CN105259222B - 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于金杂化的氧化镍钴纳米花对双氧水有良好的电化学催化能力和电子转移能力，显著提高了生物传感器的灵敏度，对粮食中赭曲霉毒素的检测具有重要的意义。

Description

一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明一种金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电化学催化性能的金杂化的氧化镍钴纳米花，制备一种检测粮食中赭曲霉毒素的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素是继黄吐霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素，赭曲霉毒素是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死，还在动物试验中观察到它的致畸作用。

目前生物传感器已经广泛用于各种真菌毒素的检测，因为生物传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记型传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。

本发明将金杂化的氧化镍钴纳米花修饰到玻碳电极表面，构建无标记型传感器。第一，金杂化的氧化镍钴纳米花中的金具有良好的生物相容性，并且能够有效地固定抗体；第二，金杂化的氧化镍钴纳米花中的氧化镍钴纳米花具有良好的电化学催化活性，能够提高传感器的灵敏度；第三，金杂化的氧化镍钴纳米花的花状结构具有大的比表面积，能够进一步增加抗体的固定和增加催化过程的接触面积。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于赭曲霉毒素的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测赭曲霉毒素提供了新途径。

发明内容

本发明的目的之一是基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建无标记型生物传感器。

本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于赭曲霉毒素的高灵敏、特异性检测。

本发明的技术方案如下

1. 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL的金杂化的氧化镍钴纳米花水溶液，干燥；

（3）继续将6 µL浓度为5 ~ 20 µg/mL的赭曲霉毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）用3 μL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

金杂化的氧化镍钴纳米花的制备

将0.5 ~ 2 mmol六水合硝酸镍、1 ~ 4 mmol六水合硝酸钴和3 ~ 12 mmol六次甲基四胺加入到10 ~ 40 mL乙醇和20 ~ 80 mL水的混合溶液中，室温条件下搅拌10 min后，将上述溶液转移到反应釜中，在90℃条件下反应4 h，离心洗涤后干燥，得到氧化镍钴纳米花；

取0.1 ~ 0.4 g氧化镍钴纳米花加入到10 ~ 40 mL无水乙醇中，随后加入0.1 ~ 0.4 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的氧化镍钴纳米花；

向10 ~ 40 mL的金纳米水溶液中加入10 ~ 40 mg的氨基化的氧化镍钴纳米花，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到金杂化的氧化镍钴纳米花。

赭曲霉毒素的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择计时电流法对赭曲霉毒素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替赭曲霉毒素抗原标准溶液进行检测。

本发明的有益成果

（1）本发明采用金杂化的氧化镍钴纳米花具有良好的生物相容性，通过形成金氮键化学键合至玻碳电极表面。

（2）本发明采用的金杂化的氧化镍钴纳米花对双氧水具有优越的电化学催化性能，提高了生物传感器的灵敏度。

（3）本发明采用的金杂化的氧化镍钴纳米花具有大的比表面积，能够有效固定大量的抗体并增加催化过程的接触面积。

（4）本发明将制备的无标记型生物传感器用于赭曲霉毒素的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。

具体实施方式

实施例 1 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 mg/mL的金杂化的氧化镍钴纳米花水溶液，干燥；

（3）继续将6 µL浓度为5 µg/mL的赭曲霉毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）用3 μL浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例 2 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1.5 mg/mL的金杂化的氧化镍钴纳米花水溶液，干燥；

（3）继续将6 µL浓度为10 µg/mL的赭曲霉毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）用3 μL浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例 3 一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6 μL浓度为2 mg/mL的金杂化的氧化镍钴纳米花水溶液，干燥；

（3）继续将6 µL浓度为20 µg/mL的赭曲霉毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）用3 μL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例 4 金杂化的氧化镍钴纳米花的制备

将0.5 mmol六水合硝酸镍、1 mmol六水合硝酸钴和3 mmol六次甲基四胺加入到10 mL乙醇和20 mL水的混合溶液中，室温条件下搅拌10 min后，将上述溶液转移到反应釜中，在90℃条件下反应4 h，离心洗涤后干燥，得到氧化镍钴纳米花；

取0.1 g氧化镍钴纳米花加入到10 mL无水乙醇中，随后加入0.1 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的氧化镍钴纳米花；

向10 mL的金纳米水溶液中加入10 mg的氨基化的氧化镍钴纳米花，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到金杂化的氧化镍钴纳米花。

实施例 5 金杂化的氧化镍钴纳米花的制备

将1 mmol六水合硝酸镍、2 mmol六水合硝酸钴和6 mmol六次甲基四胺加入到20 mL乙醇和40 mL水的混合溶液中，室温条件下搅拌10 min后，将上述溶液转移到反应釜中，在90℃条件下反应4 h，离心洗涤后干燥，得到氧化镍钴纳米花；

取0.2 g氧化镍钴纳米花加入到20 mL无水乙醇中，随后加入0.2 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的氧化镍钴纳米花；

向20 mL的金纳米水溶液中加入20 mg的氨基化的氧化镍钴纳米花，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到金杂化的氧化镍钴纳米花。

实施例 6 金杂化的氧化镍钴纳米花的制备

将2 mmol六水合硝酸镍、4 mmol六水合硝酸钴和12 mmol六次甲基四胺加入到40 mL乙醇和80 mL水的混合溶液中，室温条件下搅拌10 min后，将上述溶液转移到反应釜中，在90℃条件下反应4 h，离心洗涤后干燥，得到氧化镍钴纳米花；

取0.4 g氧化镍钴纳米花加入到40 mL无水乙醇中，随后加入0.4 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的氧化镍钴纳米花；

向40 mL的金纳米水溶液中加入40 mg的氨基化的氧化镍钴纳米花，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到金杂化的氧化镍钴纳米花。

实施例 7 赭曲霉毒素的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择计时电流法对赭曲霉毒素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替赭曲霉毒素抗原标准溶液进行检测；

（5）该生物传感器对赭曲霉毒素抗原检测线性范围为0.0001 ~ 10 ng/mL，检测限0.05 pg/mL。

Claims (2)

1.一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）金杂化的氧化镍钴纳米花的制备

将0.5 ~ 2 mmol六水合硝酸镍、1 ~ 4 mmol六水合硝酸钴和3 ~ 12 mmol六次甲基四胺加入到10 ~ 40 mL乙醇和20 ~ 80 mL水的混合溶液中，室温条件下搅拌10 min后，将上述溶液转移到反应釜中，在90℃条件下反应4 h，离心洗涤后干燥，得到氧化镍钴纳米花；

取0.1 ~ 0.4 g氧化镍钴纳米花加入到10 ~ 40 mL无水乙醇中，随后加入0.1 ~ 0.4 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的氧化镍钴纳米花；

向10 ~ 40 mL的金纳米水溶液中加入10 ~ 40 mg的氨基化的氧化镍钴纳米花，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到金杂化的氧化镍钴纳米花；

（2）传感器的制备

1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL的金杂化的氧化镍钴纳米花水溶液，干燥；

3）继续将6 µL浓度为5 ~ 20 µg/mL的赭曲霉毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

4）用3 μL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

5）将6 μL浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于金杂化的氧化镍钴纳米花构建的赭曲霉毒素传感器对赭曲霉毒素的检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择计时电流法对赭曲霉毒素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替赭曲霉毒素抗原标准溶液进行检测。