CN112649607B - 一种夹心免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种夹心免疫试剂盒，包括工作电极、抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)、待测样品和G‑Chi‑Au/Pt‑AIV H9/PAb纳米复合物；所述的工作电极的制备方法为将玻碳电极打磨至镜面后洗净，再分别依次在水、乙醇、水中超声清洗，用N2吹干，然后在H2SO4溶液中用循环伏安进行扫描，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用水洗净，N2吹干，用G‑Chi纳米复合物涂到吹干后所得GCE表面，自然晾干，即得工作电极。本发明所构建的夹心免疫试剂盒，具有很高的敏感性，对AIV H9检测的敏感性达100.82EID50/mL。

Description

一种夹心免疫试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及夹心免疫检测分析技术领域，特别涉及一种夹心免疫试剂盒及其应用。
背景技术
禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒。AIV囊膜表面有2种糖蛋白纤突，分别是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。按照两种纤突的抗原性不同，AIV分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)。依据不同AIV毒株对鸡致病性的强弱，可以将AIV分为高致病性禽流感(HPAIV)、低致病性禽流感(LPAIV)和非致病性禽流感(NPAIV)。H9亚型禽流感病毒(AIV H9)为LPAIV，AIV H9感染后不会出现群体大批死亡，然而感染率一直高居不下，并会导致产蛋率大幅度下降、肉鸡的生长发育迟缓等，因此，给养禽业带来巨大的经济损失。
目前检测AIV H9的主要方法有病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验(HA-HI试验)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR等。但这些方法各有不足之处，如病毒分离鉴定及HA-HI试验所耗时较长，不适应临床快速诊断的要求，RT-PCR技术复杂且电泳时需要接触EB等有害物质，实时荧光定量PCR所需仪器和试剂昂贵，这些不足阻碍了它们的在临床诊断上的应用。近年来，一项新的生物传感器技术已经成功应用于环境成份分析、食品工业质检测和临床医学诊断等领域。生物传感器技术具有操作简便快速和反应灵敏特异等优点。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种夹心免疫试剂盒及其应用，采用甲壳胺修饰石墨烯，制成石墨烯-甲壳胺复合物(G-Chi)和石墨烯-甲壳胺-Au/Pt复合物(G-Chi-Au/Pt)，从而建立一种简便、快速、灵敏的电化学免疫的试剂盒，用以检测AIV H9。电化学免疫传感器是将免疫检测技术与电化学传感技术相结合，构建而成的一种新型生物传感器。它同时具备了免疫测定法的高特异性和电化学传感技术的高敏感性，可用于痕量病毒的分析检测。本发明首次提出以G-Chi作为传感器平台，以G-Chi-Au/Pt作为传感器的信号放大材料，为AIV H9检测提供了一种特异、敏感和快速的新型检测诊断方法，对AIV H9有效防控具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种夹心免疫试剂盒，包括工作电极、抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)、待测样品和G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物；
优选地，所述的工作电极的制备方法为将玻碳电极(GCE,
Figure BDA0002851659620000021
)以0.05μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别依次在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min,用N2吹干，然后在0.5mol·L-1H2SO4溶液(扫描前通入N2除氧15min)中用循环伏安进行扫描，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干，用移液枪移取10μL G-Chi纳米复合物涂到吹干后所得GCE表面，4℃下自然晾干，即得工作电极，待用。
优选地，所述G-Chi纳米复合物的制备为：将0.3g的甲壳胺(Chi)加入到300mL1.0％(V/V)醋酸溶液中，在室温条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将300mg的石墨烯(G)加入到300mL以上的甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的G-Chi(1mg/mL)悬浊液，即为G-Chi纳米复合物；
优选地，所述G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物的制备方法为移取10mL G-Chi-Au/Pt纳米复合物，加入500μL抗AIV H9多克隆抗体(AIV H9/PAb)，400μL 5wt％BSA溶液，在4℃冰箱内反应过夜，用二次去离子水反复离心(10000r/min,10min)洗涤3次，即得G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物。
