CN108593727A - 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法 - Google Patents

一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108593727A
CN108593727A CN201810402342.4A CN201810402342A CN108593727A CN 108593727 A CN108593727 A CN 108593727A CN 201810402342 A CN201810402342 A CN 201810402342A CN 108593727 A CN108593727 A CN 108593727A
Authority
CN
China
Prior art keywords
electrode
histone acetyltransferase
optical electro
mos
sio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810402342.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108593727B (zh
Inventor
殷焕顺
周云雷
艾仕云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN201810402342.4A priority Critical patent/CN108593727B/zh
Publication of CN108593727A publication Critical patent/CN108593727A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108593727B publication Critical patent/CN108593727B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法。通过组蛋白乙酰转移酶催化底物肽的乙酰化反应，将乙酰基供体乙酰辅酶A催化水解成辅酶A。构建基于MoS2纳米片的光电化学传感器，以水解生成的辅酶A为桥连试剂，将亲和素修饰的β‑半乳糖苷酶修饰至电极表面，催化底物4‑氨基苯‑β‑D‑半乳糖苷水解生成4‑氨基苯酚。4‑氨基苯酚可作为传感器上光电活性材料的电子供体，促进光电信号。根据组蛋白乙酰转移酶的浓度与光电信号之间的线性关系，可实现对组蛋白乙酰转移酶的灵敏检测。本发明构建的光电化学传感器具有优良的性能，其在临床分析领域具有良好的应用前景。

Description

一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测 方法
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法。
背景技术
组蛋白乙酰转移酶(Histone Acetyltransferase，HAT)能够催化组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化修饰反应，此反应需要依靠乙酰辅酶A作为乙酰基供体。反应后，乙酰辅酶A因失去乙酰基团而生成辅酶A。组蛋白乙酰化是一种非常重要的转录后修饰，在很多生物学过程中具有非常重要的作用，如转录调控和信号转导等。组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。而研究发现，异常的组蛋白乙酰化与多种疾病相关，而异常的组蛋白乙酰化又与组蛋白乙酰转移酶相关。因此，组蛋白乙酰转移酶可作为疾病治疗的潜在靶向分子。要实现相关的药物开发，关键在于对组蛋白乙酰转移酶的灵敏检测。
目前，关于组蛋白乙酰转移酶的检测，主要依赖于检测组蛋白乙酰转移酶催化生成的乙酰化的肽或者乙酰化的蛋白，主要技术有放射性标记法、酶联免疫分析、液相色谱、质谱等。放射性技术存在放射性污染的危害，对操作者的健康也有危害。酶联免疫分析则受制于抗体的有效性和假阳性，且抗体试剂比较昂贵。色谱和质谱技术则需要昂贵的大型仪器，样品前处理繁琐，需要专业的操作人员。因此，建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的方法，用于组蛋白乙酰转移酶的临床诊断分析，是至关重要的。
光电化学分析是一种新兴的分析技术，具有电化学分析和光化学分析的优点。其利用光激发光电活性材料，产生光生电子和空穴。而光生电子则被电极捕获，产生电流。基于其，其激发光源和检测信号是完全不同的两种形式，这样可以有效地降低背景信号的干扰，从而极大地提高分析检测的灵敏度。MoS2纳米片层材料具有较低的细胞毒性和良好的光电转换活性，在可见光激发下，可产生光电子，形成稳定的光电流。目前尚未有基于MoS2纳米片的光电化学分析方法检测组蛋白乙酰转移酶活性的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法，实现了对组蛋白乙酰转移酶的高特异性和高灵敏性检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器，包括：电极，依次固定在电极表面的石墨烯-纳米金、MoS2纳米片、氨基功能化的SiO2纳米材料(SiO2-NH2)、(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、辅酶A(CoA)、ZrO2、生物素修饰的双链DNA(Biotin-dsDNA)和亲和素修饰的β-半乳糖苷酶(Avidin-Gal)。
所述生物素修饰的双链DNA，其中一条DNA链修饰有磷酸根，其序列如SEQ ID NO.1所示；另一条DNA链修饰有生物素，其序列如SEQ ID NO.2所示。具体如下：
5'-PO4-AGTCGACCTGGCAGG-3'(SEQ ID NO.1)；
5-'biotin-CCTGCCAGGTCGACT-3'(SEQ ID NO.2)。
所述辅酶A是组蛋白乙酰转移酶在乙酰辅酶A和底物肽存在条件下，催化底物肽的乙酰化，同时将乙酰辅酶A变为辅酶A。
本发明的第二方面，提供上述光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对电极进行预处理；
(2)分别将石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2加入到去离子水中，超声分散，得到分散液，将石墨烯-纳米金分散液、MoS2纳米片分散液和SiO2-NH2分散液依次滴加到预处理后的电极表面，干燥；
