CN103235123A - 一种检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器及其制备方法。本发明提供了用于制备电化学免疫传感器的复合物A的制备方法，包括如下步骤：1）制备含有石墨烯和甲壳胺的悬浊液；2）将AgNO₃水溶液与所述含有石墨烯和甲壳胺的悬浊液混匀，反应，得到复合物A。本发明的实验证明，本发明制备了一种新的石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物，且将其与呼肠孤病毒抗体复合，得到抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物，通过抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物和石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物对金电极进行修饰，得到的免疫电极作为工作电极，可以不需要在测试底液中加入电化学活性物质作为电化学指示剂。

Description

一种检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器及其制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员，可感染鸡、火鸡、鸭、鹅及其它野鸟，引起病毒性关节炎、呼吸道疾病、肠道疾病、中枢神经症状和免疫抑制等多种疾病。

目前检测ARV的主要方法有ELISA、RT-PCR、半套式RT-PCR、核酸探针技术。

电化学免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的电化学传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，可用于痕量免疫原性物质的分析检测，具有很强的专一性。其工作原理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在传感器表面，通过传感技术将抗原抗体发生的免疫反应转变成可检测的电化学信号来测定样品中的目标物质。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备电化学免疫传感器的复合物A（G-Chi-Ag纳米粒子复合物）的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）制备石墨烯-甲壳胺悬浊液；

2）将AgNO₃水溶液与所述石墨烯-甲壳胺悬浊液混合，依次经加热反应和超声，得到复合物A；

所述制备石墨烯-甲壳胺悬浊液的方法包括如下步骤：

A）将甲壳胺(Chi，甲壳胺分子式为:(C₆H₁₁NO₄)n，MV:～1.5×10⁵，Viscosity:～100Mpa.S)溶于醋酸溶液中，混合，得到甲壳胺溶液；

所述醋酸溶液为冰醋酸和水混合得到的溶液；

B）将石墨烯与甲壳胺溶液混匀，超声，得到石墨烯-甲壳胺悬浊液。

上述方法中的各原料投料配比如下：所述甲壳胺：所述冰醋酸：所述石墨烯：所述AgNO₃为5g：28ml：1g：0.34g。

上述方法中，

步骤1）的A中，所述混合为25℃混匀（具体为磁力搅拌）0.5-2h，所述混合具体为25℃混匀1h；

步骤1）的B中，所述超声的条件为功率250W连续超声，所述超声的时间为1-3h，所述超声时间具体为2h；

步骤2）中，所述混合为25-28℃混匀（磁力搅拌）30-120min；所述混合具体为25℃混匀30min；

所述加热反应为所述混合得到的产物在80℃反应0.5-1h，得到加热反应产物，所述加热反应具体为所述混合得到的产物在80℃反应1h，得到加热反应产物；

所述超声为所述加热反应产物在超声功率250W下连续超声2min得到石墨烯-甲壳胺悬浊液。由上述的方法制备的复合物A也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供用于制备电化学免疫传感器的复合物B（抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物，G-Chi-Ag-ARV/MAb）的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述的复合物A和抗体在BSA水溶液中反应，得到复合物B。

上述方法中的各原料的投料质量比如下：制备所述复合物A所需的石墨烯：所述抗体为50：1；

所述BSA水溶液的质量百分含量具体为1%-5%，所述BSA水溶液的质量百分含量进一步具体为1%；

所述抗体具体为单克隆抗体或多克隆抗体（即为待测样品的单克隆抗体或多克隆抗体），所述单克隆抗体进一步具体为禽呼肠孤病毒单克隆抗体；

所述反应条件为2-8℃、反应8-24h，所述反应条件具体为4℃、反应12h。

由上述方法制备的复合物B也是本发明保护的范围。

本发明第三个目的是提供一种用于制备电化学免疫传感器工作电极的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括独立包装的上述的复合物B和复合物C（G-Chi-Au纳米粒子复合物）；

