CN116676373B - 一种样本稀释倍数定量方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种样本稀释倍数定量方法及其应用，将外源重组质粒引入原始肿瘤细胞系DNA样本，得到含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本；所述原始肿瘤细胞系DNA样本为将肿瘤细胞系DNA样本利用与肿瘤细胞系DNA配对的正常细胞系DNA样本稀释至ctDNA丰度达到预设值的样本；利用正常细胞系DNA样本对含外源重组质粒的肿瘤细胞系DNA样本进行梯度稀释；选取管家基因作为内参基因，对各梯度样本中的非人源基因片段和管家基因的拷贝数进行定量，确定各梯度样本的实际稀释倍数。本发明采用非人源基因片段拷贝数稀释策略，实现对各梯度样本中ctDNA丰度的精准定量，尤其能够实现百万级ctDNA丰度的精准定量。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种样本稀释倍数定量方法及其应用。
背景技术
MRD（Minimal Residual Disease，微小残留病灶）是判断治疗后肿瘤耐药、复发的重要指标。2021年《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》中指出肺癌MRD的概念：肺癌分子异常，是指在外周血可稳定检测出丰度≥0.02%的ctDNA（circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA），包括肺癌驱动基因或其他的Ⅰ/Ⅱ类基因变异，这就要求MRD产品的检测限不得高于0.02%的ctDNA丰度。更甚者，PhasED-Seq、NeXT Personal等越来越多的公司和产品已达到百分级别的检测限，可以让越来越多的患者受益于MRD的检测。企业内部参考品是保证MRD产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一，企业内部参考品中ctDNA的精准定量对于产品的设计开发和验证尤为重要，但如此低丰度的ctDNA在现有技术水平下，无法实现精准定量。本领域技术人员仅会根据理论稀释倍数推算出最终样本中含有的ctDNA丰度，而实际得到的ctDNA丰度可能会与理论值相差甚远，例如目前以点突变频率的理论稀释倍数来定量样本的稀释倍数，但在超低ctDNA丰度（低于0.1%）下，点突变频率会呈现出不规则波动，导致无法基于点突变频率精准定量稀释倍数，从而导致无法为MRD产品的设计开发提供准确的参考品。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术无法精准定量超低丰度ctDNA的问题，提供一种样本稀释倍数定量方法及其应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种样本稀释倍数定量方法，包括：
1）将外源重组质粒引入原始肿瘤细胞系DNA样本，得到含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本；
其中，所述外源重组质粒为导入非人源基因片段的重组质粒，所述非人源基因片段为与人类基因组片段无同源序列的基因片段；所述原始肿瘤细胞系DNA样本为将肿瘤细胞系DNA样本利用与肿瘤细胞系DNA配对的正常细胞系DNA样本稀释至ctDNA丰度达到预设值的样本；
2）利用所述正常细胞系DNA样本对含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本进行梯度稀释，得各梯度样本；
3）选取管家基因作为内参基因，对各梯度样本中的非人源基因片段和管家基因的拷贝数进行定量，确定各梯度样本的实际稀释倍数。
作为一种优选的实施方式，所述外源重组质粒为经过可行性验证的质粒，所述可行性验证指：
利用含有纯合突变位点的细胞系的点突变频率在不同梯度样本中的稀释倍数验证外源重组质粒的可行性，如果在不同梯度样本中，点突变频率稀释倍数与非人源基因片段拷贝数的稀释倍数的一致性高于预设值，则通过可行性验证。