(3)将SMCC溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h，清洗，再将组蛋白乙酰转移酶催化底物肽乙酰化后的催化反应液滴加到电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h；
(4)将ZrO2加入到去离子水中，超声分散，得到ZrO2分散液，将ZrO2分散液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h；
(5)将生物素修饰的双链DNA溶液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，25-40℃、潮湿条件下反应0.5-3h；
(6)将亲和素修饰的β-半乳糖苷酶溶液滴加到步骤(5)处理后的电极表面，15-40℃、潮湿条件下反应2-7h，即制备得到用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器。
优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗，再用丙酮和二次水清洗，晾干。
优选的，步骤(1)中，所述电极为ITO导电玻璃。
优选的，步骤(3)中，所述催化反应液由如下方法制备而成：
将20-50μL不同浓度的组蛋白乙酰转移酶、20-50μL的底物肽、10-40μL乙酰辅酶A、20-50μL 10mMTris-HCl(pH 7.5)混合均匀；然后将混合液在20-50℃下温育1-5小时。
进一步优选的，所述底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体如下：
RGKGGKGLKGGAKA(SEQ ID NO.3)。
进一步优选的，所述底物肽的浓度为10-40μM，乙酰辅酶A的浓度为100-300μM。
优选的，所述湿润条件是指湿度为75-99％。
上述光电化学传感器在检测组蛋白乙酰转移酶的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学传感器检测组蛋白乙酰转移酶的方法，包括以下步骤：
以上述光电化学传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，建立光电流与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，对样品中组蛋白乙酰转移酶含量进行检测。
优选的，所述Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为含有1mmol/L 4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的10mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液。
需要说明的是，上述检测方法为非疾病诊断方法。在非疾病诊断方面，可以通过检测组蛋白转乙酰酶的活性，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测方法简单，仅在ITO电极表面进行简单修饰，即可进行组蛋白乙酰转移酶的检测。实现了仪器小型化，且易于操作，检测费用低。
(2)本发明制备的MoS2/Gr-Au/ITO电极，具有很好的导电性、生物相容性、大的比表面积，可以增加Avidin-Gal的负载量，催化信号放大，从而提高检测的灵敏性，检测限可达0.037nmol/L。
(3)本发明是基于组蛋白乙酰转移酶对其底物肽的催化反应，具有很高的检测选择性。而且，组蛋白乙酰转移酶的催化反应是在液相中发生，相比于将组蛋白乙酰转移酶修饰到电极表面，液相反应具有较高的催化活性，可实现信号的有效扩增，提高检测灵敏性。此外，本发明对组蛋白乙酰转移酶的检测，是基于间接检测，利用组蛋白乙酰转移酶对其底物肽的催化反应中生成的辅酶A，通过检测辅酶A进而实现对组蛋白乙酰转移酶的检测。由于辅酶A的稳定性比组蛋白乙酰转移酶高，使得传感器的储备稳定性得到改善。
附图说明
图1：本发明光电化学传感器构建和组蛋白乙酰转移酶检测的原理图。
图2：不同浓度的组蛋白乙酰转移酶的光电响应曲线；曲线a-h代表的浓度分别为0.1、0.3、1、5、10、100、200、300nmol/L的组蛋白乙酰转移酶。
图3：光电流与组蛋白乙酰转移酶浓度的线性拟合曲线。
图4：不同蛋白条件下的光电响应的柱状图。
图5：光电连续扫描曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
正如背景技术部分所介绍的，现有技术中组蛋白乙酰转移酶的检测方法存在一定的不足，基于此，本发明构建了一种用于用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器。
本发明的光电化学传感器构建和检测的原理图见图1。首先将底物肽、乙酰辅酶A和组蛋白乙酰转移酶混合均匀，置于反应器中，使组蛋白乙酰转移酶催化底物肽的乙酰化反应。作为乙酰基供体，乙酰辅酶A在失去乙酰基后生成辅酶A(图1中A)。辅酶A结构中存在巯基和磷酸根结构。然后构建传感器(图1中B)：首先将ITO电极预处理，然后将石墨烯-纳米金复合材料修饰于电极表面。石墨烯-纳米金复合材料具有很好的生物兼容性和导电性，可增加MoS2纳米片在光照条件下的生成激发电子的迁移速率，从而起到扩增信号的作用。然后再将光电活性材料MoS2纳米片修饰于电极表面。随后，将氨基功化的SiO2修饰于电极表面，利用其表面丰富的氨基，可进一步修饰SMCC偶联剂。再利用SMCC与巯基之间的特异的化学反应，将辅酶A修饰到电极表面。接下来，利用辅酶A分子结构中的磷酸根与ZrO2之间的结合作用，将ZrO2捕获至电极表面。再利用ZrO2与双链DNA上磷酸根的反应，将生物素修饰的双链DNA修饰到电极表面。利用生物素与亲和素之间的特异结合作用，进而将亲和素修饰的β-半乳糖苷酶修饰到电极表面。至此，传感器构建成功。然后，利用电极表面的β-半乳糖苷酶催化水解检测底液中的4-氨基苯-β-D-半乳糖苷，生成MoS2光电反应的电子供体4-氨基苯酚。4-氨基苯酚可提供电子捕获MoS2纳米片的光生空穴，阻止光生电子与空穴的复合，起到增强光电信号的作用。而4-氨基苯酚的生成量与组蛋白乙酰转移酶的浓度成正比，因此，根据光电流与组蛋白乙酰转移酶的线性关系，可实现对组蛋白乙酰转移酶的检测。
