KR20120103496A - 실시간 중합효소 연쇄 반응에 있어서 표준 곡선 및 임계값을 획득하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 얻은 증폭 사이클 횟수에 따른 폴리뉴클레오티드 양을 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선으로부터 보다 정확한 표준 곡선(standard curve)을 획득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행했을 때, 복수개의 증폭 곡선으로부터의 데이터를 통합적으로 반영한 보다 정확한 표준 곡선을 획득하여 폴리뉴클레오티드 정량을 보다 정확하게 할 수 있다.

Description

실시간 중합효소 연쇄 반응에 있어서 표준 곡선 및 임계값을 획득하는 방법{Method for acquiring a standard curve and a threshold in real-time PCR}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 얻은 증폭 사이클 횟수에 따른 폴리뉴클레오티드 양을 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선으로부터 표준 곡선(standard curve)을 획득하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 임계값을 선택하는 방법에 관한 것이다.
실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time polynucleotide chain reaction: Real time PCR)은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 폴리뉴클레오티드의 정량을 할 수 있는 기술로 유전자 발현의 측정, 자극에 대한 생물학적 반응의 모니터링, 게놈 수준(genomic-level) 유전자 정량 및 병원체 검출과 같은 생물학적 연구 및 임상학적 분석에 널리 사용되고 있다.
Real time PCR에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 검출 방법으로 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 quencher 물질로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다. 상기 방법들을 이용하였을 때, Real time PCR이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 사용자는 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
증폭 프로파일 곡선은 일반적으로 실질적인 폴리뉴클레오티드 양이 반영되지 않은 배경 형광신호세기가 나타나는 베이스라인(baseline) 영역, 폴리뉴클레오티드 양의 증가가 반영되어 형광신호세기의 증가가 나타나는 지수적 영역(exponential region), 및 PCR 반응이 포화 상태에 이르러 더 이상 형광신호세기의 증가가 나타나지 않는 정체 상태 영역(plateau region)으로 나뉘어 진다(도1). PCR 반응 초기에 베이스라인 영역이 나타나는 이유는 PCR 증폭 산물량이 아직 형광으로 검출 가능한 양에 도달하지 못하였기 때문이다.
통상적으로 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 지점, 즉 PCR 증폭 산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달한 때의 형광신호세기를 임계점(threshold)이라고 하고 증폭 프로파일 곡선에서 임계점에 대응하는 증폭 사이클 횟수를 임계 사이클(threshold cycle:CT)이라고 한다. 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 달리하여 각기 Real time PCR을 수행하였을 때, 초기 폴리뉴클레오티드 양이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 도달하는 증폭 사이클 횟수가 적어지므로 임계 사이클 값이 적어진다(도 2). 따라서 초기 폴리뉴클레오티드 양의 로그값과 임계 사이클 값은 강한 반비례 관계에 있게 되고, 이러한 초기 폴리뉴클레오티드 양의 로그값에 대한 임계 사이클 값을 나타낸 함수가 표준 곡선(standard curve)이다(도 3). 표준 곡선이 결정되게 되면 폴리뉴클레오티드의 양을 모르는 미지의 시료에 대해서도 그의 임계 사이클 값을 표준 곡선에 대입하여 폴리뉴클레오티드의 양을 추정할 수 있게 된다.
임계점에 따라 표준 곡선이 결정되므로, 임계점의 결정은 Real time PCR의 폴리뉴클레오티드 정량에 있어 중요한 역할을 한다. 임계점을 결정하기 위한 방법으로 AFL(임의 형광 값: arbitrary fluorescence value) 이라고 불리는 미리 결정된 신호 레벨에 형광 신호세기가 도달했을 때를 임계점으로 하는 방법, 증폭 프로파일 곡선의 이차 미분 계수의 최대값을 임계점으로 하는 방법 등이 있다. AFL을 이용하는 방법의 경우 초기 PCR 사이클에서의 평균적인 베이스라인 형광 레벨의 변화에 민감하다는 단점이 있고 미분을 이용하는 방법의 경우 아웃라이어(outlier)에 민감하고 표준 곡선은 모든 증폭 프로파일 곡선의 임계 사이클 값으로부터 결정됨에도 불구하고 증폭 프로파일 곡선 각각에 대하여 따로 분석을 수행한다는 단점이 있었다. 상기 방법들로 적합한 표준 곡선이 만들어지지 않는 경우, 통상적으로 사용자가 직접 임계점을 눈으로 보고 결정할 수 있는데, 이러한 경우에도 사용자의 주관적인 판단이 들어가기 때문에 폴리뉴클레오티드의 정량의 정확도를 낮출 수 있다. 따라서 보다 정확한 폴리뉴클레오티드 정량을 위하여 Real time PCR의 증폭 프로파일 곡선 데이터로부터 정확한 임계값을 결정하여 보다 정확한 표준 곡선을 획득해야 하는 필요가 존재한다.
대한민국 특허 KR2005-74620A, 초록 및 청구항 1
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 얻은 증폭 사이클 횟수에 따른 폴리뉴클레오티드 양을 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선으로부터 보다 정확한 표준 곡선(standard curve)을 획득하는 방법을 제공한다.
본 발명은 보다 정확한 폴리뉴클레오티드 정량을 하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 첫번째 양태는 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 표준 곡선(standard curve)을 획득하는 방법을 제공한다.
표준 곡선을 획득하기 위한 제1 구체예는 다음의 방법을 포함한다.
(a) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
(b) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
(c) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 하나를 선택하여, 임의의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
(d) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계; 및
(f) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 획득하는 단계를 포함하는 방법.
상기 표준 곡선을 획득하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
상기 방법은, 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계를 포함할 수 있다.
용어 "실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction: Real time PCR)"은 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제를 사용하여 증폭시키는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 개량한 기술로, PCR 수행시 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 형광 물질을 같이 넣어 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양의 증가를 형광 물질이 발산하는 형광의 세기에 의해 실시간으로 모니터링할 수 있는 기술을 의미한다. 상기 중합효소 연쇄 반응은 폴리뉴클레오티드를 dNTP, 프라이머, 폴리머라제 등과 함께 두고 변성(denaturation), 결합(annealing), 신장(elongation)의 온도를 달리하는 세 단계를 반복적으로 수행하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 반응을 의미한다. 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응은 사용되는 형광 물질에 따라 인터컬레이팅(Intercalating)법, 택맨 프로브(TaqMan probe)법, 사이클링 프로브(cycling probe)법을 사용할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도는 바람직하게는, 이미 농도를 알고 있는 폴리뉴클레오티드 시료를 단계적으로 희석하여 만든 농도일 수 있다. 상기 검출 가능한 프로브는 SYBR Green I, Ethidium bromide, YO-PRO-1 BOXTO와 같은 인터컬레이팅 염색제, 3' 말단에는 도너 플루오르포어(donor fluorephore) (FITC)가 표지되고 5' 말단에는 어셉터 플루오르포어(acceptor fluorophore)가 표지된 플루오르제닉 하이브리디제이션 올리고 프로브(fluoregenic hybridization oligoprobe), 택맨 프로브(TaqMan prob), 헤어핀 올리고프로브(Hairpin oligoprobe), 자가-형광 엠프리콘(self-fluorescing amplicon(sunrise primer & scorpion primer))를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
상기 방법은, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
Real time PCR을 수행하면 증폭 사이클 횟수가 증가함에 따라 폴리뉴클레오티드의 양이 증가하고 상기 프로브가 제공하는 신호세기 값이 증가한다. 상기 증폭 프로파일 곡선은 이러한 신호세기 값을 검출하여, 상기 증폭 사이클 횟수에 따라 상기 프로브가 제공하는 신호세기 값을 나타내도록 한 관계 함수를 의미한다. 바람직하게는 상기 증폭 프로파일 곡선은 검출한 신호세기를 수동 참조 프로브(passive reference dye)으로부터의 신호세기로 나누어 표준화된 값인 Rn 또는 Rn 값에서 반응 초기 신호세기 값의 증가가 나타나지 않는 영역(베이스라인 영역)의 Rn 값을 차감한 ΔRn을 y축으로 하고 증폭 사이클 횟수를 x축으로 한 그래프로 나타낼 수 있다.
상기 방법은, 상기 신호세기 값 중에서 임의로 하나를 선택하여, 임의의 임계값(threshold)을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 임계값은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 적용된 신호세기 값 중 임의적으로 선택한 하나의 값이 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 임계값은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 베이스라인 영역 및 정체 상태 영역 사이의 신호세기 값, 더 바람직하게는 증폭 프로파일 곡선에서 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 지점의 신호세기 값이 될 수 있다. 상기 베이스 라인 영역은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 Real time PCR 반응 초기 신호세기 값이 지속적으로 증가하지 않는 영역을, 상기 지수적 영역은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 신호세기 값이 증가하는 영역을, 상기 정체 상태 영역은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 상기 지수적 영역 다음에 나타나는 신호세기 값이 증가하지 않는 영역을 의미한다. 상기 베이스 라인 영역은 폴리뉴클레오티드의 양이 아직 검출 가능한 신호세기 값을 갖는 폴리뉴클레오티드 양에 도달하지 못하였기 때문에 나타난다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (c) 단계는 상기 신호세기 값 중 일정 구간을 정하여 그 구간을 균등 분할하는 값들을 임계값으로 선택하는 단계일 수 있다. 상기 일정 구간은 상기 증폭 프로파일 곡선의 신호세기 값 중 임의로 두 개의 값을 선택했을 때 그 두 개의 값 사이의 구간을 의미한다. 일정 구간을 결정하는 두 개의 값은 사용자가 임의로 선택할 수 있다. 다만, 통상적으로 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 부분이 정확한 정량을 위한 임계값이라고 알려져 있으므로 바람직하게는, 증폭 프로파일 곡선의 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 부분 주변의 신호세기 값들을 포함하도록 일정 구간을 결정할 수 있다. 일정 구간을 균등 분할 하는 값이란 일정 구간을 일정한 범위로 분할하는 값들을 의미한다.
예를 들어 일정 구간이 1 내지 5에 해당할 때 범위를 1로 하여 균등 분할하면 그 값은 1, 2, 3, 4, 및 5가 된다. 일정 구간을 균등 분할 하여 임계값을 선택하는 이유는 선택한 일정 구간 전 범위에 걸쳐 임계값들의 정확도를 구간별 차등 없이 시험해 볼 수 있기 때문이다. 바람직하게는 정확한 정량을 가능하게 하는 임계값이 있을 것으로 예상되는 부분(베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 부분 주변)을 일정 구간으로 잡아, 보다 조밀하게 균등 분할 한 값들을 임계값으로 할수록 보다 정확한 표준 곡선을 산출하는 임계값을 선택할 수 있을 것이다.
상기 방법은, 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "임계 사이클(thresold cycle)"은 상기 증폭 프로파일 곡선에서 신호세기 값이 임계값일 때의 증폭 사이클 횟수 값을 의미한다. 초기 폴리뉴클레오티드 양이 많을수록 적은 증폭 사이클 횟수에서 지수적 영역이 시작된다. 따라서 초기 폴리뉴클레오티드 양이 많을수록 적은 임계 사이클 값을 가질 수 있다.
상기 방법은, 상기 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
임계 사이클 값은 2 내지 n개(n은 2 이상의 자연수) 선택될 수 있다. 복수의 임계 사이클 값을 선택하는 것은 복수의 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 얻을 수 있기 때문이다. 바람직하게 n은 2 내지 100, 2 내지 10 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은, 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
용어, "표준 곡선(standard curve)"은 임계 사이클 값에 따른 초기 폴리뉴클레오티드 양을 나타낸 관계 함수를 의미한다. 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들은 각각이 (a) 단계의 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응된다. 따라서 상기 임계 사이클 값들을 기초로 하여 상기 임계 사이클 값과 (a) 단계의 초기 폴리뉴클레오티드 양의 관계를 나타내는 2차원 함수를 결정할 수 있고 이것을 표준 곡선으로 할 수 있다.
상기 방법에서는 (e) 단계에서 (d) 단계의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하므로, (f) 단계에서의 표준 곡선은 (e) 단계에서 선택한 2개 이상의 임계 사이클 값으로부터 획득할 수 있다. 통상적으로는 Real time PCR에서 표준 곡선을 획득할 때 모든 임계 사이클 값을 기초로 하나, 본 발명은 모든 임계 사이클 값 중 선택한 일부를 기초로 하기 때문에 아웃라이어(outlier) 임계 사이클 값을 배제할 수 있는 기회를 가질 수 있다.
상기 표준 곡선은 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 양에 대응하는 2개 이상의 임계 사이클 값들로부터 선형 회귀 분석을 수행하여 1차 함수로 획득될 수 있다. 또한 상기 표준 곡선은 상기 임계 사이클 값들에 따른 상기 초기 폴리뉴클레오티드 양의 로그값의 관계 함수로 나타낼 수 있다. 초기 농도를 알고 있는 폴리뉴클레오티드 시료들의 Real time PCR로 일단 표준 곡선이 획득되면 초기 폴리뉴클레오티드의 양을 모르는 미지의 시료에 대해서도 동일한 조건 하에서 Real time PCR 반응을 수행하여, 동일한 임계값을 적용하여 임계 사이클 값을 구할 수 있을 것이고, 상기 획득한 표준 곡선에 임계 사이클 값을 적용시켜 초기 폴리뉴클레오티드 양을 알 수 있다.
두개의 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 얻을 경우, 상기 표준 곡선은 임계 사이클 값에 따른 초기 폴리뉴클레오티드 양을 나타내는 1차 함수의 형태로 표시될 수 있다. 또한, 선택하는 임계 사이클 값이 3개 이상일 경우 1차 함수인 표준 곡선을 산출하기 위해 선형 회귀 분석을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기의 표준 곡선을 획득하는 방법은
(g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 추가되는 단계를 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
상기 방법은, (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (g) 단계는 상기 (e) 단계에서 선택되는 2개 이상의 임계 사이클 값들을 포함하는 집합이 상기 (e) 단계를 반복할 때마다 상이하도록, 상기 (e) 및 (f) 단계를 상이한 집합을 선택할 수 있는 모든 경우의 수만큼 반복하는 단계일 수 있다.
예를 들어 (e) 단계에서 임계 사이클 값을 n개 선택하고 (d) 단계에서 결정된 임계 사이클 값의 모든 갯수가 p라고 하면 pCn 회만큼 (e) 및 (f) 단계를 반복하게 될 것이다. 상기 pCn은 확률 및 통계학에서 쓰이는 조합 기호를 나타내는 것으로, p개의 변수 중에서 상이한 n개를 선택할 수 있는 모든 방법의 수를 의미한다. (pCn=p!/n!(p-n)!) 모든 경우의 수만큼 표준 곡선을 획득하여 그 중에서 인라이어를 가장 많이 포함하는 표준 곡선을 선택하게 되면 주어진 임계값 및 조건에 대해 최적의 표준 곡선을 획득할 수 있다.
상기 (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복할 경우 복수개의 표준 곡선을 획득할 수 있다. 이때, 상기 (g) 단계에서는 (e) 단계에서 선택되는 임계 사이클 값들을 반복할 때마다 상이하게 하여 (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여 반복 횟수만큼의 서로 상이한 표준 곡선들을 획득할 수 있다.
상기 방법은, 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "아웃라이어(outlier)"는 획득한 데이터 값들의 대부분이 일정한 규칙에 따른다고 가정할 때, 획득한 데이터 값 중 이러한 규칙에 따르지 않는 노이즈 값을 의미한다. 이러한 노이즈 값들은 측정 장비의 오차, 실험자의 실험 미숙, 시료의 오염 등으로 인해 발생될 수 있다.
상기 아웃라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미하는 것이다. (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값은 표준 곡선 위에 존재할 수 있으나, 표준 곡선 밖에 존재할 수 있다. 이때 동일한 핵산량에서 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값의 차이가 존재하고, 이러한 차이가 일정 범위, 즉 소정의 임계 사이클 이상을 갖을 때, (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값을 아웃라이어라고 할 수 있다. 이때, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 임계 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
반면에 용어 "인라이어(inlier)"는 획득한 데이터 값들의 대부분이 일정한 규칙에 따른다고 가정할 때, 이러한 규칙에 따르는 대부분의 데이터 값을 의미한다.
상기 인라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미하는 것이다. (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값은 표준 곡선 위에 존재할 수 있으나, 표준 곡선 밖에 존재할 수 있다. 이때 동일한 핵산량에서 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값의 차이가 존재하고, 이러한 차이가 일정 범위, 즉 소정의 임계 사이클 이하일 때, (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값을 인라이어라고 할 수 있다. 이때, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
획득한 데이터 값들이 따르는 일반적인 규칙을 산출할 때, 인라이어와 아웃라이어를 모두 반영하는 것보다 최대한 아웃라이어를 배제하고 인라이어만을 반영하여야 보다 정확한 규칙을 산출할 수 있다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 상기 (h) 단계는 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계로 치환될 수 있다.
상기 (h) 단계는 상기 반복 횟수만큼의 상이한 표준 곡선들 중에서 최종적으로 하나의 표준 곡선을 선택한다. 상기 (h) 단계에서 아웃라이어를 최대한 배제하고 인라이어를 최대한 포함하는 표준 곡선이라는 것은 (d) 단계에서 결정한 대부분의 임계 사이클 값들의 경향성을 가장 잘 예측하는 표준 곡선을 의미한다. 인라이어를 어떤 범위로 정의하느냐에 따라 선택되는 표준 곡선이 달라질 수 있다. 표준 곡선 상에 있는 임계 사이클 값을 인라이어라고 정의한다면 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들을 가장 많이 포함하는 표준 곡선이 선택될 것이고, 표준 곡선으로부터 일정 오차 범위 내에 있는 임계 사이클 값을 인라이어라고 정의한다면 표준 곡선으로부터 일정 오차 범위 내에 있는 임계 사이클 값이 가장 많은 표준 곡선이 선택될 것이다. 후자의 경우 더 나아가, 표준 곡선과 인라이어들 간의 오차들의 평균이 가장 작은 표준 곡선을 선택할 수도 있다.
이와 같이 하나의 임계값으로 결정된 모든 임계 사이클 값(이 중에는 아웃라이어도 포함되어 있다)을 반영하여 표준 곡선을 산출하지 않고, 상이한 일부분의 임계 사이클 값들을 반영하여 상이한 표준 곡선을 반복적으로 산출한 다음, 이 중 인라이어에 최대한 부합하는 표준 곡선을 선택함으로써, 최대한 아웃라이어를 반영하지 않은 표준 곡선을 획득할 수 있다. 표준 곡선을 반복적으로 산출하는 횟수를 일부분의 임계 사이클 값을 선택할 수 있는 모든 경우의 수로 한다면, 선택된 표준 곡선이 정해진 조건 및 정해진 임계값에 있어서 최적의 표준 곡선이라고 할 수 있을 것이다.
기존의 표준 곡선을 산출하는 방법 중 미분계수를 이용하는 방법은 각각의 증폭 프로파일 곡선으로부터 2차 미분 계수를 사용하여 임계값을 결정하므로 증폭 프로파일 곡선마다 임계값이 상이할 수 있어 이러한 임계값 중 하나를 선택하여 산출한 표준 곡선은 모든 증폭 프로파일 곡선의 데이터 값의 상대적인 차이가 반영된 것이라고 보기 힘들었다. 본 발명의 방법을 사용하면 하나의 임계값을 토대로 하여 각각의 증폭 프로파일 곡선으로부터 산출된 임계 사이클 값들이 가장 많이 반영된 표준 곡선이 선택되므로, 보다 많은 증폭 프로파일 곡선들의 경향이 반영된 표준 곡선을 얻을 수 있다. 또한 각각의 증폭 프로파일 곡선에 대해서 미분을 수행하지 않고 하나의 임계값에 대한 임계 사이클 값을 한 번에 계산하기 때문에 계산을 수행하는데 걸리는 시간도 줄어들 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기의 표준 곡선을 획득하는 방법은
상기 (h) 단계는 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계인 방법일 수 있다.
상기 오차는 동일한 핵산량에 대하여 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선의 임계 사이클의 차이인 것인 방법을 나타낸다. 즉, 동일한 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대한 획득된 표준 곡선과 관측된 임계 사이클 값의 차이를 의미한다.
상기 오차들의 평균 값을 산출할 때, 일정 값 이상의 오차 값은 제외하고 산출할 수 있다. 표준 곡선과의 오차 값이 너무 큰 임계 사이클 값은 아웃라이어라 할 수 있으므로 이를 제외하고 오차들의 평균 값을 산출하는 것이 더 정확한 표준 곡선을 선택하는데 도움이 되기 때문이다. 상기 일정 값은 사용자가 판단했을 때 이 이상의 오차 값을 가지는 임계 사이클 값은 아웃라이어라고 판단되는 정도의 값을 의미하며 사용자가 임의로 정할 수 있다. 구체적으로 0.01 내지 1 임계 사이클 값, 0.1 내지 0.7 임계 사이클 값, 0.2 내지 0.5 임계 사이클 값, 더 바람직하게는 0.25 내지 0.4 임계 사이클 값, 0.25 임계 사이클 값이 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기의 단계를 거치면 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선 각각에 대하여 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 총합에 대한 관계를 알 수 있다. 이렇게 정해 표준 곡선에 대한 오차의 총합을 비교하여, 오차의 총합이 가장 작은 것을 표준 곡선으로 선택한다.
표준 곡선을 획득하기 위한 두번째 구체예는 다음의 방법을 포함한다.
(a1) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
(b1) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
(c1) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 복수개를 선택하여, 임의의 복수개의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
(d1) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 복수개의 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
(e1) 상기 (d1) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계; 및
(f1) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계를 포함하는 방법.
상기 첫 번째 구체예를 설명하기 위해 기술한 용어의 정의가 상기 두 번째 구체예에도 동일하게 적용된다. 상기 두 번째 구체예에 따르면, 임계값을 복수개 선택하여 각각의 임계값에 따른 표준 곡선을 획득한다. 이렇게 획득한 후, 최적의 표준 곡선을 선택하기 위하여 다양한 방법을 적용할 수 있다.
최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 하나의 방법은,
(g1) 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계일 수 있다.
최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또 다른 방법은,
(g1) 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계일 수 있다.
이때, 상기 아웃라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
상기 인라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또다른 방법은,
(g1) 상기 (f1) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계일 수 있다. 상기 오차는 동일한 핵산량에 대하여 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (g1) 단계에서 획득한 표준 곡선의 임계 사이클의 차이인 것인 방법을 나타낸다. 즉, 동일한 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대한 획득된 표준 곡선과 관측된 임계 사이클 값의 차이를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (e1) 단계에서 상기 표준 곡선은 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 2개 이상을 선택하여, 상기 선택한 임계 사이클 값들로부터 획득하는 것인 방법이 제공된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 (e1) 단계에서 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값 중 2개 만을 선택하여 이로부터 표준 곡선을 획득할 수 있다. 선택된 임계값에 따른 표준 곡선을 산출할 때 모든 임계 사이클 값을 반영하여 표준 곡선을 산출하는 것이 아닌 일부의 임계 사이클 값만을 반영하여 표준 곡선을 산출함으로서 아웃 라이어로부터의 영향을 배제시킬 수 있는 기회를 가질 수 있다.
본 발명의 두번째 양태는 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 임계값(threshold)을 획득하는 방법을 제공한다.
임계값을 획득하기 위한 첫번째 구체예는 다음의 방법을 포함한다.
실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 임계값(threshol)을 획득하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
(b) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
(c) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 하나를 선택하여, 임의의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
(d) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계;
(f) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 획득하는 단계;
(g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
(h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계;
(i) 상기 (c) 단계에서 선택되는 임계값이 상기 (c) 단계를 반복할 때마다 상이하도록, (c), (d), (g) 및 (h) 단계를 복수 회 반복하는 단계;
(j) 상기 (h) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계; 및
(k) 상기 (j) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
상기 표준 곡선을 구하기 위한 구체예를 설명하기 위해 기술한 용어의 정의가 상기 임계값을 선택하기 위한 구체예에도 동일하게 적용된다.
다만, 최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또 다른 방법은,
(h) 단계가, 상기 (f) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계로 치환될 수 있다.
이때, 상기 아웃라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 임계 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
상기 인라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 임계 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또다른 방법은,
(h) 단계가, 상기 (f) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계로 치환될 수 있다.
상기 오차는 동일한 핵산량에 대하여 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선의 임계 사이클의 차이인 것인 방법을 나타낸다. 즉, 동일한 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대한 획득된 표준 곡선과 관측된 임계 사이클 값의 차이를 의미한다.
또한, 상기 (h) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
(h) 단계에서 최적의 표준 곡선을 선택하였으므로, 이 표준 곡선을 이용하여 특정 농도의 핵산에 대한 최적의 임계값을 산출할 수 있다. 또한, 특정 임계값을 갖는 미지의 농도를 갖는 핵산에서 정확한 핵산량을 산출할 수 있다.
그후, 표준 곡선을 선택한 후에 추가되는 단계를 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
(i) 상기 (c) 단계에서 선택되는 임계값이 상기 (c) 단계를 반복할 때마다 상이하도록, (c), (d), (g) 및 (h) 단계를 복수 회 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
이 단계에서는 여러가지 상이한 임계값을 얻기 위하여 반복하는 단계로서, 이 단계를 거치면 상이한 여러가지 임계값을 얻을 수 있으며, 이렇게 얻은 임계값은 상이한 표준 곡선을 획득하게 된다. 또한, 이 단계를 반복하여 다양한 값의 표준 곡선을 선택할 수 있게 된다.
또한, (j) 상기 (h) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
(i) 단계에서 (c) 내지 (h) 단계를 반복하게 되면, 다양한 종류의 표준 곡선을 얻을 수 있고, (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들에서 아웃라이어를 최대한 배제하고, 인라이어를 최대한 포함하는 최적의 표준곡선을 선택할 수 있다.
또한, 상기 (j) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (j) 단계에서 결정된 아웃라이어를 최대한 배제하고, 인라이어를 최대한 포함한 최적의 표준 곡선에 근거하여 임계값을 획득할 수 있다.
임계값을 획득하기 위한 두번째 구체예는 다음의 방법을 포함한다.
(a1) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
(b1) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
(c1) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 복수개를 선택하여, 임의의 복수개의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
(d1) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 복수개의 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
(e1) 상기 (d1) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계; 및
(f1) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
(g1) 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계;
(h1)상기 (g1) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
상기 표준 곡선을 구하기 위한 구체예를 설명하기 위해 기술한 용어의 정의가 상기 임계값을 선택하기 위한 구체예에도 동일하게 적용된다.
다만, 최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또 다른 방법은,
(g1) 단계가, 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계로 치환될 수 있다.
이때, 상기 아웃라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
상기 인라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미한다, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클일 수 있다. 또한, 상기 소정의 사이클은 0.2 내지 0.5 임계 사이클일 수 있으며, 0.25 임계 사이클 일 수 있다. 소정의 임계 사이클은 표준 곡선의 정확도를 높이기 위하여 적절히 선택되어 질 수 있다.
최적의 표준 곡선을 선택하기 위한 또 다른 방법은,
(g1) 단계가, 상기 (f1) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계로 치환될 수 있다.
상기 오차는 동일한 핵산량에 대하여 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (f1) 단계에서 획득한 표준 곡선의 사이클의 차이인 것인 방법을 나타낸다. 즉, 동일한 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대한 획득된 표준 곡선과 관측된 임계 사이클 값의 차이를 의미한다.
또한, 상기 (g1) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
(g1) 단계에서 최적의 표준 곡선을 선택하였으므로, 이 표준 곡선을 이용하여 특정 농도의 핵산에 대한 최적의 임계값을 산출할 수 있다. 또한, 특정 임계값을 갖는 미지의 농도를 갖는 핵산에서 정확한 핵산량을 산출할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행했을 때, 복수개의 증폭 곡선으로부터의 데이터를 통합적으로 반영한 보다 정확한 표준 곡선을 획득하여 폴리뉴클레오티드 정량을 보다 정확하게 할 수 있다.
도 1은 Real time PCR을 수행하여 얻을 수 있는 일반적인 증폭 프로파일 곡선을 나타낸다.
도 2는 초기 폴리뉴클레오티드 양을 달리하여 Real time PCR을 수행하였을 때의 증폭 프로파일 곡선들, 임계값 및 이에 따를 임계 사이클 값들(CT)을 나타낸다.
도 3은 도 2로부터 얻은 임계 사이클 값들을 이용하여 결정될 수 있는 표준 곡선의 일 예를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 실시간 PCR을 수행하여 획득한 증폭 프로파일 곡선을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 동일한 데이터를 기초로 하여 각각 본 발명의 방법에 따라 획득한 표준 곡선(도 5a)와 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 기계로 획득한 표준 곡선(도 5b)을 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 표준 곡선의 산출 방법
RNase P의 초기 핵산량을 10000, 5000, 2500, 1250, 625 카피(copy)로 하여 각 핵산량에 대해 동일한 샘플을 3개씩 만들어 15개 샘플의 실시간 중합효소 연쇄반응을 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 기계로 수행하여 증폭 사이클에 따른 형광 신호세기의 데이터 값을 획득하였다. 이 때 수행된 증폭 사이클 수는 40회이고 사용된 형광 프로브는 TaqMan 프로브였다. 상기 획득한 형광 신호세기 데이터 값을 토대로 한 증폭 프로파일 곡선을 도 4에 나타내었다. 도 4의 y축인 형광 신호세기 데이터 값은 ΔRn으로 나타내었다. 상기 ΔRn값 중 0.1~6.7의 범위에서 0.1의 간격을 두고 임계값을 67개 선택하였다. 상기 선택한 임계값을 도 4의 증폭 프로파일 곡선에 대입하여 상기 초기 농도에 따른 임계 사이클 값들을 산출하였다. 각 임계값마다 임계 사이클 값들을 2개씩, 15개의 임계 사이클 값 중 상이한 2개를 선택할 수 있는 모든 경우의 횟수 (15C2)만큼 선택하였다. 상기 선택한 2개의 임계 사이클 값으로 1차 직선인 표준 곡선을 산출하여 각 임계값 마다 15C2개의 표준 곡선을 산출하였다. 표준 곡선의 x축은 핵산량(카피 수)에 로그를 취한 값(편의상 도 5의 x축에 기재한 값은 핵산의 카피 수이다)이고, y축은 임계 사이클 값이다. 표준 곡선에서 0.5 임계 사이클 이상 벗어난 샘플은 아웃라이어로 0.5 임계 사이클 미만 벗어난 샘플은 인라이어로 판단하였다. 각 임계값마다 인라이어를 가장 많이 포함하는 표준 곡선을 선택하였다. 이는, 표준 곡선으로부터의 오차 범위가 0.5 임계 사이클 미만에 있는 임계 사이클 값의 갯수가 가장 많은 표준 곡선을 선택하였음을 의미한다. 결과적으로 각 임계값마다 하나의 표준 곡선이 선택되었는데 이러한 표준 곡선들 중에서 다시 인라이어를 가장 많이 포함하는 표준 곡선을 선택하였다. 이 때 선택된 표준 곡선은 15개의 샘플을 모두 인라이어로 포함하였고 이 때의 임계값은 0.2 였다. 선택된 표준 곡선은 임의적으로 선택된 2개의 임계 사이클 값을 기초로 한 것이므로, 임계값을 0.2로 하여 산출된 15개의 임계 사이클 값으로 선형 회귀 분석을 사용하여 최종적인 표준 곡선을 결정하였다 (도 5a). 최종 표준 곡선의 기울기는 -3.5894이고, R2 계수는 0.996이었다. 반면 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 기계에서 계산된 표준 곡선의 R2 계수는 0.992였다(도 5b). R2 계수는 표준 곡선이 데이터 값에 일치하는지를 나타내는 계수로, R2 계수 값이 1에 가까울수록 표준 곡선이 임계 사이클 데이터 점들에 더 일치한다는 것을 의미한다. 본원 발명으로 획득한 표준 곡선의 R2 계수가 더 높으므로 본원 발명의 방법으로 보다 데이터들에 일치하는 표준 곡선을 획득할 수 있었다는 것을 알 수 있다. 도 5를 보아도 도 5a의 데이터들이 도 5b의 경우보다 표준곡선 주위에 조밀하게 밀집해 있어, 본원 발명의 방법으로 보다 데이터들에 일치하는 표준 곡선을 획득하였다는 것을 눈으로 확인할 수 있다.
[실시예 1을 수행하는데 사용된 Matlab 코드]
function [CtList quantities threshold] = ComputeCt(deltaRn,quantityList,standardIndex,nonStandardIndex)
%% Description
% ComputeCt finds the threshold cycle for each well
%
% INPUT deltaRn: normalized Reporter - baseline, [numCycles x numWells]
% INPUT quantityList : the quantity list of Standard samples [1 x
% numStandards]
% INPUT standardIndex : the index list of Standard samples [ 1 x
% numStandards]
% OUTPUT CtList: the list of the threshold cycle [1 x numWells]
% OUTPUT quantities : the list of the estimated quantities [1 x numWells]
% OUTPUT threshold : the estimated threshold [1 x 1]
if size(quantityList,2) ==1
quantityList = quantityList';
end
if size(standardIndex,2) ==1
standardIndex = standardIndex';
end
numWells = size(deltaRn,2);
numCycles = size(deltaRn,1);
numStandards = length(standardIndex);
CtList = zeros(1,numWells);
if nargin < 4
nonStandardIndex = setdiff(1:numWells,standardIndex);
end
%% Find the threshold cycles for each possible threshold
mx = max(deltaRn(:));
ThresholdList = 0.1:0.1:mx;
sz = length(ThresholdList);
CtMatrix = zeros(sz,numStandards);
for wellIndex = 1:numStandards,
CtMatrix(:,wellIndex) = compCtMatrix(deltaRn,ThresholdList,standardIndex(wellIndex),numCycles);
end
%% Find the best threshold using RANSAC
numIteration = 50;
% candidates: [score, slope, offset, the number of inliers]
candidates = zeros(sz,4);
% xs: quantity index
xs = log(quantityList)./log(10);
ErrThreshold = 0.5;
for index = 1:sz
ys = CtMatrix(index,:);
pts = sort(randi(numStandards,[numIteration 2]),2);
pts = pts(find(xs(pts(:,1)) ~= xs(pts(:,2))),:);
y2 = ys(pts(:,2));
y1 = ys(pts(:,1));
x2 = xs(pts(:,2));
x1 = xs(pts(:,1));
a = (y2-y1)./(x2-x1);
b = (y1.*x2 - y2.*x1)./(x2-x1);
A = repmat(a',1,length(xs));
B = repmat(b',1,length(xs));
Xs = repmat(xs,length(a),1);
Ys = A.*Xs + B;
%% find inliers and ninlier
err = abs(Ys - repmat(ys,length(a),1));
inliers = (err<ErrThreshold & Ys<= numCycles);
outliers = 1-inliers;
ninliers = sum(inliers,2);
fails = find(ninliers < max(ninliers));
%% compute scores
score = inliers.*err + outliers.*ErrThreshold;
* score = mean(score,2);
score(fails) = Inf;
%%
[X I ] = min(score);
candidates(index,1) = score(I);
candidates(index,2) = a(I);
candidates(index,3) = b(I);
candidates(index,4) = ninliers(I);
end
%% Find the threshold with the most inliers
X = max(candidates(:,4));
selected = find(candidates(:,4)==X);
[X index] = min(candidates(selected,1));
index = selected(index);
%% Re-estimate the standard curve using all the inliers
CtList(standardIndex) = CtMatrix(index,:);
ys = CtMatrix(index,:);
if rem(length(xs),2) ==1
offset = mean(ys(find(median(xs)==xs)));
else
offset = mean(ys(find(median(xs(2:end))==xs)));
end
Y = ys-offset;
X = xs-median(xs);
slope = X'\Y';
offset = mean(ys'-slope*xs');
threshold = ThresholdList(index);
numNonStandards = length(nonStandardIndex);
for wellIndex = 1:numNonStandards,
CtList(nonStandardIndex(wellIndex)) = compCtMatrix(deltaRn,threshold,nonStandardIndex(wellIndex),numCycles);
end
quantities = 10.^((CtList - offset)./slope);
quantities(standardIndex) = quantityList;
function Ct = compCtMatrix(deltaRn, Threshold, index, numCycles)
sz = length(Threshold);
x = 1:numCycles;
y = deltaRn(:,index)';
xx = 1:0.01:numCycles;
yy = spline(x,y,xx);
yy = repmat(yy,sz,1);
xx = repmat(xx,sz,1);
Threshold = repmat(Threshold',1,size(yy,2));
[X I ] = min(abs(yy-Threshold),[],2);
index = sub2ind(size(Threshold),1:sz,I')';
indexminus = sub2ind(size(Threshold),1:sz,I'-1)';
Ct = xx(indexminus)+ ... (Threshold(index)-yy(indexminus)).*(xx(index)-xx(indexminus))./(yy(index)-yy(indexminus));
Ct = Ct';

Claims (27)

  1. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 표준 곡선(standard curve)을 획득하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
    (b) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
    (c) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 하나를 선택하여, 임의의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
    (d) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계; 및
    (f) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 획득하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 아웃라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  5. 제4항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  6. 제4항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.25 내지 0.5 임계 사이클인 것인 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 인라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  8. 제7항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  9. 제7항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.25 내지 0.5 임계 사이클인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    (g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 오차는 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선의 차이인 것인 방법.
  12. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 임계값(threshold)을 획득하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
    (b) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
    (c) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 하나를 선택하여, 임의의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
    (d) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계;
    (f) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (g) (e) 및 (f) 단계를 복수회 반복하여, 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (h) 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계;
    (i) 상기 (c) 단계에서 선택되는 임계값이 상기 (c) 단계를 반복할 때마다 상이하도록, (c), (d), (g) 및 (h) 단계를 복수 회 반복하는 단계;
    (j) 상기 (h) 단계에서 획득한 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계;
    (k)상기 (j) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (h) 단계의 표준 곡선을 선택하는 단계는, 상기 (g) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계인 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 아웃라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  15. 제14항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 인라이어는, 상기 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  17. 제16항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서,
    상기 (h) 단계의 표준 곡선을 선택하는 단계는, 상기 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 오차는 (d) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (g) 단계에서 획득한 표준 곡선의 차이인 것인 방법.
  20. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 폴리뉴클레오티드를 정량하기 위한 임계값(threshold)을 획득하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a1) 서로 상이한 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 갖는 복수개의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 중합효소연쇄반응(PCR)을 하는 단계로서, 상기 중합효소 연쇄 반응은 복수회의 증폭 사이클을 포함하고, 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 양에 따른 신호를 제공할 수 있는 검출 가능한 프로브의 존재 하에서 하는 것인 단계;
    (b1) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 그룹들을 증폭하여 얻은 신호세기로부터, 증폭 사이클 회수와 신호세기 값에 관한 복수개의 증폭 프로파일 곡선을 획득하는 단계;
    (c1) 상기 신호세기 값 중에서 임의로 복수개를 선택하여, 임의의 복수개의 임계값(threshold)을 선택하는 단계;
    (d1) 상기 복수개의 증폭 프로파일 곡선으로부터 상기 선택한 복수개의 임의의 임계값에 대응하는 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 산출하고, 산출된 복수개의 증폭 사이클 횟수 값을 각각의 초기 폴리뉴클레오티드 농도에 대응하는 임계 사이클(threshold cycle) 값으로 결정하는 단계;
    (e1) 상기 (d1) 단계에서 결정한 복수개의 임계 사이클 값 중 2개 이상의 값을 선택하는 단계; 및
    (f1) 상기 선택한 임계 사이클 값으로부터 복수개의 표준 곡선을 획득하는 단계;
    (g1) 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 아웃라이어(outlier)를 최대한 배제하고 인라이어(inlier)를 최대한 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계;
    (h1)상기 (g1) 단계에서 결정된 선택된 표준 곡선에 근거하여 임계값을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 (g1) 단계의 표준 곡선을 선택하는 단계는, 상기 (f1) 단계에서 획득한 복수개의 표준 곡선들 중에서 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 중 인라이어(inlier)를 대부분 포함하는 표준 곡선을 선택하는 단계인 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 아웃라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이상인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  23. 제22항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 인라이어는, 상기 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 표준 곡선의 차이가 소정의 임계 사이클 이하인 임계 사이클 값을 의미하는 것인 방법.
  25. 제24항 있어서, 상기 소정의 임계 사이클은 0.1 내지 1 임계 사이클인 것인 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 (g1) 단계의 표준 곡선을 선택하는 단계는, 상기 (f1) 단계에서 획득한 표준 곡선과 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값들 사이의 오차의 합이 가장 작은 표준 곡선을 선택하는 단계인 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 오차는 (d1) 단계에서 결정한 임계 사이클 값과 (f1) 단계에서 획득한 표준 곡선의 차이인 것인 방법.
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