基于点突变频率的实际稀释倍数和外源重组质粒的实际稀释倍数的一致性确定外源重组质粒用于样本稀释倍数定量的可行性，将通过可行性验证的外源重组质粒用于样本稀释倍数定量。此外，该非人源基因片段仅基于稀释水平实现稀释倍数定量，因此不应对后续实验产生影响。进一步的，此处的一致性指在数字PCR仪器的检测限范围内保持一致性，当突变频率低于数字PCR仪器检测限时，基于点突变频率确定稀释倍数的局限性，可能存在突变频率低于检测限时，点突变频率无法随稀释梯度稳定变化的问题，使得基于点突变频率的实际稀释倍数和外源重组质粒的实际稀释倍数偏离了一致，而此时的非一致性是由于点突变频率自身的局限性带来，即：点突变频率确定的稀释倍数这一参照对象已不再可靠。例如对于伯乐ddPCR，其检测限为0.1%，当突变频率低于0.1%时，点突变频率无法准确定量样本稀释倍数，而外源Phix质粒拷贝数稀释体系仍呈现稳定的稀释梯度变化，可用于样本稀释倍数的确定。进一步的，此处的一致性量化定义为：R2达到0.99或以上。
作为一种优选的实施方式，所述可行性验证的方式为：
配制由点突变为阴性的细胞系与含有纯合突变位点的细胞系组成的基因组样本，将外源重组质粒掺入基因组样本，获取混合样本；利用所述点突变为阴性的细胞系对混合样本进行梯度稀释；
分别使用管家基因和非人源基因片段的引物和探针对混合样本中管家基因和非人源基因片段拷贝数进行定量，并确定不同梯度混合样本的实际稀释倍数；
作为一种优选的实施方式，所述1）中，从非人源基因组中选择至少一个片段导入质粒，获取含非人源基因片段的质粒；
选取的片段超过一个时，不同片段等长，并分别导入不同质粒，获取多个含非人源基因片段的质粒；将所述多个含非人源基因片段的质粒等摩尔比混合后引入原始肿瘤细胞系DNA样本。优选的方式是选取三个等长的基因片段，构建三个相互独立的质粒；使用三个相互独立的质粒互为技术重复，相比1个质粒做3次重复得到的结果更准确，且更有说服力。
作为一种优选的实施方式，所述外源重组质粒与肿瘤细胞系DNA样本/基因组样本的DNA混合质量比基于数字PCR仪器的检测限确定。
作为一种优选的实施方式，加入的外源重组质粒样本体积不超过原始肿瘤细胞系DNA样本体积的1%。加入样本体积不超过原始肿瘤细胞系DNA样本体积1%的情况下，加入的样本体积可以忽略，不影响总体积，可默认混合后样本浓度不变，避免产生额外的计算。
作为一种优选的实施方式，所述各梯度样本的实际稀释倍数的确定方式为：
通过所述含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本中非人源基因片段与管家基因的拷贝数确定两者的扩增效率比；
根据每个梯度样本中非人源基因片段的拷贝数与扩增效率比的比值，确定来源于上一梯度的管家基因的拷贝数；
计算每个梯度样本中总体的管家基因拷贝数与源于上一梯度的管家基因的拷贝数的比值，即得到样本实际稀释倍数。
作为一种优选的实施方式，所述非人源基因片段包括来自细菌、真菌、噬菌体、病毒、植物、非人动物的基因片段。本发明所指的非人源基因片段，可以来源于细菌、真菌、噬菌体、病毒、植物、非人动物等等，只要满足该基因片段与人类基因组没有同源序列。优选的，所述非人源基因片段选用来自噬菌体或植物的基因片段。更优选所述非人源基因片段选用来自Phix基因组或PHYB基因的基因片段。
作为一种优选的实施方式，所述非人源基因片段的长度为300-1000bp。考虑掺入片段长度太短不容易克隆到载体上，太长可能导致载体不稳定，因此长度推荐为300-1000bp，只要插入片段之间不重叠即可。更优选的非人源基因片段的长度为500-950bp，可增加载体的稳定性；更进一步优选的非人源基因片段的长度为800-950bp。
本发明的另一目的在于保护上述方法在制备ctDNA丰度检测产品参考品中的应用。企业内部参考品是保证MRD产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一，因此参考品中ctDNA的精准定量对于产品的设计开发和验证尤为重要，而目前的方法是基于点突变频率确定样本稀释倍数，在点突变频率低于0.1%后就会出现不规则波动，即无法按照梯度稀释的倍率稳定变化，而采用本发明方法制备的参考品，在ctDNA丰度低至0.0008%的情况下仍遵循设定的梯度稀释倍率稳定变化，即可以预计，其检测限甚至低于0.0008%，可为MRD产品的设计研发和验证提供可靠的验证产品。
本申请具有如下有益效果：
