CN111145835A - 一种多重熔解曲线的软件分析方法 - Google Patents

一种多重熔解曲线的软件分析方法 Download PDF

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李政
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孙瑶
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Abstract

本发明揭示了一种多重熔解曲线的软件分析方法，包括：获取或接收包括多条多重熔解曲线的数据集；对所述数据集中的每条多重熔解曲线进行校正，获得归一化的多重熔解曲线；根据归一化的多重熔解曲线，计算得到目标峰；对归一化的目标峰进行聚类分析，确定目标基因的类别。本发明实现自动对多重熔解曲线进行分析及判定，且消除仪器间孔位的温度差、光路不一致、样本含量不一致、试剂含量不一致等的影响。

Description

一种多重熔解曲线的软件分析方法
技术领域
本发明涉及软件分析方法领域，尤其是涉及一种多重熔解曲线的软件分析方法。
背景技术
熔解曲线(Melting Curve)是显示DNA双链结构的熔解程度随温度升高而变化的曲线，不同的DNA双链由于碱基序列、片段长度与GC含量的不同，其熔解温度Tm(总DNA双链熔解一半时的温度)也将不同。
基于此原理，熔解曲线常用于分析目标基因的非特异性扩增情况、突变情况以及拷贝数变异等。目前，市面上已有能够进行熔解曲线实验的配套仪器及试剂，但却很少有能够分析熔解曲线的方案提供给用户。
因此，研发一种能够自动分析多重熔解曲线的软件分析方案，仍是市场所急需的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种多重熔解曲线的软件分析方法。
为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种多重熔解曲线的软件分析方法，包括：
S1，获取或接收包括多条多重熔解曲线的数据集；
S2，对所述数据集中的每条多重熔解曲线进行校正，获得归一化的多重熔解曲线；
S3，根据归一化的多重熔解曲线，计算得到目标峰；
S4，对归一化的目标峰进行聚类分析，确定目标基因的类别。
优选地，每条所述多重熔解曲线包括熔解前区域、熔解区及熔解后区域，所述熔解区包括至少一个熔解段，且所述多个熔解段中，其中一个为参考基因的熔解段，其它的均为目标基因的熔解段。
优选地，每条所述多重熔解曲线包括多个数据点，每个所述数据点对应一对坐标值。
优选地，所述S2包括：
S21，统计所述数据集中的最大降幅，按最大降幅比例的经验值设定阴阳性阈值，并根据所述阴阳性阈值去除所述数据集中的阴性曲线；
S22，定位去除阴性曲线后的数据集的熔解前区域和熔解后区域；
S23，根据所述数据集的熔解前区域与熔解后区域，去除每条多重熔解曲线的背景曲线，获得无背景曲线的第一多重熔解曲线；
S24，对所述第一多重熔解曲线进行归一化，获得归一化后的第二多重熔解曲线。
优选地，所述S22包括：
S221，对每条多重熔解曲线进行开窗，得到多个窗区，依次计算每个窗区的线性相关系数，并根据所述线性相关系数判断当前窗区是否为目标区域，其中，每个窗区的开窗长度为n个数据点，n为大于等于1的整数；
S222，统计去除阴性曲线后的数据集内所有多重熔解曲线的熔解前区域的最小起始温度，根据所述最小起始温度确定数据集的熔解前区域；统计S1数据集内所有多重熔解曲线的熔解后区域的最大结束温度，根据所述最大结束温度确定数据集的熔解后区域。
优选地，所述n的范围由多重熔解曲线的x轴的温度间距决定，其计算公式为：
Figure BDA0002338738950000021
其中，step为温度间距。
优选地，所述S221中，判断当前窗区是否为目标区域的过程包括：若当前窗区的线性相关系数比前两个窗区的线性相关系数大，且比后一个窗区的线性相关系数大，则判定当前窗区为目标区域。
优选地，所述S23包括：
S231，根据数据集的熔解前区域与熔解后区域，计算每条多重熔解曲线的背景曲线，计算公式如下：
y＝c×ea(x-T0)，
