CN104297464B - 一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用 - Google Patents

一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用。该方法具体采用二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯作为抗体捕获基底，其优良的导电性和大的比表面积能有效减小背景信号。利用Cd2+功能化的多孔TiO2纳米颗粒作为半抗原标记物载体，通过在电极表面直接滴加Na2S，原位生成高光电转换率的窄带隙CdS，通过可见光波长的LED灯照射CdS，产生光电流信号。载体TiO2与CdS能带匹配度良好，能进一步提高CdS的光电转换信号，从而制备超灵敏检测玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉醇，黄曲霉毒素B1、B2，赭曲霉毒素A、B等多种真菌毒素的竞争型光电化学免疫传感器。

Description

一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用，具体涉及一种原位生成CdS的竞争型真菌毒素光电化学传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料与食品安全检测技术领域。
背景技术
近年来，食品污染日趋严重和频繁，不仅造成巨额的经济损失，还会严重影响人类的身体健康。真菌毒素是其中的一类主要的食品污染物，它是一种由霉菌或真菌产生的次生代谢物，由于分布广泛，很容易污染农作物，通过污染的粮食或饲料以及该饲料喂养的动物等进入食物链，间接地进入人体内，最终造成神经和内分泌紊乱、免疫抑制、肝肾损伤、繁殖障碍、致癌致畸致突变等严重后果。
监测是保证食品安全的重要环节，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法十分重要。目前国内外对真菌毒素污染物的分析方法主要包括生物鉴定法、化学分析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术和酶联免疫分析法等。但是，这些检测方法多数存在靶标物单一、样品前处理复杂、操作繁琐、所需样品用量大、耗时长等缺点，不能很好地满足定量分析的需求。因此，为了解决上述方法的不足之处，本发明提供了一种简单准确、快速、灵敏度和选择性高的光电化学免疫分析方法。
光电化学传感器是基于物质的光电转换特性来确定待测物浓度的一类检测装置。光电化学检测方法具有灵敏度高、设备简单、易于微型化的特点，已经成为一种极具应用潜力的分析方法，在食品、环境、医药等领域具有广阔的应用前景。
本发明采用二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯作为抗体捕获基底，其优良的导电性和大的比表面积能有效减小背景信号。利用Cd2+功能化的多孔TiO2纳米颗粒标记真菌毒素，通过在电极表面直接滴加Na2S，原位生成高光电转换率的窄带隙CdS。本发明制备的基于原位生成CdS的竞争型光电化学传感器，具有低成本、高灵敏、特异性好、快速检测等优点，且制备过程简单，在可见光区域实现了对多种真菌毒素的快速、灵敏检测，有效克服了目前真菌毒素检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是利用导电性好、比表面积大的二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯作为抗体捕获基底，制备了一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的传感器。
本发明的目的之二是通过原位生成的窄带隙CdS与真菌毒素载体TiO2之间的能带匹配，实现了可见光区域对多种真菌毒素超灵敏检测目的。
本发明的技术方案如下：
1.一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；取6μL、2~4mg/mL二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，400~500℃煅烧30~60min，冷却，得到二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料GS-CeO2修饰的玻璃电极；
（2）在GS-CeO2修饰的玻璃电极表面，滴加5μL、0.1~1μg/mL的真菌毒素抗体溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴加3μL、质量分数为1~3%的BSA溶液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴加5μL真菌毒素混合溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得了真菌毒素光电化学传感器。
所述真菌毒素混合溶液，是由等体积的TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液分别与不同浓度待测的真菌毒素溶液混合制得；
所述不同浓度待测的真菌毒素溶液，其浓度为0.1pg/mL~10ng/mL。
2.二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
所述二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料，其特征在于，制备步骤如下：配制1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，超声5~10h，取20~50mL与硝酸铈溶液混合搅拌5min，转移至高压釜中，100℃加热反应20~30h，离心洗涤，50℃真空干燥，制得粉末材料，置于马弗炉中400℃煅烧2~4h，得到GS/CeO2复合纳米材料；