（1）本发明采用外源的非人源基因片段拷贝数稀释策略，在高丰度ctDNA（该丰度可用现有二代测序技术平台进行验证）的样本中掺入特定长度的含有非人源基因片段的质粒（更优选采用3个相互独立的质粒互为技术重复），使用阴性DNA进行一系列梯度稀释至预期超低丰度ctDNA时，含有非人源基因片段的质粒也会随之等比例递减，通过对一系列稀释样本中非人源基因片段的拷贝数进行定量，即可确定样本的实际稀释倍数，从而实现对各梯度样本中ctDNA丰度的精准定量。相比现有稀释倍数确定方法能够确定更低ctDNA丰度（低至0.0008%）的精准定量。
（2）采用本发明的方法设计MRD产品的参考品，可在超低ctDNA丰度（低至0.0008%）下实现稀释倍数的精准定量，为高精度MRD产品的设计提供了可靠的参照。
附图说明
图1是外源Phix质粒拷贝数稀释体系定量方法流程图。
图2是点突变频率和Phix拷贝数实际稀释倍数关系（点突变频率范围0.2%～25%）。
图3是点突变频率和Phix拷贝数实际稀释倍数关系（点突变频率范围0.025%～25%）。
图4是点突变频率和PHYB拷贝数实际稀释倍数关系（点突变频率范围0.2%～25%）。
图5是Phix实际测量ctDNA丰度稀释倍数与单位点突变频率比较。
具体实施方式
实施例以来源于Phix基因组的片段为例，对本发明的技术方案做进一步阐述。
（1）对发明内容或实施例中涉及的部分名词解释如下：
非人源基因片段：用于定量的扩增子经比对后，与人基因组没有同源序列的基因片段。
管家基因：指在生物体内所有细胞中都表达，并且为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的高度保守的一类基因。
外源重组质粒：在质粒中插入非内源性的（不是来自研究对象/研究生物体的）基因片段后形成重组质粒，并导入研究对象/研究生物体。
肿瘤细胞系DNA：源于肿瘤组织，后经过体外培养的肿瘤细胞中的DNA。
与肿瘤细胞系DNA配对的正常细胞系DNA：与肿瘤细胞系同一病人来源的，永生化后可在体外培养的B淋巴细胞的DNA，用于作为肿瘤细胞系DNA的阴性参照。
点突变频率：单位点发生突变的频率。
（2）对实施例中的试剂（成分）、设备等来源说明如下：
1X TE 缓冲液（1X TE Buffer）：pH 8.0,10mM Tris-HCL,0.1mM EDTA-2Na，Coolaber，货号：SL2081-500ML；
GM12878 gDNA：南京科佰生物科技有限公司，货号：CBP61250D；
KRAS p.G12C细胞系gDNA：南京科佰生物科技有限公司，货号：CBP10478；
Qubit 1X dsDNA HS检测试剂盒/500 ASSAYS：Invitrogen™，货号：Q33231；
KRAS p.G12C ddPCR引物和探针：南京科佰生物科技有限公司，野生型货号CBP00039，突变型货号CBP00040；
内参基因EFTUD2的引物和探针：南京科佰生物科技有限公司，货号：CBP00152；
片段化的配对细胞系参考品GCTM001-T、GCTM001-N：菁良科技（深圳）有限公司定制，货号分别为：CA2730和CA2731。
实施例1
本实施例为质粒及相应引物和探针的设计，主要包括3个含Phix片段的质粒设计、并送到金唯智公司合成；及相应的ddPCR引物和探针设计，并送到朗晶公司合成。
从Phix基因组中选择3个约900bp的序列，连接到片段长度为2671bp的pUC57质粒中，3个Phix插入片段序列Phix-insert-1、Phix-insert-2、 Phix-insert-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。
所述引物和探针序列见表1：
表1 Phix引物和探针序列
实施例2
本实施例为Phix拷贝数稀释体系的验证。
1.质粒混合
上述合成的3个独立的含有Phix插入片段的质粒的原始标识浓度为50 ng/μL，使用1X TE Buffer将浓度进行10倍稀释，Qubit定量后，等质量混合，得到Phix-mix，由于插入片段长度一致，等质量比混合，即为3个质粒的等摩尔比混合。
2.质粒掺入比例计算
