WO2023003444A1 - 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법 - Google Patents

핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법 Download PDF

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calibration
plate
well
fluorescence signal
difference
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김인겸
김진원
박영용
주영탁
류다미
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주식회사 씨젠
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Definitions

  • the present invention relates to a calibration plate for a nucleic acid reaction detection device, a calibration kit including the same, and a method for preparing the same.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a real time polymerase chain reaction (Real time PCR) device is a PCR-based technology for detecting a signal by a nucleic acid reaction in real time while the nucleic acid reaction is in progress.
  • a specific target nucleic acid is detected by irradiating a reaction product with light and measuring a fluorescence signal generated thereby. Therefore, the real-time PCR device includes a light source and a photodetector, and it is very important to accurately detect the fluorescence signal emitted by the PCR reaction of the target nucleic acid by precisely setting them.
  • the amount of irradiated light (intensity of the light source), the movement of the light source, and the sensitivity of the fluorescence signal of the photodetector may be adjusted according to positions of the wells provided in the plate inserted into the device.
  • multiplex PCR real-time multiplex PCR
  • filters for detecting specific wavelength bands of different fluorescences are used.
  • the plurality of filters have adjacent wavelength bands that may overlap with each other, cross-talk due to overlapping spectra of each fluorescence signal interferes with accurate signal detection. Therefore, multiplex PCR needs to be calibrated with a dye capable of minimizing the effect of crosstalk on the fluorescence signal.
  • the plate may be made of materials such as polypropylene (PP) and polycarbonate (PC) without the sample, and may be, for example, an empty plate or a buffer or a buffer depending on the purpose/object of calibration.
  • a solution containing a fluorescent dye to be detected may be dispensed onto the plate. Since these well plates for calibration serve as standards for calibrating various signals of a nucleic acid reaction detection device, base fluorescence emission that may occur in each well needs to be little or all at the same level.
  • the present inventors discovered that the detection error of the fluorescence signal continuously generated during the calibration of the PCR device did not originate only from the design of the optical system of the device, and made intensive research efforts to improve the uniformity between wells of the calibration plate.
  • the invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing a calibration plate for a nucleic acid reaction detection device having improved uniformity between wells.
  • Another object of the present invention is to provide a calibration plate for a nucleic acid reaction detection device with very little variation between wells and a kit including the same.
  • the present invention provides a method for preparing a calibration plate for a nucleic acid reaction detection device comprising the following steps:
  • step (a) dispensing a calibration solution to each well of a plate including a plurality of wells; (b) determining a well-to-well fluorescence signal difference by fluorescence signal intensity for each well of a plate equipped with a calibration solution; and (c) providing a calibration plate by manipulating the plate such that the fluorescence signal difference between the wells of the plate is equal to or less than a second target difference value; The second target difference value is smaller than the fluorescence signal difference between wells determined in step (b).
  • the method may further include, prior to step (a), selecting a plate having a fluorescence signal difference between wells of an empty plate including a plurality of wells equal to or less than a first target difference value.
  • the second difference target value may be smaller than the first difference target value.
  • the present inventors have tried to develop a method capable of minimizing the fluorescence signal deviation of each well of a calibration plate in order to more accurately calibrate the fluorescence signal distortion caused by the design of the optical system of the nucleic acid reaction detection device.
  • the present inventors can prepare a plate for calibration with excellent uniformity between wells by reducing the difference in fluorescence signal between wells and errors in reagents such as buffers and dyes included in each well, which occur due to the characteristics of the plastic material of the plate. confirmed that there is
  • the term "plate” refers to a plate in which a plurality of wells are formed for reacting a very small amount of a reaction solution in performing biochemical and molecular biological experiments, and is preferably made of a transparent plastic material.
  • PP polypropylene
  • PC polycarbonate
  • the term “well-to-well fluorescence signal difference” refers to a difference in fluorescence signals generated in at least two or more wells, respectively, and, for example, the fluorescence signal difference between wells is It may be (i) the difference between the maximum and minimum values of the fluorescence signal, (ii) the variance, (iii) the standard deviation, (iv) the absolute deviation of the median, or (v) the coefficient of variation.
  • the first difference target value and the second difference target value may be coefficients of variation of fluorescence signals for each well.
  • the coefficient of variation is a widely used statistic to indicate the variance of data.
  • the coefficient of variation of the well plate of the present invention is a value obtained by dividing the standard deviation of fluorescence signal differences between wells by the average of the signal values, and represents a relative comparison value of how large the standard deviation is compared to the average. Therefore, in order to derive a plate with excellent uniformity in the present invention, it is possible to check the deviation scale of the data for each well plate by comparing the coefficient of variation of each plate.
  • the coefficient of variation between wells of the calibration plate may be calculated according to Equation 1 below.
  • Equation 1 X n is the fluorescence signal value of each well, n is a natural number of 2 or more, and M is the average of the signal values.
  • the first target difference value may be a real number selected from 1 to 10
  • the second target difference value may be a real number selected from 0.5 to 4.5.
  • the first difference target value is 1, 2, 3, 4, 5, 5,1, 5.2, 5.3, 5.5, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.1, 7.5, 8 , 9 or 10
  • the well plate for calibration selected before step (a) has a coefficient of variation between wells of 1 or less, 2 or less, 3 or less, 4 or less, 5 or less, 5,1 or less, 5.2 or less, 5.3 or less, or 5.5 or less. , 5.8 or less, 6 or less, 6.2 or less, 6.4 or less, 6.6 or less, 6.8 or less, 7 or less, 7.1 or less, 7.5 or less, 8 or less, 9 or less, or 10 or less.
  • step (a) the step of selecting a plate having a fluorescence signal difference between wells equal to or less than the first difference target value is performed on an empty plate including a plurality of wells, for example, a multi-well plate with empty wells.
  • step (a) it is a process of detecting the fluorescence signal of each well provided in the plate and first selecting a plate having a small difference in fluorescence signal between wells that may occur due to the characteristics of the plate material.
  • the coefficient of variation between wells of the plate selected through step (a) is much smaller than the first difference target value, or it is very rare.
  • the fluorescence signal for each well may be performed based on a fluorescence signal in a wavelength band of 450 nm to 530 nm or 450 nm to 510 nm.
  • the fluorescence signal value of a channel in the FAM region The uniformity of the plate material can be determined.
  • the nucleic acid reaction detection equipment needs to be calibrated to analyze the fluorescence signal generated according to the sample very precisely, but the present inventors found that commercially available calibration plates themselves do not secure uniformity between wells. Since it is difficult to provide a plate with no difference in fluorescence signal between wells due to the manufacturing characteristics of well plates made of plastic, the present inventors first select a plate through fluorescence signal analysis on an empty plate, and between wells through the steps described below. A method for preparing a calibration plate with a minimized fluorescence signal difference was developed.
  • the step (a) is a step of dispensing a calibration solution to each well of the plate.
  • calibration solution is a composition to be included in each well of the calibration plate and may be referred to as one component of the calibration plate. If the calibration solution contains a fluorescent substance, the uniformity of the plate itself can be secured based on the fluorescence signal value detected by the corresponding fluorescence channel, and then applied to calibration to eliminate fluorescence signal crosstalk that may occur between each fluorescence channel. Adjust.
  • the dispensing of the calibration solution may be performed in the same capacity.
  • the calibration solution is 5 ⁇ l to 150 ⁇ l, 10 ⁇ l to 130 ⁇ l, 15 ⁇ l to 115 ⁇ l, 20 ⁇ l to 100 ⁇ l, 25 ⁇ l to 95 ⁇ l, 30 ⁇ l to 90 ⁇ l, 40 ⁇ l to 80 ⁇ l or 50 ⁇ l It can be dispensed in volumes of from 60 ⁇ l to 60 ⁇ l.
  • step (a) when the surface layer of the solution, that is, the area of the solution facing the irradiated light is a certain value or more according to the volume of the calibration solution accommodated in each well, the accuracy of the detected fluorescence signal can be improved. can However, if the dose is included above a certain level, there is a problem in that the solution is wasted compared to the improvement effect, so it needs to be included below the appropriate dose.
  • the maximum cross-sectional area formed by the calibration solution contained in each well in contact with the inner surface of the well is 9 mm2 to 15 mm2, 10 mm2 to 14 mm2, 11 mm2 to 13 mm2, or 12 mm 2 to 12.8 mm 2 .
  • the maximum cross-sectional area of the calibration solution accommodated in each well is 40% to 100%, 40% to 80%, 40% to 70%, 45% to 65%, 50% to 60%, or 54% to the opening area of the well. % to 58%.
  • the calibration solution may include a fluorescent material.
  • fluorescent material refers to a material capable of absorbing energy of a specific first wavelength and emitting energy of a different second wavelength.
  • fluorescein or a derivative thereof such as fluorescein isothiocyanate, carboxy fluorescein such as FAM, fluorescein amadite, cyanine or derivative thereof such as Cy3, Cy5, Cy7, TAMRA (tetramethylrhodamine ) such as rhodamine or its derivatives, coumarin or its derivatives, etc., but is not limited thereto.
  • the fluorescent material is FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 670, Quasar 705, and combinations thereof.
  • the calibration solution is 0.5 nM to 200 nM, 1 nM to 180 nM, 3 nM to 170 nM, 5 nM to 160 nM, 10 nM to 150 nM, 20 nM to 130 nM, 30 nM to 110 nM , 50 nM to 100 nM, 70 nM to 90 nM, or 75 nM to 85 nM. If the fluorescence signal is out of the above range, it may be difficult to control the deviation between wells by increasing or decreasing the solution volume in the next step because the amount of fluorescence signal detected is limited or excessive.
  • the calibration solution may further include a surfactant.
  • surfactant is any molecule or ion composed of a water-soluble (hydrophilic) part and an oil-soluble (lipophilic) part, and preferably a substance that does not show fluorescence.