所述硝酸铈溶液是由0.2g六水合硝酸铈、8mL超纯水和20μL、2mol/L的氢氧化钠溶液混合而成
3.TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
（1）TiO2的制备
钛酸四丁酯与乙二醇以体积比1:15~30混合，搅拌6~10h，向50mL混合液中加入150~200mL丙酮，搅拌0.5~2h，在乙醇中离心洗涤3次，加入10~30mL水，100℃回流搅拌1~3h，离心水洗3次，50℃真空干燥，在马弗炉中400℃煅烧2~4h，制得TiO2；
（2）TiO2Cd2+溶液的制备
取1mL、20mg/mL的TiO2水溶液，加入10mMCd(NO3)2·4H2O水溶液共混，50℃水浴振荡4~24h，离心洗涤，制得的TiO2Cd2+；将其分散于水中，配制成10mg/mL的TiO2Cd2+溶液；
（3）TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
取10mL、10mg/mL的TiO2Cd2+溶液与1mL、体积分数为2.5~5%的戊二醛水溶液，振荡1~3h，加入100～500μL、10μg/mL真菌毒素抗原，在4℃冰箱中振荡孵化20h，离心，用pH为7.4的PBS洗涤，分散在1mLpH为7.4的PBS中，制得TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液，4℃下保存备用。
4.如上所述的制备的一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器，用于真菌毒素的检测，步骤如下：
（1）在所制备的光电化学传感器电极表面，滴加5μL、0.7mol/L的Na2S溶液，放置30~80min；
（2）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的光电化学传感器电极为工作电极，在10mL、pH7.0~7.5的含0.1mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试；
（3）用时间-电流法对分析物标准溶液进行检测，设置电压为0.1V，运行时间100s，照射LED灯波长为400~450nm；
（4）当背景电流趋于稳定后，每隔20s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（5）将待测的真菌毒素样品溶液代替真菌毒素标准溶液进行检测。
5.如权利要求1所述的一种CdS敏化TiO2光电化学传感器制备方法，其特征在于，所述真菌毒素选自下列之一：玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉醇，黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B。
本发明的有益成果
（1）利用导电性好、比表面积大的二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯作为抗体捕获基底，有效降低背景信号2倍，显著提高了检测的灵敏度。
（2）利用Cd2+功能化的TiO2纳米颗粒作为真菌毒素标记物，采用在电极表面直接滴加Na2S原位生成窄带隙的CdS半导体纳米材料，原料低廉、方法简单，使电极修饰更加均匀，并缩短了传感器的制作时间。
（3）电极表面原位生成的CdS与作为真菌毒素载体的TiO2具有良好的能带匹配，有效的提高了CdS的光电转换效率，使制得的传感器实现了对真菌毒素的超灵敏检测。
（5）本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
（6）本发明制备的竞争型光电化学免疫传感器，用于多种真菌毒素的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用
（1）将导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；取6μL、2mg/mL二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，400℃煅烧30min，冷却，得到二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料GS-CeO2修饰的玻璃电极；
（2）在GS-CeO2修饰的玻璃电极表面，滴加5μL、0.1μg/mL的真菌毒素抗体溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴加3μL、质量分数为1%的BSA溶液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴加5μL真菌毒素混合溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得了真菌毒素光电化学传感器。
所述真菌毒素混合溶液，是由等体积的TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液分别与不同浓度待测的真菌毒素溶液混合制得；
所述不同浓度待测的真菌毒素溶液，其浓度为0.1pg/mL~10ng/mL。
实施例2一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用
（1）将导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；取6μL、3mg/mL二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，450℃煅烧45min，冷却，得到二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料GS-CeO2修饰的玻璃电极；