Figure BDA0002338738950000031
Figure BDA0002338738950000032
其中，y表示计算所得的背景曲线，
k0为熔解前区域的拟合直线的斜率，
k1为熔解后区域的拟合直线的斜率，
T0为熔解前区域的平均温度，
T1为熔解后区域的平均温度；
S232，用多重熔解曲线减去背景曲线，得到无背景曲线的所述第一多重熔解曲线。
优选地，所述S24中，归一化的公式如下：
Figure BDA0002338738950000033
其中，F2为归一化后的第二多重熔解曲线，F1为第一多重熔解曲线，Max，Min分别为F1的最大值与最小值。
优选地，所述S3包括：
S31，对每条归一化的第二多重熔解曲线进行负一阶导的计算，得到峰值曲线；
S32，对每条所述峰值曲线进行开窗，且在峰值曲线上搜索目标峰；
S33，根据参考基因的熔解温度，确定参考峰；
S34，将峰值曲线归一化，得到归一化峰值曲线上的目标熔解峰。
优选地，所述S4包括：
S41，根据标准品的类别，确定目标熔解峰的聚类分析的类别；
S42，将所有目标熔解峰根据峰高进行聚类，并将每个目标熔解峰类别映射到标准品的相应类别中；
S43，统计每个目标熔解峰类别的均值与方差，并根据所述均值与方差估计当前目标熔解峰类别在其映射的标准品相应类别中的概率；
S44，根据所述概率及预设的概率阈值，判断目标熔解峰分类正确与否。
本发明的有益效果是：提供了一种用于多重熔解曲线的软件分析方案，通过对多重熔解曲线的数据集进行校正，归一化和聚类，实现自动对多重熔解曲线进行分析及判定，且消除仪器间孔位的温度差、光路不一致、样本含量不一致、试剂含量不一致等的影响。
附图说明
图1是多重熔解曲线示意图；
图2是本发明实施例进行多重熔解曲线分析的流程示意图；
图3是本发明包括多条多重熔解曲线的数据集示意图；
图4是本发明标识有阴阳性阈值线，熔解前起始温度线，熔解前结束温度线，熔解后起始温度线，熔解后结束温度线的多重熔解曲线示意图；
图5是校正后的数据集示意图；
图6是归一化的峰值曲线集。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明所揭示的一种多重熔解曲线的软件分析方法，通过对多重熔解曲线的数据集进行校正，归一化和聚类，实现自动对多重熔解曲线进行分析及判定，且消除仪器间孔位的温度差、光路不一致、样本含量不一致、试剂含量不一致等的影响。
多重熔解曲线如图1所示，每条多重熔解曲线包括熔解前区域，熔解区以及熔解后区域。所述熔解区可包括至少一个的熔解段(如熔解段1、熔解段2……)，所有熔解段中，其中一个作为参考基因的熔解段，其它的则均为目标基因的熔解段。且每条多重熔解曲线包括多个数据点，每个数据点对应一对坐标值。
如图2所示，本发明实施例所揭示的一种多重熔解曲线的软件分析方法，用于测定目标基因的拷贝数变异情况，所述方法具体包括：
S1，获取或接收包括多条多重熔解曲线的数据集。
本实施例中，通过导入实验数据以获得所述数据集，获得的数据集如图3所示，图3中的y轴和x轴分别表示荧光强度(RFU)和温度(Temperature)。
S2，对所述数据集中的每条多重熔解曲线进行校正，获得归一化的多重熔解曲线。
具体地，所述S2包括：
S21，统计数据集中的最大降幅，按最大降幅比例的经验值设定阴阳性阈值，并根据阴阳性阈值去除数据集中的阴性曲线。
本实施例中，根据步骤S1中获取或接收的数据集，统计该数据集中的最大降幅，将最大降幅的20％定义为阴阳性阈值，如图4所示的水平阈值线。根据这个阴阳性阈值，将数据集中降幅小于这个阴阳性阈值的多重熔解曲线剔除，直接判定为阴性曲线。在后续的所有步骤中，剔除的多重熔解曲线不再参与计算。这里的最大降幅即是图4曲线中y轴的最大值(即曲线最大值Max)和最小值(即曲线最大值Min)之间的降幅，最大降幅比例的经验值是根据不同检测目标而设定的，不同数据集对应的经验值可能不同，即不限定是这里的20％。
S22，定位去除阴性曲线后的数据集的熔解前区域和熔解后区域。
具体地，所述S22具体包括：
S221，对每条多重熔解曲线进行开窗，得到多个窗区，依次计算每个窗区的线性相关系数，并根据所述线性相关系数判断当前窗区是否为目标区域，其中，每个窗区的开窗长度为n个数据点，n为大于等于1的整数。