优选地，所述G-Chi-Au/Pt纳米复合物的制备为：取1mL HAuCl4(10mmol/L)、1mLK2PtCl4(10mmol/L)溶液加入上述所得G-Chi(20mL)悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到G-Chi-Au/Pt纳米复合物，Au:Pt:G质量比为2:2:20。
优选地，所述的石墨烯(G)的制备，根据Hummer方法改进后制得G，实验步骤如下：冰水浴条件下加入1g石墨粉、2.5g KNO3、100mL H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾，随后置于35℃水浴反应2h，加入100mL去离子水，于95℃继续反应1h，观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL蒸馏水，并加入H2O2(质量分数为30％)中和未反应的高锰酸钾，然后用0.5mol/L的HCl洗涤，再用二次去离子水反复离心洗涤5次，真空干燥，即得氧化石墨，称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去二次去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯(GO)，再以NaBH4作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯(G)。
采用如上所述夹心免疫试剂盒检测H9亚型禽流感病毒(AIV H9)的方法：取工作电极，然后滴涂抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)反应，再浸泡牛血清蛋白(BSA)溶液封闭，取出用二次去离子水洗净，最后滴涂待测样品反应，再滴涂G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物反应，用二次去离子水反复洗涤3次，磷酸缓冲盐溶液中进行计时电流扫描(CA)，50S加入双氧水(H2O2)；对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，结果检测的电流值大于0.974mA时说明检测到H9。
优选地，所述的AIV H9单克隆抗体浓度为10μg/mL，用量为10μL；滴涂抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)置于4℃下反应8小时。
优选地，再浸泡200μL 1wt％牛血清蛋白(BSA)溶液37℃下封闭1h。
优选地，最后滴涂15μL待测样品37℃下反应40min，再滴涂15μL G-Chi-Au/Pt-AIVH9/PAb纳米复合物置于密闭湿润盒内,然后于37℃温箱内反应60min。
优选地，所述的磷酸缓冲盐溶液为浓度为0.01mol·L-1，用量为10mL，所述磷酸缓冲盐溶液为含0.1mol·L-1KCl，pH＝7.0的磷酸缓冲盐溶液，即PBS溶液；所述的双氧水浓度为10moL/L，用量为10μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明夹心免疫试剂盒，当待测样品为阳性时，AIV H9与AIV H9/MAb及AIV H9/PAb特异结合(夹心免疫反应)，G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物被固定到电极的表面，Au/Pt能有效的催化底物H2O2,通过计时电流法(CA)监测其催化反应时的电流信号，从而达到对AIV H9有效检测；敏感性结果表明，本发明所构建的夹心免疫试剂盒，具有很高的敏感性，对AIV H9检测的敏感性达100.82EID50/mL。
附图说明
图1是各纳米复合材料的形貌及化学表征：其中(a)为本发明制备所得石墨烯(G)投射电镜(TEM)图；(b)本发明制备所得G-Chi-Au/Pt纳米复合物投射电镜(TEM)图；(c)为射线能谱仪(EDS)对本发明制备所得G和G-Chi-Au/Pt纳米复合物的元素分析所得图谱。
图2为固定不同修饰材料的玻碳电极在10mM PBS(含5mM K4Fe(CN)6+5mM K3Fe(CN)6+0.1M KCl,pH 7.0)混合溶液中的交流阻抗；其中，左图是交流阻抗的奈奎斯特图，右图是交流阻抗的奈奎斯特图的半径与电极的关系；(a)玻碳电极(GCE)，(b)G-Chi-GCE，(c)MAb/AIV H9-G-Chi–GCE，(d)BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE。
图3不同信号标记物下的免疫传感器检测过程计时电流法；其中，左图是计时电流法时间与电流关系，右图是电流与不同信号标记物下的免疫传感器关系；(a)blank，(b)Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9，(c)G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9。
图4为信号标记物的组分及用量优化；其中，左图为计时电流法时间与电流关系，右图为电流与不同组分及用量信号标记物下的免疫传感器关系。
图5为测试底液pH值优化结果。
图6为H2O2含量对检测结果的影响。
