CN101633961B - 循环“连接－延伸”基因组测序法 - Google Patents

Abstract

循环“连接-延伸”DNA测序方法，基于SOLiD测序技术的连接法测序原理，采用一条测序引物连接一段通用寡核苷酸后，通过延伸一个碱基检测DNA模板对应位置的碱基信息，然后将标记物从测序引物连接的寡核苷酸中某个位置切割，按照同样的方法再连接相同的寡核苷酸后延伸一个标记单体，依次可以测定DNA模板上若干间隔位置的碱基信息；将上一完成若干间隔位置碱基序列测定的测序引物通过变性或消化法清除，更换新测序引物，同样按照“连接-延伸”法测定DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息；循环更换测序引物，最后将这些测序引物确定的间隔位置碱基信息组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息，实现DNA序列检测。

Description

循环“连接-延伸”基因组测序法

技术领域

本发明涉及基因测序技术，尤其是一种循环“连接—延伸”基因组测序法，属于生物医学技术领域。 

背景技术

现有基因测序技术有以下几种 

1、焦磷酸测序法(Pyrosequencing) 

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。它可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。但是，与此同时，焦磷酸测序技术可以检测核苷，但是会出错，因为这项技术很难区分单一碱基和一串类似的相邻碱基之间的不同，其运用具有一定的局限性。 

2、Solexa测序技术 

将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片断，在片断的两个末端加上接头，利用专利的芯片：其芯片表面连接有一层单链引物，DNA片断成单链后通过芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上，引物扩增使得单链DNA成为双链，该双链变性后成为单链，其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”。这样的反应在上千万DNA单分子上发生，形成的单链桥以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增，经过30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇群”。“DNA簇群”在Genome Analyzer综合分析仪上进行序列分析。序列合成反应体系包括有引物、DNA聚合酶、4种标记了不同荧光的核苷酸，每个核苷酸的碱基被保护基团封闭。每次反应掺入一个核苷酸，该核苷酸类别可通过标记荧光进行识别，经过扫描，读取该次反应颜色后，位于碱基末端的保护基团被除去，继续下一轮反应，如此反复，得出片段的精确序列。该技术读长为30-35个核苷酸。 

3.SOLiD测序技术 

SOLiD测序技术中首先将DNA经物理方法处理成几百碱基左右的片段，两端与接头相连接，与Adaptor相连的DNA片段和固定有与接头序列互补序列的磁珠混合后，进行Emulsion PCR。PCR扩增结束后，将变性DNA单链与磁珠移至载玻片上。 

连接法测序：测序引物与接头可以互补杂交，其5’端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接(该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点)。当其标记颜色被读取后，即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断，以移除标记，进行下一轮反应，依此循环。在第一轮反应中，可以得到确定的碱基位点为：4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程，偏移一位碱基，使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应，可以确定的碱基位点包括：3、4、8、9、13、14等，如此往复，直至偏移至引物的第一个碱基(即待测序列0位点碱基)。由于该位点碱基已知，可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型，然后，又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型，依此类推，直至整个序列读序完成。此技术目前的读长为30至35个碱基。 

SOLiD System Overview的测序原理及其特点 

目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454(GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。 

实验室引进的SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI(Applied Biosystems)公司生产的高通量测序仪。目前这台SOLiD运行稳定，SOLiD实验及数据分析小组也可以为大家提供专业的技术服务。所以接下来的关键是如何把SOLiD测序仪应用到符合其技术特点的科研项目中。 

SOLiD关键技术及其原理 

SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 

SOLiD文库构建 

使用SOLiD测序时，可根据实际需要，制备片段文库(fragment library)或末端配对文库(mate-paired library)。简单地说，制备片段文库就是在短DNA片段(60～110bp)两端加上SOLiD接头(P1、P2adapter)。 

油包水PCR 

文库制备得到大量末端带P1、P2adapter但内部插入序列不同的DNA双链模板。和普通PCR一样，油包水PCR也是在水溶液进行反应，该水相含PCR所需试剂，DNA模板及可分别与P1、P2adapter结合的P1、P2PCR引物。 