其中，n的范围由多重熔解曲线的x轴的温度间距决定，其计算公式为：
Figure BDA0002338738950000061
其中，step为温度间距。
判断当前窗区是否为目标区域的过程包括：若当前窗区的线性相关系数比前两个窗区的线性相关系数大，且比后一个窗区的线性相关系数大，则判定当前窗区为目标区域。若从多重熔解曲线左侧开始进行开窗，得到的目标区域为熔解前区域，若从多重熔解曲线右侧开始进行开窗，得到的目标区域为熔解后区域。
S222，统计去除阴性曲线后的数据集内所有多重熔解曲线的熔解前区域的最小起始温度，根据所述最小起始温度确定数据集的熔解前区域；及统计S1数据集内所有多重熔解曲线的熔解后区域的最大结束温度，根据所述最大结束温度确定数据集的熔解后区域。
本实施例中，结合图3和图4所示，最小起始温度所在的熔解前区域即为当前数据集的熔解前区域，最大结束温度所在的熔解后区域为当前数据集的熔解后区域。如图4所示的四条垂直直线，从左往右分别代表多重熔解曲线集的熔解前区域的起始温度、结束温度，熔解后区域的起始温度、结束温度。其中，熔解前区域的起始温度为这里的最小起始温度，熔解后区域的结束温度为这里的最大结束温度，且熔解前区域的起始温度与结束温度之间为确定的数据集的熔解前区域，熔解后区域的起始温度与结束温度之间为确定的数据集的熔解后区域。
S23，根据数据集的熔解前区域与熔解后区域，去除每条多重熔解曲线的背景曲线，获得无背景曲线的第一多重熔解曲线。
本实施例中，首先根据数据集的熔解前区域与熔解后区域，计算每条多重熔解曲线的背景曲线，计算公式如下：
y＝c×ea(x-T0)；
Figure BDA0002338738950000071
Figure BDA0002338738950000072
其中，y为计算所得的背景曲线；
k0为熔解前区域的拟合直线的斜率；
k1为熔解后区域的拟合直线的斜率；
T0为熔解前区域的平均温度；
T1为熔解后区域的平均温度。
然后，用多重熔解曲线减去背景曲线，如计算公式表示为：F1＝F-y，其中，F为多重熔解曲线，y为上述背景曲线，得到无背景曲线的第一多重熔解曲线，记为曲线F1。减去多重熔解曲线的背景曲线，可以减少背景对测定结果的影响。
S24，对所述第一多重熔解曲线进行归一化，获得归一化后的第二多重熔解曲线。
本实施例中，归一化的公式如下：
Figure BDA0002338738950000073
其中，Max，Min分别为F1的最大值与最小值，F2为归一化后的第二多重熔解曲线。图4所示的数据集，经归一化后得到的曲线集如图5所示。其中，这里的Max表示曲线F1的y轴的最大值，Min表示曲线F1的y轴的最小值。
S3，根据归一化的多重熔解曲线，计算得到目标峰。
其中，目标峰包括参考峰和目标熔解峰，计算得到的目标峰是用于判定目标基因是否变异的特征。
本实施例中，步骤S3具体包括：
S31，对每条归一化的第二多重熔解曲线进行负一阶导的计算，得到峰值曲线。
S32，对每条所述峰值曲线进行开窗，且在峰值曲线上搜索目标峰。
本实施例中，开窗长度为n个数据点，其中，n为大于等于1的整数。
S33，根据参考基因的熔解温度，确定参考峰。
S34，将峰值曲线归一化，得到归一化后峰值曲线上的目标熔解峰。
具体地，本实施例中，对所有峰值曲线，进行放缩，平移操作，将所有的参考峰重叠在一起，得到归一化的参考峰，同样对目标熔解峰进行相同的放缩与平移，得到归一化峰值曲线上的目标熔解峰。归一化后的峰值曲线集，如图6所示。
S4，对归一化的目标峰进行聚类分析，确定目标基因的类别。
本实施例中，步骤S4具体包括：
S41，根据标准品的类别，确定目标熔解峰的聚类分析的类别。这里的标准品是预先知道类别的样品。
S42，将所有目标熔解峰根据峰高进行聚类，并将每个目标熔解峰类别映射到标准品的相应类别中。聚类实施时可采用但不限于K均值聚类法实现。
S43，统计每个目标熔解峰类别的均值与方差，并根据所述均值与方差估计当前目标熔解峰类别在其映射的标准品相应类别中的概率。
S44，根据所述概率及预设的概率阈值，确定目标熔解峰分类正确与否。