在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学传感器的构建过程为：
(1)ITO电极预处理：首先将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，并用乙醇/NaOH混合液(比例为1:1-1:6)超声清洗30-60分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30-60分钟，并在室温下晾干，待用。
(2)石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2的固定：分别将5-20、4-18和7-21mg的石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2加入到3-10mL去离子水中，超声分散30-60分钟，得到石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2分散液。将10-50μL上述分散液依次滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。得到的电极依次标记为：Gr-Au/ITO、MoS2/Gr-Au/ITO、SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(3)SMCC和辅酶A的固定：将10-50μL 0.5-2.0mM的SMCC溶液滴加到SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3小时，用5-20mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3-6次。再将10-50μL催化反应液滴加到电极表面，室温潮湿条件下反应0.5-3小时，用5-20mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3-5次。电极标记为：CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(4)ZrO2的固定：将5-30μL0.3-3.2mg/mL的ZrO2分散液滴加到CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，室温潮湿条件下反应0.5-3小时。用2-20mMTris-HCl(pH7.4)清洗3-5次。电极标记为：ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(5)Biotin-dsDNA的固定：将5-30μL0.3-2.4μM的Biotin-dsDNA溶液滴加到ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，25-40℃潮湿条件下反应0.5-3小时。用3-15mMTris-HCl(pH7.4)清洗3-6次。电极标记为：DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(6)Avidin-Gal的固定：将20-60μL5.5-14.6μg/mL的Avidin-Gal溶液滴加到DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，15-40℃潮湿条件下反应2-7小时。用5-40mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3-6次。电极标记为：Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
上述光电化学传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。固定修饰在ITO电极表面的材料可以是市售产品，也可自行制备得到，只要性能上满足使用要求即可，本发明不做特别的限定。其中：
步骤(2)中，石墨烯-纳米金可以由如下方法进行制备：
将5-30mg石墨烯加到70-100mL去离子水中，超声分散1-3小时。然后，10-50mL氯金酸溶液(浓度为10-50mM)加入到石墨烯分散液中，超声分散1-3小时。将该分散液转移至250mL两口烧瓶中，加入10-50mL柠檬酸钠(0.1-0.5mol/L)。反应体系加热至回流，反应20-50分钟。将制备的复合材料分别用去离子水和乙醇洗涤3-5次。最后于60℃下真空干燥。
步骤(2)中，MoS2纳米片可以由如下方法进行制备：
将0.5-1g MoS2粉末材料和0.5-1.7g胆酸钠加入到100-380mL的去离子水中，超声剥离16-24小时。然后将分散液在2000-4000rpm转速下离心分离，收集上层分散液。再将上层分散液在8000-15000rpm转速下离心分离，所得到的固体用去离子水洗涤3-5次。
步骤(2)中，SiO2-NH2可以由如下方法进行制备：
配制溶液A：12-24mL 20-28％％的浓氨水、25.8-36.4mL乙醇、40.5-54.8mL水混合均匀，置于烧杯中，磁力搅拌。配制溶液B：6-12mL正硅酸乙酯(TEOS)、65-92mL乙醇，混合均匀。然后，将B溶液快速加入A溶液中。继续搅拌。一分钟后，将搅拌速度降低。室温下继续反应0.5-2小时。离心，用乙醇洗3-6遍。得到纳米SiO2。称取0.5-1.5g纳米SiO2超声分散于5-20mL无水乙醇中。然后加入0.08-0.6mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，磁力搅拌下反应1-5小时，然后升温回流，继续反应0.5-3小时。离心，用乙醇洗3-6遍。得到氨基功能化的纳米SiO2。
步骤(3)中，催化反应液有如下方法制备：
将20-50μL不同浓度的组蛋白乙酰转移酶、20-50μL的底物肽(浓度为10-40μM)、10-40μL乙酰辅酶A(浓度为100-300μM)、20-50μL 10mMTris-HCl(pH 7.5)混合均匀。然后将混合液在20-50℃下温育1-5小时。得到的溶液标记为催化反应液。
本发明中依次修饰在电极表面的各个材料的作用分别为：
石墨烯-金纳米片：具有很好的生物兼容性和导电性，可增加MoS2纳米片在光照条件下的生成激发电子的迁移速率，从而起到扩增信号的作用。
MoS2纳米片：作为光电活性材料，光照下产生光电流。
氨基功能化的SiO2纳米材料(SiO2-NH2)：作为SMCC的固定载体。
SMCC：辅酶A的固定载体。