  • the calibration solution contains 0.01% (w / v) to 10% (w / v), 0.02% (w / v) to 8% (w / v), 0.04% (w / v) to 6% ( w/v), 0.06% (w/v) to 5% (w/v), 0.08% (w/v) to 4% (w/v), 0.1% (w/v) to 3% (w/v) v), 0.3% (w/v) to 2.5% (w/v), 0.7% (w/v) to 2% (w/v), 0.9% (w/v) to 1.5% (w/v) Alternatively, it may be included at a concentration of 1% (w/v) to 1.2% (w/v). Using a surfactant in the above range can minimize its effect on the fluorescence signal detected for calibration while improving the homogenization effect of the fluorescent dye.
  • the surfactant may be a nonionic detergent, an ionic (anionic or cationic) detergent, a zwitterionic reagent or urea.
  • the surfactant is selected from the group consisting of Tween-20, Triton X-100, n-lauroyl sarcosine, sodium dodecyl sulfate (SDS), and combinations thereof It may be any one, and it is not limited thereto as long as it does not show fluorescence and helps to improve the solubility of the fluorescent material.
  • the step (c) is a step of providing a calibration plate by manipulating the plate so that the fluorescence signal difference between the wells of the plate is equal to or less than the second difference target value, the second difference target value determined in step (b) less than the fluorescence signal difference between wells.
  • the step (c) is a step of resolving the variation between wells inherent in the plate, the dispensing error of the solution, or the concentration error of the fluorescent substance included in the solution by adjusting the volume of the calibration solution.
  • the volume of the calibration solution accommodated in at least one well is changed to determine the fluorescence signal difference between the wells of the plate may be adjusted below the second difference target value.
  • the second target difference value may be a real number selected from 0.5 to 4.5 as a coefficient of variation of fluorescence signals for each well.
  • the second target difference value is 0.5, 1, 1.5, 1.8, 2, 2.3, 2.5, 3, 3.5, 4, or 4.5
  • the calibration plate of the present invention has a coefficient of variation between wells of 0.5 or less, 1 or less, 1.5 or less, 1.8 or less, 2 or less, 2.3 or less, 2.5 or less, 3 or less, 3.5 or less, 4 or less, or 4.5 or less. That is, when the capacity of some wells needs to be changed in step (c), the fluorescence signal difference between the wells determined in step (b) exceeds the second target difference value. At this time, through step (c), the fluorescence signal difference between the wells of the plate is manipulated to be equal to or less than the second difference target value, thereby providing a calibration plate.
  • the manipulation of the plate may be performed for wells having a large difference between the fluorescence signals for each well and their average values.
  • the capacitance change may be performed for wells in which a difference between a fluorescence signal for each well and an average value thereof is equal to or greater than a predetermined reference value.
  • the change of the capacity may be performed by removing a predetermined amount of the calibration solution from the corresponding well when the fluorescence signal for each well is greater than the average value thereof.
  • it may be performed by adding a predetermined amount of a calibration solution to the corresponding well.
  • the type and concentration of the fluorescent material and the buffer of the calibration solution to be added are the same as those of the calibration solution dispensed in step (b).
  • the manipulation of the plate i.e., the adjustment of the fluorescence signal difference between the wells,
  • the calibration solution of the well is added or subtracted according to the following information, and the coefficient of variation between wells of the plate is adjusted to the second difference target value or less. Repeat until there is.
  • X n is the fluorescence signal value of each well
  • n is a natural number of 2 or more
  • M is the average value of the fluorescence signal value
  • l is 1 or more is a natural number
  • the l is listed in order of increasing size
  • the difference between the fluorescence signal value and the average signal value for each well is greater than the standard deviation ( ⁇ ) of the signal value for each well of the plate, or is greater than 2 ⁇ , There may be wells greater than 3 ⁇ .
  • the predetermined amount may be a capacity defined by Equation 2 below.
  • Equation 2 X n is the fluorescence signal value of each well, Y n is the volume of the calibration solution contained in each well, n is a natural number equal to or greater than 2, and M is the average of the fluorescence signal values.
  • the predetermined amount may be a capacity defined by Equation 3 below.
  • Equation 3 X n is the fluorescence signal value of each well, Y n is the volume of the calibration solution contained in each well, n is a natural number equal to or greater than 2, and M is the average of the fluorescence signal values.
  • the fluorescence values of some wells having a large difference between the average fluorescence signal value and the individual fluorescence signal value are recalibrated, thereby realizing a calibration plate having a very small difference in fluorescence signal between wells.
  • Detection of the fluorescence signal value for each well of the plate may be performed with a fluorometer, a spectrofluorometer, a fluorescence microscope, a fluorometric imaging plate reader or a microplate reader.
  • the microplate reader may be a microplate fluorometer, a microplate fluorescence reader, or a microplate fluorescence spectroscopy.
  • a microplate reader with a very small detection error of the fluorescence signal value can be used, and for example, the fluorescence signal value of each plate can be detected with Spark equipment from Tecan.
  • the present invention provides a calibration plate for a nucleic acid reaction detection device prepared by the method described above.
  • the present invention includes a plurality of wells containing a calibration solution containing a fluorescent substance and a surfactant, and detects a nucleic acid reaction in which a fluorescence signal difference between wells determined by a fluorescence signal for each well is equal to or less than a predetermined difference target value
  • a calibration plate for the device is provided.
  • the material of the plate, the specific contents of each of the fluorescent substance and the surfactant of the calibration solution included in the plate, and other overall characteristics related to the plate are the same as those mentioned in the preparation method of the calibration plate in item I. In order to avoid description, a brief explanation will be given.
  • the signal difference between wells is (i) the difference between the maximum and minimum values of the fluorescence signal for each well, (ii) the variance, (iii) the standard deviation, (iv) the absolute deviation of the median value, or (v) the coefficient of variation.
  • the target value of the fluorescence signal difference between the wells may be 0.5 to 4.5 as a coefficient of variation.
  • the calibration solution may include a fluorescent material at a concentration of 0.5 nM to 200 nM.
  • the fluorescent material is FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 670, It may be any one selected from the group consisting of Quasar 705 and combinations thereof.
  • the calibration solution may include a surfactant at a concentration of 0.01% (w/v) to 10% (w/v).
  • the surfactant is any selected from the group consisting of Tween-20, Triton X-100, n-lauroyl sarcosine, sodium dodecyl sulfate (SDS), and combinations thereof can be one
  • the calibration solution may be accommodated in a volume of 5 ⁇ l to 150 ⁇ l in each well.
  • the calibration plate has a very small fluorescence signal difference between wells compared to commercially available plates for calibrating a conventional nucleic acid detection device.
  • the calibration solution may be added or subtracted in some wells if necessary, the capacity of the calibration solution accommodated between all wells may not be the same.
  • the present invention provides a calibration kit for a nucleic acid reaction detection device comprising the calibration plate prepared by the method described in item I. and/or the calibration plate described in item II.
  • the calibration kit includes a plurality of calibration plates, and calibration solutions containing fluorescent materials of different detection wavelength bands may be accommodated between the plates.
  • the calibration kit may be configured according to a detection fluorescent substance arbitrarily set for a specific device.
  • a calibration kit including 4 calibration plates each containing 4 types of fluorescent materials and a calibration kit including 5 calibration plates each containing 5 types of fluorescent materials may be provided.
  • the calibration kit may further include a calibration plate that includes a buffer and does not include a fluorescent material or a surfactant.
  • a calibration plate in which only TE buffer is dispensed and three, four or five calibration plates containing three, four or five fluorescent substances, respectively, may be provided as one kit.
  • a calibration kit including a calibration plate including a TE buffer, a FAM calibration plate, a C560 calibration plate, a C610 calibration plate, a Q670 calibration plate, and a Q705 calibration plate may be provided.
  • nucleic acid reaction detection device particularly a device used for detecting various fluorescent signals such as multiplex PCR
  • various deviation corrections for light sources and photodetectors so that each signal corresponding to a target nucleic acid can be accurately detected.
  • the nucleic acid reaction detection device is calibrated using a commercially available calibration plate, there is a problem in that the deviation of the Ct value and the like for the same sample appears somewhat large when detecting a sample even after all related procedures have been performed.
  • the present invention confirms that there is a fluorescence signal difference between wells due to the material characteristics of the well plate itself used for calibration while analyzing the causes for various devices and experimental conditions, and The uniformity between the wells of the calibration plate was improved by sorting through fluorescence detection and adjusting the calibration solution.
  • the present invention provides a calibration plate with minimized variation between wells and a calibration kit including the same, enabling more accurate detection of a nucleic acid reaction signal of a device calibrated with the plate.
  • Figure 1 shows conditions for fluorescence imaging of an empty 96-well plate with a microplate reader.
  • Figure 3 shows the fluorescence signal for each well detected by the RT-PCR device with respect to the plates of the experimental group and the control group.
  • Figure 4 is a graph showing the fluorescence signal for each well detected by the RT-PCR device for the plates of the experimental group and the control group.
  • 5 is a graph showing fluorescence signals for each well detected by an RT-PCR device for the plates of the experimental group and the control group.
  • FIG. 6 shows fluorescence signals for each well detected by a microplate reader for the plates of the experimental group and the control group.
  • FIG. 8A shows fluorescence signals for each well captured in the FAM channel of the calibration plate of SET 1.
  • 8B shows fluorescence signals for each well captured in the HEX channel of the calibration plate of SET 1.
  • 8C shows the fluorescence signal for each well captured in the C610 channel of the SET 1 calibration plate.
  • FIG. 8D shows fluorescence signals for each well captured in the Q670 channel of the SET 1 calibration plate.
  • 8E shows the fluorescence signal for each well captured in the Q705 channel of the calibration plate of SET 1.
