CN103278628A - 一种幽门螺杆菌elisa检测与分离的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，该方法是利用电动流体力将制备好的带有幽门螺杆菌的磁珠、酶标抗体、酶反应底物、胃液样品、清洗液分别放入到微流控芯片上的不同的储液池中，通过电动操控控制不同储液池中的液体流动，全自动完成ELISA的检测，并利用检测到的荧光信号作为触发信号，实现HP样品的全自动分离，装置由平台结构、微流控芯片、电控箱组成，微流控芯片是由玻璃片、聚二甲基硅氧烷方板、驱动电极构成，通过软光刻技术在聚二甲基硅氧烷方板表面光刻形成微通道、混合通道、检测区域并设有储液池，具有体积小、重量轻、便于携带、操作方便，造价低，能够进行手持用于现场检测等优点，有利于推广普及应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，尤其涉及一种在微流控芯片上实现ELISA方式对胃液胃黏膜样品中幽门螺杆菌的全自动计数与分离的方法与装置，属于微电子医学检测技术领域。
背景技术
幽门螺杆菌（HP）是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形，幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素，已被世界卫生组织/国际癌症研究机构（WHO/IARC）将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。 目前对于幽门螺杆菌检测的方法主要有：胃镜采样检测法、细菌直接检测法、尿素酶检查法、免疫学检测法、聚合酶链反应技术等。
胃镜采样检测法：主要在患者需做胃镜检查时“搭车”采样，在活检采样时一起作显微镜检查。检测是否有幽门螺杆菌。如果为阳性，即可确诊幽门螺杆菌感染阳性。但由于观察时间过短或某些因素的影响导致结果不够可靠。另外，胃镜采样难度较大，比较复杂，费用较高，部分医院没有高端仪器，仍然使用此方法，给患者带来不便。
细菌直接检查法：是指通过胃镜检查钳取胃粘膜（多为胃窦粘膜）作直接涂片、染色，组织切片染色及细菌培养来检测HP。其中胃粘膜细菌培养是诊断HP最可靠的方法，可作为验证其他诊断性试验的“金标准”，同时又能进行药敏试验，指导临床选用药物。
尿素酶检查法：因为HP是人胃内唯一能够产生大量尿素酶的细菌，故可通过检测尿素酶来诊断HP感染。尿素酶分解胃内尿素生成氨和二氧化碳，使尿素浓度降低、氨浓度升高。基于此原理已发展了多种检测方法：①胃活检组织尿素酶试验；②呼吸试验；③胃液尿素或尿素氮测定；④15N-尿素试验。
免疫学检测法：目前已有多种免疫学检测方法，通过测定血清中的HP抗体来检测HP感染，包括补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定（ELISA）等，但传统的ELISA检测方法所需设备昂贵、笨重、操作复杂、需要受过专业高度训练的技术人员来准备样品、实验和分析结果，操作过程中人为因素影响较大。
聚合酶链反应技术：正常胃粘膜很少检出HP（0～6%），慢性胃炎患者HP的检出率很高，约50%～80%，慢性活动性胃炎患者HP检出率则更高，达90%以上。然而它存在与免疫学检测法类似的问题。综上分析，幽门螺杆菌的全自动快速检测与分离是医学领域中亟待解决的重要问题之一。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，利用电动流体力将制备好的带有幽门螺杆菌的磁珠、酶标抗体、酶反应底物、胃液样品、清洗液分别放入到微流控芯片上的不同的储液池中，通过电动操控控制不同储液池中的液体流动，全自动完成ELISA的检测，该方法克服了目前幽门螺杆菌检测方法中存在的设备昂贵、样品处理需要人工操作、操作过程繁琐复杂耗时以及由此而带来的误差等问题，从而解决幽门螺杆菌的全自动快速检测与分离问题。这将对于医学领域，尤其是对胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的检测具有重要的科学意义和现实价值。