KR20140002241A - Ｐｃｒ 데이터 및 다른 데이터에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

PCR 데이터 및 다른 데이터에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법에 있어서, 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이를 이용하여 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호들을 보정하고, 보정된 크로스토크 신호들로 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들을 추정한다.

Description

ＰＣＲ 데이터 및 다른 데이터에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치{Method and apparatus for analyzing nucleic acid by compensating effect of cross-talk in PCR and other data}
PCR 데이터, 마이크로어레이 데이터 등에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치에 관한다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사법으로, 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법이다. PCR에 의해, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있으므로, 인간의 DNA와 같은 핵산을 증폭하여 여러 종류의 유전질환을 진단하는 데 사용된다. 또한 세균이나 바이러스, 진균의 핵산에 적용하여 감염성 질환의 진단 등에 사용할 수 있다.
일반적으로, PCR의 순서는 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하기 위하여 열변성(denaturation)시키는 과정, 온도를 낮추어 프라이머(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)시키는 과정, 및 다시 열을 약간 올려서 DNA를 합성하는 중합 반응을 일으키는(polymerization or extension) 과정의 3단계로 이루어진다. PCR을 1회 수행하면 유전 물질은 2배로 증폭되므로, PCR의 반복 수행에 의하여 핵산의 기하급수적인 증폭이 가능하다.
최근에는, 복수 개의 서로 다른 형광 염료들 또는 프로브 등을 이용하여 표적 유전물질을 증폭하는데 사용되는 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex PCR)도 등장하였다. 멀티플렉스 PCR을 이용한 실험 결과를 획득하기 위해서는 서로 다른 형광 염료들로부터 발광된 서로 다른 형광들 각각의 특정한 파장 대역을 검출하는 필터들이 사용된다. 그러나, 이와 같은 다수의 필터들은 인접한 파장 대역을 갖는바, 인접한 대역의 형광 신호들에 의한 크로스토크(cross-talk)가 발생하여 정확한 실험 결과를 측정하기 어렵다. 따라서, 이러한 크로스토크의 영향을 고려하여 핵산의 분석 결과를 정확하게 파악하고자 하는 연구들이 진행 중에 있다.
PCR 데이터, 마이크로어레이 데이터 등에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치를 제공하는데 있다. 또한, 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공하는 데 있다. 본 실시예가 해결하려는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
일 측면에 따르면, 핵산 분석 방법은 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득하는 단계; 상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크(cross-talk) 신호들을 보정하는 단계; 및 상기 보정된 크로스토크 신호들로 상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles)을 추정하는 단계를 포함한다.
다른 일 측면에 따르면, 상기 핵산 분석 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.
또 다른 일 측면에 따르면, 핵산 분석 장치는 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득하는 농도 분석부; 상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크(cross-talk) 신호들을 보정하는 보정부; 및 상기 보정된 크로스토크 신호들로 상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles)을 추정하는 추정부를 포함한다.
상기된 바에 따르면, 복수의 서로 다른 형광 염료들을 사용하여 핵산을 분석하고자 할 경우 형광 염료들간의 농도 차이를 반영하여 크로스토크 신호가 정확하게 보정될 수 있으므로, 보다 정확한 핵산 분석 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 장치(10)의 구성도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 4 컬러의 형광 염료들을 사용하는 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 검출된 형광 신호의 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 염료들에 대한 크로스토크의 예를 설명하는 표이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 FAM dye에 대하여 측정부(110)에서 측정된 2-플렉스(2-plex) PCR인 경우의 형광 세기와 크로스토크의 변화를 도시한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 Cal560 dye에 대하여 측정부(110)에서 측정된 2-플렉스(2-plex) PCR인 경우의 형광 세기와 크로스토크의 변화를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 측정부(110)에서 측정된 FAM dye 및 Cal560 dye에 대한 2플렉스 PCR인 경우의 형광 세기의 변화를 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 산출부(120)에서 최초 임계 사이클값들(initial CT)을 산출하는 과정을 도시한 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 FAM dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 결과를 도시한 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선이 보정된 결과를 도시한 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 Cal560 dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 결과를 도시한 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 FAM dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선이 보정된 결과를 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 동일한 조건하에서 수행된 멀티플렉스(2-플렉스) PCR의 분석 결과에 대하여, 형광 염료들의 농도 차이를 고려한 경우와 고려하지 않은 경우를 비교한 것을 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 동일한 조건하에서 수행된 멀티플렉스(4-플렉스) PCR의 분석 결과에 대하여, 형광 염료들의 농도 차이를 고려한 경우와 고려하지 않은 경우를 비교한 것을 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 방법의 흐름도이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하도록 하겠다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)의 구성도이다. 도 1을 참고하면, 핵산 분석 시스템(1)은 PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22)와 핵산 분석 장치(10)를 포함한다. 도 1에 도시된 시스템(1)은 본 실시예의 특징이 흐려지는 것을 방지하기 위하여 본 실시예에 관련된 구성요소들만이 도시되어 있다. 하지만, 도 1에 도시된 구성요소들 외에 다른 범용적인 구성요소들이 더 포함될 수 있다.