油包水PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。SOLiD测序把小水滴体积及水相中DNA模板和磁珠的个数比等重要参数进行了技术优化和流程固定，尽可能提高“优质小水滴”(水滴中只含一个DNA模板一个P1磁珠)的数量，为后续SOLiD测序提供只含有一种DNA模板扩增产物的高质量P1磁珠。 

含DNA模板P1磁珠的固定 

SOLiD测序反应在SOLiD玻片表面进行。含有DNA模板的P1磁珠共价结合在SOLiD玻片表面。磁珠是SOLiD测序的最小单元。每个磁珠SOLiD测序后形成一条序列。 

SOLiD双碱基编码原理及测序流程 

SOLiD“双碱基编码原理”实质上是阐明了荧光探针的颜色类型与探针编码区碱基对的对应关系。SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针5’末端可分别标记荧光染料；探针3’端1～5位为随机碱基，可以是“A，T，C，G”四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，“双碱基编码矩阵”规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3～5位的“n”表示随机碱基，6～8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基，由上可知，SOLiD连接反应底物中共有45种底物探针。 

单向SOLiD测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应(一般情况下，片段文库是7次，mate-paired文库是5次，所以片段文库共有35个连接反应，而末端配对文库共有25次连接反应)。每轮测序反应的第一次连接反应由与P1引物区域互补的“连接引物”介导。这五种连接引物长度相同，但在P1引物区域的位置相差一个碱基(分别用n，n-1，n-2，n-3，n-4表示)，都含有5’端磷酸，所以可以介导连接反应的进行。现以图5所示一个磁珠上发生的SOLiD测序反应为例进行说明。 

数据分析原理 

SOLiD测序完成后，获得了由颜色编码组成的SOLiD原始序列。理论上来说，按照“双碱基编码矩阵”，只要知道所测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解码”成碱基序列。但由于双碱基编码规则中双碱基与颜色信息的兼并特性(一种颜色对应4种碱基对)，前面碱基的颜色编码直接影响紧跟其后碱基的解码，所以一个错误颜色编码就会引起“连锁解码错误”，改变错误颜色编码之后的所有碱基。和所有其它测序仪一样，测序错误在所难免，关键是对测序错误的评价和后续处理。为避免“连锁解码错误”的发生，SOLiD数据分析软件不直接将SOLiD原始颜色序列解码成碱基序列，而是依靠reference序列进行后续数据分析。SOLiD序列分析软件首先根据“双碱基编码矩阵”把reference碱基序列转换成颜色编码序列，然后与SOLiD原始颜色序列进行比较，来获得SOLiD原始颜色序列在reference的位置，及两者的匹配性信息。Reference转换而成的颜色编码序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有两种情况：“单颜色不匹配”和“两连续颜色不匹配”。由于每个碱基都被独立地检测两次，且SNP位点将改变连续的两个颜色编码，所以一般情况下SOLiD将单颜色不匹配处理成测序错误，这样一来，SOLiD分析软件就完成了该测序错误的自动校正；而连续两颜色不匹配也可能是连续的两次测序错误，SOLiD分析软件将综合考虑该位置颜色序列的一致性及质量值来判断该位点是否为SNP。 

SOLiD技术可对具有reference基因组序列的物种进行重测序，鉴定SNP，indel及基因组结构变化；对含有全基因组序列且转录本注释较好的物种开展转录组学研究，解析细胞转录产物的数量变化及其结构信息。但SOLiD测序所得序列的长度只有几十个碱基， 数据分析过程依赖reference序列，目前尚没有基于SOLiD原始颜色序列的从头拼接(denovo assembly)软件，这些不足之处大大限制了SOLiD技术在新物种测序领域的应用。SOLiD测序仪内在技术特点决定其并不适合每个测序项目。要根据实际情况(物种基因组研究现状和测序通量要求等)理性判断。 

