CN115963094A - 用于荧光检测的多通道光学系统及补偿方法、存储介质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于荧光检测的多通道光学系统及补偿方法、存储介质，该系统包括多个单通道，不同单通道的荧光染料的光谱特性不同，多个单通道直线或并列或矩阵排布，单通道包括激发光路和探测光路，激发光路用于激发样品内荧光物质发出荧光，探测光路用于探测样品内激发出的荧光。本发明根据不同通道的荧光染料的光谱特性，选择对应的光源，配合各通道选择的光源，选取合适的滤光片、二向色镜组合，使之与每个通道的光谱一一对应，实现多通道荧光检测；并且各通道滤光片的波段相互错开，减少各光谱的重叠，即通过光学件的选取能够完全避免串色问题，并有效减弱荧光串扰。经过补偿之后，荧光通道数据实现了解耦。

Description

用于荧光检测的多通道光学系统及补偿方法、存储介质

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于荧光检测的多通道光学系统及补偿方法、存储介质。

背景技术

荧光定量PCR检测，是分子生物学常用的检测手段，主要用于对生物的DNA和RNA进行检测。其操作是在PCR过程中，加入特定的荧光基团，通过检测荧光值的上升，推算DNA的量的变化。理论上，检测到的荧光值大小，代表了染料的浓度，即DNA的数量。

在荧光定量PCR仪的检测中，由于激发光谱和发射光谱的重叠以及滤光片过滤带宽，使得各检测通道测得的荧光值均存在不同程度的干扰。光谱重叠的存在，使得测得的信号无法真实反映被测目标的准确值。

发明内容

为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一目的是提供用于荧光检测的多通道光学系统，包括多个单通道，不同单通道的荧光染料的光谱特性不同，多个所述单通道直线或并列或矩阵排布，所述单通道包括激发光路和探测光路，所述激发光路用于激发样品内荧光物质发出荧光，所述探测光路用于探测样品内荧光物质发出的荧光。

进一步地，所述单通道包括第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道和第六通道。

进一步地，所述第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道和第六通道对称并列排布。

进一步地，所述激发光路包括光源、光源准直透镜、激发滤光片、二向色镜及荧光收集透镜，所述光源产生激发光，经过光源准直透镜形成平行光，并经过所述激发滤光片获得所需光谱波段，再通过所述二向色镜发生反射，然后由所述荧光收集透镜将激发光透过PCR管盖聚焦到管内样品，激发样品内荧光物质发出荧光。

进一步地，所述探测光路包括荧光收集透镜、二向色镜、发射滤光片、荧光聚焦透镜及探测器，荧光物质发出的荧光通过所述荧光收集透镜形成平行光，荧光透过二向色镜，再通过所述发射滤光片获得所需光谱波段，然后通过所述荧光聚焦透镜汇聚进入所述探测器。