辅酶A：其数量由组蛋白乙酰转移酶的量控制，间接反应组蛋白乙酰转移酶的量。
ZrO2：利用其能与磷酸根离子相结合的性质，作为桥，链接辅酶A(辅酶A有巯基)，继而固定后续的磷酸根修饰的双链DNA。
生物素修饰的双链DNA：其中一条DNA链修饰有磷酸根，便于其通过ZrO2修饰到电极表面。另一条DNA链修饰有生物素，便于通过生物素与亲和素的相互结合作用，将后续的亲和素修饰的β-半乳糖苷酶修饰到电极表面。具体序列如下：
5'-PO4-AGTCGACCTGGCAGG-3'(SEQ ID NO.1)
5-'biotin-CCTGCCAGGTCGACT-3'(SEQ ID NO.2)
亲和素修饰的β-半乳糖苷酶：催化检测底液里面的4-氨基苯-β-D-半乳糖苷，产生4-氨基苯酚，作为电子供体，促进MoS2的光电信号。
在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学传感器检测组蛋白乙酰转移酶的过程为：以电化学工作站为信号采集仪器，200-500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，以-0.5-0.2V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：组蛋白乙酰转移酶催化底物肽乙酰化
将20μL 50nM的组蛋白乙酰转移酶、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)、20μL 10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合均匀。然后将混合液在37℃下温育1小时。得到的溶液标记为催化反应液。
实施例2：石墨烯-纳米金复合材料的制备
将20mg石墨烯加到80mL去离子水中，超声分散1小时。然后，30mL氯金酸溶液(浓度为50mM)加入到石墨烯分散液中，超声分散1小时。将该分散液转移至250mL两口烧瓶中，加入20mL柠檬酸钠(0.1mol/L)。反应体系加热至回流，反应30分钟。将制备的复合材料分别用去离子水和乙醇洗涤3次。最后于60℃下真空干燥。
实施例3：MoS2纳米片的制备
将0.5g MoS2粉末材料和1.5g胆酸钠加入到300mL的去离子水中，超声剥离20小时。然后将分散液在2000rpm转速下离心分离，收集上层分散液。再将上层分散液在12000rpm转速下离心分离，所得到的固体用去离子水洗涤3次
实施例4：SiO2-NH2的制备。
配制溶液A：18mL 28％的浓氨水、32.5mL乙醇、49.5mL水混合均匀，置于烧杯中，磁力搅拌。配制溶液B：9mL正硅酸乙酯(TEOS)、91mL乙醇，混合均匀。然后，将B溶液快速加入A溶液中。继续搅拌。一分钟后，将搅拌速度降低。室温下继续反应2小时。离心，用乙醇洗3遍。得到纳米SiO2。称取0.5g纳米SiO2超声分散于10mL无水乙醇中。然后加入0.2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，磁力搅拌下反应5小时，然后升温回流，继续反应1小时。离心，用乙醇洗3遍。得到氨基功能化的纳米SiO2。
实施例5：光电化学传感器构建
(1)电极预处理：
首先将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，并用乙醇/NaOH混合液(1:1)超声清洗30分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30分钟，并在室温下晾干，待用。
(2)石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2的固定
分别将10、15和15mg的石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2加入到5mL去离子水中，超声分散30分钟，得到浓度为2、3、3mg/mL的石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2分散液。将40μL上述分散液依次滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。得到的电极依次标记为：Gr-Au/ITO、MoS2/Gr-Au/ITO、SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(3)SMCC和辅酶A的固定
将40μL 0.5mM的SMCC溶液滴加到SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应1小时，用10mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3次。再将40μL催化反应液滴加到电极表面，室温潮湿条件下反应1小时，用10mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3次。电极标记为：CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(4)ZrO2的固定
将20μL 2mg/mL的ZrO2分散液滴加到CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，室温潮湿条件下反应2小时。用10mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3次。电极标记为：ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(5)Biotin-dsDNA的固定
将20μL1μM的Biotin-dsDNA溶液滴加到ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，37℃潮湿条件下反应2小时。用10mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3次。电极标记为：DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
(6)Avidin-Gal的固定
将40μL10μg/mL的Avidin-Gal溶液滴加到DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO表面，37℃潮湿条件下反应3小时。用10mMTris-HCl(pH 7.4)清洗3次。电极标记为：Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO。