目前完成一个哺乳动物全基因组的测序大约需要上千万美元。大幅度降低DNA测序成本将会给生命科学和医学的研究方式带来革命性的变化。快速低成本人类全基因组测序技术正在全世界范围内高速发展，已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。由于目前的DNA测序方法均应用PCR产物作为测序模板，因此很难实现人类全基因组的高覆盖度再测序，而且测序成本还很高。 

为了实现高通量，低成本快速的DNA检测方案，使得全基因组DNA测序成本能够被一般人能接受，为以后充分开发利用DNA序列信息为人类进行疾病诊断与预防，实现个性化的医疗方案，以及药物开发，生物工程等领域的具体研究具有重要而深远的意义，应该说上述的几种方法都具有很高的应用价值，但都存在许多不足。 

发明内容

本发明目的是克服现有技术之不足，提供一种新的高通量测序策略，即循环“连接-延伸”DNA测序方法，其技术方案如下： 

循环“连接-延伸”DNA测序方法，基于SOLiD测序技术的连接法测序原理，其特征在于：采用一条测序引物连接一段通用寡核苷酸后，通过延伸一个碱基检测DNA模板对应位置的碱基信息，然后将标记物从测序引物连接的寡核苷酸中某个位置切割，按照同样的方法再连接相同的寡核苷酸后延伸一个标记单体，依次可以测定DNA模板上若干间隔位置的碱基信息；将上一完成若干间隔位置碱基序列测定的测序引物通过变性或消化法清除，更换新测序引物，同样按照“连接-延伸”法测定DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息；循环更换测序引物，最后将这些测序引物确定的间隔位置碱基信息组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息，实现DNA序列检测。 

测序步骤包括： 

(1)通用引物与模板链的其起始片段连接，探针混合物与模板反应，第4、第5位上恰与模板链互补配对的探针与模板结合，诱发荧光显色； 

(2)用现有化学的方法从探针第5位点后的切割位点切去末三位碱基； 

(3)接着，从模板的第6位碱基开始，与探针混合物进行反应，重复以上步骤，得到第4位开始之后每间隔5位，与第5位开始之后每间隔5位所形成的相邻两个碱基(如9，10，14，15，19，20位)的颜色信息； 

(4)循环进行以上步骤，直至得到序列中所有满足(3)中条件的相邻碱基颜色信息； 

(5)将上一引物通过消化法清除，新的通用引物向前移动一位，探针的连接位置也就向前移动了一位，相同的方法我们们可以得到模板链第3、第4位的相邻碱基颜色信息； 

(6)促灭荧光，重复相同的步骤，即可得到该序列的3，4位；8，9位；13，14位等两两位点颜色信息； 

(7)将通用引物依次向前移动，循环实验即可得到模板上所有相邻位点的颜色信息； 

(8)在已知模板序列第一个碱基的情况下，依据所用SOLiD仪器识别的的四色标记矩阵即可推断出全序列的信息。 

基因组是由A，T，C，G四种碱基组成的，将四种碱基两两分别组合，依据已定义四色定义矩阵，就可以将一条序列的所有相邻的碱基用颜色定义出来，测序时就用相应颜色的荧光标记探针。 

我们采用的探针长度为八个碱基，第4、第5两个碱基为特异结合位点，当这两个位置上的碱基恰与模板链相应位置上的碱基互补配对时，连在探针尾部的荧光便会发光。 

本发明的优点及显著效果： 

1)基因组DNA片段化和环化，以环状DNA为模板，采用滚环扩增技术，制备多拷贝的单分子DNA测序模板阵列，构建全基因组的多拷贝单分子微阵列测序模板芯片。该创新DNA测序思路是该新型人类全基因组测序技术的核心； 