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法，首先制备表面带有HP抗体的磁珠、能与HP反应的酶标抗体、能与酶作用的酶反应底物，然后将制备好的磁珠、酶标抗体、酶反应底物、胃液样品、清洗液分别放入到微流控芯片上的不同的五个样品储液池中，通过电动操控控制不同样品储液池中的液体流动，实现全自动ELISA检测，过程为：将磁珠抗体与胃液样品在微通道内充分混合，HP会结合到磁珠上形成磁珠抗原抗体复合物；将微通道中的磁珠固定，电驱动控制清洗液清洗除去其他未结合物质；将磁珠抗原抗体复合物与酶标抗体在微通道内充分混合，电驱动控制清洗液清洗除去其他未结合的酶标抗体，此时磁珠载体上带有的酶量与样品中HP的量相关；然后将带有酶的磁珠载体与酶反应底物在微通道内充分混合，酶反应底物将与磁珠载体上的酶发生反应，产生荧光；电驱动具有产生荧光能力的含有HP的样品通过微流控芯片通道中的荧光检测区，由于结合上HP的磁珠能够产生荧光信号，而未结合上HP的磁珠则不能产生荧光信号，根据荧光信号的计数可以得到HP的个数，同时也可根据总体荧光信号强度得到HP的浓度；最后根据所测量荧光信号作为触发信号，利用微流控芯片内电泳与介电泳技术将带有HP的样品全自动分离出来。
一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的装置，是由平台结构、微流控芯片、电控箱组成。在平台结构上置有微流控芯片，微流控芯片上设有的五个样品储液池内设有的驱动电极分别与电控箱内的继电器组件电连接，在微流控芯片上设有的废液储液池和分离样品储液池内设有的驱动电极也分别与电控箱内的继电器组件电连接，电控箱内激光光源上连接的激光发射头和激光检测器上连接的激光检测头分别置于微流控芯片内检测区域的上方。所述的微流控芯片是由玻璃片、聚二甲基硅氧烷方板、驱动电极构成，通过软光刻技术在聚二甲基硅氧烷方板表面光刻形成沟道，在聚二甲基硅氧烷方板和玻璃片表面经等离子体处理后贴附在一起形成微通道、混合通道、检测区域，在五个微通道左侧末端均连接有在聚二甲基硅氧烷方板上设有的样品储液池，五个微通道右侧交汇后与混合通道连接，在混合通道左边设有检测区域，在混合通道右边的两个末端分别连接有在聚二甲基硅氧烷方板上设有的废液储液池和分离样品储液池，在五个样品储液池、废液储液池和分离样品储液池内均设有驱动电极。所述的电控箱是由微处理器、显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、激光检测器、驱动模块、继电器组件构成，显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、驱动模块分别与微处理器连接，激光检测器与数据采集卡连接，继电器组件与驱动模块连接。
方法与装置的工作原理是：装置的七个储液池中均放有驱动电极，通过微处理器控制驱动模块，由继电器组件执行，可使样品在微通道内运动，控制两个储液池之间产生电位差的通断，驱动目标样品运动，非目标样品不运动；五个样品储液池中分别放入表面带有HP抗体的磁珠、能与HP反应的酶标抗体、能与酶作用的酶反应底物、胃液样品及清洗液，五个样品储液池中的驱动电极与废液储液池中的电极形成电势差，由此驱动不同样品池中的样品在微通道内运动，清洗液为PBS缓冲液，也可为其他缓冲液，在依次完成磁珠抗体与含有HP的胃液样品在微通道内混合形成磁珠抗原抗体复合物、将磁珠抗原抗体复合物与酶标抗体在微通道内混合、带有酶的磁珠载体与酶反应底物在微通道内混合、酶反应底物与磁珠载体上的酶发生反应后，驱动具有产生荧光能力的含有HP的样品通过微流控芯片通道中的荧光检测区，微处理器驱动激发光源激发酶反应底物和酶合成物产生荧光，以此荧光强度判断是否存在HP，根据所测量荧光信号作为触发信号，利用微流控芯片内电泳与介电泳技术将带有HP的样品全自动分离出来到分离样品储液池，另外以此荧光脉冲个数计算出HP的含量。