  • FIG. 9a shows fluorescence signals for each well captured in the FAM channel of the calibration plate of SET 2.
  • 9B shows fluorescence signals for each well captured in the HEX channel of the calibration plate of SET 2.
  • FIG. 9c shows fluorescence signals for each well captured in the C610 channel of the SET 2 calibration plate.
  • FIG. 9d shows fluorescence signals for each well captured in the Q670 channel of the calibration plate of SET 2.
  • FIG. 9E shows the fluorescence signal for each well captured in the Q705 channel of the calibration plate of SET 2.
  • 10A shows the fluorescence signal for each well captured in the FAM channel of the calibration plate of SET 3.
  • 10B shows fluorescence signals for each well captured in the HEX channel of the calibration plate of SET 3.
  • 10C shows the fluorescence signal for each well captured in the C610 channel of the SET 3 calibration plate.
  • FIG. 10D shows fluorescence signals for each well captured in the Q670 channel of the calibration plate of SET 3.
  • 10E shows the fluorescence signal for each well captured in the Q705 channel of the calibration plate of SET 3.
  • FIG. 11a shows fluorescence signals for each well captured in the FAM channel of the calibration plate of SET 4.
  • FIG. 11B shows fluorescence signals for each well captured in the HEX channel of the calibration plate of SET 4.
  • FIG. 11C shows the fluorescence signal for each well captured in the C610 channel of the SET 4 calibration plate.
  • FIG. 11d shows the fluorescence signal for each well captured in the Q670 channel of the calibration plate of SET 4.
  • FIG. 11e shows the fluorescence signal for each well captured in the Q705 channel of the calibration plate of SET 4.
  • FIG. 12a shows fluorescence signals for each well captured in the FAM channel of the calibration plate of SET 5.
  • FIG. 12B shows fluorescence signals for each well captured in the HEX channel of the calibration plate of SET 5.
  • 12c shows the fluorescence signal for each well captured in the C610 channel of the SET 5 calibration plate.
  • FIG. 12d shows fluorescence signals for each well captured in the Q670 channel of the calibration plate of SET 5.
  • FIG. 12e shows fluorescence signals for each well captured in the Q705 channel of the SET 5 calibration plate.
  • 13 is a graph showing the fluorescence signal difference (coefficient of variation) for each well of 25 types of calibration plates of SET 1 to SET 5.
  • FIG. 14 is a graph showing ⁇ Ct by applying the calibration coefficients of the calibration plates of SET 2 to SET 5 with respect to the amplification results of RT-PCR samples as of June 2, 2021.
  • 15 is a graph showing ERFU_CV to which correction coefficients of calibration plates of SET 2 to SET 5 are applied to the amplification results of RT-PCR samples as of June 2, 2021.
  • 16 is a graph showing ⁇ Ct by applying the calibration coefficients of the calibration plates of SET 2 to SET 5 with respect to the amplification results of RT-PCR samples as of June 11, 2021.
  • 17 is a graph showing ERFU_CV to which correction coefficients of calibration plates of SET 2 to SET 5 are applied to the amplification results of RT-PCR samples as of June 11, 2021.
  • Fifty 96-well plates made of polypropylene from Company B were prepared using the same product. Each plate was photographed with a microplate reader (MMR SPARK, Tecan Co.), and fluorescence photographing conditions such as excitation light and emission wavelength are shown in FIG. 1. Based on the detected fluorescence signals of 96 wells, a coefficient of variation (CV) value was calculated as an average fluorescence signal value and a fluorescence signal difference between wells, and the results are shown in Table 1 and FIG. 1 .
  • CV coefficient of variation
  • the present inventors developed a method including the step of performing a primary screening process in order to minimize the influence of the plate's autofluorescence.
  • a calibration solution was prepared with the composition shown in Table 2 below.
  • 20 ⁇ l of each solution was sequentially dispensed per well from column 1 to column 12 to prepare a calibration plate.
  • fluorescence signals were detected in CFX96 and a microplate reader (MMR SPARK, Tecan Co.) to confirm the fluorescence signal difference between wells. The results are shown in Figures 3 to 6.
  • the fluorescent dyes used for detecting nucleic acid reactions are hydrophobic in terms of molecular structure, so they are not uniformly dissolved in a solvent, and there is a concern that a large difference in concentration between the upper and lower layers may appear.
  • the present inventors devised a method of adding a surfactant that does not generate a fluorescence signal to the calibration solution, and as shown in the results of this experiment, the addition of the surfactant increases fluorescence in the solvent without affecting the fluorescence signal. It was confirmed that the homogeneity of the dye was improved.
  • a set of five calibration plates having the characteristics shown in Table 3 were prepared and the difference in fluorescence signal between the wells of each plate was confirmed.
  • fluorescent dyes a plate containing a calibration solution in which FAM, C560, C610, Q670, and Q705 per set were dissolved as single fluorescent substances in TE buffer (1M Tris-HCl (pH8.0), 0.1M EDTA) buffer, respectively. 5 were produced, and information about this is shown in Table 4.
  • 5 calibration plates were prepared by dispensing 20 ⁇ l of the calibration solution containing the surfactant. Thereafter, the fluorescence signal was detected with a microplate reader (MMR SPARK, Tecan Co.) to calculate the average value of the fluorescence signal value for each well and the deviation between the average value and the signal value for each well, and then the capacity was added or subtracted according to the following formula for all wells .
  • Five calibration plates of SET 4 were completed by increasing or decreasing the dose until the fluorescence signal difference between the wells of the plate was less than 3%.
  • fluorescence signals were detected with a microplate reader (MMR SPARK, Tecan Co.), and the shooting conditions are shown in FIG. 7 .
  • the fluorescence signal values of 96 wells for each plate are shown in FIGS. 8A to 12E, and their Cv values are summarized in Table 5 and FIG. 13 below.
  • the correction factor derived from the calibration plates of SET 2 to SET 5 of Experimental Example 3 was applied to the amplification result of the same reagent in the RT-PCR device. Specifically, the correction coefficient is calculated based on fluorescence signal values of all wells of an individual plate using a specific program. After applying the calculated correction factor, the ⁇ Ct of the amplification result (the difference between the largest value and the smallest value among Ct values) and ERFU_Cv (Cv of 96 wells at the peak of the RFU value in the amplification graph with the baseline value removed) were confirmed.
  • Step Tm (°C) Time Cycle plate read One 95 15:00 One 2 95 00:10 45 3 60 00:15 plate read 4 72 00:10 plate read 5 GOTO 2 44 more times 6 55 00:30 One 7 Melting curve 55 ⁇ 85°C (5 sec/0.5°C) plate read
  • the experiment proceeded as follows. Regarding the RT-PCR device (Seegene, SGRT), Bioplastics' B70679/B57801 plate and AllplexTM Entero-DR reagent (Seegene) were applied (see Table 6), and the amplification reaction was performed according to the protocol in Table 7, and 2021.06. 02. and 2021.06.11. A total of two nucleic acid reactions were detected. For each experimental result, the correction factor for each plate of SET 2 to SET 5 was applied, and the results of 2021.06.02 are shown in Table 8, Fig. 14 and Fig. 15, and the results of 2021.06.11 are shown in Table 8, Fig. 14 and Fig. 15. Meanwhile, during the experiment on June 2, 2021, an error occurred in Q705 and the experimental value could not be derived.

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Abstract

본 발명은 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트, 이를 포함하는 캘리브레이션 키트 및 이의 준비 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법
본 발명은 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트, 이를 포함하는 캘리브레이션 키트 및 이의 준비 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 공지된 가장 많이 사용되는 핵산 증폭 반응은 이중가닥 DNA의 변성, 변성된 DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki　et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR) 장치는 핵산 반응이 진행되는 동안 핵산 반응에 의한 신호를 실시간으로 검출하기 위한 PCR 기반 기술이다. 일반적으로 반응물에 광을 조사하고, 이로 인하여 발생하는 형광 신호를 측정하는 방법으로 특정 표적 핵산을 검출한다. 따라서, 실시간 PCR 장치는 광원 및 광 검출부를 포함하고 있으며, 이들을 정교하게 설정하여 타겟 핵산의 PCR 반응으로 인해 방출되는 형광 신호를 정확히 검출하는 것이 매우 중요하다.
이에, 실시간 PCR 장치들에 대하여 장치 출하 전 공장에서 및/또는 사용 전 현장에서 다양한 캘리브레이션 프로세스를 진행하여 장비간 편차를 보정한다. 구체적으로, 장치에 삽입되는 플레이트에 구비된 웰들의 위치에 따라 조사받는 광량(광원의 세기), 광원의 움직임, 광검출부의 형광신호 민감도 등을 조절할 수 있다.
또한, 복수 개의 형광 염료들을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex PCR)의 경우에는 서로 다른 형광들 각각의 특정한 파장 대역을 검출하는 필터들이 사용된다. 이때, 이와 같은 다수의 필터들은 서로 중복될 수 있는 인접한 파장 대역을 가지는 바, 여기서의 각 형광 신호들의 중첩되는 스펙트럼들에 의한 크로스토크(cross-talk)가 정확한 신호 검출을 방해하는 문제가 있다. 따라서, 멀티플렉스 PCR은 이러한 크로스토크의 형광 신호에 대한 영향을 최소화할 수 있는 염료(dye) 캘리브레이션이 수행될 필요가 있다.