본 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)은 PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22)에서 핵산 샘플에 표지된 서로 다른 종류의 복수의 형광 염료들로부터 검출된 복수의 형광 신호들을 핵산 분석 장치(10)를 이용하여 분석하는 시스템이다. 그 결과로 핵산의 정량분석 정보(30)가 생성된다.
유전자 샘플로부터 핵산을 검출하고 정량화하기 위한 다양한 분석 방법들 중에서, PCR(real-time multiplex PCR)은 가장 널리 쓰이는 방법 중 하나로서, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
간략하게 설명하면, PCR 기기(21)는 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하기 위하여 열변성(denaturation)시키는 과정, 온도를 낮추어 프라이머(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)시키는 과정, 및 다시 열을 약간 올려서 DNA를 합성하는 중합 반응을 일으키는(polymerization or extension) 과정의 3단계를 거쳐 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기기이다. 특히, PCR 기기(21)는 증폭된 핵산의 농도에 비례하는 형광 신호의 세기를 실시간으로 검출함으로써 핵산의 정량 분석을 가능하게 하는 실시간(real-time) PCR 방법을 많이 이용하고 있다.
최근에는, 복수 개의 서로 다른 형광 염료들을 이용하여 표적 유전물질을 증폭하는 실시간 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex PCR) 방법도 많이 이용되고 있다. 멀티플렉스 PCR을 이용한 실험 결과를 획득하기 위해서는 서로 다른 형광 염료들로부터 발광된 서로 다른 형광들 각각의 특정한 파장 대역을 검출하는 필터들이 사용된다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 4 컬러의 형광 염료들을 사용하는 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 검출된 형광 신호의 스펙트럼을 도시한 도면이다. 도 3a를 참고하면, FAM dye, Cal560 dye, Cal610 dye 및 Q670 dye 각각에 대한 스펙트럼들이 도시되어 있다. 그러나, 이와 같은 각각의 염료들에 대한 스펙트럼들은 인접한 파장 대역을 갖는바, 인접한 대역의 형광 신호들에 의한 크로스토크(cross-talk)가 발생할 수 있다. 크로스토크는 특히, 멀티플렉스 PCR 방법에서 사용하고자 하는 형광 염료들의 컬러 수가 많아질수록 중첩(overlap)되는 스펙트럼들이 증가하므로, 두드러지게 발생될 수 있다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 염료들에 대한 크로스토크의 예를 설명하는 표이다. 도 3b를 참고하면, FAM dye, Cal560 dye, Cal610 dye 및 Q670 dye 각각은 Blue channel, Green channel, Orange channel 및 Red channel에 해당되며 크로스토크를 최소화하기 위해 형광 필터(Excitation, emission, dichroic 필터) 설계를 최적화하여 얻은 값이다. 예를 들어, FAM dye에 대한 형광 신호는 Cal560 dye에 의해 3.0%, Cal610 dye에 의해 -0.1%, Q670 dye에 의해 0.2% 정도의 크로스토크의 영향을 받는다. 이 밖에 Cal560 dye, Cal610 dye 및 Q670 dye 각각에 대한 형광 신호들도 도 3b의 표와 같이 크로스토크의 영향을 받을 수 있다.
이와 같이 형광 필터 밴드 설계를 최적화하여 크로스토크의 영향을 최소화하여도 크로스토크의 영향으로 인하여 각각의 형광 염료들에 대한 형광 신호들이 간섭되므로, 검출할 형광의 컬러 개수가 증가할수록 정확한 핵산의 정량화 결과 등의 실험 결과를 얻을 수 없다. 따라서, 이러한 크로스토크의 영향을 고려하여 핵산의 분석 결과를 정확하게 파악하는 것이 필요하다.