所述复合物C按照如下方法制备：将HAuCl₄水溶液与权利要求1-3中任一所述方法中的所述含有石墨烯和甲壳胺的悬浊液混合，反应，得到复合物C；

所述复合物C制备方法中的原料的投料配比具体如下：所述甲壳胺：所述冰醋酸：所述石墨烯：所述HAuCl₄为5g：28ml：1g：0.2g；

所述混合为25-28℃混匀30-120min；所述混匀具体为25℃混匀30min；

所述加热反应为将所述混合得到的产物在80℃反应0.5-2h，得到复合物C，所述加热反应具体为将所述混合得到的产物在80℃反应1h，得到复合物C。

本发明第四个目的是提供一种用于检测呼肠孤病毒电化学免疫传感器的工作电极的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将上述试剂盒中的复合物C涂到金电极表面，干燥（室温25℃下自然晾干），得到复合物C修饰金电极；

2）将待测样品涂到所述复合物C修饰金电极上，反应，得到固定待测样品金电极；

3）将BSA水溶液涂到所述固定待测样品金电极上，反应，得到BSA封闭金电极；

4）将上述的复合物B涂到所述BSA封闭金电极上，反应，得到工作电极；

上述金电极为将金电极

以0.05μm的Al₂O₃抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min,用N₂吹干；然后在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液(扫描前通入N₂除氧15min)中用循环伏安进行扫描，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3至+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N₂吹干待用，得到待修饰金电极；

步骤1）中，所述干燥为室温25℃下自然晾干；

步骤2）中，所述反应具体为2-8℃下反应8-24h，所述反应进一步具体为4℃下反应8小时；

步骤3）中，所述BSA水溶液的质量百分含量具体为1%-5%，所述BSA水溶液的质量百分含量进一步具体为1%；

所述反应具体为2-8℃下反应8-24h，所述反应进一步具体为4℃下反应12小时；

步骤4）中，所述反应具体为37℃下反应30-60min，所述反应进一步具体为37℃下反应40min。

本发明的第五个目的是提供一种利用电化学免疫传感器检测待测样品的套装产品。

本发明提供的套装产品，为包括上述的复合物B和免疫传感器，所述免疫传感器的金电极为由上述试剂盒中的复合物C修饰的金电极；

上述由上述试剂盒中的复合物C修饰的金电极按照上述检测呼肠孤病毒电化学免疫传感器的工作电极的制备方法中的步骤1）制备。

包括上述方法制备的工作电极的电化学免疫传感器也是本发明保护的范围；

或上述的复合物A、上述的复合物B、上述的试剂盒、上述方法制备的工作电极在制备用于检测呼肠孤病毒中的产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明具有如下优点：

1）本发明制备了一种新的石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物，且将其与禽呼肠孤病毒抗体复合，得到抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物（探针），将其作为电化学免疫传感器分析检测的示踪标记物可实现信号放大，大大的提高检测的灵敏度，并且该传感器不需要在测试底液中加入电化学活性物质，只需要简单的KCl溶液作为测试底液即可完成电化学检测；

2）利用石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物对金电极进行修饰，其大的比表面积和好的生物相容性为下一步的样品固定奠定良好的界面，并且其好的导电性为最后的电化学检测呼肠孤病毒提供充足的电子传递通道；

3）相对现有的电化学免疫传感器，本发明的免疫传感器还有一大突破：一般的传感器固定敏感界面之后会固定探针，用于捕获待测样品中的目标物质，通常固定在电极表面的探针在4℃下只能保存一个月，有效时间较短，很大程度上限制了免疫传感器在实际中的应用。而本发明突破了常规的思路，在固定石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物作为传感器的敏感界面后，直接滴涂待测样品，然后再与抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物探针反应，这样既可以保证了传感器特异性的前提下，提高了传感器的有效保存时间。

附图说明

图1为不同电极修饰材料的循环伏安曲线

图2为免疫电极作为工作电极在1M KCl溶液中的线性扫描伏安(LSV)图

图3为检测禽呼肠孤病毒灵敏度检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的仪器有：CHI660D电化学工作站(北京华科普天科技责任有限公司)，使用常规的三电极电化学池进行电化学测量，修饰的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，铂电极作为辅助电极。免疫传感器包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的电极系统，免疫传感器通过导线与电化学工作站相连。

实施例1、石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物、石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物和抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物的制备

1、石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物（G-Chi-Au）和石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物（G-Chi-Ag）的制备