本发明的有益效果是：（1）本发明中通过微流控芯片上全自动完成幽门螺旋杆菌的检测与分离，自动化程度高、操作简单，克服了传统方法（例如传统ELISA方法）中人工操作时带来的人为因素影响、误差以及对操作人员须具备丰富的医学、生物学知识的要求。（2）由于本发明中采用微流控芯片作为幽门螺旋杆菌检测的微平台，而相关的电驱动操控、光电检测与分离设备亦可采用体积较小的结构形式（例如用微处理器代替PC机、用电极驱动代替泵驱动、光电倍增管或单光子计数模块代替CCD或ICCD），因此，相对于现有大型检测设备（例如细菌培养、组织切片染色等设备），本检测装置具有体积小、重量轻、便于携带，能够进行手持用于现场检测等优点。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
图1是本发明一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置的结构示意图。
图2是图1的微流控芯片结构示意图。
附图标记
1、平台结构 2、微流控芯片 3、电控箱
2-1、玻璃片 2-2、聚二甲基硅氧烷方板 2-3、样品储液池
2-4、驱动电极 2-5、微通道 2-6、混合通道 2-7、检测区
2-8、废液储液池 2-9、分离样品储液池 3-1、激光发射头
3-2激光检测头。
具体实施方式
请参阅图1、图2，一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法，包括如下步骤：
（a）制备表面带有HP抗体的磁珠、能与HP反应的酶标抗体、能与酶作用的酶反应底物；
（b）将制备好的磁珠、酶标抗体、酶反应底物、胃液样品、清洗液分别放入到微流控芯片上的不同的样品储液池中，通过电动操控控制不同储液池中的液体流动；
（c）将磁珠抗体与胃液样品在微通道内充分混合，HP会结合到磁珠上形成磁珠抗原抗体复合物；
（d）将微通道中的磁珠固定，电动控制清洗液清洗除去其他未结合物质；
（e）将磁珠抗原抗体复合物与酶标抗体在微通道内充分混合，电动控制清洗液清洗除去其他未结合的酶标抗体，此时磁珠载体上带有的酶量与样品中HP的量相关；
（f）将带有酶的磁珠载体与酶反应底物在微通道内充分混合，酶反应底物将与磁珠载体上的酶发生反应，反应后的产物在电动控制下运动到荧光检测区；
（g）在荧光检测区，通过激发光源激发产物产生荧光信号，而未结合上HP的磁珠则不能产生荧光信号，根据荧光信号的计数可以得到HP的个数，同时也可根据总体荧光信号强度得到HP的浓度；
（h）根据所测量荧光信号作为触发信号，利用微流控芯片内电泳与介电泳技术将带有HP的样品全自动分离出来。
一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的装置，是由平台结构1、微流控芯片2、电控箱3组成。在平台结构1上置有微流控芯片2，微流控芯片2上设有的五个样品储液池2-3内设有的驱动电极2-4分别与电控箱3内的继电器组件电连接，在微流控芯片2上设有的废液储液池2-8和分离样品储液池2-9内设有的驱动电极2-4也分别与电控箱3内的继电器组件电连接，电控箱3内激光光源上连接的激光发射头3-1和激光检测器上连接的激光检测头3-2分别置于微流控芯片2内检测区域2-7的上方。所述的微流控芯片2是由玻璃片2-1、聚二甲基硅氧烷方板2-2、驱动电极2-4构成，通过软光刻技术在聚二甲基硅氧烷方板2-2表面光刻形成沟道，在聚二甲基硅氧烷方板2-2和玻璃片2-1表面经等离子体处理后贴附在一起形成微通道2-5、混合通道2-6、检测区2-7，在五个微通道2-5左侧末端均连接有在聚二甲基硅氧烷方板2-2上设有的样品储液池2-3，五个微通道2-5右侧交汇后与混合通道2-6连接，在混合通道2-6左边设有检测区2-7，在混合通道2-6右边的两个末端分别连接有在聚二甲基硅氧烷方板2-2上设有的废液储液池2-8和分离样品储液池2-9，在五个样品储液池2-3、废液储液池2-8和分离样品储液池2-9内均设有驱动电极2-4。所述的电控箱3是由微处理器、显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、激光检测器、驱动模块、继电器组件构成，显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、驱动模块分别与微处理器连接，激光检测器与数据采集卡连接，继电器组件与驱动模块连接。