종래에도 복수의 형광 염료들을 사용하는 멀티플렉스 PCR 방법에 있어서, 검출된 형광 신호들간의 크로스토크의 영향을 고려하는 방법에 대해서는 소개된 적이 있었다. 하지만, 종래에는 형광 염료들 각각의 농도의 차이를 고려하지 않고 모두 형광 염료들 각각이 모두 동일한 농도를 갖는다는 전제하에 크로스토크의 영향을 고려하였을 뿐이었다.
그러나, 실제로는 멀티플렉스 PCR 방법에서, 형광 염료들 각각은 의도하거나 또는 의도하지 않더라도 서로 다른 농도를 가질 수 있다. 형광 염료의 농도가 커질수록 다른 형광 염료에 미치는 크로스토크의 영향도 함께 증가할 수 있는바, 형광 염료들 각각의 농도가 고려된 크로스토크의 영향을 파악하여야 보다 정확한 핵산의 분석 결과를 얻을 수 있다.
따라서, 본 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)의 핵산 분석 장치(10)는 PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22)에서 복수의 형광 염료들이 동시에 사용될 때, 형광 염료들의 농도가 고려된 크로스토크의 영향을 파악함으로써, 보다 정확한 핵산의 분석 결과를 얻을 수 있는 장치이다.
본 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)의 PCR 기기(21)는 멀티플렉스 PCR 방법을 수행하는 기기에 해당될 수 있고, 마이크로어레이(22)는 하나의 스팟마다 서로 다른 복수의 형광 염료들을 사용하는 기기에 해당될 수 있다. 또한, 이외에도 하나의 챔버(chamber)에서 서로 다른 복수의 형광 염료들을 사용하는 미세 유체 소자(microfluidic device) 등이 PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22) 대신에 사용될 수 있다.
즉, 본 실시예에 따른 핵산 분석 시스템(1)은 핵산에 표지된 서로 다른 복수의 형광 염료들로부터 형광 신호들을 검출하는 기기라면, PCR 기기(21), 마이크로어레이(22) 등 이외에도 이용될 수 있음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다. 이하에서는 본 실시예에 따른 핵산 분석 장치(10)의 구체적인 구성 및 동작은 멀티플렉스 PCR을 수행하는 PCR 기기(21)를 예로 들어 설명하겠으나, 본 실시예는 이에 한정되지 않음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 장치(10)의 구성도이다. 도 2를 참고하면, 핵산 분석 장치(10)는 측정부(110), 산출부(120), 판단부(130), 농도 분석부(140), 보정부(150) 및 추정부(160)를 포함한다. 도 2에서는 본 실시예의 특징이 흐려지는 것을 방지하기 위하여 본 실시예에 관련된 하드웨어 구성요소(hardware component)들만을 기술하기로 한다. 다만, 본 실시예에 따른 핵산 분석 장치(10)에는 도 2에 도시된 하드웨어 구성요소들 외에 다른 범용적인 하드웨어 구성요소들이 포함될 수 있음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
특히, 도 2에 도시된 핵산 분석 장치(10)는 프로세서로 구현될 수 있다. 이 프로세서는 다수의 논리 게이트들의 어레이로 구현될 수 있고, 범용적인 마이크로프로세서와 이 마이크로프로세서에서 실행될 수 있는 프로그램이 저장된 메모리의 조합으로 구현될 수도 있다. 또한, 다른 형태의 하드웨어로 구현될 수도 있음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
측정부(110)는 PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22)에서 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 발광된 형광들이 검출된 결과를 수신하여 형광 세기의 변화를 측정한다. PCR 기기(21) 또는 마이크로어레이(22)로부터 출력된 형광 신호에 따라 형광 세기의 변화를 측정하는 과정은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하므로, 자세한 설명은 생략하도록 하겠다.