伯乐ddPCR（digital droplet PCR，数字微滴PCR）20μL体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围：1~100000（十万）拷贝片段化核酸或者1~20000（两万）拷贝完整基因组DNA。
人类基因组有30亿个碱基对，即3.0*10^9 bp，合成的3个质粒的长度约为3571 bp（载体pUC57片段长度为2671 bp，插入片段长度约为900 bp），每个碱基对的相对分子质量为660 g/mol，则可分别得出人类基因组和合成质粒的相对分子质量，即片段长度*660。每ng DNA中样本的拷贝数=1 ng/样本相对分子质量*6.02*10^23（阿伏伽德罗常数），则可计算出每种类型的样本每ng中的拷贝数。如基因组DNA和质粒DNA按照如表2所示的比例（80000:3）进行混合时，20ng样本中，基因组拷贝数为6080，每种Phix质粒拷贝数为63854，则每种样本均未超过ddPCR规定的检测范围（1~100000（十万）拷贝片段化核酸或者1~20000（两万）拷贝完整基因组 DNA）。故可按照基因组和质粒80000:3的质量比进行Phix质粒的掺入。
表2 基因组DNA和质粒DNA混合比例计算
备注：基因组和质粒80000:3的混合质量比为本实施例中采用的混合比例，实际上使用者也可采用任何可满足伯乐ddPCR规定检测范围的混合比例进行外源Phix质粒的掺入。
3.样本配制
使用GM12878 gDNA与纯合的KRAS p.G12C细胞系gDNA（突变频率为100%）进行Phix拷贝数稀释体系的验证。首先将上述两个样本浓度均一化到10 ng/μL，并用Qubit 1XdsDNA HS,500 ASSAYS进行浓度定量，定量试剂对样本的整体误差范围在10%左右，要求样本实际测量浓度在9～11 ng/μL之间，且上述两个样本之间浓度差不得高于1 ng/μL。首先将上述样本按照1:1稀释，则其突变频率为50%，按照基因组DNA和质粒80000:3的比例掺入上述混合的Phix-mix。加入质粒的体积不得高于整体样本体积的1%，如整体样本体积为100μL，则Phix质粒体积不得高于1 μL，如此加入的质粒体积可以忽略不计，并默认混合后样本浓度不变。按照如下表3，使用GM12878 gDNA将混合DNA进行2倍梯度稀释，理论上，各稀释样本中KRAS p.G12C的突变频率分别为50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%、0.78%、0.39%、0.20%、0.10%、0.05%、0.02%，3个Phix质粒的拷贝数也会随之等比减少。
表3点突变样本梯度稀释
4.ddPCR验证点突变实际稀释倍数
使用KRAS p.G12C ddPCR引物和探针验证点突变的实际稀释倍数，每个梯度的样本做3个技术重复，3个重复的平均值作为各梯度样本点突变频率。使用自合成的3个Phix质粒的引物和探针（表1）和内参基因EFTUD2的引物和探针对Phix和EFTUD2的拷贝数进行定量。每个梯度的样本，每种Phix质粒的引物和探针各做1个重复，3个质粒之间互为技术重复，3个重复的平均值稀释倍数作为各梯度样本的最终稀释倍数。比较两者之间的相关性，验证Phix拷贝数稀释体系的可行性。
各稀释梯度样本点突变ddPCR验证结果如下所示：
表4 点突变ddPCR验证结果
备注：实际稀释倍数由原始样本点突变频率除以每一级样本点突变频率得到。
5.Phix稀释倍数计算方法
表5点突变样本中Phix质粒拷贝数定量结果
（续表5）
1）Phix insert-1～3质粒与EFTUD2的扩增效率比=原始样本（本实施例中为KRASp.G12C-25%-phix）中定量得到的Phix拷贝数/EFTUD2拷贝数，如insert-1与EFTUD2的扩增效率比=33960/5080=6.7，即insert-1的扩增比例是EFTUD2的6.7倍；
2）KRAS p.G12C-12.5%-phix是由KRAS p.G12C-25%-phix和GM12878混合得到，该梯度的样本中检出的insert-1拷贝数和EFTUD2拷贝数分别为16780和5220，则来源于KRASp.G12C-25%-phix的EFTUD2拷贝数=16780/6.7=2510.1，那么该样本的稀释梯度为整体EFTUD2拷贝数比源于上一梯度的EFTUD2拷贝数，即5220/2510.1=2.1；