（2）在GS-CeO2修饰的玻璃电极表面，滴加5μL、0.5μg/mL的真菌毒素抗体溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴加3μL、质量分数为2%的BSA溶液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴加5μL真菌毒素混合溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得了真菌毒素光电化学传感器。
所述真菌毒素混合溶液，是由等体积的TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液分别与不同浓度待测的真菌毒素溶液混合制得；
所述不同浓度待测的真菌毒素溶液，其浓度为0.1pg/mL~10ng/mL。
实施例3一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用
（1）将导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；取6μL、4mg/mL二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，500℃煅烧60min，冷却，得到二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料GS-CeO2修饰的玻璃电极；
（2）在GS-CeO2修饰的玻璃电极表面，滴加5μL、1μg/mL的真菌毒素抗体溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴加3μL、质量分数为3%的BSA溶液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴加5μL真菌毒素混合溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得了真菌毒素光电化学传感器。
所述真菌毒素混合溶液，是由等体积的TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液分别与不同浓度待测的真菌毒素溶液混合制得；
所述不同浓度待测的真菌毒素溶液，其浓度为0.1pg/mL~10ng/mL。
实施例4二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
配制1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，超声5h，取20mL与硝酸铈溶液混合搅拌5min，转移至高压釜中，100℃加热反应20h，离心洗涤，50℃真空干燥，制得粉末材料，置于马弗炉中400℃煅烧2h，得到GS/CeO2复合纳米材料；
所述硝酸铈溶液是由0.2g六水合硝酸铈、8mL超纯水和20μL、2mol/L的氢氧化钠溶液混合而成。
实施例5二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
配制1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，超声8h，取30mL与硝酸铈溶液混合搅拌5min，转移至高压釜中，100℃加热反应25h，离心洗涤，50℃真空干燥，制得粉末材料，置于马弗炉中400℃煅烧3h，得到GS/CeO2复合纳米材料；
所述硝酸铈溶液是由0.2g六水合硝酸铈、8mL超纯水和20μL、2mol/L的氢氧化钠溶液混合而成。
实施例6二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
配制1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，超声10h，取50mL与硝酸铈溶液混合搅拌5min，转移至高压釜中，100℃加热反应30h，离心洗涤，50℃真空干燥，制得粉末材料，置于马弗炉中400℃煅烧4h，得到GS/CeO2复合纳米材料；
所述硝酸铈溶液是由0.2g六水合硝酸铈、8mL超纯水和20μL、2mol/L的氢氧化钠溶液混合而成。
实施例7TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
（1）TiO2的制备
钛酸四丁酯与乙二醇以体积比1:15混合，搅拌6h，向50mL混合液中加入150mL丙酮，搅拌0.5h，在乙醇中离心洗涤3次，加入10mL水，100℃回流搅拌1h，离心水洗3次，50℃真空干燥，在马弗炉中400℃煅烧2h，制得TiO2；
（2）TiO2Cd2+溶液的制备
取1mL、20mg/mL的TiO2水溶液，加入10mMCd(NO3)2·4H2O水溶液共混，50℃水浴振荡4h，离心洗涤，制得的TiO2Cd2+；将其分散于水中，配制成10mg/mL的TiO2Cd2+溶液；
（3）TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
取10mL、10mg/mL的TiO2Cd2+溶液与1mL、体积分数为2.5%的戊二醛水溶液，振荡1h，加入100μL、10μg/mL真菌毒素抗原，在4℃冰箱中振荡孵化20h，离心，用pH为7.4的PBS洗涤，分散在1mLpH为7.4的PBS中，制得TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液，4℃下保存备用。
实施例8TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
（1）TiO2的制备
钛酸四丁酯与乙二醇以体积比1:20混合，搅拌8h，向50mL混合液中加入170mL丙酮，搅拌1h，在乙醇中离心洗涤3次，加入20mL水，100℃回流搅拌2h，离心水洗3次，50℃真空干燥，在马弗炉中400℃煅烧3h，制得TiO2；
（2）TiO2Cd2+溶液的制备
取1mL、20mg/mL的TiO2水溶液，加入10mMCd(NO3)2·4H2O水溶液共混，50℃水浴振荡18h，离心洗涤，制得的TiO2Cd2+；将其分散于水中，配制成10mg/mL的TiO2Cd2+溶液；
（3）TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