한편, 앞서 설명한 본 실시예에 따른 PCR 기기(21), 마이크로어레이(22) 등은 서로 다른 복수의 형광 염료들을 이용하는 기기에 해당됨을 설명하였다. 그러나, 복수의 형광 염료들이 멀티플렉스 PCR 방법 등을 통해 동시에 이용되기 이전에, 핵산 분석 장치(10)는 각각의 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 형광 신호를 수신하여 핵산 분석 장치(10)의 크로스토크의 영향에 대한 보정(calibration) 정보를 저장부(미도시)에 미리 저장해 놓는다. 보다 상세하게는 도 4a 및 도 4b를 참고하여 설명하도록 하겠다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 FAM dye에 대하여 측정부(110)에서 측정된 2-플렉스(2-plex) PCR인 경우의 형광 세기와 크로스토크의 변화를 도시한 도면이다. 도 4a를 참고하면, 동일한 농도 조건의 FAM dye와 Cal560 dye를 가정하였을 때, FAM dye의 형광 세기의 변화가 도시되어 있고, Cal560 dye에 의한 크로스토크의 영향이 도시되어 있다. 이하에서, FAM dye 및 Cal560 dye의 농도 104는 상대적인 지표에 해당되는 것으로 설명하도록 하겠다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 Cal560 dye에 대하여 측정부(110)에서 측정된 2-플렉스(2-plex) PCR인 경우의 형광 세기와 크로스토크의 변화를 도시한 도면이다. 도 4b를 참고하면, 도 4a와 반대의 경우로서, 동일한 농도 조건의 Cal560 dye와 FAM dye를 가정하였을 때, Cal560 dye의 형광 세기의 변화가 도시되어 있고, FAM dye에 의한 크로스토크의 영향이 도시되어 있다.
도 4a 및 도 4b를 참고하면, 동일한 농도들의 FAM dye 및 Cal560 dye가 2-플렉스 PCR로 사용되었을 경우, Cal560 dye에 의한 크로스토크의 영향을 나타내는 보정계수 a12 및 FAM dye에 의한 크로스토크의 영향을 나타내는 보정계수 a21은 다음의 수학식 1과 같이 정의될 수 있다.
Figure pat00001
도 4a 및 도 4b와 수학식 1에 따를 때, FAM dye에 대한 2-플렉스 PCR이 수행될 경우, Cal560 dye에 의한 크로스토크의 영향을 나타내는 보정계수 a12는 0.03685로 산출될 수 있다. 그리고, Cal560 dye에 대한 2-플렉스 PCR이 수행될 경우, FAM dye에 의한 크로스토크의 영향을 나타내는 보정계수 a21는 0.13568로 산출될 수 있다.
핵산 분석 장치(10)는 각각의 형광 염료들에 대한 싱글플렉스 PCR이 먼저 수행된 결과들, 즉 도 4a 및 도 4b와 수학식 1에서 설명한 내용들에 대한 정보를 보정 정보로서 미리 저장부(미도시)에 저장할 수 있다.
다시 도 2를 참고하면, 측정부(110)는 2-플렉스 PCR을 수행하는 PCR 기기(21)로부터 출력된 형광 신호들에 따른 형광 세기의 변화를 측정한다. 즉, 2-플렉스 PCR이 수행되는 경우, 측정부(110)는 FAM dye 및 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화를 측정한다.
이하에서는 본 실시예의 설명의 편의를 위하여 FAM dye 및 Cal560 dye를 사용하는 2-플렉스 PCR을 예로 들어 설명하겠으나, 3-플렉스 PCR, 4-플렉스 PCR, 5-플렉스 PCR 또는 6-플렉스 PCR 등에도 본 실시예가 동일하게 적용될 수 있음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 측정부(110)에서 측정된 FAM dye 및 Cal560 dye에 대한 2-플렉스 PCR인 경우의 형광 세기의 변화를 도시한 도면이다. 도 5를 참고하면, 측정부(110)에서 측정된 각각의 형광 염료들에 대한 형광 세기의 변화 추이는 시그모이드 곡선(sigmoidal curve)에 가깝게 나타난다.
도 5에 도시된 곡선들은 FAM dye의 농도는 104이고 Cal560 dye의 농도는 102이고, FAM dye에 대한 Cal560 dye의 크로스토크는 5%이고, Cal560 dye에 대한 FAM dye의 크로스토크는 10%인 조건들하에서, 시뮬레이션된 곡선들이다. 즉, 멀티플렉스 PCR(2-플렉스 PCR)에서 사용되는 FAM dye 및 Cal560 dye의 농도는 서로 다르다.
다시 도 2를 참고하면, 산출부(120)는 형광 세기의 변화 추이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들(initial threshold cycles, initial CT)을 산출한다.
이와 같은 임계 사이클값(CT)은 핵산의 초기 농도 등의 분석과 같이 핵산을 정량화하는데 이용되는 값에 해당된다. 임계 사이클값(CT)은 PCR 결과에 대한 시그모이드 곡선에서 특정한 사이클 수(cycle number)로 정의될 수 있다. 임계 사이클값(CT)을 구하는 방법으로는 x축과 평행한 라인을 임의로 설정하여 형광 세기에 관한 시그모이드 곡선과 교차하는 x축 값을 결정하는 임계값(threshold) 방식이 있다. 또한, 시그모이드 곡선의 1차 미분 곡선 또는 2차 미분 곡선의 최대 값으로 결정하는 1차 미분법 또는 2차 미분법이 있다. 임계 사이클값(CT)에 대해서는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하므로, 자세한 설명은 생략하도록 하겠다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 산출부(120)에서 최초 임계 사이클값들(initial CT)을 산출하는 과정을 도시한 도면이다. 도 6에 도시된 그래프들은, 도 5에 도시된 FAM dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선 및 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 2차 미분법에 의해 미분된 결과이다.