3）以此类推计算出insert-2和insert-3各梯度样本的稀释倍数，将每一梯度3个Phix质粒的稀释倍数求平均值，得到最终样本的稀释倍数；
6.点突变和Phix质粒实际稀释倍数比较
使用ddPCR对各稀释梯度样本的点突变频率和Phix质粒拷贝数进行统计，结果如下：
表6点突变和Phix质粒实际稀释倍数比较
备注：变异系数CV=标准差/平均值*100%。
从图2和表6可以看出，伯乐ddPCR检测限以上的各梯度样本，即突变频率大于0.1%的点突变频率的稀释倍数和Phix质粒的稀释倍数一致性较高，R2达到了0.9985，另外又统计了该范围内两者的变异系数，各稀释梯度样本之间的CV在0.74%～7.67%之间，说明该范围内点突变实际稀释倍数和Phix质粒实际稀释倍数一致性较好。
但从图3和表6可以看出，当突变频率低于伯乐ddPCR检测限，即0.1%及以下时，点突变频率无法准确定量样本稀释倍数，而外源Phix质粒拷贝数稀释体系仍可用于样本稀释倍数的确定。
综上所述，外源Phix质粒拷贝数稀释体系可用于样本稀释倍数的精准定量。
实施例3
本实施例为含有PHYB编码区序列的质粒及相应引物和探针的设计，以及PHYB拷贝数稀释体系的验证，主要包括：
1.3个含PHYB编码区序列的质粒设计。
从拟南芥的PHYB编码区序列中选择3个约500bp的序列，连接到片段长度为2671bp的pUC57质粒中，3个插入片段序列PHYB-insert-1、PHYB-insert-2、 PHYB-insert-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。质粒合成及引物探针合成同实施例1。
所述引物和探针序列见表7：
表7 拟南芥的PHYB编码区引物和探针序列
2.质粒混合
同实施例2。
3.掺入比例计算，计算逻辑同实施例2，结果如表2所示：
表8 基因组DNA和质粒DNA混合比例计算
4.样本配制
实验流程同实施例2。
5.ddPCR验证点突变实际稀释倍数
实验流程同实施例2，结果见下表。
表9 点突变ddPCR验证结果
备注：实际稀释倍数由原始样本点突变频率除以每一级样本点突变频率得到。
6.PHYB稀释倍数计算
表10点突变样本中PHYB质粒拷贝数定量结果
（续表10）
备注：计算规则见表5
7.点突变和PHYB质粒实际稀释倍数比较
表11点突变和PHYB质粒实际稀释倍数比较
备注：变异系数CV=标准差/平均值*100%。
从图4和表11可以看出，点突变频率的稀释倍数和PHYB质粒的稀释倍数一致性较高，R2达到了0.9954，另外又统计了两者的变异系数，各稀释梯度样本之间的CV在1.81%～8.93%之间，说明点突变实际稀释倍数和PHYB质粒实际稀释倍数一致性较好。
综上所述，外源质粒拷贝数稀释体系可用于样本稀释倍数的精准定量。
比较例1
本比较例为外源Phix质粒拷贝数稀释体系的应用。其流程如图1，将外源Phix质粒拷贝数稀释体系（实施例2中将3种质粒等摩尔比混合后的体系）掺入利用配对细胞系稀释到预设ctDNA丰度的肿瘤细胞系样本，进行梯度稀释后利用Phix质粒拷贝数定量稀释倍数，具体如下：
1.样本配制
将上述外源Phix质粒拷贝数稀释体系应用到含有超低丰度ctDNA占比的MRD参考品的研发中。选择定制的片段化的配对细胞系参考品GCTM001-T和GCTM001-N作为MRD参考品的原料。首先使用正常配对细胞系GCTM001-N DNA将肿瘤细胞系GCTM001-T DNA稀释到ctDNA丰度为10%，其次在10% ctDNA丰度中引入外源Phix质粒拷贝数稀释体系，掺入比例参考实施例2中的计算逻辑。最后，按照下表进行超低丰度ctDNA的配制。
表12配对参考品梯度稀释
2.样本稀释倍数质检
使用自合成的3个Phix质粒和内参基因EFTUD2的引物和探针验证各梯度样本的实际稀释倍数。拷贝数定量结果和稀释倍数见表13。
表13配对参考品中Phix质粒拷贝数定量结果
（续表13）
备注：稀释倍数计算逻辑见实施例2。
3.稀释样本ctDNA丰度计算
样本理论稀释倍数和由Phix拷贝数稀释体系得到的实际稀释倍数如表14所示。
表14稀释样本ctDNA丰度计算