2)碱基逐步加入的在片延伸测序方法，使测序变为一个连续的过程； 

3)用光学方法从芯片上所有DNA测序模板分子上读取碱基延伸的信息；5整合所有序列的信息，进行拼接和在基因组上的定位，最终完成对人类全基因组DNA序列的再测定。 

4)本发明方法可以在保证准确率的前提之下，使得高通量并行测序成为可能，为快速自动化测序提供可能，从而有可能通过自动化仪器实现测序工作，具有很大的应用前景。 

附图说明

图1是本发明碱基编码原理图； 

图2是本发明探针结构图； 

图3-9是本发明测序步骤对应图示； 

图10是本发明实验结果分析； 

图11、12是本发明测序方法及原理示意图； 

图13是本发明连接时间的确定的结果； 

图14是本发明切割反应时间与切割连接效率关系的测定。 

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。 

参看图1，基因组是由A，T，C，G四种碱基组成的，将四种碱基两两分别组合，我们们人为定义以下这样的四色定义矩阵，这样我们们就可以将一条序列的所有相邻的碱基用颜色定义出来，测序时就用相应颜色的荧光标记探针。 

参看图2，特异性探针长度为八个碱基，第四、第五两个碱基为特异结合位点，当这两个位置上的碱基恰与模板链相应位置上的碱基互补配对时，连在探针尾部的荧光便会发光。 

参看图3，是测序步骤(1)通用引物与模板链的其起始片段连接，探针混合物与模板反应，第四、第五位上恰与模板链互补配对的探针与模板结合，诱发荧光显色。 

参看图4，是测序步骤(2)用化学的方法从探针第五位点后的切割位点切去末三位碱基。 

参看图5，是测序步骤(3)从模板的第六位碱基开始，与探针混合物进行反应，重 复以上步骤，得到第九、第十位等等的相邻碱基颜色信息。 

参看图6，是测序步骤(4)循环进行以上步骤，直至得到第九、第十位，第14、15位等等两两相邻碱基颜色信息。 

参看图7，是测序步骤(5)将上一引物通过消化法清除，新的通用引物向前移动一位，探针的连接位置也就向前移动了一位，相同的方法我们们可以得到模板链第三、第四位的相邻碱基颜色信息。 

参看图8，是测序步骤(6)促灭荧光，重复相同的步骤，即可得到该序列的3，4位；8，9位；13，14位等两两位点颜色信息。 

参看图9，是测序步骤(7)将通用引物依次向前移动，循环实验即可得到模板上所有相邻位点的颜色信息。 

参看图10，实验结果中，第4，8，12，16，20位碱基分别由标记碱基C，C，C，A，A给出信号，因此模板上对应的碱基分别为G，G，G，T，T。 

参看图11，循环“连接-延伸”DNA测序方法：采用一条测序引物连接一段通用寡核苷酸后，通过延伸一个碱基检测DNA模板对应位置的碱基信息，然后将标记物从测序引物连接的寡核苷酸中某个位置切割，按照同样的方法再连接相同的寡核苷酸后延伸一个标记单体，依次可以测定DNA模板上若干间隔位置的碱基信息。 

将上一完成若干间隔位置碱基序列测定的测序引物通过变性或消化法清除，更换新测序引物，同样按照“连接-延伸”法测定DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息；循环更换测序引物，最后将这些测序引物确定的间隔位置碱基信息组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息，实现DNA序列检测(见图12)。 

图11、12结合图注说明如下：未知序列的DNA模板1通过5‘固定到固相载体2上，并用测序引物3与DNA模板完成杂交反应如a)；在DNA模板知道下，通过连接酶的作用将8个碱基的通用寡核苷酸序列4与测序引物3完成连接反应如b)；然后加入四种标记单体5(ddATP标记单体5-1、ddGTP标记单体5-2、ddCTP标记单体5-3、ddTTP标记单体5-4，四种单体标记不同颜料)完成延伸反应如c)；扫描确定对应模板第一个碱基的信息，使用适当的化学试剂将离标记物从末端第二个碱基处进行切割反应如d)；依次按照“连接-延伸”的方法实现DNA模板上若干间隔位置的碱基信息。 