具体地，本实施例中，将小于预设的概率阈值的目标熔解峰定义为分类不正确，反之，将高于预设的概率阈值的目标熔解峰定义为分类正确。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种多重熔解曲线的软件分析方法，其特征在于，所述方法包括：
S1，获取或接收包括多条多重熔解曲线的数据集；
S2，对所述数据集中的每条多重熔解曲线进行校正，获得归一化的多重熔解曲线；
S3，根据归一化的多重熔解曲线，计算得到目标峰；
S4，对归一化的目标峰进行聚类分析，确定目标基因的类别。
2.根据权利要求1所述的软件分析方法，其特征在于，每条所述多重熔解曲线包括熔解前区域、熔解区及熔解后区域，所述熔解区包括至少一个熔解段，且所述多个熔解段中，其中一个为参考基因的熔解段，其它的均为目标基因的熔解段。
3.根据权利要求1所述的软件分析方法，其特征在于，所述S2包括：
S21，统计所述数据集中的最大降幅，按最大降幅比例的经验值设定阴阳性阈值，并根据所述阴阳性阈值去除所述数据集中的阴性曲线；
S22，定位去除阴性曲线后的数据集的熔解前区域和熔解后区域；
S23，根据所述数据集的熔解前区域与熔解后区域，去除每条多重熔解曲线的背景曲线，获得无背景曲线的第一多重熔解曲线；
S24，对所述第一多重熔解曲线进行归一化，获得归一化后的第二多重熔解曲线。
4.根据权利要求3所述的软件分析方法，其特征在于，所述S22包括：
S221，对每条多重熔解曲线进行开窗，得到多个窗区，依次计算每个窗区的线性相关系数，并根据所述线性相关系数判断当前窗区是否为目标区域，其中，每个窗区的开窗长度为n个数据点，n为大于等于1的整数；
S222，统计去除阴性曲线后的数据集内所有多重熔解曲线的熔解前区域的最小起始温度，根据所述最小起始温度确定数据集的熔解前区域；及统计S1数据集内所有多重熔解曲线的熔解后区域的最大结束温度，根据所述最大结束温度确定数据集的熔解后区域。
5.根据权利要求4所述的软件分析方法，其特征在于，所述S221中，n的范围由多重熔解曲线的x轴的温度间距决定，其计算公式为：
Figure FDA0002338738940000021
其中，step为温度间距。
6.根据权利要求4所述的软件分析方法，其特征在于，所述S221中，判断当前窗区是否为目标区域的过程包括：若当前窗区的线性相关系数比前两个窗区的线性相关系数大，且比后一个窗区的线性相关系数大，则判定当前窗区为目标区域。
7.根据权利要求3所述的软件分析方法，其特征在于，所述S23包括：
S231，根据数据集的熔解前区域与熔解后区域，计算每条多重熔解曲线的背景曲线，计算公式如下：
y＝c×ea(x-T0)，
Figure FDA0002338738940000022
Figure FDA0002338738940000023
其中，y表示计算所得的背景曲线；
k0为熔解前区域的拟合直线的斜率，
k1为熔解后区域的拟合直线的斜率，
T0为熔解前区域的平均温度，
T1为熔解后区域的平均温度；
S232，用多重熔解曲线减去背景曲线，得到无背景曲线的所述第一多重熔解曲线。
8.根据权利要求3所述的软件分析方法，其特征在于，所述S24中，归一化的公式如下：
Figure FDA0002338738940000031
其中，F2为归一化后的第二多重熔解曲线，F1为第一多重熔解曲线，Max，Min分别为F1的最大值与最小值。
9.根据权利要求1所述的软件分析方法，其特征在于，所述S3包括：
S31，对每条归一化的第二多重熔解曲线进行负一阶导的计算，得到峰值曲线；
S32，对每条所述峰值曲线进行开窗，且在峰值曲线上搜索目标峰；
S33，根据参考基因的熔解温度，确定参考峰；
S34，将峰值曲线归一化，得到归一化峰值曲线上的目标熔解峰。
10.根据权利要求1所述的软件分析方法，其特征在于，所述S4包括：
S41，根据标准品的类别，确定目标熔解峰的聚类分析的类别；
S42，将所有目标熔解峰根据峰高进行聚类，并将每个目标熔解峰类别映射到标准品的相应类别中；
S43，统计每个目标熔解峰类别的均值与方差，并根据所述均值与方差估计当前目标熔解峰类别在其映射的标准品相应类别中的概率；
S44，根据所述概率及预设的概率阈值，确定目标熔解峰分类正确与否。
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