从表14可以看出，若不使用本发明，则技术人员会按照理论稀释倍数进行超低丰度的ctDNA的计算，但理论稀释倍数并不等同于实际稀释倍数，使用本发明的外源Phix拷贝数稀释体系后，则能够更加精准的计算出实际稀释样本中ctDNA的丰度，实现了对MRD参考品中超低丰度ctDNA的更加精准的定量。
4.超低丰度ctDNA参考品NGS检测结果
对含有10% ctDNA占比的GCTM001-10%和配对阴性样本GCTM001-N进行WES（wholeexon sequence，全外显子）检测，从结果中选择104个突变位点用于个性化探针的定制，用个性化探针对各梯度样本进行超高测序深度（高于100000×）检测，从检测结果中选择8个单位点与实际稀释倍数进行比较，从图5可以看出，在0-0.1% ctDNA丰度的情况下，使用Phix确定的实际稀释倍数仍旧呈现出2倍稀释梯度变化，而在如此超低丰度的单位点的突变频率呈现出不规则波动，再次说明本发明较其他方法而言，可用于样本的精准定量。
Claims (5)
1.一种样本稀释倍数定量方法，其特征在于，包括：
1）将外源重组质粒引入原始肿瘤细胞系DNA样本，得到含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本；
其中，所述外源重组质粒为导入非人源基因片段的重组质粒，所述非人源基因片段为与人类基因组片段无同源序列的基因片段；所述原始肿瘤细胞系DNA样本为将肿瘤细胞系DNA样本利用与肿瘤细胞系DNA配对的正常细胞系DNA样本稀释至ctDNA丰度达到预设值的样本；
所述外源重组质粒为经过可行性验证的质粒，所述可行性验证的方式为：
配制由点突变为阴性的细胞系与含有纯合突变位点的细胞系组成的基因组样本，将所述外源重组质粒掺入所述基因组样本，获取混合样本；利用所述点突变为阴性的细胞系对混合样本进行梯度稀释，得到不同梯度混合样本；
选取管家基因作为内参基因，分别使用检测管家基因和非人源基因片段的引物和探针对不同梯度混合样本中管家基因和非人源基因片段拷贝数进行定量，并确定不同梯度混合样本的实际稀释倍数；
基于点突变频率的实际稀释倍数和外源重组质粒的实际稀释倍数的一致性，确定外源重组质粒用于样本稀释倍数定量的可行性，如果在不同稀释梯度样本中，点突变频率稀释倍数与非人源基因片段拷贝数的稀释倍数的一致性高于预设值，则通过可行性验证；
所述外源重组质粒的加入体积不超过所述原始肿瘤细胞系DNA样本或所述基因组样本体积的1%；
2）利用所述正常细胞系DNA样本对含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本进行梯度稀释，得各梯度样本；
3）选取管家基因作为内参基因，对各梯度样本中的非人源基因片段和管家基因的拷贝数进行定量，确定各梯度样本的实际稀释倍数；
所述各梯度样本或所述不同梯度混合样本的实际稀释倍数的确定方法为：
通过所述含外源重组质粒的原始肿瘤细胞系DNA样本或所述含外源重组质粒的混合样本中非人源基因片段与管家基因的拷贝数确定两者的扩增效率比；
根据每个梯度样本中非人源基因片段的拷贝数与扩增效率比的比值，确定来源于上一梯度的管家基因的拷贝数；
计算每个梯度样本中总体的管家基因拷贝数与源于上一梯度的管家基因的拷贝数的比值，即得到样本的实际稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1）中，从非人源基因组中选择至少一个片段导入质粒，获取含非人源基因片段的质粒；
选取的片段超过一个时，不同片段等长，并分别导入不同质粒，获取多个含非人源基因片段的质粒；将所述多个含非人源基因片段的质粒等摩尔比混合后引入原始肿瘤细胞系DNA样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源重组质粒与所述原始肿瘤细胞系DNA样本或所述基因组样本的DNA混合质量比基于数字PCR仪器的检测限确定。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述非人源基因片段包括来自细菌、真菌、噬菌体、病毒、植物或非人动物的基因片段。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非人源基因片段的长度为300-1000bp。
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