한편, 상기 언급한 여러가지 편차를 보정하기 위해서는, 각 장치에 적합하게 제조된 특정 캘리브레이션용 플레이트를 삽입한 후, 장치에 내재된 프로그램을 적용하여 캘리브레이션을 수행하는 것이 일반적이다. 상기 플레이트는 시료가 포함되지 않은 상태로서 폴리프로필렌(Polypropylene,　PP), 폴리카보네이트(Polycarbonate,　PC) 등의 재질들로 구성될 수 있으며, 예를 들어, 보정 목적/대상에 따라 빈 플레이트이거나 버퍼 또는 검출할 형광 염료가 포함된 용액(캘리브레이션 용액)이 분주된 플레이트일 수 있다. 이러한 캘리브레이션용 웰 플레이트들은 핵산 반응 검출 장치의 여러 신호 보정의 기준이 되기 때문에, 각 웰별로 발생할 수 있는 베이스 형광 발광이 거의 없거나 모두 동일한 수준일 필요가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 PCR 장치의 캘리브레이션을 수행하던 중 지속적으로 발생하는 형광 신호의 검출 오차가 단지 장치의 광학계 설계에서만 비롯되는 것이 아님을 발견하고, 캘리브레이션용 플레이트의 웰간 균일성을 개선하고자 예의 연구 노력하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 웰간 균일성이 향상된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 웰간 편차가 매우 적은 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
I. 웰간 균일성이 향상된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법을 제공한다:
(a) 복수의 웰을 포함하는 플레이트의 각각의 웰에 캘리브레이션 용액을 분주하는 단계; (b) 캘리브레이션 용액이 구비된 플레이트의 웰별 형광 신호(fluorescence signal intensity)에 의해 웰간 형광 신호 차이(well-to-well fluorescence signal difference)를 결정하는 단계; 및 (c) 상기 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 제2 차이 목표값 이하가 되도록 상기 플레이트를 조작하여, 캘리브레이션 플레이트를 제공하는 단계; 상기 제2 차이 목표값은 상기 단계(b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이 보다 작다.
또한, 상기 단계 (a) 전에, 복수의 웰을 포함하는 빈(empty) 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 제1 차이 목표값 이하인 플레이트를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 제2 차이 목표값은 상기 제1 차이 목표값보다 작을 수 있다.
본 발명자들은 핵산 반응 검출용 장치의 광학계 설계상으로 발생하는 형광 신호 왜곡에 대하여 보다 정확한 캘리브레이션을 수행하기 위해, 캘리브레이션용 플레이트의 웰별 형광 신호 편차를 최소화할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 플레이트의 플라스틱 소재 특성상 발생하는 형광(Autofluorescence)의 웰별 형광 신호 차이 및 각 웰에 포함되는 버퍼, 염료 등의 시약 오차를 감소시킴으로써 웰간 균일성이 우수한 캘리브레이션용 플레이트를 준비할 수 있는 것을 확인하였다.
본원에 사용된 용어 “플레이트”는 생화학 및 분자생물학적 실험을 수행하는 데 있어서, 아주 작은 양의 반응액을 반응시키기 위한 웰(well)이 다수 개 이상 형성된 플레이트를 의미하며, 바람직하게는 투명한 플라스틱 재질의 플레이트이다. 본 발명에서는, 예를 들어, 폴리프로필렌(Polypropylene,　PP), 폴리카보네이트(Polycarbonate,　PC) 등의 재질들로 구성된 웰을 포함하는 플레이트로서, Bioplastics사 또는 Biorad사의 제품이 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “웰간 형광 신호 차이(well-to-well fluorescence signal difference)”는 적어도 2개 이상의 웰에서 각각 발생하는 형광 신호들의 차이를 의미하며, 예를 들어, 상기 웰간 형광 신호 차이는 웰별 형광 신호의 (i) 최대값과 최소값의 차이, (ii) 분산, (iii) 표준편차, (iv) 중앙값의 절대편차 또는 (v) 변동계수(Coefficient of variation)일 수 있다.
또한, 상기 제1 차이 목표값 및 제2 차이 목표값은 웰별 형광 신호들의 변동계수일 수 있다. 변동계수는 데이터의 편차를 나타내기 위해 널리 사용되는 통계량이다. 구체적으로,　본 발명의 웰 플레이트의 변동계수는 웰간 형광 신호 차이의 표준편차를 그 신호값의 평균으로 나눈 값으로서, 평균에 비해 그 표준편차가 얼마나 큰가에 대한 상대적인 비교치를 나타낸다.　그러므로 본 발명에서 균일성이 우수한 플레이트를 도출하기 위해, 여러 웰 플레이트별 데이터의 편차 스케일을 확인하는 것은　각 플레이트의 변동계수를 비교함으로써 가능하다.
다시 말해서, 캘리브레이션용 플레이트의 웰간 변동계수는 하기 식 1에 따라 산출될 수 있다.
[식 1]
Figure PCTKR2022010841-appb-img-000001
상기 식 1에서, X n은 각 웰의 형광 신호값이고, n은 2이상의 자연수이며, M은 신호값의 평균이다.
상기 제1 차이 목표값은 1 내지 10에서 선택되는 실수(real number)이며, 상기 제2 차이 목표값은 0.5 내지 4.5에서 선택되는 실수일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 차이 목표값은 1, 2, 3, 4, 5, 5,1, 5.2, 5.3, 5.5, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.1, 7.5, 8, 9 또는 10으로서 상기 단계 (a) 전에 선별된 캘리브레이션용 웰 플레이트는 웰간 변동계수가 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 5,1 이하, 5.2 이하, 5.3 이하, 5.5 이하, 5.8 이하, 6 이하, 6.2 이하, 6.4 이하, 6.6 이하, 6.8 이하, 7 이하, 7.1 이하, 7.5 이하, 8 이하, 9 이하, 또는 10 이하일 수 있다.
상기 단계 (a) 전에 웰간 형광 신호 차이가 제1 차이 목표값 이하인 플레이트를 선별하는 단계는 복수의 웰을 포함하는 빈 플레이트, 예를 들어, 웰이 비어 있는 멀티 웰 플레이트에 대하여 수행된다.
구체적으로, 플레이트에 구비된 각 웰들의 형광 신호를 검출하여, 먼저 플레이트 소재 특성상 발생할 수 있는 웰간 형광 신호 차이가 적은 플레이트를 선별하는 과정이다. 한편, 일반적인 플레이트의 제조공정 및 재질에 비추어 보면 (a) 단계를 통해 선별된 플레이트의 웰간 변동계수가 제1 차이 목표값보다 훨씬 작은 수치를 나타내는 경우는 없거나 매우 드문 실정이다.
이때, 상기 빈 플레이트를 선별하는 단계에서, 상기 웰별 형광 신호는 450nm 내지 530nm 또는 450nm 내지 510nm의 파장 대역의 형광 신호를 기초로 수행할 수 있으며, 예를 들어, FAM 영역의 채널의 형광 신호값으로 플레이트 소재의 균일성을 판별할 수 있다.
핵산 반응 검출 장비는 시료에 따라 발생하는 형광 신호를 매우 정교하게 분석할 수 있도록 캘리브레이션이 수행되어야 하는데, 본 발명자들은 시판되는 캘리브레이션용 플레이트가 그 자체에서 웰간 균일성이 확보하지 못하고 있다는 것을 발견하였다. 플라스틱으로 이루어진 웰 플레이트의 제조 특성상 완벽히 웰간 형광 신호 차이가 전혀 없는 플레이트를 제공하기는 어렵기 때문에, 본 발명자들은 빈 플레이트에 대한 형광 신호 분석을 통해 1차로 플레이트를 선별하고, 후술하는 단계를 통해 웰간 형광 신호 차이가 최소화된 캘리브레이션용 플레이트를 준비하는 방법을 개발하였다.
상기 단계 (a)는 상기 플레이트의 각각의 웰에 캘리브레이션 용액을 분주하는 단계이다. 본원에서 사용된 용어 “캘리브레이션 용액”은 캘리브레이션 플레이트의 각 웰에 포함시키기 위한 조성물로 캘리브레이션 플레이트의 일 구성이라 할 수 있다. 캘리브레이션 용액이 형광물질을 포함하는 경우 해당 형광 채널로 검출한 형광 신호값을 기초로 플레이트 자체의 균일성을 확보할 수 있으며, 이후, 캘리브레이션에 적용되어 각 형광 채널 간에 발생할 수 있는 형광 신호 크로스토크를 조절한다.
이때, 상기 캘리브레이션 용액의 분주는 동일 용량으로 실시될 수 있다. 또한, 상기 캘리브레이션 용액은 5 μl 내지 150 μl, 10 μl 내지 130 μl, 15 μl 내지 115 μl, 20 μl 내지 100 μl, 25 μl 내지 95 μl, 30 μl 내지 90 μl, 40 μl 내지 80 μl 또는 50 μl 내지 60 μl의 용량으로 분주될 수 있다.
상기 단계 (a)에서, 각 웰에 수용되는 캘리브레이션 용액의 용량에 따라, 그 용액의 표면층, 다시 말해서 조사되는 광에 직면하는 용액의 면적이 일정 수치 이상인 경우, 검출된 형광 신호의 정확성을 향상시킬 수 있다. 다만, 용량이 일정 수준 이상으로 포함되는 경우 개선 효과 대비 용액이 낭비되는 문제가 있으므로 적절한 용량 이하로 포함되어야 할 필요가 있다.
구체적으로, 상기 웰의 개구와 대면하는 방향으로, 각각의 웰에 수용된 캘리브레이션 용액이 웰 내부면과 맞닿아 형성하는 최대 단면적은 9 ㎟ 내지 15 ㎟, 10 ㎟ 내지 14 ㎟, 11 ㎟ 내지 13 ㎟ 또는 12 ㎟ 내지 12.8 ㎟일 수 있다. 또한, 각각의 웰에 수용된 캘리브레이션 용액의 최대 횡단면적은 웰의 개구 면적 대비 40 % 내지 100 %, 40 % 내지 80 %, 40 % 내지 70 %, 45 % 내지 65 %, 50 % 내지 60 % 또는 54 % 내지 58 %일 수 있다.