Claims (4)
1.一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，其特征在于：其方法包括如下步骤：（a）制备表面带有HP抗体的磁珠、能与HP反应的酶标抗体、能与酶作用的酶反应底物；
（b）将制备好的磁珠、酶标抗体、酶反应底物、胃液样品、清洗液分别放入到微流控芯片上的不同的样品储液池中，通过电动操控控制不同储液池中的液体流动；
（c）将磁珠抗体与胃液样品在微通道内充分混合，HP会结合到磁珠上形成磁珠抗原抗体复合物；
（d）将微通道中的磁珠固定，电动控制清洗液清洗除去其他未结合物质；
（e）将磁珠抗原抗体复合物与酶标抗体在微通道内充分混合，电动控制清洗液清洗除去其他未结合的酶标抗体，此时磁珠载体上带有的酶量与样品中HP的量相关；
（f）将带有酶的磁珠载体与酶反应底物在微通道内充分混合，酶反应底物将与磁珠载体上的酶发生反应，反应后的产物在电动控制下运动到荧光检测区；
（g）在荧光检测区，通过激发光源激发产物产生荧光信号，而未结合上HP的磁珠则不能产生荧光信号，根据荧光信号的计数可以得到HP的个数，同时也可根据总体荧光信号强度得到HP的浓度；
（h）根据所测量荧光信号作为触发信号，利用微流控芯片内电泳与介电泳技术将带有HP的样品全自动分离出来。
2.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，其特征在于：其装置是由平台结构（1）、微流控芯片（2）、电控箱（3）组成，在平台结构（1）上置有微流控芯片（2），微流控芯片（2）上设有的五个样品储液池（2-3）内设有的驱动电极（2-4）分别与电控箱（3）内的继电器组件电连接，在微流控芯片（2）上设有的废液储液池（2-8）和分离样品储液池（2-9）内设有的驱动电极（2-4）也分别与电控箱（3）内的继电器组件电连接，电控箱（3）内激光光源上连接的激光发射头（3-1）和激光检测器上连接的激光检测头（3-2）分别置于微流控芯片（2）内检测区（2-7）的上方。
3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，其特征在于：所述的微流控芯片（2）是由玻璃片（2-1）、聚二甲基硅氧烷方板（2-2）、驱动电极（2-4）构成，通过软光刻技术在聚二甲基硅氧烷方板（2-2）表面光刻形成沟道，在聚二甲基硅氧烷方板（2-2）和玻璃片（2-1）表面经等离子体处理后贴附在一起形成微通道（2-5）、混合通道（2-6）、检测区（2-7），在五个微通道（2-5）左侧末端均连接有在聚二甲基硅氧烷方板（2-2）上设有的样品储液池（2-3），五个微通道（2-5）右侧交汇后与混合通道（2-6）连接，在混合通道（2-6）左边设有检测区（2-7），在混合通道（2-6）右边的两个末端分别连接有在聚二甲基硅氧烷方板（2-2）上设有的废液储液池（2-8）和分离样品储液池（2-9），在五个样品储液池（2-3）、废液储液池（2-8）和分离样品储液池（2-9）内均设有驱动电极（2-4）。
4.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌ELISA检测与分离的方法和装置，其特征在于：所述的电控箱（3）是由微处理器、显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、激光检测器、驱动模块、继电器组件构成，显示器、输入键盘、存储器、激光光源、数据采集卡、驱动模块分别与微处理器连接，激光检测器与数据采集卡连接，继电器组件与驱动模块连接。
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