산출부(120)는 FAM dye에 대한 미분 그래프의 피크 값에 해당되는 사이클 수를 FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)으로 산출하고, Cal560 dye에 대한 미분 그래프의 피크 값에 해당되는 사이클 수를 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_Cal560)으로 산출한다. 앞서 도 5에서 FAM dye의 농도가 Cal560 dye의 농도보다 높기 때문에, FAM dye에 대한 미분 그래프에서 피크가 먼저 나타난다.
도 6의 예에 따르면, 산출부(120)는 도 5에 도시된 형광 세기의 변화 곡선들에 대하여 2차 미분법을 적용하여, FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)으로 22.03을 산출하고 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)으로 27.74를 산출한다.
산출부(120)에서 FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM) 및 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)가 산출된 결과를 살펴보면, 서로 다른 값이 산출되었다. 이는 FAM dye 및 Cal560 dye의 농도가 서로 다르기 때문이다.
다시 도 2를 참고하면, 판단부(130)는 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클 값들이 동일한지 여부를 판단한다. 즉, 판단부(130)는 FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM) 및 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)이 동일한지 여부를 판단한다.
앞서 설명한 바와 다르게, FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM) 및 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)이 동일한 경우에는, 추정부(160)에서 바로 최종 임계 사이클값들을 추정한다. 다시 말하면, 이와 같은 경우, 추정부(160)는 미리 저장된, 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 크로스토크 신호들로 보상하여 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles, final CT)을 추정한다. 여기서, 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 크로스토크 신호들은 앞서 설명한 저장부(미도시)에 미리 저장된 캘리브레이션 정보에 해당된다.
예를 들어, 판단부(130)의 판단 결과, 최초 임계 사이클값들이 동일한 경우추정부(160)는 아래의 수학식 2를 이용하여 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles, final CT)을 추정할 수 있다.
Figure pat00002
수학식 2를 참고하면, S1은 제 1 염료의 보정된 신호, S2은 제 2 염료의 보정된 신호, B1은 제 1 염료의 보정 전 신호, B2은 제 2 염료의 보정 전 신호, a12는 제 2 염료에 의한 크로스토크 보정계수 및 a21은 제 1 염료에 의한 크로스토크 보정계수를 의미한다.
그러나, 판단부(130)의 판단 결과 FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM) 및 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)이 동일하지 않은 경우에는, 핵산 분석 장치(10)는 FAM dye 및 Cal560 dye의 농도 차이를 고려한다.
농도 분석부(140)는 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득한다. 즉, 농도 분석부(140)는 도 5 및 6에서 설명된 FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM) 및 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)의 차이를 이용하여, FAM dye 및 Cal560 dye간의 농도의 차이를 획득한다.
일 실시예에 따르면, 농도 분석부(140)는 아래의 수학식 3을 이용하여 농도의 차이를 획득할 수 있다.
Figure pat00003
수학식 3을 참고하면, Δn은 형광 염료들간의 농도 차이, E는 PCR의 증폭 효율, ΔCT는 최초 임계 사이클값들의 차이를 의미한다.
앞서 설명한 도 5 및 6의 예에 따를 때, ΔCT는 5.71이다. PCR의 증폭 효율 E 를 1로 가정할 경우, FAM dye 및 Cal560 dye간의 농도의 차이 Δn은 52.35로 계산된다. 즉, 농도 분석부(140)는 이와 같이 FAM dye 및 Cal560 dye간의 농도의 차이 Δn인 52.35를 획득한다.
보정부(150)는 획득된 농도의 차이를 이용하여 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호들을 보정한다. 여기서, 보정된 크로스토크 신호들은 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 미리 저장된 크로스토크 신호들에 대해 농도 분석부(140)에서 획득된 농도의 차이가 반영되어 보정된 신호들이다.
보다 상세하게 설명하면, 보정부(150)는 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호의 형광 세기의 변화 곡선을 농도 분석부(140)에서 획득된 농도의 차이를 이용하여 조정함으로써, 크로스토크 신호들을 보정한다. 그리고 나서, 보정부(150)는 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들간의 차이를 이용하여 조정된 결과를 다시 조정함으로써, 크로스토크 신호들을 보정한다.