图7为AIV H9孵育时间对检测结果的影响。
图8为G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9孵育时间对检测结果的影响。
图9(A)不同浓度AIV H9病毒的计时电流曲线图，其中各曲线分别为(a)100.37EID50,(b)101.37EID50,(c)102.37EID50,(d)103.37EID50,(e)104.37EID50,(f)105.37EID50,(g)106.37EID50；图9(B)为电流和AIV H9含量的线性关系图。
图10为本发明实施例1所制备的夹心免疫试剂盒对其它病原体及可能的干扰物进行特异性试验所得结果。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
下列实施例中使用的主要试剂HAuCl4,K2PtCl4及牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA,)、葡萄糖(Glucose,1.0μg/mL)、维生素C(Vitamin C,1.0μg/mL)购自Sigma公司；KMnO4、K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、H2SO4、CH3CH2OH、甲壳胺、十二水合柠檬酸三钠和等均为国产分析纯；
抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)由广西兽医研究所制备(邓显文,谢芝勋,谢志勤,刘加波,庞耀珊,谢丽基,范晴,罗思思,黄莉,黄娇玲,曾婷婷,张艳芳,H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定.南方农业学报.2016,04:679-683)；
抗AIV H9多克隆抗体(AIV H9/PAb)用广西兽医研究所实验室保存的H9N2(毒株名称：A/Chicken/Guangxi/DX/2008(H9N2))用0.2％甲醛灭活后，免疫SPF鸡制备得到；
灭活的AIV H1、AIV H2、AIV H3、AIV H4、AIV H5、AIV H6、AIV H7、AIV H8、AIVH10、AIV H11、AIV H12、AIV H13、AIV H14、AIV H15、AIV H16、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、传染性支气管炎(Infectous bronchitisvirus,IBV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)，由广西兽医研究所生物技术实验室保存。
实施例中使用的石墨烯(G)的制备方法为根据Hummer方法改进后制得G，实验步骤如下：冰水浴条件下加入1g石墨粉、2.5g KNO3、100mL H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾，随后置于35℃水浴反应2h，加入100mL去离子水，于95℃继续反应1h，观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL蒸馏水，并加入H2O2(质量分数为30％)中和未反应的高锰酸钾，然后用0.5mol/L的HCl洗涤，再用二次去离子水反复离心洗涤5次，真空干燥，即得氧化石墨，称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去二次去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯(GO)，再以NaBH4作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯(G)，对所得石墨烯通过投射电镜(TEM)扫描，结果如图1(a)所示。
实施例1
G-Chi纳米复合物和G-Chi-Au/Pt纳米复合物的制备：
(1)将0.3g的甲壳胺(Chi)加入到300mL 1.0％(V/V)醋酸溶液中，在室温条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将300mg的石墨烯(G)加入到300mL以上的甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的G-Chi(1mg/mL)悬浊液，即为G-Chi纳米复合物，备用；
(2)取1mL HAuCl4(10mmol/L)、1mL K2PtCl4(10mmol/L)溶液加入到步骤(1)所得G-Chi(20mL)悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到G-Chi-Au/Pt纳米复合物(Au:Pt:G约为2:2:20)，备用，对所得G-Chi-Au/Pt纳米复合物通过投射电镜(TEM)扫描、射线能谱仪(EDS)扫描进行元素分析，结果如图1(b)和图1(c)所示；其它含量的G-Chi-Au/Pt纳米复合物用相同的方法通过在G-Chi(20mL)悬浊液中加入不同体积的HAuCl4(10mmol/L)、K2PtCl4(10mmol/L)溶液制备得到。
G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物的制备方法为：移取10mL上述备用的G-Chi-Au/Pt纳米复合物，加入500μL抗AIV H9多克隆抗体(AIV H9/PAb)，400μL 5wt％BSA溶液，在4℃冰箱内反应过夜，用二次去离子水反复离心(10000r/min,10min)洗涤3次，即得G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物，备用。