取10mL、10mg/mL的TiO2Cd2+溶液与1mL、体积分数为3.5%的戊二醛水溶液，振荡2h，加入300μL、10μg/mL真菌毒素抗原，在4℃冰箱中振荡孵化20h，离心，用pH为7.4的PBS洗涤，分散在1mLpH为7.4的PBS中，制得TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液，4℃下保存备用。
实施例9TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
（1）TiO2的制备
钛酸四丁酯与乙二醇以体积比1:30混合，搅拌10h，向50mL混合液中加入200mL丙酮，搅拌2h，在乙醇中离心洗涤3次，加入30mL水，100℃回流搅拌3h，离心水洗3次，50℃真空干燥，在马弗炉中400℃煅烧4h，制得TiO2；
（2）TiO2Cd2+溶液的制备
取1mL、20mg/mL的TiO2水溶液，加入10mMCd(NO3)2·4H2O水溶液共混，50℃水浴振荡24h，离心洗涤，制得的TiO2Cd2+；将其分散于水中，配制成10mg/mL的TiO2Cd2+溶液；
（3）TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液的制备
取10mL、10mg/mL的TiO2Cd2+溶液与1mL、体积分数为5%的戊二醛水溶液，振荡3h，加入500μL、10μg/mL真菌毒素抗原，在4℃冰箱中振荡孵化20h，离心，用pH为7.4的PBS洗涤，分散在1mLpH为7.4的PBS中，制得TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液，4℃下保存备用。
实施例10玉米赤霉烯酮的检测
（1）在所制备的光电化学传感器电极表面，滴加5μL、0.7mol/L的Na2S溶液，放置30~80min；
（2）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的光电化学传感器电极为工作电极，在10mL、pH7.0~7.5的含0.1mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试；
（3）用时间-电流法对分析物标准溶液进行检测，设置电压为0.1V，运行时间100s，照射LED灯波长为400~450nm；
（4）当背景电流趋于稳定后，每隔20s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（5）按照绘制工作曲线的方法进行玉米赤霉烯酮样品分析，测得线性范围为0.5pg/mL~10ng/mL，检测限为0.2pg/mL。
实施例11α-玉米赤霉醇的检测
绘制工作曲线步骤同实施例10，按照绘制工作曲线的方法进行α-玉米赤霉醇样品分析，测得线性范围为0.5pg/mL~8ng/mL，检测限为0.15pg/mL。
实施例12黄曲霉毒素B1的检测
绘制工作曲线步骤同实施例10，按照绘制工作曲线的方法进行黄曲霉毒素B1样品分析，测得线性范围为0.1pg/mL~5ng/mL，检测限为0.04pg/mL。
实施例13黄曲霉毒素B2的检测
绘制工作曲线步骤同实施例10，按照绘制工作曲线的方法进行黄曲霉毒素B2样品分析，测得线性范围为0.1pg/mL~7ng/mL，检测限为0.05pg/mL。
实施例14赭曲霉毒素A的检测
绘制工作曲线步骤同实施例10，按照绘制工作曲线的方法进行赭曲霉毒素A样品分析，测得线性范围为0.2pg/mL~7ng/mL，检测限为0.08pg/mL。
实施例14赭曲霉毒素B的检测
绘制工作曲线步骤同实施例10，按照绘制工作曲线的方法进行赭曲霉毒素B样品分析，测得线性范围为0.3pg/mL~7ng/mL，检测限为0.1pg/mL。

Claims (1)

1.一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；取6μL、2~4mg/mL二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，400~500℃煅烧30~60min，冷却，得到二氧化铈掺杂的还原氧化石墨烯复合纳米材料GS-CeO2修饰的玻璃电极；
（2）在GS-CeO2修饰的玻璃电极表面，依次滴加5μL0.1~1μg/mL的真菌毒素抗体溶液、3μL质量分数为1~3%的BSA溶液、5μL真菌毒素混合溶液，每次滴加后使用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，即制得真菌毒素光电化学传感器；
所述真菌毒素混合溶液，是由等体积的TiO2Cd2+-Ag真菌毒素标记物溶液分别与不同浓度待测的真菌毒素溶液混合制得；
（3）在步骤（2）所制备的光电化学传感器电极表面，滴加5μL、0.7mol/L的Na2S溶液，放置30~80min；
（4）利用竞争型原位生长CdS敏化TiO2的方法用于环境雌激素的检测，检测步骤如下：
1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的光电化学传感器电极为工作电极，在10mL、pH7.0~7.5的含0.1mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试；
2）用时间-电流法对真菌毒素标准溶液进行检测，设置电压为0.1V，运行时间100s，照射LED灯波长为400~450nm；
3）当背景电流趋于稳定后，每隔20s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
4）将待测的真菌毒素样品溶液代替真菌毒素标准溶液进行检测；
5）所述真菌毒素选自下列之一：玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉醇，黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B。
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