우선, 보정부(150)는 아래의 수학식 4를 이용하여 형광 염료들 각각에 대응되는 형광 세기의 보정을 수행한다.
Figure pat00004
Figure pat00005
수학식 4를 참고하면, IΔF는 형광 세기의 보정 값에 해당된다.
앞서 설명한 도 5 및 6의 예에 따를 때, 농도 분석부(140)에서 획득된 FAM dye 및 Cal560 dye간의 농도의 차이 Δn은 52.35이다. 따라서, 보정부(150)는 수학식 4를 이용하여, IΔF=(1-e-2.303·52.35)/(1-e-2.303·1)=1/0.900=1.11를 산출한다.
다음으로, 보정부(150)는 FAM dye 및 Cal560 dye 각각에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 보정한다.
보정부(150)에서 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 보정하는 과정은 다음과 같다. 보정부(150)는 다음의 수학식 5를 이용하여 FAM dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 후, 수학식 6을 이용하여 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 보정한다.
Figure pat00006
Figure pat00007
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 FAM dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 결과를 도시한 도면이다. 도 7a를 참고하면, 원래의 FAM dye에 의한 크로스토크 신호(701)는 보정부(150)에서 수학식 5를 이용하여 형광 세기가 보정됨으로써 형광 보정된 크로스토크 신호(702)로 변경된다. 그리고 나서, 형광 보정된 크로스토크 신호(702)는 보정부(150)에서 수학식 6을 이용하여 농도가 보정됨으로써 농도 보정된 크로스토크 신호(703)로 변경된다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 Cal560 dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선이 보정된 결과를 도시한 도면이다. 도 7b를 참고하면, Cal560 dye에 대한 원래의 형광 세기의 변화 곡선(704)은 도 7a의 보정된 크로스토크 신호(703)에 의해 보상됨으로써, 보정된 변화 곡선(705)으로 변경된다.
이와 같이 보정된 변화 곡선(705)은 Cal560 dye에 대한 실제 변화 곡선(706)과 거의 차이가 없게 된다. 즉, 보정부(150)에서 형광 염료들간의 농도 차이를 고려하여 원래의 변화 곡선(704)을 보정시킴으로써, 실제의 변화 곡선(706)에 가까운 실험 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 보다 정확한 핵산 분석이 가능해진다.
다시 도 2를 참고하면, 추정부(160)는 보정부(150)에서 보정된 형광 세기의 변화 곡선을 이용하여 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles, final CT)을 추정한다. 추정부(160)는 앞서 설명된 산출부(120)와 같이, 1차 미분법, 2차 미분법 등과 같이 일반적으로 알려진 임계 사이클값(CT)의 산출 방법을 이용하여, 최종 임계 사이클값들(final CT)을 추정한다.
추정부(160)는 앞서 도 7b에서 보정된 변화 곡선(705)을 이용하여 Cal560 dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_Cal560)을 추정한다. 도 7b의 예에 따르면, 추정부(160)는 Cal560 dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_Cal560)을 27.70으로 추정한다.
한편, 보정부(150)에서 FAM dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 보정하는 과정은 다음과 같다. 보정부(150)는 다음의 수학식 7을 이용하여 Cal560 dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 후, 수학식 8을 이용하여 FAM dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선을 보정한다.
Figure pat00008
Figure pat00009
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 Cal560 dye에 의한 크로스토크 신호를 보정한 결과를 도시한 도면이다. 도 8a를 참고하면, 원래의 Cal560 dye에 의한 크로스토크 신호(801)는 보정부(150)에서 수학식 7을 이용하여 형광 세기가 보정됨으로써 형광 보정된 크로스토크 신호(802)로 변경된다. 그리고 나서, 형광 보정된 크로스토크 신호(802)는 보정부(150)에서 수학식 8을 이용하여 농도가 보정됨으로써 농도 보정된 크로스토크 신호(803)로 변경된다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 보정부(150)에서 FAM dye에 대한 형광 세기의 변화 곡선이 보정된 결과를 도시한 도면이다. 도 8b를 참고하면, FAM dye에 대한 원래의 형광 세기의 변화 곡선(804)은 도 8a의 보정된 크로스토크 신호(803)에 의해 보상됨으로써, 보정된 변화 곡선(805)으로 변경된다.