进一步地，所述第一通道的激发滤光片的中心波长为474nm，带宽为23nm，二向色镜的波长为495nm，发射滤光片的中心波长为513nm，带宽为13nm；

所述第二通道的激发滤光片的中心波长为575nm，带宽为15nm，二向色镜的波长为593nm，发射滤光片的中心波长为605nm，带宽为15nm；

所述第四通道的激发滤光片的中心波长为671nm，带宽为10nm，二向色镜的波长为695nm，发射滤光片的中心波长为725nm，带宽为40nm；

所述第五通道的激发滤光片的中心波长为635nm，带宽为18nm，二向色镜的波长为649nm，发射滤光片的中心波长为662nm，带宽为11nm；

所述第六通道的激发滤光片的中心波长为530nm，带宽为20nm，二向色镜的波长为552nm，发射滤光片的中心波长为563nm，带宽为9nm。

本发明的第二目的是提供用于荧光检测的多通道光学系统的补偿方法，包括以下步骤：

采用单一染料进行实验，得到不同浓度的该染料在各个检测通道的荧光分布情况，测得的数据组成i×n矩阵；其中，n为通道数，i为实验次数；

对该矩阵中的数据进行主成分分析，得到第一主成分向量；

重复以上步骤，对其他通道染料进行同样的单一染料实验和分析，获得其他染料的主成分向量；

将得到的n个主成分向量分别作为矩阵的n个列向量，获得转换矩阵M；

通过转换矩阵M进行荧光补偿，得到荧光补偿后的真实检测结果。

进一步地，还包括以下步骤：

将每种染料分别稀释若干个梯度，将每个梯度进行若干次重复，在预设时间内连续读取，对读取的荧光检测数据进行分析，确定染料的线性范围以及各染料的荧光背景。

进一步地，还包括以下步骤：

将转换矩阵M中的负值设为0，并将转换矩阵M的每一列重新归一化处理，得到新的转换矩阵。

本发明的第三目的是提供一种计算机可读存储介质，其上存储有程序指令，所述程序指令被执行时实现用于荧光检测的多通道光学系统。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了用于荧光检测的多通道光学系统及补偿方法、存储介质，根据不同通道的荧光染料的光谱特性，选择对应的光源，配合各通道选择的光源，选取合适的滤光片、二向色镜组合，使之与每个通道的光谱一一对应。实现多通道荧光检测，并且各通道滤光片的波段相互错开，减少各光谱的重叠，即通过光学件的选取能够完全避免串色问题，并有效减弱荧光串扰。此外，本发明中各通道的空间并列排布方案，也有效解决了串色和荧光串扰问题。

通过补偿方法对采集到的数据进行补偿，经过补偿之后，非目标通道的数据基本呈水平状态，即不随目标通道染料荧光值的上升而变化，实现了荧光通道间数据串扰的解耦。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1的用于荧光检测的多通道光学系统原理图；

图2为实施例1的单通道光路原理图；

图3为实施例2的染料的荧光光谱及对应检测通道示意图；

图4为实施例2的两通道数据分布和其降维后的投影向量示意图；

图5为实施例2的不同浓度染料在各个通道的测试结果示意图；

图6为实施例2的经过串扰补偿后不同浓度染料在各个通道的分布情况示意图；

图7为实施例3的计算机可读存储介质示意图。

图中：1、第一通道；11、光源；12、光源准直透镜；13、激发滤光片；14、二向色镜；15、荧光收集透镜；16、PCR反应管；17、发射滤光片；18、荧光聚焦透镜；19、探测器；2、第二通道；3、第三通道；4、第四通道；5、第五通道；6、第六通道。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

用于荧光检测的多通道光学系统，包括多个单通道，不同单通道的荧光染料的光谱特性不同，多个单通道直线或并列或矩阵排布，单通道包括激发光路和探测光路，激发光路用于激发样品内荧光物质发出荧光，探测光路用于探测样品内荧光物质发出的荧光。

如图1所示，单通道包括第一通道1、第二通道2、第三通道3、第四通道4、第五通道5和第六通道6。其中，第三通道3为定制通道。图1中，第一通道1、第二通道2、第三通道3、第四通道4、第五通道5和第六通道6对称并列排布。

如图2所示，激发光路包括光源11、光源准直透镜12、激发滤光片13、二向色镜14及荧光收集透镜15，实现荧光激发功能。本实施例中，光源11为LED光源。各通道的光源11产生激发光，通过光源准直透镜12形成平行光，经过激发滤光片13获得所需光谱波段，再通过二向色镜14发生反射，然后由荧光收集透镜15将激发光透过PCR反应管16盖聚焦到管内样品，激发样品内荧光物质发出荧光。

探测光路包括荧光收集透镜15、二向色镜14、发射滤光片17、荧光聚焦透镜18及探测器19，实现荧光探测功能。荧光物质发出的荧光通过荧光收集透镜15形成平行光，由于二向色镜14的特性，对于大于一定波长范围的光可以透过二向色镜14而不会发生反射，荧光透过二向色镜14，再通过发射滤光片17获得所需光谱波段，以及滤除杂散光(激发光、其它荧光物质发出的光等)，然后通过荧光聚焦透镜18汇聚进入探测器19。