实施例6：组蛋白乙酰转移酶的检测
(1)组蛋白乙酰转移酶催化底物肽的反应
将20μL不同浓度的组蛋白乙酰转移酶、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)、20μL 10mMTris-HCl(pH 7.5)混合均匀。然后将混合液在37℃下温育1小时。得到不同的催化反应液。
(2)光电化学检测：
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有1mmol/L 4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的10mMTris-HCl(pH7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，线性范围为0.1–300nmol/L，校正曲线为I＝97.56logc–172.99(nA/cm2，nmol/L，R＝0.9947)，检出限为0.037nmol/L(图2和图3)。
(3)检测选择性实验
将20μL 50nM的组蛋白乙酰转移酶(或者100unit/mL蛋白激酶A、100unit/mL的RNase H、100unit/mL的DNase I、M.SssI DNA甲基转移酶、100unit/mL的EcoRI内切酶、0.1mg/mL的牛血清白蛋白)、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)、20μL 10mMTris-HCl(pH 7.5)混合均匀。然后将混合液在37℃下温育1小时。得到不同的催化反应液。
以SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO为基体电极，按照实施例4中的(3)-(6)步骤构建传感器，在含有1mmol/L 4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的10mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液里面检测光电流，结果表明组蛋白乙酰转移酶催化的反应液制备的电极光电流远远大于其余的蛋白反应液构建的电极，说明本发明的方法具有很好的检测特异性(图4)。
(4)稳定性实验：
采用相同的方法以及检测条件，制备10支Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO电极，组蛋白乙酰转移酶浓度为50nM，得到光电流的相对便准偏差为4.69％，说明该方法有很好的重现性。用一支Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO电极连续进行10次检测，得到光电流的相对标准偏差为2.25％，说明该方法具有很好的重现性(图5)。将Gal/DNA/ZrO2/CoA/SiO2/MoS2/Gr-Au/ITO传感器在4℃下存放2周，得到电流响应为原始相应的93.26％，说明该方法有很好的稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcgacctg gcagg 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctgccaggt cgact 15
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 底物肽
<400> 3
Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Lys Gly Gly Ala Lys Ala
1 5 10

Claims (10)

1.一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器，其特征在于，包括：电极，依次固定在电极表面的石墨烯-纳米金、MoS2纳米片、氨基功能化的SiO2纳米材料、SMCC、辅酶A、ZrO2、生物素修饰的双链DNA和亲和素修饰的β-半乳糖苷酶；
所述生物素修饰的双链DNA，其中一条DNA链修饰有磷酸根，其序列如SEQ ID NO.1所示；另一条DNA链修饰有生物素，其序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对电极进行预处理；
(2)分别将石墨烯-纳米金、MoS2纳米片和SiO2-NH2加入到去离子水中，超声分散，得到分散液，将石墨烯-纳米金分散液、MoS2纳米片分散液和SiO2-NH2分散液依次滴加到预处理后的电极表面，干燥；
(3)将SMCC溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h，清洗，再将组蛋白乙酰转移酶催化底物肽乙酰化后的催化反应液滴加到电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h；
(4)将ZrO2加入到去离子水中，超声分散，得到ZrO2分散液，将ZrO2分散液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h；
(5)将生物素修饰的双链DNA溶液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，25-40℃、潮湿条件下反应0.5-3h；
(6)将亲和素修饰的β-半乳糖苷酶溶液滴加到步骤(5)处理后的电极表面，15-40℃、潮湿条件下反应2-7h，即制备得到用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗，再用丙酮和二次水清洗，晾干。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述催化反应液由如下方法制备而成：
将20-50μL不同浓度的组蛋白乙酰转移酶、20-50μL的底物肽、10-40μL乙酰辅酶A、20-50μL 10mMTris-HCl(pH 7.5)混合均匀；然后将混合液在20-50℃下温育1-5小时。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述底物肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述底物肽的浓度为10-40μM，乙酰辅酶A的浓度为100-300μM。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述湿润条件是指湿度为75-99％。