1）石墨烯(G)的制备

根据Hummer方法改进后制备氧化石墨烯，具体步骤如下：冰水浴条件下，在200mL的烧杯中加入1g石墨粉、2.5g硝酸钾、100mL H₂SO₄，搅拌均匀后缓慢加入5g KMnO₄，随后将烧杯置于35℃水浴反应2h，逐步加入100mL去离子水，温度升至95℃继续反应1h，混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温（25℃）后加入300mL水稀释，并加入质量分数为30%的H₂O₂中和未反应的高锰酸钾，先用0.5mol/L的盐酸水溶液洗涤，再用水反复离心洗涤，真空干燥，得到氧化石墨。

称取10mg上述制备的氧化石墨置于烧杯中，加入100mL去离子水，超声（250W持续超声）1h，得到氧化石墨烯(GO)。

再以硼氢化钠(NaBH₄)作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯（G），具体如下：磁力搅拌条件下在10mL0.1mg/mL的氧化石墨烯中逐滴加入1mL1mg/mL硼氢化钠(NaBH₄)水溶液，然后升温至95℃反应30min时间，置于室温（25℃）下自然冷却后，用二次去离子水离心洗涤3次，85℃真空干燥24小时得到石墨烯。

将上述制备的石墨烯用于后期实验，也可以用商业购买的石墨烯直接制备后面的复合物。

2）G-Chi-Au纳米粒子复合物和G-Chi-Ag纳米粒子复合物的制备

A、G-Chi悬浊液的制备

将0.5g的甲壳胺(Chi，甲壳胺分子式为:(C₆H₁₁NO₄)n，MV:～1.5×10⁵，Viscosity:～100Mpa.S)加入到100mL浓度为1.0%(体积百分含量)醋酸溶液（冰醋酸溶于水中）中，室温（25℃）条件下磁力搅拌1h，得到0.5%（质量百分含量）甲壳胺溶液。其中，甲壳胺与冰醋酸的投料配比为0.5g：2.8ml。

将10mg的上述1）得到的石墨烯（G）加入到10mL0.5%（质量百分含量）甲壳胺溶液中连续超声（超声功率250W）2h，其中G：Chi的投料质量比=1：5，得到石墨烯-甲壳胺悬浊液（G-Chi悬浊液）。

B、G-Chi-Au纳米粒子复合物的制备

取0.2mL1.0%（质量百分含量）HAuCl₄水溶液加入到10ml上述A制备好的G-Chi悬浊液中室温（25℃）下混匀30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，其中甲壳胺：冰醋酸：石墨烯：HAuCl₄的投料配比为5g：28ml：1g：0.2g，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子复合物（G-Chi-Au纳米粒子复合物）。

C、G-Chi-Ag纳米粒子复合物的制备

取2mL1mM AgNO₃水溶液加入到1ml上述A制备好的G-Chi悬浊液中室温（25℃）下磁力搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，待其冷却至室温后用二次去离子水反复离心洗涤5次，最后加入1ml二次去离子水，超声（连续超声，超声功率250W）2min，其中，甲壳胺、冰醋酸、石墨烯和AgNO₃的投料配比为5g：28ml：1g：0.34g，得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物（G-Chi-Ag纳米粒子复合物）。

2、抗体-石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子复合物（G-Chi-Ag-ARV/MAb）的制备

移取1mL上述1得到的G-Chi-Ag纳米粒子复合物，加入50μL浓度为0.043mg/mlARV/MAb（由杂交瘤细胞株SF6-3K3制备得到单抗；该杂交瘤细胞株记载在禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备及特性鉴定，中国畜牧兽医，谢志勤；谢芝勋；刘加波；庞耀珊；邓显文；谢丽基；彭宜；范晴，2012年11期，47-51页，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。），200μL1%（质量百分含量）BSA水溶液，4℃下反应过夜（12h），用二次去离子水反复离心洗涤3次，最后加入1mL1%（质量百分含量）BSA水溶液于4℃保存得到的G-Chi-Ag-ARV/MAb纳米粒子复合物。

其中，制备G-Chi-Ag中的G和ARV/MAb的投料质量比为50:1。

实施例2、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器及试剂盒

一、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器

1、工作电极的制备

将金电极

以0.05μm的Al₂O₃抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min,用N₂吹干。然后在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液(扫描前通入N₂除氧15min)中用循环伏安进行扫描，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3至+1.5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，N₂吹干待用，得到待修饰金电极；

