CN115032247B - 一种基于硼氟(bodipy)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法 - Google Patents
一种基于硼氟(bodipy)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于硼氟(BODIPY)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法，属于新型功能材料、电化学发光传感领域。将溴代硼氟二吡咯荧光体（BPBF）作为发光材料，并且将双稳态自旋交叉铁(II)配合物[Fe(atrz)3]Cl2（artz=4‑氨基‑1,2,4‑三氮唑）标记在免疫传感器上，借助于分子间氢键相互作用组装成三维超分子网络多孔结构，有效增加裸露活性位点。Fe(II)聚合物中的氨基不但可以有效连接抗体，而且可作为反应平台并参与共反应物S2O8 2‑的反应，大大提高了生物传感器的灵敏度。本发明对PSA的线性检测范围为0.1 fg/mL~10 ng/mL，检测限0.03 fg/mL。
Description
技术领域
本发明属于涉及一种用于PSA检测的基于纳米级硼氟二吡咯(BODIPY)有机发光体的电化学发光免疫传感器；具体说是以BODIPY衍生物有机小分子BPBF作为发光材料，以一维配位聚合物[Fe(atrz)3]Cl2为标记物的猝灭型免疫传感器。
背景技术
监测亚健康体质的发展状况、早期癌症筛查及辅助治疗对人类健康是极其重要的；PSA由糖蛋白组成（93%的肽，7%的糖），是监测前列腺癌和乳腺癌的重要生物标志物，然而，目前面临的问题是，疾病筛查通常在专门的实验室使用大型自动化仪器进行，因此，研发适合PSA检测的便携式仪器与操作简便、低成本的筛查技术仍是我们需要突破的难题。
电化学发光(ECL)检测技术因其简单、快速和高灵敏度，在疾病预检、单细胞分析、食品安全分析和环境保护等方面受到广泛关注，与化学发光类似，ECL检测技术在检测过程中也不需要增加额外的光源，而且可以有效降低背景信号，因此具有更高的灵敏度；此外，ECL检测信号是在电极表面产生的，而且发光的位置可以有效控制，这都非常有利于提高检测的灵敏度和选择性。
目前，寻找和选择合适的发光体仍然是ECL技术发展的关键因素之一；在已报道的ECL测试技术中，所使用的发光体大多集中在成分复杂的无机材料和金属有机框架材料等；与上述发光体系相比，不含金属的纯有机发光材料具有易功能化、生物相容性好、生物毒性低等优点，在生物传感中具有巨大的潜在应用前景，其中，纳米级硼氟双吡咯（BODIPY）类有机发光体能够将发射波长调至长波甚至近红外发射且能够调节电子的转移状态，使最高占位分子轨道(HOMO)和最低未占位分子轨道(LUMO)的能量发生变化，从而产生优异的发光特性。
除了发光物质之外，ECL淬灭剂对于ECL检测系统的构建也起着至关重要的作用，一维自旋交叉配位聚合物[Fe(atrz)3]Cl2（atrz = 4-氨基-1,2-4-三唑），可以借助于分子间氢键相互作用组装成三维超分子网络多孔结构，有效增加了裸露活性位点，Fe(II)聚合物中的氨基不但可以有效连接抗体，而且整个分子可以作为反应平台并参与共反应物S2O8 2-的反应，简化传感器的组成和制备。
发明内容
本发明的目的之一是制备一种以有机发光体BODIPY衍生物BPBF为发光体，以[Fe(atrz)3]Cl2为二抗标记物的猝灭型免疫传感器（图1）。
本发明的目的之二是将该传感器用于PSA的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于硼氟(BODIPY)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法如下：
（1）将直径为4 mm的玻璃碳电极用氧化铝精细抛光后，用超纯水和乙醇冲洗；
（2）取6 μL、浓度为1~7 mg/mL的BPBF滴在电极表面，室温晾干；
（3）滴加8 μL、浓度为6~12 mg/mL的PSA抗体Ab1溶液标准于玻碳电极表面，并在4℃冰箱中保存孵育；
（4）滴加8 μL、质量分数为1~2%的BSA溶液阻断非特异性活性位点；
（5）滴加8 μL、浓度为6~12 mg/mL的0.001pg/mL～200 ng/mL的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液滴涂在玻碳电极上，4ºC冰箱中保存孵育；
（6）滴加8 μL、浓度为6~12 mg/mL的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物于玻碳电极表面，4ºC冰箱中保存孵育,即制得检测PSA的电致发光免疫传感器。
本发明的有益效果为：
（1）解决大多数疾病预检中电致发光（ECL）传感器通常要经过各种复杂的化学修饰的问题，首次实现了以BODIPY衍生物BPBF为发光物质，以双稳态铁（II）配合物为ECL猝灭剂，搭建了超敏感和简易组成的免疫传感器；
（2）首次以BODIPY衍生物BPBF作为发光物质，BPBF成膜性强，可固定大量抗体；
（3）首次将双稳态自旋交叉铁(II)配合物[Fe(atrz)3]Cl2(artz = 4-氨基-1,2-4-氮唑)标记在免疫传感器上, 作为反应平台并参与共反应物（S2O8 2-）的反应，进而提高了合成的生物传感器的灵敏度；
（4）借助于[Fe(atrz)3]Cl2分子间氢键相互作用组装成三维超分子网络多孔结构，有效增加了裸露活性位点；
（5）本发明采用BODIPY衍生物BPBF及[Fe(atrz)3]Cl2构建的超灵敏电致化学发光免疫传感器，可应用于PSA的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.001pg/mL~200ng/mL）和检出限低（0.3 fg/mL）的优点。
附图说明