工作电极的制备方法为：将玻碳电极(GCE,
Figure BDA0002851659620000061
)以0.05μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别依次在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min，用N2吹干，然后在0.5mol·L-1H2SO4溶液(扫描前通入N2除氧15min)中用循环伏安进行扫描，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干，用移液枪移取10μL上述备用的G-Chi纳米复合物涂到吹干后所得GCE表面，4℃下自然晾干，即得工作电极，待用。
一种夹心免疫试剂盒，包括上述待用的工作电极、抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)、待测样品和上述备用的G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物；
采用夹心免疫试剂盒检测H9亚型禽流感病毒(AIV H9)的方法：取上述备用的工作电极，然后滴涂10μL 10μg/mL抗AIV H9单克隆抗体(AIV H9/MAb)置于4℃下反应8小时，再浸泡200μL 1wt％牛血清蛋白(BSA)溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，最后滴涂15μL待测样品37℃下反应40min，再滴涂15μL上述备用的G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物置于密闭湿润盒内,然后于37℃温箱内反应60min，用二次去离子水反复洗涤3次，10mL 0.01mol·L-1磷酸缓冲盐溶液(PBS(含0.1mol·L-1KCl，pH＝7.0)溶液)中进行计时电流扫描(CA)，50S加入10μL双氧水(H2O2(10moL/L))；对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，结果检测的电流值大于0.974mA时说明检测到H9。
检测与分析
1、从图1(a)可以观察到G的表面有明显的褶皱结构，图1(b)表均匀的分布着Au/Pt纳米粒子，粒径10nm左右，并且G-Chi-Au/Pt纳米复合物EDS检测到C、Au及Pt元素(Cu为背景元素)，证明Au/Pt成功组装到G表面上。
2、电极修饰及检测过程的电化学表征：电化学交流阻抗(EIS)可以有效的用于表征修饰电极的表面，半圆出现在高频区，半圆的直径反应电极表面的电子转移电阻(electron-transfer resistance,Ret)，半圆的直径越大，其对应电极表面的Ret值越大，反之亦然；直线将出现在低频区，反应电极表面扩散过程，图2为固定不同修饰材料的玻碳电极在10mM PBS(含5mM K4Fe(CN)6+5mM K3Fe(CN)6+0.1M KCl,pH 7.0)混合溶液中的交流阻抗图(电解液：5mM Fe(CN)6 3-/4-+0.1M KCl+0.01M PBS(pH 7.0))；其中图2左图中a曲线为玻碳电极(Glassy carbon electrocle,GCE)的交流阻抗图，图中出现一个小半圆，而当玻碳电极上修饰了G-Chi(图2左图中b曲线)后，其交流阻抗图又出现一条直线，没有出现半圆，这是因为G具有很好的导电性，提高了电极表面的电子传递的能力，其电极表面的电阻很小，出现一条直线，说明电极表面受扩散控制；图2左图中c曲线为AIV H9单克隆抗体修饰(MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)后的交流阻抗图；图2左图中d曲线为BSA封闭(BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)后的交流阻抗图，从上述曲线b-d均可看出，其阻抗半径依次递增，其电阻依次增加，主要是由于AIV H9亚型禽流感病毒单克隆抗体、BSA阻碍了电极表面的电子转移，说明AIV H9亚型禽流感病毒单克隆抗体、BSA均已成功的修饰于电极的表面。
3、采用计时电流法(Chronoamperometry,CA)对本发明制备所得夹心免疫试剂盒的检测过程进行表征，使用同一批次制备的工作电极(BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)与106.37EID50/mL AIV H9孵育40min后，分别于100μL PBS(blank)、Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9及G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9孵育60min后，置于10mL PBS(0.01M,pH 7.0)测试底液中进行计时电流扫描，于50Sec左右加入10μL H2O2(10mM)，结果如图3所示；当传感器没有信号标记物时，加入H2O2时，电流只发生微小的变化(图3左图a曲线)，和使用信号标记物Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9及G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9对比电流变化可以忽略不计(作为背景信号)；使用G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9(图3左图c曲线)作为信号标记物引起的电流变化比Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9(图3左图b曲线)高1.5倍，这是因为G具有大的比表面积和高的导电能力，因此发明使用G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9作为夹心免疫试剂盒的信号标记物。