用移液枪移取8μL由实施例1的1的2）制备的G-Chi-Au纳米粒子复合物涂到待修饰金电极表面（涂满即可）,室温（25℃）下自然晾干，得到G-Chi-Au修饰金电极；

再将G-Chi-Au修饰金电极上滴涂（涂满即可）8μL待测样品置于4℃下反应8小时，得到固定待测样品金电极；

再将固定待测样品金电极上滴涂（涂满即可）15μL1%（质量百分含量）BSA水溶液4℃下封闭过夜（12小时），取出用二次去离子水洗净，得到BSA封闭金电极；

最后在BSA封闭金电极上滴涂（涂满即可）15μL G-Chi-Ag-ARV/MAb纳米粒子复合物37℃下反应40min，用二次去离子水反复离心洗涤3次，得到免疫电极，即为工作电极。

2、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器

禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器包括上述1制备的工作电极、参比电极和辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，铂电极作为对辅助电极。

3、禽呼肠孤病毒试剂盒

禽呼肠孤病毒试剂盒可以包括G-Chi-Au纳米粒子复合物和G-Chi-Ag-ARV/MAb纳米粒子复合物；也可以包括本实施例制备的工作电极，还可以包括本实施例的禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器。

实施例3、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器或试剂盒的应用

一、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的应用

1、禽呼肠孤病毒待测液的制备

禽呼肠孤病毒待测液的制备：将禽呼肠孤病毒S1133（购于中国兽药监察所，产品目录号：AV2311.）用浓度为0.1mol/L PBS（pH=7.4）缓冲溶液稀释至10^6.5EID₅₀/mL，得到10^6.5EID₅₀/mL的禽呼肠孤病毒待测液。

2、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器检测待测样品

电极表面修饰过程采用循环伏安法（CV）进行表征，同时采用线性扫描伏安法(LSV)法实现了对禽呼肠孤病毒的检测。

1）禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器中不同修饰的电极进行表征

采用工作电极制备过程中不同修饰的电极进行表征，不同修饰的电极具体分别为实施例2的一的1制备的待修饰金电极、G-Chi-Au修饰金电极、固定待测样品金电极（制备方法同实施例2的一的1中所示，其中待测样品为10^6.5EID₅₀/mL的禽呼肠孤病毒待测液）和BSA封闭金电极，铂电极作为对辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。

将上述不同的修饰电极、辅助电极和参比电极均置于含有5mM Fe(CN)₆ ^3-/4-+0.1MKCl的0.01mol/L PBS(pH7.0)缓冲溶液中进行循环伏安(CV)扫描，电化学工作站的测定参数：电位扫描范围-0.2-0.6V，扫描速率为0.05V/s。

结果如图1所示，为免疫传感器制备过程的循环伏安图，其中a为待修饰金电极的循环伏安曲线，出现氧化还原特征峰；当金电极上覆盖了一层Au-Chi-G之后的G-Chi-Au修饰金电极，其氧化还原峰电流值增加(图1b)，这是因为金纳米粒子和石墨烯的修饰有效的提高了电极表面的电子传导能力；随后，修饰电极滴涂了呼肠孤病毒液后得到的固定待测样品金电极，其循环伏安扫描的响应电流值明显下降(图1c)，这是因为呼肠孤病毒是蛋白分子物质，阻碍了电极表面的电子转移通道；BSA封闭电极表面的活性位点得到的BSA封闭金电极其电流值下降(图1d)。

2）禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器检测待测样品

按照实施例2的一的方法制备的免疫电极作为工作电极，其中，待测样品分别为禽呼肠孤病毒阳性待测样品和禽呼肠孤病毒阴性待测样品，得到阳性待测样品工作电极和阴性待测样品工作电极；其中禽呼肠孤病毒阳性待测样品为上述1制备的10^6.5EID₅₀/mL的禽呼肠孤病毒待测液，禽呼肠孤病毒阴性待测样品为将SPF鸡的咽候棉拭子溶解在浓度为0.1mol/L PBS（pH=7.4）缓冲溶液中得到的样品（SPF鸡不存在禽呼肠孤病毒）。