8.权利要求1所述的光电化学传感器在检测组蛋白乙酰转移酶的应用。
9.一种利用权利要求1所述的光电化学传感器检测组蛋白乙酰转移酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以上述光电化学传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，建立光电流与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，对样品中组蛋白乙酰转移酶含量进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为含有1mmol/L 4-氨基苯-β-D-半乳糖苷的10mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液。
CN201810402342.4A 2018-04-28 2018-04-28 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法 Expired - Fee Related CN108593727B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810402342.4A CN108593727B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810402342.4A CN108593727B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108593727A true CN108593727A (zh) 2018-09-28
CN108593727B CN108593727B (zh) 2020-03-24

Family

ID=63619280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810402342.4A Expired - Fee Related CN108593727B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108593727B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613093A (zh) * 2019-01-21 2019-04-12 宁波大学 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
CN109828006A (zh) * 2019-02-27 2019-05-31 山东农业大学 一种检测甲基化rna的光电化学传感器及其检测方法
CN114839247A (zh) * 2022-05-11 2022-08-02 阳江海关综合技术服务中心 一种检测虾干中生物胺含量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106124589A (zh) * 2016-07-05 2016-11-16 济南大学 一种基于铁掺杂二维纳米材料构建的电化学生物传感器的制备方法
CN106461610A (zh) * 2014-06-10 2017-02-22 美国陶氏益农公司 转基因蛋白的定量分析
CN107101997A (zh) * 2017-04-25 2017-08-29 青岛大学 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106461610A (zh) * 2014-06-10 2017-02-22 美国陶氏益农公司 转基因蛋白的定量分析
CN106124589A (zh) * 2016-07-05 2016-11-16 济南大学 一种基于铁掺杂二维纳米材料构建的电化学生物传感器的制备方法
CN107101997A (zh) * 2017-04-25 2017-08-29 青岛大学 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUFANG HU等: "Unique electrocatalytic activity of a nucleic acid-mimicking coordination polymer for the sensitive detection of coenzyme A and histone acetyltransferase activity", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613093A (zh) * 2019-01-21 2019-04-12 宁波大学 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
CN109613093B (zh) * 2019-01-21 2020-10-27 宁波大学 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
CN109828006A (zh) * 2019-02-27 2019-05-31 山东农业大学 一种检测甲基化rna的光电化学传感器及其检测方法
CN109828006B (zh) * 2019-02-27 2019-12-03 山东农业大学 一种检测甲基化rna的光电化学传感器及其检测方法
CN114839247A (zh) * 2022-05-11 2022-08-02 阳江海关综合技术服务中心 一种检测虾干中生物胺含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108593727B (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10605761B2 (en) Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme
Huang et al. Silver nanoparticles coated graphene electrochemical sensor for the ultrasensitive analysis of avian influenza virus H7