根据不同通道的荧光染料(探针)的光谱特性，选择LED光源，配合各通道选择的光源11，选取合适的滤光片、二向色镜14组合，使之与每个通道的光谱一一对应。各通道滤光片的波段相互错开，减少各光谱的重叠，即通过光学件的选取可完全避免串色问题，并有效减弱荧光串扰。此外，本实施例中各通道的空间并列排布方案，也有效解决了串色和荧光串扰问题。

在系统设计时，选择合适的激发滤光片13和发射滤光片17组合，以优化激发效率和荧光收集，同时最小化荧光团之间的串扰。

由于很多荧光物质的斯托克斯位移只有30nm左右，因此要求激发滤光片13和发射滤光片17必须有矩形化的通带波形和较高的截止深度。各通道选用LED激发光源均具有特定的光谱曲线，在保证充分的激发功率的同时，还需要考虑荧光基团之间的串扰和其他通道激发光之间的串色问题。其主要矛盾在于：当前通道的发射波长与其他通道的激发波长有一定程度的叠加，如：FAM、HEX、ROX、Cy5的发射波长分别与HEX、ROX、Cy5、Cy5.5的激发波长有一定程度的叠加，因此在考虑较高的检测效率和信噪比的同时，尽可能的减少光谱重叠。第一通道1选用的LED峰值波长在475nm，保证较高激发效率的前提下，选择中心波长474nm，带宽23nm激发滤光片13；第一通道1的发射光谱峰值在518nm，第六通道6的激发光源峰值波长为525nm，激发光谱峰值在533nm左右，为了避免串扰串色等问题，并保证第六通道6具有较好的效果，第一通道1的发射滤光片17选择中心波长513nm，带宽13nm，第六通道6的激发滤光片13选择中心波长530nm，带宽20nm。基于以上原理，第二通道2的激发滤光片13的中心波长为575nm，带宽为15nm，二向色镜14的波长为593nm，发射滤光片17的中心波长为605nm，带宽为15nm；第四通道4的激发滤光片的中心波长为671nm，带宽为10nm，二向色镜14的波长为695nm，发射滤光片17的中心波长为725nm，带宽为40nm；第五通道5的激发滤光片13的中心波长为635nm，带宽为18nm，二向色镜14的波长为649nm，发射滤光片17的中心波长为662nm，带宽为11nm；第六通道6的激发滤光片13的中心波长为530nm，带宽为20nm，二向色镜14的波长为552nm，发射滤光片17的中心波长为563nm，带宽为9nm。本实施例中，第一通道1采用FAM荧光检测通道，第二通道2采用ROX荧光检测通道，第四通道4采用Cy5.5荧光检测通道，第五通道5采用Cy5荧光检测通道，第六通道6采用HEX荧光检测通道。需要说明的是，上述五个通道的实现方式不仅限于使用FAM、HEX、ROX、Cy5、Cy5.5染料，只要能够达到各个通道设定的光学参数即可。上述5个通道滤光片组合及二向色镜14参数如表1所示。

表1实验平台所用光学元件参数表

5种染料的荧光发射光谱及本实验平台所选择的检测通道如图3所示。从图3中可以看出，选择的硬件可以将大部分非目标通道荧光过滤掉，但在各目标通道内，仍或多或少的混入了其他荧光染料的发射光。

实施例2

在多重荧光定量PCR仪中，各染料理论发射荧光值记为染料向量F，该向量中的各个元素是后续分析所需要的，但在实际操作中，由于滤光片的选择、光谱重叠等因素影响，导致测得的检测向量R无法直接用于表示各染料的实际浓度值。向量F与向量R之间存在如下关系：