또한, 상기 캘리브레이션 용액은 형광물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 “형광물질”은 특정한 제1 파장의 에너지를 흡수하고 다른 제2 파장의 에너지를 방출할 수 있는 물질을 일컫는 것이다. 예를 들면, 플루오레신 또는 그 유도체 예컨대 플 루오레신 아이소티오시아네이트, FAM과 같은 카르복시 플루오레신, 플루오레신 아마디이트, Cy3, Cy5, Cy7과 같 은 시아닌 또는 그 유도체, TAMRA (tetramethylrhodamine)과 같은 로다민 또는 그 유도체, 쿠마린 또는 그 유도 체 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
예를 들면, 상기 형광물질은 FAM, TET,　HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED,　CAL　Fluor Orange 560,　CAL　Fluor Red 590,　CAL　Fluor Red 610,　Quasar　670, Quasar　705 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, FAM, CAL　Fluor Orange 560, CAL　Fluor Red 610, Quasar　670 또는 Quasar　705가 사용될 수 있다.
또한, 상기 캘리브레이션 용액은 형광물질을 0.5 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 180 nM, 3 nM 내지 170 nM, 5 nM 내지 160 nM, 10 nM 내지 150 nM, 20 nM 내지 130 nM, 30 nM 내지 110 nM, 50 nM 내지 100 nM, 70 nM 내지 90 nM 또는 75 nM 내지 85 nM의 농도로 포함할 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 형광 신호 검출량이 제한되거나 과도하여 다음 단계의 용액 용량 가감을 통한 웰간 편차 조절이 어려울 수 있다.
상기 캘리브레이션 용액은 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 “계면활성제”는 수용성(친수성) 부분과 지용성(친유성) 부분으로 이루어진 어떤 분자 또는 이온으로서, 바람직하게는 형광을 나타내지 않는 물질이다. 상기 계면활성제를 사용함으로써 형광물질과 캘리브레이션 용액에 포함된 버퍼(예를 들면, TE 버퍼) 간의 용해성을 향상시킴으로써, 캘리브레이션 플레이트의 웰간 편차를 감소시킬 수 있다.
상기 캘리브레이션 용액은 계면활성제를 0.01 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 0.02 %(w/v) 내지 8 %(w/v), 0.04 %(w/v) 내지 6 %(w/v), 0.06 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 0.08 %(w/v) 내지 4 %(w/v), 0.1 %(w/v) 내지 3 %(w/v), 0.3 %(w/v) 내지 2.5 %(w/v), 0.7 %(w/v) 내지 2 %(w/v), 0.9 %(w/v) 내지 1.5 %(w/v) 또는 1 %(w/v) 내지 1.2 %(w/v)의 농도로 포함할 수 있다. 상기 범위로 계면활성제를 사용하는 것이 형광염료 균질화 효과를 향상시키면서도 캘리브레이션을 위해 검출하는 형광신호에 이의 영향을 최소화할 수 있다.
상기 계면활성제는 비이온성 세제, 이온성(음이온성 또는 양이온성) 세제, 쯔비터이온 시약 또는 우레아일 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 Tween-20,　Triton　X-100, n-라우로일 사르코신(n-lauroyl sarcosine), 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate,　SDS) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 형광을 나타내지 않으면서도 형광물질의 용해성을 향상시키는데 도움이 되는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (c)는 상기 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 제2 차이 목표값 이하가 되도록 상기 플레이트를 조작하여, 캘리브레이션 플레이트를 제공하는 단계이며, 상기 제2 차이 목표값은 상기 단계(b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이 보다 작다. 구체적으로, 상기 단계 (c)는 캘리브레이션 용액의 용량 조절을 통해 플레이트에 내재된 웰간 편차, 용액의 분주 오차 또는 용액에 포함된 형광물질의 농도 오차 등을 해소하는 단계이다.
상기 단계 (c)에서, 상기 단계(b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이가 상기 제2 차이 목표값을 초과하는 경우, 적어도 하나 이상의 웰에 수용된 캘리브레이션 용액의 용량을 변경하여, 플레이트의 웰간 형광 신호 차이를 제2 차이 목표값 이하로 조정할 수 있다. 상기 제2 차이 목표값은 웰별 형광 신호들의 변동계수로서 0.5 내지 4.5에서 선택되는 실수일 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 차이 목표값은 0.5, 1, 1.5, 1.8, 2, 2.3, 2.5, 3, 3.5, 4, 또는 4.5로서 본 발명의 캘리브레이션 플레이트는 웰간 변동계수가 0.5 이하, 1 이하, 1.5 이하, 1.8 이하, 2 이하, 2.3 이하, 2.5 이하, 3 이하, 3.5 이하, 4 이하, 또는 4.5 이하일 수 있다. 즉, 상기 단계 (c)에서 일부 웰의 용량의 변경이 필요한 경우는 단계 (b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이가 제2 차이 목표값을 초과하는 경우이다. 이때, 단계 (c)를 통해 플레이트의 웰간 형광 신호 차이를 제2 차이 목표값 이하로 조작하여 캘리브레이션 플레이트를 제공한다.
상기 플레이트의 조작은, 각각의 웰별 형광 신호와 이들의 평균값 간의 차이가 큰 웰에 대하여 실시될 수 있다. 구체적으로, 상기 용량의 변경은 각각의 웰별 형광 신호와 이들의 평균값 간의 차이가 소정의 기준치 이상인 웰에 대하여 실시될 수 있다.
상기 용량의 변경은, 웰별 형광 신호가 이들의 평균값보다 큰 경우 해당 웰로부터 소정량의 캘리브레이션 용액을 제거하여 실시될 수 있다. 또한, 웰별 형광 신호가 이들의 평균값보다 작은 경우 해당 웰에 소정량의 캘리브레이션 용액을 첨가하여 실시될 수 있다. 이때, 첨가하는 캘리브레이션 용액의 형광물질 및 버퍼의 종류 및 농도는 단계 (b)에서 분주된 캘리브레이션 용액과 동일한 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 플레이트 조작, 즉, 웰간 형광 신호 차이의 조정은, |Xn - M| 값 중 크기가 큰 순서대로 상위 l개의 웰을 선별한 후, 하기 내용에 따라 해당 웰의 캘리브레이션 용액을 가감하여 실시되며, 플레이트의 웰간 변동계수가 제2 차이 목표값 이하로 조정될 때까지 반복할 수 있다.
X n > M 인 경우, 해당 웰로부터 소정량의 캘리브레이션 용액을 제거하고,
X n < M 인 경우, 해당 웰에 소정량의 캘리브레이션 용액을 첨가하며, X n은 각 웰의 형광 신호값이고, n은 2이상의 자연수이며, M은 형광 신호값의 평균값이고, l은 1 이상의 자연수이다.
상기 l은 크기가 큰 순서대로 나열된 |Xn - M| 값 중 상위 3% 내지 20%에 해당하는 웰들의 개수일 수 있다. 예를 들어, 96개 웰 플레이트를 사용하는 경우, 평균 형광 신호값과 각 웰의 평광 신호값의 차이가 가장 큰 3개, 4개, 6개, 8개, 10개, 15개, 17개 또는 19개의 웰에 대하여 용량 보정을 실시할 수 있다. 한편, 상기 범위의 상한을 초과하여 너무 많은 웰에 대하여 용량 조절을 실시하면 과보정이 발생할 수 있으며, 이 경우 해당 캘리브레이션 플레이트로 캘리브레이션된 핵산 반응 검출 장치의 시료에 대한 형광신호 검출 정확성이 저하될 우려가 있다.
또한, 상기 용량의 변경 대상이 되는 소정의 기준치는 이상인 웰은 각 웰별 형광 신호값와 평균 신호값의 차이가 플레이트의 웰별 신호값의 표준 편차(σ)보다 큰 경우, 또는 2 σ보다 큰 경우, 또는 3σ보다 큰 웰들 일 수 있다.
상기 소정량은 하기 식 2로 정의되는 용량일 수 있다.
[식 2]
Figure PCTKR2022010841-appb-img-000002
상기 식 2에서, X n은 각 웰의 형광 신호값이고,Y n은 각 웰에 수용된 캘리브레이션 용액의 용량이며, n은 2이상의 자연수이고, M은 형광 신호값의 평균이다.
또한, 상기 소정량은 하기 식 3으로 정의되는 용량일 수 있다.
[식 3]
Figure PCTKR2022010841-appb-img-000003
상기 식 3에서, X n은 각 웰의 형광 신호값이고, Y n은 각 웰에 수용된 캘리브레이션 용액의 용량이며, n은 2이상의 자연수이고, M은 형광 신호값의 평균이다.
이와 같이, 플레이트 선별 처리에서 나아가 평균 형광 신호값과 개별 형광 신호값이 큰 차이가 나는 일부 웰의 형광 값을 재보정함에 따라 웰간 형광 신호 차이가 극히 적은 캘리브레이션 플레이트를 구현할 수 있다.
상기 플레이트의 웰별 형광 신호값의 검출은, 형광 측정기(fluorometer) 형광 광도계(spectrofluorometer), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광 영상 플레이트 판독기(fluorometric imaging plate　reader) 또는 마이크로플레이트 리더기(microplate　reader)로 실시될 수 있다. 상기 마이크로 플레이트 리더기는 마이크로플레이트 형광측정기(microplate fluorometer), 마이크로플레이트 형광리더기(microplate fluorescence reader) 또는 마이크로플레이트 형광 분광기(microplate fluorescence spectroscopy)일 수 있다. 구체적으로, 형광 신호값의 검출 오차가 매우 적은 마이크로플레이트 리더기가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 테칸社의 Spark 장비로 각 플레이트의 형광 신호값을 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 방법으로 준비된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 제공한다.
