CN107255664B - 一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域及光致电化学传感器领域，具体涉及一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用，以及提供一种采用所述的光致电化学传感器测氯霉素的方法。用SWNT/SnSe修饰碳糊电极，将DNA/AuNPs/MET通过DNA与SWNT/SnSe吸附作用固定在修饰电极表面，构建光致电化学传感器，当传感器与氯霉素作用后光致电化学信号发生变化，据此实现对氯霉素的测定。方法具有简单、灵敏度高的优势。
Description
技术领域
本发明属于分析化学与光致电化学传感器领域，具体为一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用。另外，本发明还涉及采用所述的光致电化学传感器测氯霉素的方法。
背景技术
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素类物质，归于抑菌性广谱抗生素类，用于治疗伤寒及厌氧菌感染类病症。根据医学数据，氯霉素在使用过程中会产生比较严重的副作用，对人体的造血功能有一定的抑制作用。此外，氯霉素还可能引发贫血，这使氯霉素这种广谱抗生素类药物的应用有了一定的局限性。由于氯霉素抑菌普遍广泛、作用效果好、与其他药物相比价格相对廉价，所以在我国的使用较为广泛。为了保障人类的健康以及减少毒副作用的产生，创建准确度高、单一性好、简捷可行的氯霉素检验方法成为分析研究工作者的一大挑战。近年来，涌现出如微生物学方法、放射免疫法、色谱法和酶免疫分析法等分析方法的氯霉素的检测方法。其中最常用的方法是微生物学方法，该方法操作起来比较简单，价格相对廉价，但此方法存在灵敏度低、特异性差等不足之处；放射免疫法具有同位素半衰期短、可能产生放射性污染及仪器设备复杂昂贵等缺点。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对氯霉素的检测要求，但这些方法各有其缺点。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用，以及提供一种采用所述的光致电化学传感器测氯霉素的方法。
本发明的目的是这样实现的：用SWNT/SnSe修饰碳糊电极，将DNA/AuNPs/MET通过DNA与SWNT/SnSe吸附作用固定在修饰电极表面，构建光致电化学传感器以实现对氯霉素的测定；一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用，包括如下步骤：
(1)硒化锡制备及剥离
a.称取0.4513g的二氯化锡(SnCl2﹒2H2O)与0.1579g固体锡(Se)于小烧杯中，用量筒量取5mL～100ml乙二醇倒入烧杯中，于通风橱中量取2mL～50ml的乙二胺倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌一会儿后，用保鲜膜封住小烧杯口后置于电磁搅拌器一段时间后，倒入反应釜中，装好反应釜盖，拧紧，放入烘箱(80℃～280℃)中烘，10h后取出得硒化锡；
b.剥离：将制备好的硒化锡(SnSe)溶液与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，按照体积比为0.2:1～2:1混合后置于离心管中超声4-5h；将超声后的溶液取出后离心，用无水乙醇洗涤3次，加以等量的去离子水，备用。
(2)探针的制备
a.纳米金(AuNPS)的制备：用分析天平准确称取柠檬酸三钠50mg，将其加入到2mL～250ml去离子水中；用分析天平准确称取5mg氯金酸(HAuCl4·4H2O)，将其加入到2mL～250ml去离子水中。将氯金酸溶液加热至沸腾，搅拌下快速加入0.2mL～5ml柠檬酸三钠溶液，加热30min，期间溶液颜色发生以下变化：黄→无→浅紫→紫红→酒红。冷却至室温，得到纳米金，转移至棕色容量瓶中，置于4℃下保存；
b.探针的制备：首先，用分析天平准确称量0.0060g甲硫氨酸(MET)，加入到5ml的离心管中，加0.2mL～5ml去离子水，摇匀。此时配制的为10-2M的甲硫氨酸溶液。将此溶液稀释1000倍至浓度10-5M备用。然后，另取2mL离心管依次加入AuNPs、DNA、甲硫氨酸溶液，混合摇匀。将其放入摇床轻摇反应20h-22h，使巯基与AuNPs连接起来。最后15000r，离心30min，得到红色沉淀后，用水洗涤两次，即制备好DNA/AuNPs/MET探针，置于4℃下避光保存。
(3)光致电化学传感器的构建
a.碳糊电极的制备：称取9g碳粉、3g石蜡混合于研钵中研磨均匀，套袋密封，置于烘箱中(80℃)，加热30min后取出，研磨均匀，如此反复操作三次直至该混合物混合均匀。将玻璃管截取至10-12cm长度，两端磨平，将碳粉和石蜡的混合物装入玻璃管中，装至1-2cm位置时将铜丝放入，并继续将碳粉和石蜡的混合物装入玻璃管直至距顶端约2cm位置，挤压。将制备的电极底端在平滑的白纸上磨平，备用。