将阳性待测样品工作电极和阴性待测样品工作电极分别与对电极和参比电极置于1M KCl水溶液中进行线性扫描伏安法(LSV)，电化学工作站的LSV测定参数：电位扫描范围-0.15-0.25V，扫描速率为0.05V/s。

结果如图2所示，其中a为禽呼肠孤病毒阴性样品检测曲线，b为禽呼肠孤病毒阳性样品检测曲线，可以看出，b线阳性样品在0.07V处出现明显的吸收峰，而阴性样品没有出现吸收峰，根据此原理本发明的禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的工作电极可以用来特异检测出禽呼肠孤病毒，且只需要简单的KCl溶液作为测试底液即可完成电化学检测。

三、检测禽呼肠孤病毒灵敏度

1、禽呼肠孤病毒待测液的制备

对病毒含量为10^6.5EID₅₀/mL的禽呼肠孤病毒液S1133用pH=7.4、浓度为0.1mol/LPBS溶液进行10倍倍比稀释到10^6.5EID₅₀/mL-10^0.5EID₅₀/mL，各取15μL作为待测样品，然后按照实施例2的一的1制备免疫电极作为禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器工作电极。

再将禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器工作电极、饱和甘汞电极(SCE)、铂电极均放入1M KCl水溶液中用线性扫描伏安法进行电化学检测。扫描电位-0.15-0.25V,扫速：0.05V/S。

结果如图3所示（图中在出峰的位置从下到上的曲线对应的禽呼肠孤病毒液S1133浓度分别依次为10^6.5EID₅₀/mL-10^0.5EID₅₀/mL），在10^-5倍稀释（10^1.5EID₅₀/mL）时仍然可以出现明显的吸收峰，因此该免疫传感器的最低检出量为10^1.5EID₅₀/mL。

四、特异性检测

1、待测液的制备

试验中选取禽呼肠孤病毒S1133、H3N6亚型禽流感病毒（Duck/HK/526/79/2BH3N6）、H9N2亚型禽流感病毒（Duck/Guangxi/1/00H9N2）、NDV毒株GX1/00、鸡白痢沙门氏菌SE、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎IBV毒株Massachussetts41和传染性法氏囊病毒A80株进行特异性试验：

H3N6亚型禽流感病毒（Duck/HK/526/79/2B H3N6）、H9N2亚型禽流感病毒（Duck/Guangxi/1/00H9N2）均记载在：A multiplex RT-PCR for detection of typeA influenza virus and differentiation of avian H5,H7,and H9hemagglutininsubtypes；Zhixun Xie^a,*,Yao-shan Pang^a,Jiabo Liu^a,Xianwen Deng^a,XiaofeiTang^a,Jianhua Sun^a,Mazhar I.Khan^b,1,*；Molecular and Cellular Probes20(2006)245–249中；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

NDV毒株GX1/00记载在文献：陈安莉,谢芝勋,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(09):917-922；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸡白痢沙门氏菌SE购自国家兽医生物菌种管理中心，目录号：cvcc534，全称:鸡白痢沙门氏菌。

传染性喉气管炎病毒购自国家兽医生物菌种管理中心，目录号：AV22

传染性支气管炎IBV毒株Massachussetts41记载在文献：谢志勤,谢芝勋,吕华刚.等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21(6):1733-1736；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

传染性法氏囊病毒A80株购自中国兽药监察所，产品目录号：AV2321

将上述各个病毒用浓度为0.1mol/L pH值7.4PBS缓冲溶液进行稀释至病毒的含量均为1mg/ml作为待测样品。

各取15μL作为待测样品按照实施例2的一的1制备免疫电极作为禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器工作电极。

再将禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器工作电极、饱和甘汞电极(SCE)、铂电极均放入1M KCl水溶液中用线性扫描伏安法进行电化学检测。扫描电位-0.15-0.25V,扫速：0.05V/S。

结果为该传感器只对呼肠孤病毒出现预期的电位的吸收峰，其他病毒均没有出现该吸收峰，表明该传感器特异性好。

Claims (10)