II. 웰간 균일성이 향상된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 형광물질 및 계면활성제를 포함하는 캘리브레이션 용액이 수용된 복수의 웰을 포함하며, 웰별 형광 신호에 의해 결정된 웰간 형광 신호 차이가 소정의 차이 목표값 이하인 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 제공한다.
상기 플레이트의 재질, 플레이트에 포함되는 캘리브레이션 용액의 형광물질 및 계면활성제 각각에 대한 구체적인 내용 및 플레이트 관련 기타 전반적인 특성은 항목 I.의 캘리브레이션 플레이트의 준비방법에서 언급한 바와 동일한 바, 관련 내용에 대한 중복기재를 피하기 위해 간단히 설명하기로 한다.
상기 웰간 신호 차이는 웰별 형광 신호의 (i) 최대값과 최소값의 차이, (ii) 분산, (iii) 표준편차, (iv) 중앙값 절대편차 또는 (v) 변동계수(Coefficient of variation)이다. 또한, 상기 웰간 형광 신호의 차이 목표값은 변동계수로서 0.5 내지 4.5일 수 있다.
상기 캘리브레이션 용액은 형광물질을 0.5 nM 내지 200 nM의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 형광물질은 FAM, TET,　HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED,　CAL　Fluor Orange 560,　CAL　Fluor Red 590,　CAL　Fluor Red 610,　Quasar　670, Quasar　705 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 캘리브레이션 용액은 계면활성제를 0.01 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 계면활성제는 Tween-20,　Triton　X-100, n-라우로일 사르코신(n-lauroyl sarcosine), 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate,　SDS) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 캘리브레이션 용액이 각각의 웰에 5 μl 내지 150 μl의 용량으로 수용된 상태일 수 있다.
상기 캘리브레이션용 플레이트는, 종래 핵산 검출 장치에 캘리브레이션을 수행하기 위해 시판되는 플레이트에 비해 웰간 형광 신호 차이가 매우 작다. 또한, 필요한 경우 일부 웰에 캘리브레이션 용액이 가감 처리되어 있을 수 있기 때문에 모든 웰간 수용된 캘리브레이션 용액의 용량이 동일하지 않을 수 있다.
III. 웰간 균일성이 향상된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 키트
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항목 I.에 기재된 방법으로 준비된 캘리브레이션 플레이트 및/또는 항목 II.에 기재된 캘리브레이션 플레이트를 포함하는 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 키트를 제공한다.
상기 캘리브레이션 키트는 복수의 캘리브레이션 플레이트를 포함하며, 상기 플레이트 간에 서로 다른 검출 파장 대역의 형광물질을 포함하는 캘리브레이션 용액이 수용될 수 있다.
상기 캘리브레이션 키트는 특정 장치를 대상으로 임의로 설정된 검출 형광물질에 맞추어 구성될 수 있다. 예를 들어, 4종류의 형광물질이 각각 포함된 4개의 캘리브레이션 플레이트를 포함하는 캘리브레이션 키트, 5종류의 형광물질이 각각 포함된 5개의 캘리브레이션 플레이트를 포함하는 캘리브레이션 키트를 제공할 수 있다.
또한, 상기 캘리브레이션 키트는 버퍼를 포함하며 형광물질 및 계면활성제가 포함되지 않은 캘리브레이션 플레이트를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, TE 버퍼만이 분주된 하나의 캘리브레이션 플레이트와 3종, 4종 또는 5종의 형광물질이 포함된 각각 3개, 4개 또는 5개의 캘리브레이션 플레이트가 하나의 키트로서 제공될 수 있다. 예를 들어, TE 버퍼를 포함하는 캘리브레이션 플레이트, FAM 캘리브레이션 플레이트, C560 캘리브레이션 플레이트, C610 캘리브레이션 플레이트, Q670 캘리브레이션 플레이트 및 Q705 캘리브레이션 플레이트가 포함된 캘리브레이션 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 특징 및 장점은 하기와 같이 요약된다:
(a) 핵산 반응 검출 장치, 특히 멀티플렉스 PCR과 같이 다양한 형광 신호를 검출하는 용도로 사용되는 장치의 경우에는 타겟 핵산에 대응되는 각 신호가 정확히 검출될 수 있도록 광원 및 광검출부에 대한 여러가지 편차 보정을 수행할 필요가 있다. 그러나, 종래 시판되는 캘리브레이션 플레이트를 통해 핵산 반응 검출 장치를 보정한 경우, 관련 절차가 모두 진행된 후에도 시료 검출시 동일 시료에 대한 Ct 값 등의 편차가 다소 크게 나타나는 문제가 있었다.
(b) 본 발명은 상술한 종래의 문제점을 해결하고자, 다양한 장치 및 실험 조건들에 대하여 원인을 분석하던 중 캘리브레이션에 사용되는 웰 플레이트 자체의 재질 특성상 웰간 형광 신호 차이가 존재하는 것을 확인하고, 사전 형광 검출을 통한 선별 및 캘리브레이션 용액 조정을 통해 캘리브레이션용 플레이트의 웰간 균일성을 향상시켰다.
(c) 이로 인해, 본 발명은 웰간 편차가 최소화된 캘리브레이션용 플레이트 및 이를 포함하는 캘리브레이션 키트를 제공함으로써, 상기 플레이트로 캘리브레이션된 장치의 보다 정확한 핵산 반응 신호 검출을 가능하게 한다.
도 1은 마이크로플레이트 리더기로 빈 96웰 플레이트를 형광 촬영하는 조건을 나타낸 것이다.
도 2는 50개의 빈 96웰 플레이트의 웰별 형광 신호를 기초로, 평균 신호값 및 변동계수(Cv)를 산출한 결과이다.
도 3은 실험군 및 대조군의 플레이트에 대하여 RT-PCR 기기로 검출한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 4는 실험군 및 대조군의 플레이트에 대하여 RT-PCR 기기로 검출한 웰별 형광 신호를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험군 및 대조군의 플레이트에 대하여 RT-PCR 기기로 검출한 웰별 형광 신호를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험군 및 대조군의 플레이트에 대하여 마이크로플레이트 리더기로 검출한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 7은 마이크로플레이트 리더기로 25 종의 캘리브레이션 플레이트를 형광 촬영하는 조건을 나타낸 것이다.
도 8a는 SET 1의 캘리브레이션 플레이트의 FAM 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 8b는 SET 1의 캘리브레이션 플레이트의 HEX 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 8c는 SET 1의 캘리브레이션 플레이트의 C610 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 8d는 SET 1의 캘리브레이션 플레이트의 Q670 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 8e는 SET 1의 캘리브레이션 플레이트의 Q705 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 9a는 SET 2의 캘리브레이션 플레이트의 FAM 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 9b는 SET 2의 캘리브레이션 플레이트의 HEX 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 9c는 SET 2의 캘리브레이션 플레이트의 C610 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 9d는 SET 2의 캘리브레이션 플레이트의 Q670 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 9e는 SET 2의 캘리브레이션 플레이트의 Q705 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 10a는 SET 3의 캘리브레이션 플레이트의 FAM 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 10b는 SET 3의 캘리브레이션 플레이트의 HEX 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 10c는 SET 3의 캘리브레이션 플레이트의 C610 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 10d는 SET 3의 캘리브레이션 플레이트의 Q670 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 10e는 SET 3의 캘리브레이션 플레이트의 Q705 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 11a는 SET 4의 캘리브레이션 플레이트의 FAM 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 11b는 SET 4의 캘리브레이션 플레이트의 HEX 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 11c는 SET 4의 캘리브레이션 플레이트의 C610 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 11d는 SET 4의 캘리브레이션 플레이트의 Q670 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 11e는 SET 4의 캘리브레이션 플레이트의 Q705 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 12a는 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 FAM 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 12b는 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 HEX 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 12c는 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 C610 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 12d는 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 Q670 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 12e는 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 Q705 채널에서 촬영한 웰별 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 13은 SET 1 내지 SET 5의 25종의 캘리브레이션 플레이트의 웰별 형광 신호 차이(변동계수)를 나타낸 그래프이다.
도 14는 2021.06.02.자 RT-PCR 시료 증폭 결과에 대하여 SET 2 내지 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 보정 계수를 적용한 ΔCt를 나타낸 그래프이다.
도 15는 2021.06.02.자 RT-PCR 시료 증폭 결과에 대하여 SET 2 내지 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 보정 계수를 적용한 ERFU_CV 를 나타낸 그래프이다.
도 16은 2021.06.11.자 RT-PCR 시료 증폭 결과에 대하여 SET 2 내지 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 보정 계수를 적용한 ΔCt를 나타낸 그래프이다.
도 17은 2021.06.11.자 RT-PCR 시료 증폭 결과에 대하여 SET 2 내지 SET 5의 캘리브레이션 플레이트의 보정 계수를 적용한 ERFU_CV를 나타낸 그래프이다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1: 플레이트 소재로 인한 웰간 형광 신호 차이 확인
B社의 폴리프로필렌 재질의 96 웰 플레이트를 동일한 제품으로 50 개 준비하였다. 마이크로플레이트 리더기(MMR SPARK, 테칸社)로 각 플레이트를 촬영하였으며, 여기광 및 발광 파장대 등 형광 촬영 조건은 도 1에 나타내었다. 검출된 96개의 웰의 형광 신호를 기초로, 평균 형광 신호값 및 웰간 형광 신호 차이로서 변동계수(CV)값을 산출하여, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.