4、采用实施例1所示方法制备不同金属比例含量(Au:Pt:G质量比例分别为1：0：20，0：1：20，2：0：20，4：0：20，0：2：20，0：4：20，1：1：20，2：1：20，1：2：20，4：4：20，2:2:20)的G-Chi-Au-PAb/AIV H9、G-Chi-Pt-PAb/AIV H9及G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9作为信号标记物，使用同一批次制备的工作电极(BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)与106.37EID50/mL AIV H9孵育40min后，再与不同金属比例含量(Au:Pt:G质量比例分别为1：0：20，0：1：20，2：0：20，4：0：20，0：2：20，0：4：20，1：1：20，2：1：20，1：2：20，4：4：20，2:2:20)的G-Chi-Au-PAb/AIV H9、G-Chi-Pt-PAb/AIV H9及G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9复合物孵育60min后，置于10mL PBS(0.01M,pH 7.0)测试底液中进行计时电流扫描，于50Sec左右加入10μL H2O2(10mM)。结果如图4所示，当G-Chi-Au-PAb/AIV H9、G-Chi-Pt-PAb/AIV H9作为信号标记物时，电化学信号随着Au、Pt含量的增加而升高，金属含量相同条件下G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9的响应电流值明显比G-Chi-Au-PAb/AIV H9、G-Chi-Pt-PAb/AIV H9高，证明Au/Pt合金对H2O2的催化能力远高于单独的Au及Pt，从图中可以看出Au；Pt:G的质量比为2：2:20时，其响应电流值最大。由此可知，信号标记物是影响传感器灵敏度最重要的因素。
5、按照实施例1所示方法制备各工作电极，使用同一批次制备的工作电极(BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)与106.37EID50/mL AIV H9孵育40min后，再与G-Chi-Au/Pt-PAb/AIVH9(Au；Pt:G的质量比为2：2:20)复合物孵育60min后，分别置于含10mM H2O2不同pH值的PBS进行CA测试，结果如图5所示，pH 6.0～7.0时响应电流随着pH值升高而升高，pH 7.0～8.0时响应电流随着pH值升高而降低，因此pH值为7.0为最佳。
6、按照实施例1所示方法制备各工作电极，使用同一批次制备的工作电极(BSA-MAb/AIV H9-G-Chi–GCE)与106.37EID50/mL AIV H9孵育40min后，再与G-Chi-Au/Pt-PAb/AIVH9(Au；Pt:G的质量比为2：2:20)复合物孵育60min后，置于10mL pH 7.0的PBS进行CA测试，每间隔50S加入2μL H2O2(10moL/L)，结果如图6所示，响应电流值随着H2O2含量的增加而升高，当H2O2的浓度达到10mmoL/L时其响应电流达到最大。
7、电极滴涂了AIV H9后在37℃条件下依次反应10,20,30,40,50,60min，然后滴涂了根据实施例1方法制备所得G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9纳米复合物后在37℃条件下60min，置于10mL pH 7.0的PBS进行CA测试，50S加入10μL H2O2(10moL/L)。由此得到的峰电流值和时间关系曲线(图7)显示，时间在40min内免疫电极的响应电流随着时间的延长而不断的增加，超出40min之后响应电流基本不变。此结果表明免疫反应需要时间是40min。对G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9纳米复合物的免疫反应时间进行优化，G-Chi-Au/Pt-PAb/AIV H9纳米复合物在37℃条件下依次反应10,20,30,40,50,60,70,80min，置于10mL pH 7.0的PBS进行CA测试，50S加入10μL H2O2(10moL/L)。由此得到的峰电流值和时间关系曲线(图8)显示，时间在60min内免疫电极的响应电流随着时间的延长而不断的增加，超出60min之后响应电流基本不变。此结果表明免疫反应需要时间是60min，或60min后免疫反应已基本结束。因此60min被确定为G-Chi-Cu(I)/Cu(II)-NDV/PAb纳米复合物的最佳孵育时间。
8、对病毒液含量为106.37EID50的AIV H9进行10倍倍比稀释，各取15μL用本发明夹心免疫试剂盒检测，结果在10-5稀释时仍然其响应电流值仍然明显下降，(如图9(A)中的a曲线)，其电流和AIV H9含量的线性关系方程式：I(mA)＝0.9517lg EID50·mL-1+0.1936，R＝0.9932.最低检测限为100.82EID50(图9(B))。