图1电化学发光免疫传感器的构建过程图。
图2本发明所得BPBF的电镜图（2A）、[Fe(atrz)3]Cl2透射电镜图（2B）。
图3为试验标准曲线的建立。
具体实施方式
实施例1一种基于硼氟(BODIPY)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻璃碳电极用氧化铝精细抛光后，用超纯水和乙醇冲洗；
（2）取6 μL、浓度为0.5 mg/mL的BPBF滴在电极表面，置于室温条件下晾干；
（3）滴加8 μL、浓度为5 mg/mL的PSA抗体Ab1溶液标准于玻碳电极表面，并在4℃冰箱中保存孵育；
（4）滴加8 μL、质量分数为1%的BSA溶液阻断非特异性活性位点；
（5）滴加8 μL、浓度为0.001pg/mL～200 ng/mL的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液滴涂在玻碳电极上，放置在4ºC冰箱中保存孵育；
（6）滴加8 μL、浓度为3 mg/mL的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物于玻碳电极表面，放置在4ºC冰箱中保存孵育,即制得检测PSA的电致发光免疫传感器。
实施例2一种基于硼氟(BODIPY)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法；
（1）将直径为4 mm的玻璃碳电极用氧化铝精细抛光后，用超纯水和乙醇冲洗；
（2）取6 μL、浓度为1 mg/mL的BPBF滴在电极表面，置于室温条件下晾干；
（3）滴加8 μL、浓度为10 mg/mL的PSA抗体Ab1溶液标准于玻碳电极表面，并在4℃冰箱中保存孵育；
（4）滴加8 μL、质量分数为2 %的BSA溶液阻断非特异性活性位点；
（5）滴加8 μL、浓度为0.001pg/mL～200 ng/mL的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液滴涂在玻碳电极上，放置在4ºC冰箱中保存孵育；
（6）滴加8 μL、浓度为3 mg/mL的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物于玻碳电极表面，放置在4ºC冰箱中保存孵育,即制得检测PSA的电致发光免疫传感器。
实施例3一种基于硼氟(BODIPY)发光体的电化学发光免疫传感器制备方法；
（1）将直径为4 mm的玻璃碳电极用氧化铝精细抛光后，用超纯水和乙醇冲洗；
（2）取6 μL、浓度为3 mg/mL的BPBF滴在电极表面，置于室温条件下晾干；
（3）滴加8 μL、浓度为11 mg/mL的PSA抗体Ab1溶液标准于玻碳电极表面，并在4℃冰箱中保存孵育；
（4）滴加8 μL、质量分数为1%的BSA溶液阻断非特异性活性位点；
（5）滴加8 μL、浓度为0.001pg/mL～200 ng/mL的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液滴涂在玻碳电极上，放置在4ºC冰箱中保存孵育；
（6）滴加8 μL、浓度为3 mg/mL的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物于玻碳电极表面，放置在4ºC冰箱中保存孵育,即制得检测PSA的电致发光免疫传感器。
实施例4制备BPBF以及[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物
将2,4-二甲基吡咯（4.8 mL）和4-溴苯甲醛（4410 mg）溶解在500毫升的二氯甲烷中，并在氮气环境下逐渐加入几滴三氟乙酸。上述溶液在室温下保持搅拌10小时，然后在减压条件下将溶剂部分蒸馏掉。将2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(10 mM)加入溶液中，搅拌1小时，然后慢慢加入三乙胺(24 mL)。随后，分几次加入三氟化硼醚（24 mL）。搅拌7小时后，用Na2SO4干燥溶液并蒸发所有溶剂。通过柱色谱法精制产品，收集的红色部分从氯仿/正己烷（1:4 v/v）中重结晶，得到最终的预期材料其扫描电镜（SEM）见图2A;
将25 mmol的四水合氯化铁和52 mmol的4-氨基-4H-1,2,4-三唑在研钵中进行研磨，研磨30分钟后得到干燥的紫色粉末，随后使用质量分数为2%的L-抗坏血酸的溶液洗涤所得粉末，过滤后并在真空干燥箱中干燥，制得[Fe(atrz)3]Cl2，其透射电镜（TEM）见图2B；将2 mg [Fe(atrz)3]Cl2分散在500 μL、pH = 7.5的PBS溶液中，并与20 mmol EDC和10 mmolNHS在4℃下混合2小时；通过离心收集形成的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2复合物，并用PBS溶液进行洗涤；之后，将上述获得的产品与100 μL牛血清白蛋白1~3％的BSA混合，并在4℃下振动6小时，以阻断[Fe(atrz)3]Cl2表面的非特异性活性位点；最终产品用PBS溶液冲洗，以清理未反应的BSA，然后重新分散在1毫升、pH = 7.5的PBS溶液中，将上述溶液被储存在冰箱中以备进一步使用。
实施例5 PSA的检测
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置如下：光电倍增管的高压设置为650 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（3）电化学工作站参数设置如下：循环伏安扫描电位范围为-0.3 V～-2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含0.1 M KCl和70 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的PSA产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH = 7.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）测定一系列不同浓度的PSA对应的电致发光信号的大小，建立电致发光信号与PSA浓度之间的线性关系, 见图3；根据该定量关系即可测定未知样品中PSA的浓度。