No. 평균값 CV No. 평균값 CV No. 평균값 CV No. 평균값 CV
1 826 9.6% 14 535 25.8% 26 404 9.4% 39 499 6.2%
2 486 32.5% 15 492 8.3% 27 440 6.3% 40 383 8.3%
3 471 6.2% 16 459 17.1% 28 445 12.2% 41 236 10.4%
4 709 7.0% 17 397 13.1% 29 492 16.7% 42 452 20.5%
5 495 8.4% 18 171 19.4% 30 703 11.5% 43 483 8.1%
6 619 8.6% 19 456 15.1% 31 571 10.3% 44 157 10.6%
7 410 10.6% 20 384 13.3% 32 687 9.6% 45 451 14.7%
8 481 9.5% 21 455 9.2% 33 476 9.2% 46 314 7.6%
9 419 10.2% 22 406 12.6% 34 442 7.5% 47 466 14.9%
10 517 10.2% 23 789 12.2% 35 399 7.8% 48 503 7.1%
11 639 11.2% 24 182 11.2% 36 460 5.2% 49 430 15.4%
12 326 7.6% 25 312 12.1% 37 461 7.7% 50 1005 7.2%
13 468 10.7% 38 401 7.4%
동일한 제품의 플레이트 50개를 촬영한 결과, 각 플레이트의 FAM 영역대에서 검출되는 RFU 평균값이 대략 100부터 1000까지 매우 다양하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 각 플레이트별 96개의 웰간 편차 역시 cv 값이 30%를 넘는 경우도 확인한 바, 서로 다른 플레이트 간 품질의 차이뿐만 아니라, 동일 플레이트 내 96개 웰 마다의 형광(autofluorescence) 오차가 매우 큰 것을 알 수 있다.이와 같이, 96웰 플레이트의 재질로 인해 발생되는 형광 신호 오차가 같은 소모품 내에서도 크다는 사실을 확인하였으며, 이는 추후 캘리브레이션 수행시 캘리브레이션 계수 산정 자체에서 부정확도를 증가시킬 우려가 있다. 이에, 본 발명자들은 상기 플레이트 자체 형광(autofluorescence)의 영향을 최소화하기 위하여 1차 선별 과정을 진행하는 단계를 포함하는 방법을 개발하였다.
실험예 2: 계면활성제의 플레이트 균질화 효과 확인
캘리브레이션 용액에 대한 계면활성제의 효과를 확인하기 위하여, 하기 표 2에 기재된 조성으로 캘리브레이션 용액을 제조하였다. 다음으로, 실험예 1에서 웰간 형광 신호 차이가 작은 것을 확인한 96 웰 플레이트 2개를 선별한 후, 각 용액을 1열부터 12열까지 순차적으로 웰마다 20μl씩 분주하여 캘리브레이션 플레이트를 제작하였다. 다음으로, RT-PCR 장치(CFX96, Bio-Rad社)에서 55℃ 3hr Incubation 진행한 후, CFX96 및 마이크로플레이트 리더기(MMR SPARK, 테칸社)에서 형광신호를 검출하여 웰간 형광 신호 차이를 확인하였다. 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
실험군 (1% SDS +Q670) 대조군 (Q670 only)
농도(nM) 150 150
Q670 dye 36 36
TE buffer 2124 2364
1% SDS 240 -
Total 2400 2400
R. Total 2400 2400
분주 용량 (μl) 20 20
* Q670(Quasar 670 T10, Cat.no: RD-5065-5, MW: 3616.7)* TE buffer(1M Tris-HCl (pH8.0), 0.1M EDTA)
도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이, CFX96 장비로 각 플레이트의 웰별 형광 신호를 검출한 결과, 계면활성제 SDS를 포함하는 캘리브레이션 용액이 수용된 경우 형광신호 균질도가 향상된 것을 확인하였다. 구체적으로, Q670만 포함하고 있는 경우 플레이트의 웰별 형광 신호 차이인 cv 값이 7.5 정도로 확인되는 것에 비해, 1% SDS가 추가로 포함된 경우에는 cv 값이 5.8 정도로 낮아졌다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, SPARK 장비로 플레이트의 균일성을 확인한 결과 계면활성제가 포함된 경우 웰간 형광 신호 차이가 줄어든 것을 알 수 있다. 한편, CFX96의 경우 장치 특성상 1열에서 12열로 갈수록 형광세기가 높게 측정되는 경향이 있고, 분주 시간이 지날수록 플레이트에서 용액 내 염료의 균일성이 떨어질 수 있기 때문에 1~6열의 RFU 값보다 7~12열의 RFU 값이 높게 측정된 것으로 예상된다.
핵산 반응 검출을 위해 사용되는 형광염료들 중 일부는 분자구조상 소수성을 띄어 용매에 균일하게 녹지 않고 상층부 및 하층부의 농도차가 크게 나타날 우려가 있다. 이에 착안하여, 본 발명자들은 캘리브레이션 용액에 형광 신호를 발생시키지 않는 계면활성제를 첨가하는 방안을 고안하였고, 본 실험 결과에 나타난 바와 같이, 계면활성제의 첨가는 형광 신호에 영향을 주지 않으면서도 용매 내 형광염료의 균질성을 향상시키는 것을 확인하였다.
실험예 3: 캘리브레이션 플레이트별 웰간 편차 확인
캘리브레이션 용액의 계면활성제, 용량, 플레이트 선별에 따른 효과를 확인하기 위하여, 하기 표 3에 나타난 특징을 갖는 다섯 개의 캘리브레이션 플레이트 세트를 제작하여 플레이트마다의 웰간 형광 신호 차이를 확인하였다. 형광염료와 관련하여, 한 세트당 FAM, C560, C610, Q670 및 Q705가 각각 TE buffer(1M Tris-HCl (pH8.0), 0.1M EDTA)버퍼에 단독 형광물질로 용해된 캘리브레이션 용액을 포함하는 플레이트를 5개씩 제작하였으며, 이에 관한 정보는 표 4에 나타난 바와 같다.
계면활성제 용량(μl) 플레이트 선별 용량 가감
SET 1 X 20 X X
SET 2 1% SDS 20 X X
SET 3 1% SDS 50 X X
SET 4 1% SDS 50 O O
SET 5 1% SDS 50 O O
형광물질 Product name Cat No. 사용 농도
FAM 6-FAM T10 Calibration Standard RD-5025-5 80 nM
C560 CAL Fluor® Orange 560 T10 Calibration Standard RD-5081-5 60 nM
C610 CAL Fluor® Red 610 T10 Calibration Standard RD-5082-5 60 nM
Q670 Quasar® 670 T10 Calibration Standard RD-5065-5 80 nM
Q705 Quasar® 705 T10 Calibration Standard RD-5067-5 80 nM
구체적으로, 표 3 및 표 4에 기재된 정보에 따라 FAM, C560, C610, Q670 및 Q705를 포함하는 캘리브레이션 용액을 20 μl 분주하여 SET 1의 캘리브레이션 플레이트 5개를 제작하였다. 다음으로, 계면활성제를 포함하는 캘리브레이션 용액을 20 μl 분주하여 SET 2의 캘리브레이션 플레이트 5개, 계면활성제를 포함하는 캘리브레이션 용액을 50 μl 분주하여 SET 3의 캘리브레이션 플레이트 5개를 제작하였다. 또한, 실험예 1의 방법으로 마이크로플레이트 리더기(MMR SPARK, 테칸社)를 통해 96개 웰의 웰간 형광 신호 차이로서 변동계수가 10% 이하인 플레이트 10개를 준비하였다. 다음으로, 계면활성제를 포함하는 캘리브레이션 용액을 20 μl 분주하여 캘리브레이션 플레이트 5개를 제작하였다. 이후, 마이크로플레이트 리더기(MMR SPARK, 테칸社)로 형광 신호를 검출하여 웰별 형광 신호값의 평균값 및 평균값과 각 웰별 신호값의 편차를 산출한 후, 모든 웰에 대하여 하기 식에 따른 용량을 가감하였다. 용량 가감을 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 3%미만이 될 때까지 진행하여 SET 4의 캘리브레이션 플레이트 5개를 완성하였다.
Figure PCTKR2022010841-appb-img-000004
아울러, 각 웰의 신호값과 평균의 차이가 표준 편차의 2배가 넘는 웰에 대해서만 1회 용량 가감을 진행한 점을 제외하고는 SET 4와 동일한 방법으로 SET 5의 캘리브레이션 플레이트 5개를 제작하였다.
제작한 5개의 세트 총 25개의 플레이트에 대하여, 마이크로플레이트 리더기(MMR SPARK, 테칸社)로 형광 신호를 검출하였으며, 촬영 조건을 도 7에 나타내었다. 각 플레이트별 96개 웰의 형광 신호값은 도 8A 내지 도 12E에 나타내었으며, 이의 Cv값을 정리하여 하기 표 5 및 도 13에 나타내었다.
No. 계수 산정일 용량(μl) 96 웰간 Cv (%)
FAM HEX C610 Q670 Q705
SET 1 - 20 5.25 6.17 7.00 5.44 6.28
SET 2 4/30 20 4.63 4.89 6.99 4.59 6.23
SET 3 5/4 50 4.47 4.87 4.21 4.90 3.86
SET 4 5/12 50 2.09 2.79 2.41 2.53 2.26
SET 5 6/10 50 3.79 2.86 3.99 2.43 3.28
표 5 및 도 13을 살펴보면, SET 1 대비 SET2의 웰간 형광 신호 차이가 작은 바, 캘리브레이션 용액에 계면활성제를 포함시킴에 따라 용매 내 형광물질의 균질화 효과가 있는 것을 알 수 있다. 특히, 소수성으로 TE 버퍼에 대한 용해성이 떨어지는 dye에 대하여 더 효과가 있는 것으로 보인다. 또한, SET 2 대비 SET 3의 웰간 형광 신호 차이가 작은 바, 캘리브레이션 용액의 용량이 증가됨에 따라 캘리브레이션 플레이트의 웰간 균일성이 향상되는 것을 확인하였다. 아울러, 캘리브레이션 용액이 분주된 상태에서 웰간 형광 신호 차이를 확인한 후 용량 보정을 통해 재보정된 SET 4와 SET5의 경우, 각 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 2~3% 대의 변동계수를 나타내었다. 이는 캘리브레이션 플레이트의 품질이 우수하여 핵산 반응 검출 장치에 대한 매우 정교한 캘리브레이션을 가능케 할 것으로 예상된다.