1.一种用于制备电化学免疫传感器的复合物A的制备方法，包括如下步骤：

1）制备石墨烯-甲壳胺悬浊液；

2）将AgNO₃水溶液与所述石墨烯-甲壳胺悬浊液混合，依次经加热反应和超声，得到复合物A；

所述制备石墨烯-甲壳胺悬浊液的方法包括如下步骤：

A）将甲壳胺溶于醋酸溶液中，混合，得到甲壳胺溶液；

所述醋酸溶液为冰醋酸和水混合得到的溶液；

B）将石墨烯与甲壳胺溶液混匀，超声，得到石墨烯-甲壳胺悬浊液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述方法中的各原料投料配比如下：所述甲壳胺：所述冰醋酸：所述石墨烯：所述AgNO₃为5g：28ml：1g：0.34g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤1）的A中，所述混合为25℃混匀0.5-2h，所述混合具体为25℃混匀1h；

步骤1）的B中，所述超声的条件为功率250W连续超声，所述超声的时间为1-3h，所述超声时间具体为2h；

步骤2）中，所述混合为25-28℃混匀30-120min；所述混合具体为25℃混匀30min；

所述加热反应为所述混合得到的产物在80℃反应0.5-1h，得到加热反应产物，所述加热反应具体为所述混合得到的产物在80℃反应1h，得到加热反应产物；

所述超声为所述加热反应产物在超声功率250W下连续超声2min得到石墨烯-甲壳胺悬浊液。

4.由权利要求1-3中任一所述的方法制备的复合物A。

5.用于制备电化学免疫传感器的复合物B的制备方法，包括如下步骤：将权利要求4所述的复合物A和抗体在BSA水溶液中反应，得到复合物B。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中的各原料的投料质量比如下：制备所述复合物A所需的石墨烯：所述抗体为50：1；

所述BSA水溶液的质量百分含量具体为1%-5%，所述BSA水溶液的质量百分含量进一步具体为1%；

所述抗体具体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体进一步具体为禽呼肠孤病毒单克隆抗体；

所述反应条件为2-8℃、反应8-24h，所述反应条件具体为4℃、反应12h。

7.由权利要求5或6的方法制备的复合物B。

8.一种用于制备电化学免疫传感器工作电极的试剂盒，包括独立包装的权利要求7所述的复合物B和复合物C；

所述复合物C按照如下方法制备：将HAuCl₄水溶液与权利要求1-3中任一所述方法中的所述含有石墨烯和甲壳胺的悬浊液混合，加热反应，得到复合物C；

所述复合物C制备方法中的原料的投料配比具体如下：所述甲壳胺：所述冰醋酸：所述石墨烯：所述HAuCl₄为5g：28ml：1g：0.2g；

所述混合为25-28℃混匀30-120min；所述混匀具体为25℃混匀30min；

所述加热反应为将所述混合得到的产物在80℃反应0.5-2h，得到复合物C，所述加热反应具体为将所述混合得到的产物在80℃反应1h，得到复合物C。

9.一种用于检测呼肠孤病毒电化学免疫传感器的工作电极的制备方法，包括如下步骤：

1）将权利要求8所述试剂盒中的复合物C涂到金电极表面，干燥，得到复合物C修饰金电极；

2）将待测样品涂到所述复合物C修饰金电极上，反应，得到固定待测样品金电极；

3）将BSA水溶液涂到所述固定待测样品金电极上，反应，得到BSA封闭金电极；

4）将权利要求7所述的复合物B涂到所述BSA封闭金电极上，反应，得到工作电极；

步骤2）中，所述反应具体为2-8℃下反应8-24h，所述反应进一步具体为4℃下反应8小时；

步骤3）中，所述BSA水溶液的质量百分含量具体为1%-5%，所述BSA水溶液的质量百分含量进一步具体为1%；

所述反应具体为2-8℃下反应8-24h，所述反应进一步具体为4℃下反应12小时；

步骤4）中，所述反应具体为37℃下反应30-60min，所述反应进一步具体为37℃下反应40min。

10.一种利用电化学免疫传感器检测待测样品的套装产品，包括权利要求7所述的复合物B和免疫传感器，所述免疫传感器的金电极为由权利要求8所述试剂盒中的复合物C修饰的金电极；

或包括权利要求9制备的工作电极的电化学免疫传感器；

或权利要求4所述的复合物A、权利要求7所述的复合物B、权利要求8所述的试剂盒、权利要求9的方法制备的工作电极在制备用于检测呼肠孤病毒中的产品中的应用。

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