实施例6
应用实施例1、2和3构建的传感器按照实施例5的检测方法对PSA进行了检测，测得传感器的线性检测范围为0.001pg/mL~200 ng/mL，检测限为0.3 fg/mL。
Claims (6)
1.一种基于氟化硼二吡咯的发光体的电化学发光免疫传感器制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝精细抛光后，用超纯水和乙醇冲洗；
(2)取6μL、浓度为1～7mg/mL的BPBF滴在电极表面，置于室温条件下晾干；
(3)滴加8μL、浓度为6～12mg/mL的PSA抗体Ab1标准溶液于玻碳电极表面，并在4℃冰箱中保存孵育；
(4)滴加8μL、质量分数为1～2％的BSA溶液阻断非特异性活性位点；
(5)滴加8μL、浓度为6～12mg/mL的0.1fg/mL～10ng/mL的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液滴涂在玻碳电极上，放置在4℃冰箱中保存孵育；
(6)滴加8μL、浓度为6～12mg/mL的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物于玻碳电极表面，放置在4℃冰箱中保存孵育,即制得检测PSA的电致发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于氟化硼二吡咯的发光体的电化学发光免疫传感器制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的BPBF及[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2生物结合物制备方法如下：
将4～10mL的2,4-二甲基吡咯和4000～5000mg的4-溴苯甲醛溶解在二氯甲烷中，并在氮气环境下逐渐加入几滴三氟乙酸；
上述溶液在室温下保持搅拌5-10小时，然后在减压条件下将溶剂部分蒸馏掉；
将7～12mM的2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌加入溶液中，搅拌1小时，然后慢慢加入20～30mL的三乙胺；
随后，分批次加入20～30mL的三氟化硼醚；
搅拌7小时后，用Na2SO4干燥溶液并蒸发所有溶剂；
通过柱色谱法精制产品，收集的红色部分从体积比为1：4的氯仿/正己烷中重结晶，得到BPBF；将20～40mmol的四水合氯化亚铁和50～80mmol的4-氨基-4H-1,2,4-三唑在研钵中研磨，研磨30分钟后得到干燥的紫色粉末，随后使用质量分数为1～5％的L-抗坏血酸的溶液洗涤所得粉末，过滤后并在真空干燥箱中干燥，制得[Fe(atrz)3]Cl2；将1～3mg[Fe(atrz)3]Cl2分散在500μL、pH＝7.5的PBS溶液中，并与20mmol EDC和10mmol NHS在4℃下混合2小时；通过离心收集形成的[Fe(atrz)3]Cl2-Ab2复合物，并用PBS溶液进行洗涤；之后，将洗涤后的Fe(atrz)3]Cl2-Ab2复合物与100μL牛血清白蛋白1～3％的BSA混合，并在4℃下振动6小时，以阻断[Fe(atrz)3]Cl2表面的非特异性活性位点；最终产品用PBS溶液冲洗，以清理未反应的BSA，然后重新分散在1mL、pH＝7.5的PBS溶液中，将上述溶液储存在冰箱中以备进一步使用。
3.根据权利要求2所述的一种基于氟化硼二吡咯的发光体的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述PBS溶液，用0.1M Na2HPO4和0.1M KH2PO4配制组成，用浓度为40～140mM K2S2O8调节其酸碱值，使其处于pH＝5.0～8.5的范围内。
4.根据权利要求1所述制备方法制备的电致化学发光传感器的应用方法，其用于人体血清中PSA浓度的检测。
5.根据权利要求1所述的一种基于氟化硼二吡咯的发光体的电化学发光传感器的制备方法所获得的传感器，其特征在于：所述步骤(5)中的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液的配置条件为，从上海领潮生物科技有限公司购得的0.8mg/mL的PSA溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。
6.一种PSA的检测方法，其特征在于，检测步骤如下：
(A)将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、根据权利要求1的制备方法制备的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
(B)化学发光检测仪参数设置光电倍增管的高压设置为650V，扫描速率设置为0.1V/s；
(C)电化学工作站参数设置如下：循环伏安扫描电位范围为-0.3V～-2V，扫描速率设置为0.1V/s；
(D)测定权利要求5所述的一系列浓度梯度的PSA的标准溶液中不同浓度的PSA对应的电致发光信号强度的大小，建立电致发光信号强度与PSA浓度之间的线性关系；
(E)根据权利要求6步骤(D)中建立的电致发光信号强度与PSA浓度之间的线性关系即可测定未知样品中PSA的浓度。
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