실험예 4: 캘리브레이션 플레이트 적용에 따른 증폭 보정 확인
캘리브레이션 플레이트의 품질에 따른 보정 효과를 확인하기 위하여, RT-PCR 장치의 동일 시약의 증폭 결과에 대하여 실험예 3.의 SET 2 내지 SET 5의 캘리브레이션 플레이트로부터 도출된 보정 계수를 적용하였다. 구체적으로, 상기 보정 계수는 특정 프로그램을 이용하여 개별 플레이트의 전체 웰의 형광 신호값을 기초로 산출한다. 산출한 보정계수를 적용한 후 증폭 결과의 ΔCt(Ct값 중 가장 큰 값 - 가장 작은 값의 차이)와 ERFU_Cv(Baseline값이 제거된 증폭 그래프 중 RFU 값 최고점에서의 96 웰의 Cv)을 확인하였다.
Allplex TM Entero-DR 시약 구성물 Mix
Symbol Contents Volume Description 1X
Primer Entero-DR MOM 500μl MuDT Oligo Mix (MOM):- 증폭 및 검출 시약 Template 5
Premix EM4 500μl -DNA polymerase
- Uracil DNA Glycosylase (UDG)
- dNTPs 포함 버퍼		 Entero-DR MOM 5
Buffer EM4 buffer 500μl Buffer for Real time PCR- BSA 및 글리세롤 포함 버퍼 EM4 5
CONTROL+ Entero-DR PC 50μl Positive control (PC)- Pathogene and ic clone 믹스 EM4 buffer 5
Step Tm (℃) Time Cycle Plate read
1 95 15:00 1
2 95 00:10 45
3 60 00:15 Plate read
4 72 00:10 Plate read
5 GOTO 2 44 more times
6 55 00:30 1
7 Melting curve 55~85℃ (5 sec/0.5℃) Plate read
실험은 다음과 같이 진행되었다. RT-PCR 장치(씨젠, SGRT)에 대하여, Bioplastics사의 B70679/B57801 플레이트 및 Allplex™ Entero-DR 시약(씨젠社)을 적용하여(표 6 참고) 상기 표 7의 프로토콜로 증폭 반응을 수행하여 2021.06.02. 및 2021.06.11. 총 2회 핵산 반응을 검출하였다. 각 실험 결과에 대하여 SET 2 내지 SET 5의 플레이트별 보정계수를 적용하여, 2021.06.02.의 결과를 표 8, 도 14 및 도 15에, 2021.06.11.의 결과를 표 8, 도 14 및 도 15에 나타내었다. 한편, 2021.06.02.자 실험 중 Q705는 오류가 발생하여 실험값을 도출하지 못했다.
Dye 항목 SET 2 SET 3 SET 4 SET 5
FAM △Ct 1.14 1.05 1.14 0.75
ERFU_CV 11.45 10.86 10.82 6.17
HEX △Ct 0.85 0.74 0.75 0.54
ERFU_CV 9.40 8.75 7.80 5.13
C610 △Ct 1.72 1.35 1.08 0.70
ERFU_CV 15.05 12.40 10.88 5.56
Q670 △Ct 2.44 2.46 2.34 2.13
ERFU_CV 11.86 12.26 9.88 5.36
Q705 △Ct - - - -
ERFU_CV - - - -
Dye 항목 SET 2 SET 3 SET 4 SET 5
FAM △Ct 1.10 1.14 1.07 1.00
ERFU_CV 10.37 10.68 10.24 6.67
HEX △Ct 0.89 0.84 0.84 0.47
ERFU_CV 9.89 9.30 8.99 4.59
C610 △Ct 1.73 1.33 1.25 0.84
ERFU_CV 14.66 11.62 10.79 5.10
Q670 △Ct 1.81 1.78 1.65 1.51
ERFU_CV 11.71 11.87 9.90 5.99
Q705 △Ct 1.68 1.88 1.77 1.55
ERFU_CV 8.76 10.18 9.09 6.49
SET 4 및 SET 5의 Cv 값이 2~3%대인 캘리브레이션 플레이트를 적용하여 보정된 경우 ΔCt 및 End RFU 값의 웰간 형광 신호 차이(Cv값)이 모두 작아진 것을 알 수 있다. 또한, 모든 웰에 대하여 캘리브레이션 용액 용량 가감을 처리한 SET4의 캘리브레이션 플레이트보다 편차가 2σ를 초과하는 웰에 대해서만 용량 가감을 수행한 SET 5의 캘리브레이션 플레이트를 적용하는 경우 증폭 결과가 보다 개선되었다.따라서, 본 발명에 따라 웰간 형광 신호 차이가 작은 캘리브레이션 플레이트를 준비할 수 있고, 이를 적용하여 보정된 핵산 반응 검출 장치는 보다 정확한 시료 증폭 결과를 도출할 수 있는 것을 확인하였다.

Claims (28)

  1. 다음의 단계를 포함하는 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트를 준비하는 방법:
    (a) 복수의 웰을 포함하는 플레이트의 각각의 웰에 캘리브레이션 용액을 분주하는 단계;
    (b) 캘리브레이션 용액이 구비된 플레이트의 웰별 형광 신호(fluorescence signal intensity)에 의해 웰간 형광 신호 차이(well-to-well fluorescence signal difference)를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 제2 차이 목표값 이하가 되도록 상기 플레이트를 조작하여, 캘리브레이션 플레이트를 제공하는 단계; 상기 제2 차이 목표값은 상기 단계(b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이 보다 작다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a) 전에, 복수의 웰을 포함하는 빈(empty) 플레이트의 웰간 형광 신호 차이가 제1 차이 목표값 이하인 플레이트를 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제2 차이 목표값은 상기 제1 차이 목표값보다 작은 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 웰간 형광 신호 차이는 웰별 형광 신호들의 (i) 최대값과 최소값의 차이, (ii) 분산, (iii) 표준편차, (iv) 중앙값 절대편차 또는 (v) 변동계수(Coefficient of variation)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제1 차이 목표값 및 제2 차이 목표값은 웰별 형광 신호들의 변동계수인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 차이 목표값은 1 내지 10에서 선택되는 실수이며, 상기 제2 차이 목표값은 0.5 내지 4.5에서 선택되는 실수인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 빈 플레이트를 선별하는 단계에서, 상기 웰별 형광 신호는 450nm 내지 530nm의 파장 대역에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서, 상기 캘리브레이션 용액의 분주는 동일 용량으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액은 5 μl 내지 150 μl의 용량으로 분주되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액은 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액은 형광물질을 0.5 nM 내지 200 nM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 형광물질은 FAM, TET,　HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED,　CAL　Fluor Orange 560,　CAL　Fluor Red 590,　CAL　Fluor Red 610,　Quasar　670, Quasar　705 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액은 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액은 계면활성제를 0.01 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 계면활성제는 Tween-20,　Triton　X-100, n-라우로일 사르코신(n-lauroyl sarcosine), 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate,　SDS) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 단계(c)에서, 상기 단계(b)에서 결정된 웰간 형광 신호 차이가 상기 제2 차이 목표값을 초과하는 경우, 적어도 하나 이상의 웰에 수용된 캘리브레이션 용액의 용량을 변경하여, 플레이트의 웰간 형광 신호 차이를 제2 차이 목표값 이하로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 용량의 변경은, 각각의 웰별 형광 신호와 이들의 평균값 간의 차이가 소정의 기준치 이상인 웰에 대하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 용량의 변경은, 웰별 형광 신호가 이들의 평균값보다 큰 경우 해당 웰로부터 소정량의 캘리브레이션 용액을 제거하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 용량의 변경은, 웰별 형광 신호가 이들의 평균값보다 작은 경우 해당 웰에 소정량의 캘리브레이션 용액을 첨가하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 플레이트의 웰별 형광 신호는 형광 측정기(fluorometer) 형광 광도계(spectrofluorometer), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광 영상 플레이트 판독기(fluorometric imaging plate　reader) 또는 마이크로플레이트 리더기(microplate　reader)로 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 준비된 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트.
  22. 형광물질 및 계면활성제를 포함하는 캘리브레이션 용액이 수용된 복수의 웰을 포함하며, 웰별 형광 신호에 의해 결정된 웰간 형광 신호 차이가 소정의 차이 목표값 이하인, 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 플레이트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 웰간 형광 신호 차이는 웰별 형광 신호의 (i) 최대값과 최소값의 차이, (ii) 분산, (iii) 표준편차, (iv) 중앙값 절대편차 또는 (v) 변동계수(Coefficient of variation)인 것을 특징으로 하는, 캘리브레이션 플레이트.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 차이 목표값은 웰별 형광 신호의 변동계수로서 0.5 내지 4.5 인 것을 특징으로 하는, 캘리브레이션 플레이트.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 용액이 각각의 웰에 5 μl 내지 150 μl의 용량으로 수용된 것을 특징으로 하는, 캘리브레이션 플레이트.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 캘리브레이션 플레이트를 포함하는 핵산 반응 검출 장치용 캘리브레이션 키트.
  27. 제26항에 있어서,
    복수의 캘리브레이션 플레이트를 포함하며, 상기 플레이트 간에 서로 다른 검출 파장 대역의 형광물질을 포함하는 캘리브레이션 용액이 수용된 것을 특징으로 하는, 캘리브레이션 키트.
  28. 제26항에 있어서,
    버퍼를 포함하며 형광물질 및 계면활성제를 포함하지 않은 캘리브레이션 플레이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 캘리브레이션 키트.
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