b.光致电化学传感器的构建：将制备好的碳糊电极用二次蒸馏水冲洗干净，吹干电极表面，备用；取单壁碳纳米管溶液与剥离后的硒化锡溶液以体积比1：1超声混合后的溶液40μL滴涂在碳糊电极表面，得SnSe/SWNT修饰碳糊电极，即SnSe/SWNT/CPE，置于避光处自然晾干。取40μL上述制备好的DNA/AuNPs/MET探针滴涂在SnSe/SWNT/CPE表面，置于避光处，自然晾干，从而制得光致电化学传感器。
一种利用上述方法制备的光致电化学传感器检测氯霉素含量的方法，当将光致电化学传感器插入含10-4M的多巴胺的溶液中，进行光致电化学测试，得光致电化学信号I0；当光致电化学传感器插入含一定浓度的氯霉素时，氯霉素与DNA作用，使得探针从电极表面脱落，获得作用后的光致电化学传感器，经氯霉素与DNA作用后的光致电化学传感器再经光致电化学检测，得光致电化学信号I，以I-I0为分析信号，进行氯霉素的测定。
由于上述方法制备的光致电化学传感器可以检测氯霉素，因此，本发明提供了上述的光致电化学传感器在检测氯霉素含量中的应用。
与现有技术相比，本发明涉及的光致电化学传感器具有如下优点和显著地进步：纳米金提供相对大的比表面积用于负载MET，使光致电化学信号得以淬灭，使得本发明设计的光致电化学传感器具有高灵敏度。因此，本发明涉及的一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用有良好的发展前景。
DNA从北京赛百盛基因技术有限公司获得。它们的核苷酸序列如下：DNA,5`-CATTCT AGGGT GGATC ATTGT GATCT A-SH-3`。
当利用其它相应的适体时，这种检测技术还可以测量其他分析物，因此，这样一种简便的技术将会变成一种新的光致电化学传感器。这种传感器具有高灵敏度和选择性的特点。
附图说明
图1本发明的实验原理图。
图2透射电镜图。(A)SWNT；(B)SnSe/SWNT。
图3电极表面不同修饰状态的电化学阻抗图。(a)CPE；(b)SnSe/SWNT/CPE；(c)DNA/AuNPS/MET/SnSe/SWNT/CPE；(d)DNA/AuNPS/MET/SnSe/SWNT/CPE与氯霉素作用后的电化学阻抗图。
图4光致电化学信号与氯霉素浓度关系图。
图5电位优化。
图6pH优化。
图7SnSe/SWNT用量优化。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
实施例1电位优化
制备的光致化学传感器可能会因为电极电位的不同来改变自身的电子传递系统，从而对光致电化学信号测定产生一定的影响。分别在-0.1V、0.0V、0.1V、0.2V不同工作电位下测定光致电化学信号。图5为不同电位下的光致电化学信号响应。随着电极电位的增大，光致电化学信号值呈升高趋势。但是随着电位的升高，在电位为0.2V时，峰形较差。在电极电位为0.1V下测定时，光致电化学信号值较大且峰形相对较好便于读数，所以最终选择的电极电位为0.1V。
实施例2pH优化
将电极分别在含10-4M的多巴胺的溶液中，pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下测定光致电化学信号。图6为在电位0.1V条件下，在不同pH条件下测定的光致电化学信号响应。可以看出，在pH在6.0-7.0时信号增大，在pH为7.0左右达到最大值，而在7.0-8.0区间则呈现下降趋势。所以选择检测介质的pH为7.0。
实施例3SnSe/SWNT用量的优化
用移液枪分别准确移取30μL、40μL、50μL、60μL、70μL的SnSe/SWNT混合液滴涂在碳糊电极上，测定光致电化学信号。图7为SnSe/SWNT不同用量情况下的光致电化学信号。可以看出，在SnSe/SWNT用量为30μL到50μL时信号增大，在SnSe/SWNT用量为50μL到70μL区间则呈现下降趋势。SnSe/SWNT用量为50μL时光致电化学信号最大。选择SnSe/SWNT用量为50μL。
实施例4方法灵敏度试验
考察了方法测定的灵敏度和线性范围等分析特性。在优选的试验条件下，目标物氯霉素的浓度在1.0×10-8M到1.0×10-6M范围内与光致电化学信号成线性函数关系式。线性函数关系式为：ΔI＝0.8116C+2.30364，(ΔI是光致电化学信号差；C是氯霉素的浓度)，线性相关系数R＝0.99587，检测限是0.3×10-9M(3σ)。
实施例5实际样品中氯霉素含量的测定
使用建立的方法测定了从市场购买的新鲜水果、鱼和猪肉中氯霉素的含量。测得的氯霉素的浓度如表1所示。并通过回收实验考察了方法的准确度与精密度，回收率在98.1％-101.6％之间。
表1实际样品中氯霉素含量的测定结果
| 编号 | 含量 | 标准加入量<sup>a</sup> | 测得量<sup>a</sup> | 相对标准偏差 | 回收率 |