按照图1的方法采用测序引物P1将DNA模板上第9、16、23、30、……、等位置上的碱基信息确定。然后将测序引物P1从DNA模板中清除变性(消化)反应a)，再采用测序引物P2将DNA模板上第8、15、22、29、……、等位置上的碱基信息确定，依次更换测序引物将DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息确定，其中P8，P9引物不需要进行连接反应，只需要进行一步延伸反应确定一个碱基的信息。最后将这些碱基信息全部组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息实现DNA序列。 

测序化学方法和实验条件 

1.碱基测定的特异性 

采用固定人工合成的寡核苷酸序列作为DNA测序模板，通过两组双色标记单体的方式进行单个碱基的检测。实验结果表明该方法单个碱基的检测具有高的特异性(只有标记碱 基G给出了信号，说明DNA模板上对应得碱基为C)(参见图13)。图注在固定合成DNA模板的两个区域分别用双色标记单体(a：A-Cy5+G-Cy3；b：C-Cy5/T-Cy3)进行碱基检测的结果。 

2.连接时间的确定(参见图13) 

连接20分钟后荧光强度增加量已经很少，20分钟是最佳连接时间。 

3.连接次数的确定 

连接效率60％时，连接1、2、3、4次中未连接所占比例(0.4；0.16；0.064；0.026)连接效率60％时，连接1、2、3、4次中未连接所占比例(0.4；0.16；0.064；0.026) 

4.切割反应时间与切割连接效率关系(参见图14) 

由图可知，随着切割时间的越长，切割效率越高，当切割时间达到15分钟后，切割效率变化不大，故选择15分钟作为切割反应时间。 

5.切割条件对待测摸板的影响 

对摸板的影响考察1：64个点杂交-连接-酶切(18h，中间加酶1次)，变性，荧光引物杂交对比实验：64个点杂交-连接-不酶切(18h处理)，变性，荧光引物杂交总平均值之比：(酶切/不酶切)[(20433/38713＝0.52)；(最小值/最大值＝0.35)] 

6.结果验证：使用循环“连接-延伸”测序法测得前5个碱基测定的结果，如下： 

Claims (1)

1.循环“连接——延伸”基因组测序法，基于SOLiD测序技术的连接法测序原理，其特征在于：采用一条测序引物连接一段通用寡核苷酸后，通过延伸一个碱基检测DNA模板对应位置的碱基信息，然后将标记物从测序引物连接的寡核苷酸中引物末端位置切割，按照同样的方法再连接相同的寡核苷酸后延伸一个标记单体，依次可以测定DNA模板上若干间隔位置的碱基信息；将上一完成若干间隔位置碱基序列测定的测序引物通过变性或消化法清除，更换新测序引物，同样按照“连接-延伸”法测定DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息；循环更换测序引物，最后将这些测序引物确定的间隔位置碱基信息组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息，实现DNA序列检测；包括以下步骤：

(1)未知序列的DNA模板通过5’端固定到固相载体上，并用测序引物与DNA模板完成杂交反应；在DNA模板的指导下，通过连接酶的作用将8个碱基的通用寡核苷酸序列与测序引物完成连接反应；

(2)加入ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP四种单体，分别用不同的荧光对四种单体进行标记，完成延伸反应；

(3)扫描确定对应模板第一个碱基的信息，使用化学试剂将离标记物从末端第二个碱基处进行切割反应；

(4)依次按照“连接-延伸”的方法实现DNA模板上若干间隔位置的碱基信息：

1)采用测序引物P1将DNA模板上第9、16、23、30、……位置上的碱基信息确定；

2)然后将测序引物P1从DNA模板中清除变性，再采用测序引物P2将DNA模板上第8、15、22、29、……位置上的碱基信息确定；

3)依次更换测序引物将DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息确定，其中P8，P9引物不需要进行连接反应，只需要进行一步延伸反应确定一个碱基的信息，最后将这些碱基信息全部组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息实现DNA序列。

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