R＝M·F

其中，转换矩阵M为n×n的方阵，n为荧光染料/检测通道数量，该矩阵即为荧光串扰矩阵。M的列向量表示某染料在各个检测波长下的荧光强度。计算的目标是针对特定系统，得到矩阵M。但在实际检测中，由于无法直接获得染料向量F中各元素的理论值，因此无法通过方程线性求解系数的方式进行计算。

为了方便描述，假设有两种荧光染料dye1和dye2及其对应检测通道channel1和channel2，当取不同浓度的dye1进行实验时，由于荧光光谱的重叠，会有部分荧光进入到channel2中，实验得到的数据如图3所示。其中，X轴为channel1数据，Y轴为channel2数据。在系统硬件一定的情况下，可以看出dye1在channel1和channel2中的比例相对固定，其中的数据波动来源于测量误差。计算荧光串扰，就是要确定dye1在各通道中的读数比例。主成分分析方法是数据分析中常用的降维方法，其原理是通过寻找一组新的坐标系，将原始数据投影至该坐标系下，同时最大限度地保留原始信息。将其原理应用于串扰补偿，对于二维坐标系的情形，若想进行降维，很容易观察到，图4中e所指的方向即为将来降维后新坐标系的基。因此，通过主成分分析方法，找到其第一主成分，其所代表的方向即指出了染料在各个通道的分布情况。以上是在两个通道的情形下进行计算，当通道数增多时，该计算方法的优势将更加明显。

将以上方法拓展到n个染料的情况，则用于荧光检测的多通道光学系统的补偿方法，包括以下步骤：

采用某种单一染料进行实验，得到不同浓度的该染料在各个检测通道的荧光分布情况，测得的数据组成i×n矩阵；其中，n为通道数，i为实验次数；

对该矩阵中的数据进行主成分分析，得到第一主成分向量；其中，得到的主成分表示的并不是某一通道的荧光值，而是一种抽象的混合荧光，虽然如此，但是该主成分所表示的向量，明确地给出各荧光通道所占比例。

通过将第一主成分向量旋转，反向计算得到该染料真正的荧光值或者相对荧光值，同时该染料对其他通道的串扰也得到了量化，通过计算，将该部分串扰从其他通道中剔除；

重复以上步骤，对其他通道染料进行同样的单一染料实验和分析，获得其他染料的主成分向量；

将得到的n个主成分向量分别作为矩阵的n个列向量，获得转换矩阵M；

通过转换矩阵M进行荧光补偿，得到荧光补偿后的真实检测结果。

在实验开始前，需先确定系统荧光染料浓度线性范围。将5种染料分别稀释若干个梯度如8个梯度，为了减少实验误差，每个梯度进行3次重复，10分钟内连续读取，对读取的荧光检测数据进行分析，确定染料的线性范围，同时，确定各染料的荧光背景。

分别在各染料浓度线性范围内，选取16个浓度梯度，加入PBS稀释剂，配制成单一染料溶液，分别将单一染料放入搭建的实验平台，每隔30s读取一次，重复读取20次。对于任意单一染料，每次读数均可得到所有通道荧光检测数据。通过上述补偿方法，利用实验得到的各通道数据，可得到荧光补偿矩阵。

检测结果如图5所示，分别表示用FAM、HEX、ROX、Cy5和Cy5.5单一染料进行测试时，各通道测得的荧光数据。其中，横坐标为相对应染料的荧光值，纵坐标为其余通道的荧光值，图5中数据已被去除荧光背景。

由于实验过程中，系统误差带来的数据波动，导致串扰矩阵中部分元素出现负数，但理论上不应产生负串扰。因此，将负值设为0，并对矩阵的每一列重新归一化，得到新的串扰矩阵如下：

从图6中可以看出，经过补偿之后，非目标通道的数据基本呈水平状态，即不随目标通道染料荧光值的上升而变化，实现了荧光通道间数据串扰的解耦。

实施例3

一种计算机可读存储介质，如图7所示，其上存储有程序指令，程序指令被执行时实现的用于荧光检测的多通道光学系统。关于方法的详细描述，可以参照上述方法实施例中的对应描述，在此不再赘述。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。