| 1 | 29.81 | 30.00 | 59.97 | 4.3％ | 100.5％ |
| 2 | 14.06 | 20.00 | 34.12 | 3.8％ | 100.3％ |
| 3 | 11.99 | 10.00 | 21.80 | 3.7％ | 98.1％ |
| 4 | 11.4 | 10.00 | 21.56 | 3.2％ | 101.6％ |
a单位：nM。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法及应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CATTCT AGGGT GGATC ATTGT GATCT A 26
Claims (3)
1.一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法；用SWNT/SnSe修饰碳糊电极，将DNA/AuNPs/MET通过DNA与SWNT/SnSe吸附作用固定在修饰电极表面，构建光致电化学传感器以实现对氯霉素的测定，包括如下步骤：
(1)硒化锡制备及剥离
a.制备：称取0.4513g的二氯化锡(SnCl2﹒2H2O)与0.1579g固体锡(Se)于小烧杯中，用量筒量取5mL～100ml乙二醇倒入烧杯中，于通风橱中量取2mL～50ml的乙二胺倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌一会儿后，用保鲜膜封住小烧杯口后置于电磁搅拌器一段时间后，倒入反应釜中，装好反应釜盖，拧紧，放入烘箱在80℃到280℃中烘10h后取出得硒化锡；
b.剥离：将制备好的硒化锡(SnSe)溶液与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，按照体积比为0.2:1～2:1混合后置于离心管中超声4-5h；将超声后的溶液取出后离心，用无水乙醇洗涤3次，加以等量的去离子水，备用；
(2)探针的制备
a.纳米金(AuNPS)的制备：用分析天平准确称取柠檬酸三钠50mg，将其加入到2mL～250ml去离子水中；用分析天平准确称取5mg氯金酸(HAuCl4·4H2O)，将其加入到2mL～250ml去离子水中；将氯金酸溶液加热至沸腾，搅拌下快速加入0.2mL～5ml柠檬酸三钠溶液，加热30min，期间溶液颜色发生以下变化：黄→无→浅紫→紫红→酒红；冷却至室温，得到纳米金，转移至棕色容量瓶中，置于4℃下保存；
b.探针的制备：首先，用分析天平准确称量0.0060g甲硫氨酸(MET)，加入到5ml的离心管中，加0.2mL～5ml去离子水，摇匀；此时配制的为10-2M的甲硫氨酸溶液；将此溶液稀释1000倍至浓度10-5M备用；然后，另取2mL离心管依次加入AuNPs、DNA、甲硫氨酸溶液，混合摇匀；将其放入摇床轻摇反应20h-22h，使巯基与AuNPs连接起来；最后15000r，离心30min，得到红色沉淀后，用水洗涤两次，即制备好DNA/AuNPs/MET探针，置于4℃下避光保存；
(3)光致电化学传感器的构建
a.碳糊电极的制备：称取9g碳粉、3g石蜡混合于研钵中研磨均匀，套袋密封，置于80℃烘箱中，加热30min后取出，研磨均匀，如此反复操作三次直至该混合物混合均匀；将玻璃管截取至10-12cm长度，两端磨平，将碳粉和石蜡的混合物装入玻璃管中，装至1-2cm位置时将铜丝放入，并继续将碳粉和石蜡的混合物装入玻璃管直至距顶端约2cm位置，挤压；将制备的电极底端在平滑的白纸上磨平，备用；
b.光致电化学传感器的构建：将制备好的碳糊电极用二次蒸馏水冲洗干净，吹干电极表面，备用；取单壁碳纳米管溶液与剥离后的硒化锡溶液以体积比1：1超声混合后的溶液40μL滴涂在碳糊电极表面，得SnSe/SWNT修饰碳糊电极，即SnSe/SWNT/CPE，置于避光处自然晾干；取40μL上述制备好的DNA/AuNPs/MET探针滴涂在SnSe/SWNT/CPE表面，置于避光处，自然晾干，从而制得光致电化学传感器。
2.根据权利要求1的一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法，其特征在于将光致电化学传感器插入含10-4M的多巴胺的溶液中，进行光致电化学测试，得光致电化学信号I0；当光致电化学传感器插入含一定浓度的氯霉素时，氯霉素与DNA作用，使得探针从电极表面脱落，获得作用后的光致电化学传感器，经氯霉素与DNA作用后的光致电化学传感器再经光致电化学检测，得光致电化学信号I，以I-I0为分析信号，进行氯霉素的测定。
3.根据权利要求1的一种检测氯霉素的SnSe/SWNT修饰电极光致电化学传感器制备方法，所述的DNA为：5`-CATTCT AGGGT GGATC ATTGT GATCT A-SH-3`。
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