Cao et al. Ultrasensitive luminol electrochemiluminescence for protein detection based on in situ generated hydrogen peroxide as coreactant with glucose oxidase anchored AuNPs@ MWCNTs labeling
Darain et al. Disposable amperometric immunosensor system for rabbit IgG using a conducting polymer modified screen-printed electrode
Wu et al. Digital single virus electrochemical enzyme-linked immunoassay for ultrasensitive H7N9 avian influenza virus counting
CN109828006B (zh) 一种检测甲基化rna的光电化学传感器及其检测方法
CN105044171B (zh) 一种纳米铂掺杂/酶修饰碳糊电极的制备方法及应用
Viet et al. Gold-linked electrochemical immunoassay on single-walled carbon nanotube for highly sensitive detection of human chorionic gonadotropinhormone
CN108593727A (zh) 一种用于检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学传感器及其检测方法
Mao et al. A new electrochemiluminescence immunosensor based on Ru (bpy) 32+-doped TiO2 nanoparticles labeling for ultrasensitive detection of human chorionic gonadotrophin
Jiang et al. Electrochemical cloth-based DNA sensors (ECDSs): A new class of electrochemical gene sensors
CN109709170B (zh) 一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法
Shan et al. Sensitive electrogenerated chemiluminescence peptide-based biosensor for the determination of troponin I with gold nanoparticles amplification
Wang et al. Determination of glucose in human stomach cancer cell extracts and single cells by capillary electrophoresis with a micro-biosensor
Liao et al. Electrochemiluminescence quenching via capture of ferrocene-labeled ligand-bound aptamer molecular beacon for ultrasensitive detection of thrombin
Cheng et al. A sensitive homogenous aptasensor based on tetraferrocene labeling for thrombin detection
He et al. An ultrasensitive electrochemiluminescence immunoassay based on supersandwich DNA structure amplification with histidine as a co-reactant
Wang et al. Modulated light-activated electrochemistry at silicon functionalized with metal-organic frameworks towards addressable DNA chips
Islam et al. A mediator free amperometric bienzymatic glucose biosensor using vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs)
CN106568820A (zh) 基于dna信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用
CN107091872B (zh) 一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用
Schüler et al. Screen printing as cost-efficient fabrication method for DNA-chips with electrical readout for detection of viral DNA
CN104614417B (zh) 一种用于糖蛋白检测的电化学方法
Yang et al. The preparation of reagentless electrochemical immunosensor based on a nano-gold and chitosan hybrid film for human chorionic gonadotrophin
Zhang et al. Peptide-modified nanochannel system for carboxypeptidase B activity detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200324

Termination date: 20210428

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee