JP6907388B2

JP6907388B2 - 核酸増幅反応を分析するための分析方法およびシステム

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Publication number: JP6907388B2
Application number: JP2020109687A
Authority: JP
Inventors: ロルフ・クノーベル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-08-27
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2035-08-25
Also published as: EP3770272B8; JP2016047046A; EP2990490B1; CN105389479A; EP3770272B1; CN105389479B; ES2832544T3; US20160061731A1; EP3770272A1; EP2990490A1; ES2899739T3; CN113707219B; CN113707219A; US20190162665A1; JP2020162621A

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲなどのリアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲのための分析方法、ならびに、核酸増幅反応による試料中の検体の存在を検出しおよび／または検体の量を測定するためなど、検体の核酸増幅反応を分析するためのシステムに関する。

インビトロの核酸増幅技法は、様々な手法に基づく種々の方法を含む。１つの手法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を増殖させる方法を含み、このことによりこれを種々の処置または試験のためにより容易に検出可能にする。たとえば、核酸のインビトロの増幅は、以下の方法のうちの１つを使用して行われ得る：ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法、または等温転写媒介増幅（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）法。上述の手法の全てにおいて、核酸は反復的な増幅サイクルにかけられる。

種々の医療、生物学、または産業用途のために頻繁に使用される技法は、ＰＣＲ技法である。この技法は、核酸鎖の特定の領域の増幅を目的とした核酸の酵素による複製のための反復的な加熱および冷却のサイクルを備える、熱サイクル処理に依拠する。ＰＣＲが進行するにつれ、生成されたＤＮＡは、それ自体が複製のための鋳型として使用され、連鎖反応を進行させ、この連鎖反応においては、ＤＮＡの鋳型が各反応サイクルごとに（少なくとも理論上は）倍増して、指数関数的に増幅される。

核酸増幅技法は、多くの変形形態を含む。これらの変形形態のうちの１つは、リアルタイム核酸ＲＮＲと呼ばれ、試料中の核酸を増幅し、同時にその存在を検出し、加えて試料中のその濃度を定量化することを基本とする。

定量的な核酸増幅における産物の検出のための知られている方法がいくつか存在する。これらの方法のうちの１つによれば、ＲＮＲ中の核酸の量を間接的に測定するために、検体の蛍光放射の強度が取得され、ＲＮＲサイクル範囲にわたる蛍光放射の強度を示す増殖曲線が作り出される。最初の固定的なベースラインを超える増殖曲線信号の増加が、各反応における定量化サイクルＣｑを判定するために使用される。

種々のＣＴ法を使用する増殖曲線に基づく定量化サイクルＣｑの判定は、複数の特許出願の論題である。
ＥＰ２７１９７７０Ａ１は、ＰＣＲによる試料中の検体の存在の検出および／または検体の量の測定の方法、ならびにそれぞれの分析器を開示する。特に、信号の最大増殖値を考慮に入れた増殖曲線の信号正規化が開示される。

米国特許第７７８８０３９（Ｂ２）号は、試料中の標的核酸の量を判定するための方法を開示する。標的の最初の量が、基準物（ｓｔａｎｄａｒｄ）の最初の量ならびに標的増殖曲線値および基準増殖曲線値を使用する較正式に従って計算され、この場合、較正式は非線形の式である。

ＥＰ１７９８６５２Ｂ１は、測定データから増殖信号を作り出すための数学的アルゴリズムを開示する。
ＥＰ１７９８５４２Ａ１は、試料中の核酸の存在を判定するための方法を示し、この場合、増殖信号に対してデジタル値が選択され、核酸の存在は、選択されたデジタル値の較正されたデジタル値との比較から判定される。

「Ａｎａｌｙｚｉｎｇｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｄａｔａｂｙｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣ_Ｔｍｅｔｈｏｄ（比較Ｃ_Ｔ法によるリアルタイムＰＣＲデータの分析）」、ＴｈｏｍａｓＤＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎら、ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ３、１１０１〜１１０８頁（２００８）は、定量的な遺伝子発現の研究のための比較Ｃ_Ｔ法の概要を提供する。

種々の核酸増幅法に基づく核酸増幅システムが、種々の供給業者から市販されており、これらは感染性疾患の検出などの医療用途に関して採用される。したがって、核酸増幅法の信頼性および精度が、最も重要なことである。

ＥＰ２７１９７７０Ａ１米国特許第７７８８０３９（Ｂ２）号ＥＰ１７９８６５２Ｂ１ＥＰ１７９８５４２Ａ１

「Ａｎａｌｙｚｉｎｇｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｄａｔａｂｙｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣＴｍｅｔｈｏｄ」、ＴｈｏｍａｓＤＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎら、ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ３、１１０１〜１１０８頁（２００８）

本発明の実施形態はしたがって、核酸増幅を使用する改善された分析方法、ならびに、核酸増幅分析の堅牢性、精度、正確度、線形性、および定性的識別能（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）の改善を可能にするそれぞれのシステムを提供することを目標とする。

本発明の実施形態によれば、請求項１で特許請求されるような、試料中の検体の存在の検出および／または検体の量の測定のための、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のための分析方法が提供される。さらに、請求項１３に記載の、検体の核酸増幅反応を分析するためのシステムが提供される。本発明のさらなる実施形態が、従属請求項において与えられる。

本発明の実施形態は、ＲＮＲサイクル範囲にわたって、少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える結合閾値関数（ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｈｒｅｓｈｏｌｄｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＣＴＦを使用する、リアルタイム核酸増幅ＲＮＲのための分析方法に関する。ＣＴＦは、少なくとも２つの異なる閾値レベルに基づく計算によって得られる。

この計算は、蛍光放射の強度の取得および増殖曲線の作成の前または後に行われ得る。たとえば、この計算は１回行われ、結果的なＣＴＦは、電子メモリに記憶されて、ＲＮＲの定量化サイクル数Ｃｑを判定するためにこのＣＴＦが必要とされるときに、これが読み出される。代替として、ＣＴＦは、蛍光放射の強度の取得の後に、および／または増殖曲線の作成の後で定量化サイクル数の判定の前に、計算される。

本発明の実施形態は、少なくとも２つの異なる閾値レベルをＣＴＦへと結合することに
より、検体濃度の広い範囲にわたるＲＮＲの精度の改善、および／または干渉する物質の存在の効果の制限が可能になるので、特に有利である。

さらに、本発明の実施形態は、希薄な検体濃度に関する偽陰性および高い検体濃度に関する誤ったＣｑ値の発生が防止され、したがってＲＮＲ分析の信頼性の高い作動範囲を増加させるので、特に有利である。

本発明の実施形態によれば、ＣＴ閾値レベルのうちの少なくとも１つは、ＲＮＲサイクル範囲にわたる定数値である。この定数値は、相対的切片増加（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｎｃｒｅａｓｅ）（ＲＩＩ法）、部分的増殖閾値（ｐａｒｔｉａｌｇｒｏｗｔｈｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＰＧＴ法）、ベースラインを超える増殖曲線の標準偏差の倍数、手動で設定した閾値、または定数関数によって与えられ得る。

本発明の実施形態によれば、ＣＴＦは、少なくとも２つの異なる閾値レベルから、ＲＮＲサイクル範囲にわたって閾値レベルを結合することによって、たとえば重ね合わせ、線形結合、または非線形結合によって、得られる。代替としてまたは加えて、ＣＴＦは、ＲＮＲサイクル範囲を複数のＲＮＲサイクル区間へと分割して、区間ごとに少なくとも２つの異なる閾値レベルを使用して区間ごとに別個のＣＴＦを計算することによって得られ、この場合、少なくとも２つの異なる閾値レベルは区間によって異なり得る。

本発明の実施形態によれば、ＣＴＦは、ＲＮＲサイクル範囲全体にわたる２つの閾値レベルの、線形結合などの結合である。閾値レベルのうちの１つは、１０、１５、または２０を下回るサイクル数に関してなど、ＲＮＲの早期の反応サイクルにおいてＣＴＦに対して支配的に寄与し、一方、閾値レベルのうちの１つは、３０、４０、または５０より大きいサイクル数に関してなど、ＲＮＲの後期の反応サイクルにおいてＣＴＦに対して支配的に寄与する。本発明の実施形態によれば、ＣＴＦはＲＮＲサイクル範囲にわたって最初の閾値レベルから最終閾値レベルへと移行する。言い換えれば、最初の閾値レベルのＣＴＦに対する寄与は、サイクル数０または１に関してなど、ＲＮＲの早期の反応サイクルに関して支配的であり得、また、最終閾値レベルのＣＴＦに対する寄与は、サイクル数０または１に関してなどＲＮＲの早期の反応サイクルにおいて０など、最初の閾値レベルの寄与を実質的に下回り得る。同様に、ＲＮＲの後期の反応サイクルにおける最終閾値レベルのＣＴＦに対する寄与は、最初の閾値レベルの寄与を実質的に超える可能性がある。ＲＮＲサイクル範囲にわたる最初の閾値レベルから最終閾値レベルへのＣＴＦの移行は、一段階もしくは複数段階の移行（ａｓｔｅｐｏｒｍｕｌｔｉ−ｓｔｅｐｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、線形の移行、多項式の移行、指数関数的な移行、またはこれらの組合せであり得る。

本発明の実施形態によれば、最初の閾値レベル自体は、少なくとも２つの異なる閾値レベルの第１の結合Ａを備える。代替としてまたは加えて、最終閾値レベル自体は、少なくとも２つの異なる閾値レベルの第２の結合Ｂを備え、この場合、最初の閾値レベルへと結合される閾値レベルは、最終閾値レベルへと結合される閾値レベルと同じまたは異なる閾値レベルとすることができる。

本発明の実施形態によれば、最初の閾値レベルおよび最終閾値レベルの一方は、複数の閾値レベルを結合したものではなく単一の閾値レベルである。
本発明の実施形態によれば、最初の閾値レベルは、強固な増殖曲線、すなわち高い検体濃度および／または低い干渉物質の濃度に関して得られる増殖曲線に関する定量化サイクル数の高精度の判定のために適合された、少なくとも１つの閾値レベルを備える。

他方で、最終閾値レベルは、後期の増加、すなわち低い検体濃度および／または高い干
渉物資の濃度に関する定量化サイクル数の高精度の判定のために適合された、少なくとも１つの閾値レベルを備える。ＲＮＲサイクル範囲にわたる最初の閾値レベルから最終閾値レベルへのＣＴＦの移行により、早期の信号増加および後期の信号増加の両方に関して、定量化サイクル数の高精度の判定が可能とされる。

本発明の実施形態によれば、最初の閾値レベルは、最終閾値レベルの終点のｙ座標を下回るｙ座標を有する始点を有し、この結果、正の傾きを有する増加する結合閾値関数が得られるか、または、最初の閾値レベルは、最終閾値レベルの終点のｙ座標を超えるｙ座標を有する始点を有し、この結果、減少する結合閾値関数、すなわちＲＮＲサイクル範囲にわたって負の傾きを有する結合閾値関数が得られる。

本発明の実施形態によれば、始点のｙ座標および終点のｙ座標を使用して、２つのｙ座標の間の線形の、多項式の、指数関数的な、対数的な、または他の移行によって、結合閾値関数を計算する。たとえば、２つのｙ座標は、電子メモリに記憶され、この電子メモリから読み込まれて、２つのｙ座標の間の線形補間によって結合閾値関数が計算される。

本発明の実施形態によれば、ＣＴＦは、ＲＮＲサイクル範囲にわたって一定である。たとえば、閾値レベルの各々は定数を提供し、また、結合閾値関数は、２つの定数の平均または加重平均などの、２つの定数の線形結合として計算される。たとえば、閾値レベルのうちの一方は、早期の信号増加に関する定量化サイクル数の高精度の判定のために適合され、一方、２つの閾値レベルのうちの他方は、後期の信号増加に関する、したがってＲＮＲの後期の反応サイクルにおけるＣＴ判定に関する、定量化サイクル数の高精度の判定のために適合され得る。

本発明の別の態様によれば、検体の核酸増幅反応を分析するためのシステムが提供され、このシステムは、ＲＮＲの各増幅反応サイクルに関して検体の蛍光放射の強度を取得するように構成された検出システムと、ＲＮＲの反応サイクルの範囲にわたる蛍光放射の強度を示す増殖曲線を作り出し、少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える結合閾値関数ＣＴＦを提供し、ＲＮＲの定量化サイクル数Ｃｑを判定するように構成された処理ユニットと、を備え、定量化サイクル数Ｃｑは、結合閾値関数との増殖曲線の交点に対応するサイクル数として増殖曲線の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す。

本発明の実施形態によれば、処理ユニットは、システムの電子メモリから結合閾値関数を記述するデータを読み込み、このデータおよび／または増殖曲線を使用して結合閾値関数を計算することによって、結合閾値関数を提供する。たとえば、電子メモリに記憶されたデータは、最初の閾値レベルの始点および最終閾値レベルの終点のｙ座標を示し、また、プロセッサによる結合閾値関数の計算は、ＲＮＲサイクル範囲にわたるｙ座標同士の間の補間によって行われる。

本発明の実施形態は、検体の広い濃度範囲にわたって分析の正確度および精度が向上され得、かつ／または、干渉物に対する堅牢性が向上され得るので、特に有利であり得る。
以下では、本発明の実施形態について、単なる例示として、図面を参照して、より詳細に記載される。

生物学試料などの試料を分析するためのＲＮＲ分析器の概略図を例示するブロック図である。各ＲＮＲサイクルに関する検体のＲＮＲ増殖曲線を概略的に例示する図である。図３Ａは２つの異なるＲＮＲ増殖曲線、２つの閾値レベル、および結果的なＣＴＦを概略的に例示する図である。図３Ｂは２つの異なるＲＮＲ増殖曲線、２つの閾値レベル、および結果的なＣＴＦを概略的に例示する図である。図３の増殖曲線の代替のＣＴＦを例示する図である。負に傾斜したＣＴＦを有する、分析器によって表示されるウィンドウを示す図である。最初の閾値レベルとしてのＲＩＩから最終閾値レベルとしてのＰＧＴに移行する負に傾斜したＣＴＦを有する、分析器によって表示されるウィンドウを示す図である。正に傾斜したＣＴＦを有する、分析器によって表示されるウィンドウを示す図である。最初の閾値レベルと最終閾値レベルとの間の線形の、二次の、および指数関数的な移行に関する例を示す図である。希釈系列の種々の増殖曲線を示す図である。知られている閾値レベルおよび進歩性を備えたＣＴＦを使用して得られた、種々のＣ_ｑ値の比較を示す図である。知られている閾値レベルおよび進歩性を備えたＣＴＦに関する、Ｃ_ｑ値の種々の較正曲線を濃度の関数として示す図である。干渉物の増殖曲線を示す図である。干渉物の閾値を示す図である。Ｃ_ｑ値を干渉物の増殖曲線の関数として示す図である。

以下の本発明の実施形態の詳細な説明の全体にわたって、同一のまたは類似の要素は、同一の参照符号によって指定される。
「ベースライン」の用語は、信号増加を示さない、増殖曲線の最初の部分を指す。

本明細書で理解されるような「切片」または「切片値」の用語は、早期のサイクル数、すなわち外挿によって得られるものである０における、増殖曲線の信号オフセット値である。

「飽和線」の用語は、指数関数的増幅段階とも呼ばれる指数関数的増殖段階の後、および平準化段の後の、増殖曲線のプラトー領域における部分を指す。
本明細書で使用される場合、「閾値レベル」の用語は、増殖曲線に関する閾値レベルを包含する。

本明細書で理解されるような「結合閾値関数」または「ＣＴＦ」は、少なくとも２つの異なる閾値レベルから構成されるサイクル範囲にわたる数学的関数を包含する。１つの実施形態によれば、ＣＴＦは、２つの異なる閾値レベルの線形結合または対数的な結合とすることができる。

１つの実施形態では、ＣＴＦによって所与のＸ値、すなわちサイクル数に対して返されるＹ値、すなわち閾値レベルは、２つの異なる閾値レベルの一方から他方へと移行し得る。

１つの実施形態によれば、ＣＴＦは、少なくとも２つの異なる閾値レベルの（たとえば線形のまたは対数的な）第１の結合から、少なくとも２つの異なる閾値レベルの（たとえば線形のまたは対数的な）第２の結合へと移行し得る。

本明細書で理解されるような「リアルタイム核酸増幅ＲＮＲサイクル範囲」の用語は、増殖曲線の作成に関する強度値を取得するために実行されるサイクル数の範囲を指す。た
とえば、ＲＮＲサイクル範囲は、３０、４０、または５０などの、事前に定義された固定された数とすることができる。ＲＮＲサイクル範囲を設定することは、核酸増幅反応を分析するための分析システムのスループットと、弱い信号の定量化サイクル数の判定のための分析システムの感度との間の、トレードオフである。

本発明の実施形態によれば、閾値法は、相対的切片増加ＲＩＩとして実施される。たとえば、ＲＩＩはベースラインを超える平行線である。
本発明の実施形態によれば、ＲＩＩは以下の形式を有し得る。

ｙ（ｘ）＝Ｂ＋ｒ・Ｉ（１）
Ｂ：ベースライン関数、典型的には線形
Ｉ：サイクル数０に対する切片外挿
ｒ：正の百分率パラメータ、たとえば５０％
本発明の実施形態によれば、閾値法は、飽和線とベースラインとの間の増殖曲線の信号の差、すなわちベースラインから飽和線までの増殖に依存する、部分的増殖閾値ＰＧＴとして実施され得る。ＰＧＴは、サイクル数の範囲全体にわたって一定のＹ値を返すことができる。

本発明の実施形態によれば、ＰＧＴは以下の形態を有し得る。
ｙ（ｘ）＝Ｂ＋ｐ・Ｇ＝Ｂ＋ｐ・（Ｓ−Ｂ）（２）
Ｂ：ベースライン関数
Ｓ：飽和線
Ｇ：ベースラインから飽和線までの増殖
ｐ：好ましくは０％から１００％の間のパラメータ、たとえば５％
本発明の実施形態によれば、閾値法は、ベースラインを超える増殖曲線の標準偏差によって与えられ、以下の形態を有し得る。

ｙ（ｘ）＝Ｂ＋ｆ・Ｄ（３）
Ｂ：ベースライン関数
ｆ：乗率パラメータ、たとえば１０
Ｄ：増殖曲線の標準偏差
本発明の実施形態によれば、閾値法は、事前に設定されるかまたは使用者によって手動で入力される、閾値の値によって与えられる。

本発明の実施形態によれば、閾値法は、ＲＮＲサイクル範囲にわたって一定である定数値であり、たとえば以下の通りである。
ｙ（ｘ）＝Ｃ（４）
Ｃ：経験的なデータに基づく事前に定義された定数
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの異なる閾値レベルのうちの１つ、すなわち最初の閾値レベルから、少なくとも２つの異なる閾値レベルのうちの他の１つ、すなわち最終閾値レベルへの移行は、図８に例示するように、一段階もしくは複数段階の、線形の、多項式の、および／または指数関数的な移行によるものなどである。

たとえば、最初の閾値レベルｙ_１から最終閾値レベルｙ_２への線形の移行を伴うＣＴＦは、以下の形態を有し得る。

ここで、
ｘ_１：早期の反応サイクル数、たとえば０または１、
ｘ_２：後期の反応サイクル数、たとえば３０、４０、または５０、
ｙ_１：最初の閾値レベル、
ｙ_２：最終閾値レベル。

本発明の実施形態によれば、ＣＴＦは、多項式の移行の実施のための以下の形式を有し得る。

ここで、
ｐ：固定された多項式の次数、たとえば二次多項式の関数に対して２。
本発明の実施形態によれば、ＣＴＦは、指数関数的な移行の実施のための以下の形式を有し得る。

図１は、リアルタイムの検体の増幅および同時に行われる定量化のための、ＲＮＲシステム１００の概略図を示す。ＲＮＲ法を使用して、増幅過程中に信号が作り出され、検出される。この信号は一般に、増幅中に作り出され結果として試料中に存在する、任意の検体の量を表す。試料は、検体および／または増幅反応の他の産物を含み得る液体である。ＲＮＲシステムは、サーマルサイクラーブロック１２０と、励起光源１１０と、ＲＮＲ信号をリアルタイムで収集するための検出器システム１３０と、処理ユニットおよびＲＮＲ信号を記憶するためのメモリ１５０およびＲＮＲ信号を分析するためのプログラム命令１６０を備えるデータ処理システム１４０と、信号を表示し分析の結果を出力するためのユニット１７０と、を備える。

検体は蛍光色素と共役とされ、試料はサーマルサイクラーブロック１２０内に充填される。サーマルサイクラーブロック１２０は、従来の設計の試料ブロックとすることができ、これは９６個のウェルを備え、最大９６個の試料を保持することができる。試料は蛍光励起源１１０を用いて照射され、未加工の蛍光データがＲＮＲ検出器システム１３０によって各ＲＮＲサイクル数に関して測定される。ＲＮＲ検出器１３０は、１つまたは複数の蛍光色素によって放射されるＲＮＲ蛍光信号を収集するのに好適である。測定されたデータは、データ処理システムメモリユニット１５０に収集され、正規化されていないＲＮＲ増殖曲線として、または代替として正規化されたＲＮＲ増殖曲線として、表示ユニット１７０上に表示され得る。

図２は、各ＲＮＲサイクルに関して取られたＲＮＲ信号を表す増殖曲線（ｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅ）２００の、概略的な例を示す。この図は、横座標がｘ軸として指定され縦座標がｙ軸として指定されるとともに、ｘがＲＮＲのサイクル数でありｙが蛍光の放射の強度である、デカルト座標系を含む。

図２は、点線として蛍光強度値２０５も示し、この場合、強度値２０５の各々は、進行中の増幅反応の蛍光放射強度測定を行うことによって取得されている。強度値２０５は、
数学的な増殖曲線モデル方程式または別の種類の補間および／または補間を使用してモデル化される。ＲＮＲ信号は、図２において増殖曲線２００として示される。この場合、切片値２１０は、ＲＮＲサイクル数が零であるときの、ＲＮＲ信号オフセット値である。

ベースライン２４０は、ＲＮＲ反応産物に起因する検出可能な蛍光の増加のないサイクル１とサイクル１５との間で典型的には測定される、ＲＮＲ反応の最初のサイクル中のＲＮＲ信号である。ベースライン２４０は、ベースライン関数Ｂである（式１から３を参照）。事前に定義された閾値２２０が、ＲＮＲ信号がＲＮＲ反応のベースライン２４０を上回るときのサイクル数、すなわち最初の検出可能な有意な蛍光の増加が存在するサイクルを判定するために使用され、ここではおよそＣ_ｑ＝２２である。閾値２２０は、ＣＴＦによって与えられる（式５から７を参照）。

最大増殖値２５０は、プラトー領域２３０におけるＲＮＲ信号の最大強度とベースライン２４０におけるＲＮＲ信号との間の差である。プラトー段２３０は、ＲＮＲ反応の最終サイクル中のＲＮＲ信号である。

プラトー領域２３０におけるＲＮＲ信号の強度はＳであり、最大増殖値２５０は、上記の式２における増殖Ｇである。
図３Ａは、増殖曲線２００．１および破線として示される別の増殖曲線２００．２の図像表示を伴う図を示す。この図は、ｘがＲＮＲのサイクル数でありｙが蛍光の放射の強度である図２に示された図と同様に、横座標がｘ軸として指定され縦座標がｙ軸として指定されるデカルト座標系を含む。

この図は、第１の閾値レベルｙ１および第２の閾値レベルｙ２を含む。
閾値レベルｙ１は、始点Ｔ_１（ｘ_１，ｙ_１）を入力することによって定義され得、同様に、閾値レベルｙ２は、終点Ｔ_２（ｘ_２，ｙ_２）を入力することによって定義され得る。

ここで考慮される実施形態では、図３Ａに例示されるように、閾値レベルｙ１を判定する始点Ｔ_１のｙ座標は、終点Ｔ_２のｙ_２のそれぞれの座標よりも大きく、したがってｙ１は、他方の閾値レベルｙ２を超えている。

増殖曲線２００．１は、ＲＮＲのダイナミックレンジの上端における試料濃度に由来し、一方、増殖曲線２００．２に関する試料濃度は、ダイナミックレンジの下端のところにある。結果として、増殖曲線２００．１の指数関数的な段階は、図３Ａに例示されるような増殖曲線２００．２に関する場合である、はるかに低いサイクル数範囲において生じる。

増殖曲線２００．１および２００．２のＣ_ｑの判定に閾値レベルｙ１のみを適用することは、増殖曲線２００．１に関してのみＣ_ｑが検出され、増殖曲線２００．２に関するＣ_ｑ値が検出されない（または非常に遅れて検出される）結果をもたらすであろう。これは、後者が弱すぎて、ＲＮＲサイクル範囲内で、その指数関数的段階および／またはプラトー領域において強度ｙ_１に達しないからである。

他方で、閾値レベルｙ２のみの使用は、増殖曲線２００．２に関するＣ_ｑ値の検出をもたらすであろうが、ｙ_２がベースラインに近く、このため変動により増殖曲線２００．１に関して不正確なＣ_ｑ検出がもたらされ得るので、増殖曲線２００．１に関するＣ_ｑ値の検出に関しては、信頼性を欠くものとなるであろう。

この状況は、結合閾値関数ＣＴＦ（ｘ）を提供する、閾値レベルｙ１およびｙ２の結合によって修正される。ここで考慮される例では、ＣＴＦは上記の式５によるものであり、
したがってＣＴＦは、図３Ａに例示されるように、ｘ座標範囲ｘ_１からｘ_２にわたる、ｙ_１からｙ_２への線形の移行を有する。このことは、ＣＴＦが増殖曲線２００．１および２００．２の両方とそれらのそれぞれの指数関数的増殖段階内で交差し、結果としてそれぞれの定量化サイクル数Ｃ_ｑ１およびＣ_ｑ２の、信頼性が高く高精度な検出をもたらすという、有益な効果を有する。

したがって、結合閾値関数ＣＴＦ（ｘ）は、閾値レベルｙ１およびｙ２を結合することによって計算される。ここで考慮される実施形態では、これは、Ｔ_１からＴ_２へのｘ軸に沿った線形の移行を提供する、線形結合である。ＲＮＲサイクル範囲は、ここで考慮される実施形態では、ｘ座標範囲ｘ_１からｘ_２に等しくなるように設定され得るが、これは、サイクルｘ_２を超える追加のＲＮＲサイクルが、定量化サイクル数の判定に対して有意な寄与を提供せず、システムスループットを単に低減させると考えられるからである。

ＣＴＦの計算は、ＲＮＲシステム１００（図１を参照）によって行われ得る。たとえば、点Ｔ_１からＴ_２の座標が、メモリ１５０に記憶される。プログラム命令１６０の実行により、Ｔ_１からＴ_２がメモリ１５０から読み込まれ、結合閾値関数ＣＴＦが、式５、６、または７によってなどで計算される。代替として、結合閾値関数ＣＴＦは、表形式などでＣＴＦを記述するデータによって、メモリ１５０に記憶される。

図３Ａに例示された例では、ＣＴＦは、最初の閾値レベルｙ１から最終閾値レベルｙ２へと移行する。ここで考慮される例では、移行は線形であり、結果として負に傾斜したＣＴＦをもたらし、この場合、最初の閾値レベルｙ１は、サイクル数ｘ_１＝０において最初の始点Ｔ_１を提供し、また、最終閾値レベルｙ２は、サイクル数ｘ_２においてＣＴＦの終点Ｔ_２を提供する。

図３Ｂは、レベルｙ１およびｙ２の代替の選択を例示する。ここで考慮される例では、閾値レベルｙ１のみの使用は、図３の例に関する場合のように、偽陰性をもたらす結果とはならないであろう。しかしながら、増殖曲線２００．２がＣＴＦ閾値レベルｙ１と交差する点は、後期のサイクル数Ｃ_ｑ２のところ、すなわちｘ＝４０（すなわちＣ_ｑ１よりも、第１の検体の濃度と第２の検体の濃度との間の１０^６の比に対応する、約ｌｏｇ_２１０^６＝１９．９３≒２０サイクルだけ後）ではなく、ｘ＝４８のところにしかない。このことは、定性的な結果のためには比較的大きい数のサイクルが実行されねばならず、このことが分析システムのスループットを低減するので、不利である。別の欠点は、ＣＴ閾値レベルｙ１と増殖曲線２００．２との間の交差する点が、ＲＮＲ過程がその平準化段にある（すなわち核酸の量がサイクルごとにそれ以上倍増されない）、増殖曲線２００．２の指数関数的増殖段階の後に生じ得ることであり、このことは偽であるＣ_ｑ値をもたらし得る。この状況は、ｙ１とｙ２との結合の結果得られるＣＴＦを使用することによって改善されるが、これは、交差する点およびしたがって増殖曲線２００．２に関するＣ_ｑが、ｘ＝４０に移動されるからである。

代替として、ＣＴＦ（ｘ）は、上記の式６もしくは７によるものとすることができ、またはＣＴＦ（ｘ）は、別の単調関数もしくは階段関数とすることができる。
本発明の実施形態によれば、閾値レベルｙ１は式２によるものであり、したがってプラトー段階における飽和線の信号レベルＳを考慮し、一方、閾値レベルｙ２は式１によるものであり、Ｓではなく切片値Ｉを考慮する。

図４は、線形結合による、閾値ｙ_１およびｙ_２の結合に関する代替の実施形態を例示し、たとえば以下の通りである。
ＣＴＦ（ｘ）＝０．５ｙ１＋０．５ｙ２、これは定数であり、したがってこの場合ＣＴＦの移行は存在せず、ここで閾値レベルｙ１はＲＮＲの早期の反応サイクルに関して適切
であり、一方、閾値レベルｙ２はＲＮＲの後期の反応サイクルに関して適切であり、結果としてこれらの結合は、広いサイクル範囲にわたって適切であるＣＴＦをもたらす。たとえば、ｙ１およびｙ２の適切な選択は、図４に例示されるように、ｙ１＞ｙ２となるようにｙ１およびｙ２を選択することである。

結果的なＣＴＦが、こうして増殖曲線２００．１および２００．２に関して検出される定量化サイクル数Ｃ_ｑとともに、図４に例示される。
図５は、図３の実施形態と同様の、Ｃ_ｑ１およびＣ_ｑ２の検出のための、負の傾きを有するＣＴＦを有する、ディスプレイ１７０（図１を参照）上に出力されるウィンドウを例示する。

図６は、図３Ａおよび図３Ｂの実施形態と同様のさらなる実施形態を例示し、この場合、最初の閾値レベルｙ１−式１によるＲＩＩである−は、上記の式５により最終の閾値レベルｙ２−上記の式２によるＰＧＴである−へと線形に移行する。

図７は、ＣＴＦが正の傾きを有する実施形態を例示する。
図８は、式５による線形の移行、式６による二次（ｐ＝２）の移行、および式７による指数関数的な移行に関する、閾値ｙ１およびｙ２のＣＴＦに対する寄与の推移を例示する。

図９は、希釈系列に関する増殖曲線２００．１から２００．７を示し、この場合、増殖曲線２００．１は検体の最高濃度に関して得られ、引き続く増殖曲線２００．２、２００．３などは減少していく検体の濃度に関して得られ、ここで、検体濃度は、ある増殖曲線から次のものへと１桁減少されるが、これは、分析器（図１のＲＮＲシステム１００を参照）のダイナミックレンジを示している。

図１０は、３つの場合に関して増殖曲線２００．１から２００．７から得られるＣ_ｑ値を例示する。
ｉ．曲線３００は、ＲＩＩのみが使用されるときに、ｒ＝５０％とした式１により得られるＣ_ｑ値を示す。

ｉｉ．曲線３０２は、ＰＧＴのみが使用される場合に、ｐ＝０．１とした式２により得られるＣ_ｑ値を示す。
ｉｉｉ．曲線３０４は、これらのＲＩＩとＰＧＴとを結合するＣＴＦが使用されるときに、たとえば式５、６、または７により得られ、結果として希釈系列に関してほぼ等距離のＰＧＴのＣ_ｑ値が得られる。

図１０で観察され得るように、固定された閾値高さ、たとえばＲＩＩ０．５を用いる標準的なＣＴ法の使用は、増加がそれほど急ではないため、低濃度の曲線に関して、相対的なＣ_ｑの遅延につながる。他方で、ＰＧＴのような増殖と関連したＣＴ法の使用は、Ｃ_ｑ値の早期の検出によって、それほど顕著でない増殖の効果を過剰に補償する可能性がある。

上記のｉｉｉ．の場合において得られる等距離のＣ_ｑ値は、結果としての増殖曲線２００．１から２００．７に対応するそれぞれの検体の一定の相対濃度（すなわち引き続く曲線に関して１桁）を反映しており、このことは、ＣＴＦがそれぞれの増殖曲線と交差する点が、極めて広範な濃度範囲にわたる検体の希釈の程度に関係なく、常に指数関数的増殖段階内にあることに起因する。このことはさらに、増殖曲線が有するノイズの量が指数関数的増殖段階内で最も低くしたがってこの増殖曲線が最も正確な結果を生むことに起因して、Ｃ_ｑ判定の精度が、上記のｉ．およびｉｉ．の場合と比較して実質的に向上されることを示唆する。

図１１は、ＲＩＩまたはＰＧＴが単独で使用される場合の、ならびに、図１１から明らかなようにほぼ完全な線形較正曲線を提供する結合されたＣＴＦ曲線に関する、図１０のデータの較正曲線を示す。ＲＩＩまたはＰＧＴなどの単一の閾値法のみが使用される場合、図１１から明らかなように、対数尺度上で、Ｃ_ｑ値を試料の最初の検体濃度に関連付ける理論上の線形法則からの、較正曲線の有意な逸脱が存在する。

図１２は、検体の濃度は同じだがＲＮＲ反応に影響を与える干渉物質の濃度が異なる３つの増殖曲線２００．１、２００．２、および２００．３を示す。
図１３は、平坦閾値法（ｆｌａｔｔｈｒｅｓｈｏｌｄｍｅｔｈｏｄ）ＲＩＩが使用される場合に、および式５、６、または７によってなど負の傾きを有するＣＴＦが使用されるときに、図１２の増殖曲線２００．１から２００．３に関して得られる、結果的なＣ_ｑ値を示す。

図１３から明らかなように、閾値法ＲＩＩのみが使用される場合、３つの増殖曲線２００．１、２００．２、および２００．３に関して得られたＣ_ｑ値は、３０から３２の間で変動し、結果としてそれぞれの大きな誤差をもたらす。対照的に、同じく図１３に例示されるように、負に傾斜したＣＴＦを使用してこれらの曲線に関して得られたＣ_ｑ値は、結果としてこれらの曲線の全てに関してほぼ同一のＣ_ｑ値をもたらし、こうして、試料中に干渉物質の種々の濃度が存在する場合であっても、精度を大きく改善する。このことは、同一の試料濃度のＣ_ｑ値を干渉物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）の濃度の関数として示す、図１４にも例示される。

１００ＲＮＲシステム
１１０励起源
１２０サーマルサイクラーブロック
１３０検出システム
１４０データ処理システム
１４５処理ユニット
１５０メモリ
１６０プログラム命令
１７０ディスプレイ
２００増殖曲線
２０５強度値
２１０切片値
２２０閾値
２３０プラトー領域
２４０ベースライン
２５０最大増殖値
３００曲線
３０２曲線
３０４曲線

Claims

リアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲのための分析方法であって、
前記ＲＮＲの各増幅反応サイクルに関する検体の蛍光放射の強度を取得するステップと、
ＲＮＲサイクル範囲にわたる前記蛍光放射の前記強度を示す増殖曲線（２００）を作り出すステップと、
少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える、前記ＲＮＲサイクル範囲にわたる結合閾値関数（ＣＴＦ）を計算するステップと、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定するステップと
を含み、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が前記ＲＮＲの前記サイクル数に依存し、前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が最初の閾値レベル（ｙ１）から最終閾値レベル（ｙ２）へと移行し、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）とは異なり、
前記最終閾値レベル（ｙ２）が、
ｙ２＝B＋ｒ・I
であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、ベースラインは、信号増加を示さない前記増殖曲線の最初の部分であり、
ｒは、正の百分率パラメータであり、
Iは、サイクル数０に対する切片外挿であり、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、
ｙ（ｘ）＝B＋ｐ・G＝B＋ｐ（S-B）であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、
Sは、前記増殖曲線の飽和線であり、
Gは、前記ベースラインから、飽和線への増殖であり、
pは、0％と100％の間のパラメータであり、
前記最初の閾値レベル（y1）が、前記最終閾値レベル（y2）の上にあり、
前記結合閾値関数が、以下の３つの関数の群（ｉ〜iii）から選択され、
ｉ．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への線形の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
x1は、0又は1に等しい、早期の反応サイクル数であり、
x2は、30より大きい後期の反応サイクル数であり、
y1は、前記最初の閾値レベルであり、
y2は、前記最終閾値レベルである、
もの；
ii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への、多項式の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
pは、固定された多項式の次数であり、
pは、２次多項式関数に対して２である、
もの；
iii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値（y2）への、指数関数的な移行を有するＣＴＦ；
更に、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定するステップを含む、
分析方法。
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）の終点（Ｔ_２）のｙ座標を超えるｙ座標を有する始点（Ｔ_１）を有し、この結果、減少する結合閾値関数（ＣＴＦ）が得られる、
請求項１に記載の分析方法。
リアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲのための分析方法であって、
前記ＲＮＲの各増幅反応サイクルに関する検体の蛍光放射の強度を取得するステップと、
ＲＮＲサイクル範囲にわたる前記蛍光放射の前記強度を示す増殖曲線（２００）を作り出すステップと、
少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える、前記ＲＮＲサイクル範囲にわたる結合閾値関数（ＣＴＦ）を計算するステップと、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定するステップと
を含み、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が前記ＲＮＲの前記サイクル数に依存し、前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が最初の閾値レベル（ｙ１）から最終閾値レベル（ｙ２）へと移行し、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）とは異なり、
前記最終閾値レベル（ｙ２）が、
ｙ２＝B＋ｒ・I
であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、ベースラインは、信号増加を示さない前記増殖曲線の最初の部分であり、
ｒは、正の百分率パラメータであり、
Iは、サイクル数０に対する切片外挿であり、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、
ｙ（ｘ）＝B＋ｐ・G＝B＋ｐ（S-B）であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、
Sは、前記増殖曲線の飽和線であり、
Gは、前記ベースラインから、飽和線への増殖であり、
pは、0％と100％の間のパラメータであり、
前記最初の閾値レベル（y1）が、前記最終閾値レベル（y2）の下にあり、
前記結合閾値関数が、以下の３つの関数の群（ｉ〜iii）から選択され、
ｉ．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への線形の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
x1は、0又は1に等しい、早期の反応サイクル数であり、
x2は、30より大きい後期の反応サイクル数であり、
y1は、前記最初の閾値レベルであり、
y2は、前記最終閾値レベルである、
もの；
ii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への、多項式の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
pは、固定された多項式の次数であり、
pは、２次多項式関数に対して２である、
もの；
iii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値（y2）への、指数関数的な移行を有するＣＴＦ；

更に、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定するステップを含む、
分析方法。
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）の終点（Ｔ _２）のｙ座標より小さいｙ座標を有する始点（Ｔ _１）を有し、この結果、減少する結合閾値関数（ＣＴＦ）が得られる、
請求項３に記載の分析方法。
前記リアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲがリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲである、請求項１から４の一項に記載の分析方法。
検体のリアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲを分析するためのシステムであって、
前記ＲＮＲの各増幅反応サイクルに関する前記検体の蛍光放射の強度を取得するように構成された検出システム（１３０）と、
（ａ）前記ＲＮＲの反応サイクルの範囲にわたる前記蛍光放射の前記強度を示す増殖曲線（２００）を作り出し、
（ｂ）少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える前記ＲＮＲサイクル範囲にわたる結合閾値関数（ＣＴＦ）を提供し、
（ｃ）前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す、前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定する、
ように構成された処理ユニット（１４５）と
を備え、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が前記ＲＮＲの前記サイクル数に依存し、前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が最初の閾値レベル（ｙ１）から最終閾値レベル（ｙ２）へと移行し、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）とは異なり、
前記最終閾値レベル（ｙ２）が、
ｙ２＝B＋ｒ・I
であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、ベースラインは、信号増加を示さない前記増殖曲線の最初の部分であり、
ｒは、正の百分率パラメータであり、
Iは、サイクル数０に対する切片外挿であり、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、
ｙ（ｘ）＝B＋ｐ・G＝B＋ｐ（S-B）であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、
Sは、前記増殖曲線の飽和線であり、
Gは、前記ベースラインから、飽和線への増殖であり、
pは、0％と100％の間のパラメータであり、
前記最初の閾値レベル（y1）が、前記最終閾値レベル（y2）の上にあり、
前記結合閾値関数が、以下の３つの関数の群（ｉ〜iii）：
ｉ．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への線形の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
x1は、0又は1に等しい、早期の反応サイクル数であり、
x2は、30より大きい後期の反応サイクル数であり、
y1は、前記最初の閾値レベルであり、
y2は、前記最終閾値レベルである、
もの；
ii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への、多項式の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
pは、固定された多項式の次数であり、
pは、２次多項式関数に対して２である、
もの；
iii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値（y2）への、指数関数的な移行を有するＣＴＦ；
から選択されるシステム。
検体のリアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲを分析するためのシステムであって、
前記ＲＮＲの各増幅反応サイクルに関する前記検体の蛍光放射の強度を取得するように構成された検出システム（１３０）と、
（ａ）前記ＲＮＲの反応サイクルの範囲にわたる前記蛍光放射の前記強度を示す増殖曲線（２００）を作り出し、
（ｂ）少なくとも２つの異なる閾値レベルを備える前記ＲＮＲサイクル範囲にわたる結合閾値関数（ＣＴＦ）を提供し、
（ｃ）前記結合閾値関数（ＣＴＦ）との前記増殖曲線（２００）の交点に対応するサイクル数として前記増殖曲線（２００）の定量的なおよび／または定性的な分析結果を示す、前記ＲＮＲの定量化サイクル数（Ｃｑ）を判定する、
ように構成された処理ユニット（１４５）と
を備え、
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が前記ＲＮＲの前記サイクル数に依存し、前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が最初の閾値レベル（ｙ１）から最終閾値レベル（ｙ２）へと移行し、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、前記最終閾値レベル（ｙ２）とは異なり、
前記最終閾値レベル（ｙ２）が、
ｙ２＝B＋ｒ・I
であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、ベースラインは、信号増加を示さない前記増殖曲線の最初の部分であり、
ｒは、正の百分率パラメータであり、
Iは、サイクル数０に対する切片外挿であり、
前記最初の閾値レベル（ｙ１）が、
ｙ（ｘ）＝B＋ｐ・G＝B＋ｐ（S-B）であり、ここで、
Bは、ベースライン関数であり、
Sは、前記増殖曲線の飽和線であり、
Gは、前記ベースラインから、飽和線への増殖であり、
pは、0％と100％の間のパラメータであり、
前記最初の閾値レベル（y1）が、前記最終閾値レベル（y2）の下にあり、
前記結合閾値関数が、以下の３つの関数の群（ｉ〜iii）：
ｉ．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への線形の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
x1は、0又は1に等しい、早期の反応サイクル数であり、
x2は、30より大きい後期の反応サイクル数であり、
y1は、前記最初の閾値レベルであり、
y2は、前記最終閾値レベルである、
もの；
ii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値レベル（y2）への、多項式の移行を有するＣＴＦであって、ここで、
pは、固定された多項式の次数であり、
pは、２次多項式関数に対して２である、
もの；
iii．

に従った、前記最初の閾値レベル（y1）から、前記最終閾値（y2）への、指数関数的な移行を有するＣＴＦ；
から選択されるシステム。
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）が、前記システムの電子メモリから前記結合閾値関数（ＣＴＦ）を記述するデータおよび／もしくは命令を読み込むことにより、ならびに／または
前記結合閾値関数（ＣＴＦ）を計算することにより、前記処理ユニットによって提供される、請求項６又は７に記載のシステム。
前記リアルタイム核酸増幅反応ＲＮＲがリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲである、請求項６から８のいずれか一項に記載のシステム。