이와 같이 보정된 변화 곡선(805)은 FAM dye에 대한 실제 변화 곡선(806)과 거의 차이가 없게 된다. 즉, 보정부(150)에서 형광 염료들간의 농도 차이를 고려하여 원래의 변화 곡선(804)을 보정시킴으로써, 실제의 변화 곡선(806)에 가까운 실험 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 보다 정확한 핵산 분석이 가능해진다.
다시 도 2를 참고하면, 추정부(160)는 앞서 도 8b에서 보정된 변화 곡선(805)을 이용하여 FAM dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_FAM)을 추정한다. 도 8b의 예에 따르면, 추정부(160)는 FAM dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_FAM)을 22.03으로 추정한다.
앞에 설명된 예에 따르면, 추정부(160)는 Cal560 dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_Cal560)을 27.70으로 추정하였고, FAM dye에 대한 최종 임계 사이클값(final CT_FAM)을 22.03으로 추정하였다. 하지만, 산출부(120)는 Cal560 dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_Cal560)을 27.74으로 산출하였고, FAM dye에 대한 최초 임계 사이클값(initial CT_FAM)을 22.03으로 산출하였다.
비교하여 보면, Cal560 dye에 대한 임계 사이클값(CT_Cal560)이 특히 차이가 있다. 이와 같은 결과는, FAM dye 및 Cal560 dye의 농도 차이에서 비롯된 것으로써, 농도 차이를 고려하지 않고 계산되었던 최초 임계 사이클값들보다는 정확한 결과라는 것을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 동일한 조건하에서 수행된 멀티플렉스(2-플렉스) PCR의 분석 결과에 대하여, 형광 염료들의 농도 차이를 고려한 경우와 고려하지 않은 경우를 비교한 것을 도시한 도면이다. 도 9를 참고하면, 앞서 설명한 바와 같이, 특히 Cal560 dye에 대해서, 종래 방법에 해당되는 ABI method와 비교할 때 본 실시예에 따라 농도 차이를 고려한 경우에, 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 동일한 조건하에서 수행된 멀티플렉스(4-플렉스) PCR의 분석 결과에 대하여, 형광 염료들의 농도 차이를 고려한 경우와 고려하지 않은 경우를 비교한 것을 도시한 도면이다. 도 10을 참고하면, 종래 방법에 해당되는 ABI method와 비교할 때 본 실시예에 따라 농도 차이를 고려한 경우에, 마찬가지로 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 실시예에서는 4-플렉스 PCR에 대해서는 자세히 설명되지 않았으나, 앞서 설명된 2-플렉스 PCR 방법을 이용함으로써 4-플렉스 PCR에 대해서도 용이하게 구현될 수 있음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
한편, 이제까지 설명된 FAM dye 및 Cal560 dye에 관한 그래프 및 수치들은 단지 본 실시예의 이해를 돕기 위하여 예로 든 것일 뿐, 본 실시예는 이에 한정되지 않음을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이해할 수 있다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 분석 방법의 흐름도이다. 도 11을 참고하면, 본 실시예에 따른 핵산 분석 방법은 도 1 및 2의 핵산 분석 장치(10)에서 시계열적으로 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서, 이하 생략된 내용이라 하더라도 도 1 및 2 등에 관하여 이상에서 기술된 내용은 본 실시예에 따른 핵산 분석 방법에도 적용된다.
1101 단계에서, 농도 분석부(140)는 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득한다.
1102 단계에서, 보정부(150)는 획득된 농도의 차이를 이용하여 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호들을 보정한다.
1103 단계에서, 추정부(160)는 보정된 크로스토크 신호들로 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들을 추정한다.
한편, 상술한 본 발명의 실시예들은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 프로그램으로 작성 가능하고, 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 이용하여 상기 프로그램을 동작시키는 범용 디지털 컴퓨터에서 구현될 수 있다. 또한, 상술한 본 발명의 실시예에서 사용된 데이터의 구조는 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 여러 수단을 통하여 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체는 마그네틱 저장매체(예를 들면, 롬, 플로피 디스크, 하드 디스크 등), 광학적 판독 매체(예를 들면, 시디롬, 디브이디 등)와 같은 저장매체를 포함한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
10: 핵산 분석 장치 21: PCR 기기
22: 마이크로어레이 30: 핵산의 정량분석 정보
110: 측정부 120: 산출부
130: 판단부 140: 농도 분석부
150: 보정부 160: 추정부

Claims (20)

  1. 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득하는 단계;
    상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크(cross-talk) 신호들을 보정하는 단계; 및
    상기 보정된 크로스토크 신호들로 상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles)을 추정하는 단계를 포함하는 핵산 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 보정된 크로스토크 신호들은
    상기 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 미리 저장된 크로스토크 신호들에 상기 획득된 농도의 차이가 반영되어 보정된 신호들인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들(initial threshold cycles)을 산출하는 단계를 더 포함하고,
    상기 획득하는 단계는 상기 산출된 최초 임계 사이클값들간의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 상기 농도의 차이를 획득하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 형광 염료들 각각에 대응되는 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일한지 여부를 판단하는 단계를 더 포함하고.
