，然后用乙醇/NaOH混合液(1:1)，丙酮和二次水分别清洗40分钟，并在室温下晾干，待用。
实施例5：WS2纳米片的固定
WS2纳米片分散液的制备：称取12mg WS2纳米片，加入到3mL去离子水中，超声分散1小时。
将40μL WS2纳米片分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。制备的电极标记为WS2/ITO。
实施例6：AuNPs的固定
将40μL 10mM AuNPs滴加到WS2/ITO电极表面，红外灯照射干燥。制备的电极标记为AuNPs/WS2/ITO。
实施例7：4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑的固定
将40μL 100μg/mL 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑分散液滴加到AuNPs/WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为AHM/AuNPs/WS2/ITO。
实施例8：5fC的固定
将20μL包含5fC的Tris-HCl缓冲液滴加到AHM/AuNPs/WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO。
实施例9：B-TiO2的固定
B-TiO2分散液的制备：称取15mg B-TiO2，加入到5mL去离子水中，超声分散1小时。
将40μL二氧化钛分散液滴加到5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO。
实施例10：光电化学检测
以B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO电极，饱和甘汞电极，铂丝电极分别为工作电极，参比电极，辅助电极，pH＝7.4的10mM Tris-HCl-AA缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)在电化学工作站上进行光电流信号采集。建立光电流与5fC浓度之间的关系，线性范围为0.01-200nM，校正曲线为I(nA)＝136.21logc(nM)+642.06(R＝0.9991)，检出限为3.35pM(图2和图3)。
实施例11：选择性检测
选择性是光电化学传感器性能的一个重要指标，因此我们选择5-羟基胞嘧啶(5hmC)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、m6A、m1A以及四种不同的碱基作为干扰物对传感器的选择性进行研究。并对不同干扰试剂参与构建的传感器的光电流变化值(ΔI＝I2-I1，I1是AHM/AuNPs/WS2/ITO的电流值，I2是AHM/AuNPsWS2/ITO经过不同干扰物处理后的电极继续经黑色二氧化钛处理后的电极的光电流值，干扰物和5fC的浓度均为1nM)进行了对比。结果表明，干扰物参与构建传感器电流值变化明显低5fC，表明构建的传感器具有很好的特异性(图4)。
实施例12：稳定性实验
采用相同的方法制备10支B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO电极，然后在含有AA的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为7.4)中进行光电流信号检测，得到电流的相对标准偏差为4.76％，说明该方法有很好的重现性。将B-TiO2/5fC/AHM/AuNPs/WS2/ITO传感器在4℃下存放2周，再进行光电流检测，得到电流响应为原始响应的94.85％，说明该方法有很好的稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测5fC的光电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极，依次修饰在电极表面的薄层硫化钨纳米片、AuNPs、4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑、5fC和黑色二氧化钛；
优选的，所述电极为ITO电极。
2.权利要求1所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将电极进行预处理；
(2)将薄层硫化钨纳米片修饰到处理后的电极表面；
(3)将AuNPs修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
(4)将4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑修饰于步骤(3)处理后的电极表面；
(5)利用4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑上的联胺基团与5fC上醛基之间的共价反应，将5fC修饰到步骤(4)处理后的电极表面；
(6)利用5fC暴露在外侧的磷酸根与黑色二氧化钛的多配位连接作用，将黑色二氧化钛修饰到步骤(5)处理后的电极表面；即得到制备的生物传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗20-60min，晾干；
优选的，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将薄层硫化钨纳米片修饰到预处理后的电极表面的方法为：
将薄层硫化钨纳米片加入到去离子水中，超声分散，制备得到硫化钨纳米片分散液；将硫化钨纳米片分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述薄层硫化钨纳米片由如下方法制备而成：
将块状硫化钨和聚丙烯酸加入到水中，超声振荡，得到分散溶液；将分散溶液在3000-5000rpm离心10-20分钟，收集上清液；将上清液继续在9000-12000rpm离心10-40分钟，收集固体，洗涤，真空冷冻干燥。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将AuNPs修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将AuNPs分散液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，红外灯照射下干燥。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑修饰于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：
将浓度为1-100μg/mL4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑溶液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，放入孵化箱中37℃、潮湿环境下孵化1-5h。
8.权利要求1所述的光电化学生物传感器在检测5fC中的应用。
9.一种利用权利要求1所述的光电化学生物传感器检测5fC的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以权利要求1所述的光电化学生物传感器作为工作电极，Pt丝作为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行光电化学信号检测，检测液为含有抗坏血酸的0.1-100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH为5.5-8.5)，建立电流与5fC浓度之间的关系，对5fC含量进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.3V。
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