9、用本发明实施例1所制备的夹心免疫试剂盒对其它病原体及可能的干扰物包括：AIV H1(105.61EID50)、AIV H2(106.29EID50)、AIV H3(107.43EID50)、AIV H4(105.45EID50)、AIV H5(107.34EID50)、AIV H6(106.19EID50)、AIV H7(107.64EID50)、AIV H8(106.23EID50)、AIVH10(105.73EID50)、AIV H11(106.47EID50)、AIV H12(107.12EID50)、AIV H13(105.37EID50)、AIVH14(106.72EID50)、AIV H15(105.81EID50)、AIV H16(105.63EID50)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV,106.45EID50)、传染性支气管炎(Infectousbronchitis virus,IBV,107.93EID50)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV,106.79EID50)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,1.0μg/mL)、葡萄糖(Glucose,1.0μg/mL)、维生素C(Vitamin C,1.0μg/mL)进行特异性试验，结果如图10显示，该夹心免疫试剂盒只有在AIV H9(104.37EID50)存在时响应电流值增大，而对其它病原体及干扰物的检测其电流值与空白对照(Blank)对比几乎不发生改变，并且其他干扰物和AIV H9同时存在的下，不影响检测检测结果表明该传感器特异性良好。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (1)

1.一种夹心免疫试剂盒，其特征在于：包括工作电极、抗AIV H9单克隆抗体 AIV H9/MAb、和G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物；
所述的工作电极的制备方法为将GCE, Ø = 3 mm的玻碳电极以0.05 μm的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别依次在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5 min，用N2吹干，然后在0.5 mol·L-1 H2SO4溶液中用循环伏安进行扫描，其中扫描前通入N2除氧15min，扫描速度为50 mV/s，电压范围为-0.3~ +1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N2吹干，用移液枪移取10 μL的G-Chi纳米复合物涂到吹干后所得GCE表面，4℃下自然晾干，即得工作电极；
其中，所述G-Chi纳米复合物的制备为：将0.3g的甲壳胺Chi加入到300mL 1.0%V/V醋酸溶液中，在室温条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt%甲壳胺溶液，将300 mg的石墨烯G加入到300mL以上的甲壳胺溶液超声2 h，得到稳定的1mg/mL的G-Chi悬浊液，即为G-Chi纳米复合物；
其中，所述G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物的制备方法为移取10 mL的G-Chi-Au/Pt纳米复合物，加入500μL抗AIV H9多克隆抗体AIV H9/PAb，400μL 5wt% BSA溶液，在4℃冰箱内反应过夜，用二次去离子水10000r/min、10min反复离心洗涤3次，即得G-Chi-Au/Pt-AIV H9/PAb纳米复合物；
其中，所述的石墨烯G的制备，根据Hummer方法改进后制得G，实验步骤如下：冰水浴条件下加入1g石墨粉、2.5g KNO3、100mL H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾，随后置于35℃水浴反应2h，加入100mL 去离子水，于95℃继续反应1h，观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300mL 蒸馏水，并加入质量分数为30%的H2O2中和未反应的高锰酸钾，然后用0.5mol/L 的HCl洗涤，再用二次去离子水反复离心洗涤5次，真空干燥，即得氧化石墨，称取10mg 氧化石墨置于烧杯中，加入100mL 去二次去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯GO，再以NaBH4作还原剂，95 ℃的条件下进行还原得到石墨烯G；
其中G-Chi-Au/Pt纳米复合物的制备为：取1 mL 10 mmol/L的HAuCl4、1 mL 10 mmol/L的K2PtCl4溶液加入到上述所得20mLG-Chi悬浊液中，在室温条件下搅拌3 h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到G-Chi-Au/Pt纳米复合物，Au : Pt : G的质量比为2 : 2 : 20。
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