以上仅为本说明书实施例而已，并不用于限制本说明书一个或多个实施例。对于本领域技术人员来说，本说明书一个或多个实施例可以有各种更改和变换。凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本说明书一个或多个实施例的权利要求范围之内。本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例。

Claims (10)

1.用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：包括多个单通道，不同单通道的荧光染料的光谱特性不同，多个所述单通道直线或并列或矩阵排布，所述单通道包括激发光路和探测光路，所述激发光路用于激发样品内荧光物质发出荧光，所述探测光路用于探测样品内荧光物质发出的荧光。

2.如权利要求1所述的用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：所述单通道包括第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道和第六通道。

3.如权利要求2所述的用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：所述第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道和第六通道对称并列排布。

4.如权利要求2所述的用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：所述激发光路包括光源、光源准直透镜、激发滤光片、二向色镜及荧光收集透镜，所述光源产生激发光，经过光源准直透镜形成平行光，并经过所述激发滤光片获得所需光谱波段，再通过所述二向色镜发生反射，然后由所述荧光收集透镜将激发光透过PCR管盖聚焦到管内样品，激发样品内荧光物质发出荧光。

5.如权利要求4所述的用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：所述探测光路包括荧光收集透镜、二向色镜、发射滤光片、荧光聚焦透镜及探测器，荧光物质发出的荧光通过所述荧光收集透镜形成平行光，荧光透过二向色镜，再通过所述发射滤光片获得所需光谱波段，然后通过所述荧光聚焦透镜汇聚进入所述探测器。

6.如权利要求5所述的用于荧光检测的多通道光学系统，其特征在于：

所述第一通道的激发滤光片的中心波长为474nm，带宽为23nm，二向色镜的波长为495nm，发射滤光片的中心波长为513nm，带宽为13nm；

所述第二通道的激发滤光片的中心波长为575nm，带宽为15nm，二向色镜的波长为593nm，发射滤光片的中心波长为605nm，带宽为15nm；

所述第四通道的激发滤光片的中心波长为671nm，带宽为10nm，二向色镜的波长为695nm，发射滤光片的中心波长为725nm，带宽为40nm；

所述第五通道的激发滤光片的中心波长为635nm，带宽为18nm，二向色镜的波长为649nm，发射滤光片的中心波长为662nm，带宽为11nm；

所述第六通道的激发滤光片的中心波长为530nm，带宽为20nm，二向色镜的波长为552nm，发射滤光片的中心波长为563nm，带宽为9nm。

7.如权利要求1所述的用于荧光检测的多通道光学系统的补偿方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用单一染料进行实验，得到不同浓度的该染料在各个检测通道的荧光分布情况，测得的数据组成i×n矩阵；其中，n为通道数，i为实验次数；

对该矩阵中的数据进行主成分分析，得到第一主成分向量；

重复以上步骤，对其他通道染料进行同样的单一染料实验和分析，获得其他染料的主成分向量；

将得到的n个主成分向量分别作为矩阵的n个列向量，获得转换矩阵M；

通过转换矩阵M进行荧光补偿，得到荧光补偿后的真实检测结果。

8.如权利要求7所述的用于荧光检测的多通道光学系统的补偿方法，其特征在于：还包括以下步骤：

将每种染料分别稀释若干个梯度，将每个梯度进行若干次重复，在预设时间内连续读取，对读取的荧光检测数据进行分析，确定染料的线性范围以及各染料的荧光背景。

9.如权利要求7所述的用于荧光检测的多通道光学系统的补偿方法，其特征在于：还包括以下步骤：

将转换矩阵M中的负值设为0，并将转换矩阵M的每一列重新归一化处理，得到新的转换矩阵。

10.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有程序指令，所述程序指令被执行时实现如权利要求7至9中任意一项所述的方法。

Images