    상기 획득하는 단계는 상기 판단 결과 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일하지 않은 경우에 상기 농도의 차이를 획득하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 판단 결과 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일한 경우,
    상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 상기 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 미리 저장된 크로스토크 보정계수를 이용하여 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들을 추정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 최초 임계 사이클값들 및 최종 임계 사이클값들은
    n차 미분(n≥1) 방식 또는 임계값(threshold) 방식을 이용하여 산출된 값들인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 보정하는 단계는
    상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호의 형광 세기의 변화 추이를 상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 조정함으로써, 상기 크로스토크 신호들을 보정하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 보정하는 단계는
    상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들간의 차이를 이용하여 상기 조정된 결과를 다시 조정함으로써, 상기 크로스토크 신호들을 보정하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 서로 다른 형광 염료들은
    상기 형광 염료들을 동시에 검출하여 핵산을 분석하는 멀티플렉스 PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction) 기기, 마이크로어레이 및 미세 유체 소자 중 적어도 하나에서 사용되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산에 표지된 상기 서로 다른 형광 염료들로부터 발광된 형광을 검출하여 상기 형광 세기의 변화를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10항 중에 어느 한 항의 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체.
  12. 핵산에 표지된 서로 다른 형광 염료들로부터 검출된 형광 세기의 변화 추이의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 농도의 차이를 획득하는 농도 분석부;
    상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크(cross-talk) 신호들을 보정하는 보정부; 및
    상기 보정된 크로스토크 신호들로 상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들(final threshold cycles)을 추정하는 추정부를 포함하는 핵산 분석 장치.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 보정된 크로스토크 신호들은
    상기 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 미리 저장된 크로스토크 신호들에 상기 획득된 농도의 차이가 반영되어 보정된 신호들인 장치.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 이용하여 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들(initial threshold cycles)을 산출하는 산출부를 더 포함하고,
    상기 농도 획득부는 상기 산출된 최초 임계 사이클값들간의 차이를 이용하여 상기 형광 염료들간의 상기 농도의 차이를 획득하는 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 형광 염료들 각각에 대응되는 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일한지 여부를 판단하는 판단부를 더 포함하고.
    상기 농도 획득부는 상기 판단 결과 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일하지 않은 경우에 상기 농도의 차이를 획득하는 장치.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 추정부는
    상기 판단 결과 상기 산출된 최초 임계 사이클 값들이 동일한 경우,
    상기 검출된 형광 세기의 변화 추이를 상기 형광 염료들 각각이 개별적으로 사용되었을 경우에서의 미리 저장된 크로스토크 보정계수를 이용하여 보상함으로써, 상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최종 임계 사이클값들을 추정하는 장치.
  17. 제 12 항에 있어서,
    상기 보정부는
    상기 형광 염료들 각각에 의해 기인된 크로스토크 신호의 형광 세기의 변화 추이를 상기 획득된 농도의 차이를 이용하여 조정함으로써, 상기 크로스토크 신호들을 보정하는 장치.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 보정부는
    상기 형광 염료들 각각에 대응되는 최초 임계 사이클값들간의 차이를 이용하여 상기 조정된 결과를 다시 조정함으로써, 상기 크로스토크 신호들을 보정하는 장치.
  19. 제 12 항에 있어서,
    상기 서로 다른 형광 염료들은
    상기 형광 염료들을 동시에 검출하여 핵산을 분석하는 멀티플렉스 PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction) 기기, 마이크로어레이 및 미세 유체 소자 중 적어도 하나에서 사용되는 장치.
  20. 제 12 항에 있어서,
    상기 핵산에 표지된 상기 서로 다른 형광 염료들로부터 발광된 형광을 검출하여 상기 형광 세기의 변화를 측정하는 측정부를 더 포함하는 장치.
KR1020120070234A 2012-06-28 2012-06-28 Ｐｃｒ 데이터 및 다른 데이터에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치 KR101969846B1 (ko)

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