CN115094117A - 一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用，当待测基因的突变位点为n个时，将含有n个突变位点的基因序列的n个突变基因片段作为n个突变型基因序列，其对应的n个野生型基因片段作为n个野生型基因序列；2）随机序列的获得；3）定量序列的选择；4）依次将n个野生型基因序列、n个突变型基因序列、随机序列间隔设计得到n个序列片段，将n个序列片段采用随机序列连接起来得到一个序列，在序列最后连接1个定量序列即得突变基因参考品。本发明通过将一组或多组野生序列、突变序列设计在同一个序列上，中间用无关序列隔开的方法，可以使野生/突变序列的理论比例完全和实际一致，且能有效规避因为核酸降解所带来的误差和风险。
Description
技术领域
本发明属于生命科学的研究领域、分子诊断领域，具体涉及一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用。
背景技术
遗传性突变基因检测是目前检测遗传病的常规手段，在检测试剂的生产和检测过程中，需要采用参考品或者对照品，对试剂盒的质量以及检测过程进行把控。但是，由于突变基因样本的稀缺性，从人群中获取突变基因样本较为困难，而且从伦理上讲，也不适合采用临床样本作为常规参考品或者试剂盒的对照品。因此，采用人工合成的方法制备突变基因成为首选的方法。
目前已经具有构建大片段质粒的方法，可以按照人们的需求，设计出想要的特定碱基序列的参考品。现有的带有突变基因的参考品的制备方法，是将构建的野生型(未发生突变的基因)和突变型基因按照一定比例进行混合，混合后进行测试、验证，最后得到特定混合比例的突变参考品，如申请中的专利(申请号：201910421072.6和申请号：201910431817.7)中提到的方法，该方法为目前现有厂家或者科研院所主要采用的方法，但存在以下问题：1)分别合成野生和突变基因的序列，或者只合成突变基因序列，然后和正常基因进行混合，这样合成就需要合成不只一个基因片段；2)野生和突变基因、或者突变和正常基因的混合比例需要不断的摸索；3)基因片段是一种不太稳定的化学物质，会随着时间、以及反复冻融等操作造成降解，如果参考品中野生基因和突变基因为两个合成片段，那么一定会有不同的降解速度，因此发生降解后就不能达到原来的效果，又需要重新去摸索混合比例，如图1的示意所示。从图1可见，已经调试好配比为1∶1，降解后就变成了2∶3。
实际上，参考品的降解一定不可避免的，这是造成人工制备的参考品不稳定的最大因素，而参考品作为衡量试剂盒性能，以及把控实验过程的参照品，如果本身就不稳定，那么对于过程控制的意义就会大大降低。
因此，等位基因突变参考品中，野生和突变的比例是非常重要的。如果能建立一种野生和突变基因的比例非常稳定，且不受降解、冻融等因素的影响的参考品，就能大大提高其应用价值。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用，解决目前常用的参考品制备方法中需要反复调试混合比例，以及降解又会造成比例不匹配的问题。该方法建立的突变基因参考品，由于在设计的时候野生和突变基因的比例非常确定，因此不受降解、冻融等因素的影响，大大提高了其应用价值。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种突变基因参考品的制备方法，包括以下步骤：
1)当待测基因的突变位点为n个时，将含有n个突变位点的基因序列的n个突变基因片段作为n个突变型基因序列，其对应的n个野生型基因片段作为n个野生型基因序列；所述n＝1～100的自然数；
2)随机序列的获得：所述随机序列为无关序列，包括人基因组序列、微生物基因组序列或其他与野生、突变基因不相互干扰的序列；
3)定量序列的选择：所述定量序列为待测基因对应的基因组上1个无突变位点的保守序列；
4)依次将n个野生型基因序列、n个突变型基因序列、随机序列间隔设计得到n个序列片段，将n个序列片段采用随机序列连接起来得到一个序列，在序列最后连接1个定量序列即得突变基因参考品。
其中，步骤2)中所述随机序列的获得方式为：
21)采用excel随机生成很多1～4的随机数，公式为INT(RAND()*4+1)；
22)然后将1、2、3、4分别用A、T、C、G来替换，并连接起来，形成随机碱基序列；
23)将得到的随机碱基序列导入NCBI中进行比对，如没有相同或类似序列即可。
其中，所述随机序列可以采用1个相同的随机序列，也可以采用多种不同的随机序列。
其中，所述野生型基因序列和突变型基因序列、定量序列和随机序列的长度均为20～500bp，所述野生型基因序列和突变型基因序列的比例为0.01∶1～100∶1。
其中，所述野生型基因序列和突变型基因序列的比例为是1∶1、1∶2、2∶1或3∶1。
本发明内容还包括所述的制备方法获得的突变基因参考品。
其中，所述突变基因参考品包括人工合成的一个序列片段，所述一个序列片段包括n个突变基因序列组合，所述n个突变基因序列组合包括n个野生型基因序列、n个突变型基因序列、随机序列和1个定量序列，所述野生型基因序列和突变型基因序列之间用随机序列进行连接。
本发明内容还包括所述的突变基因参考品在制备试剂盒对照品或质控品中的应用。
本发明内容还包括一种试剂盒，包括所述的突变基因参考品。
其中，所述试剂盒还包括核酸保护剂，所述的核酸保护剂包括海藻糖、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、山梨醇、甘氨酸、谷氨酰胺或氟化钠中的一种或几种。
其中，所述试剂盒还包括稀释液，所述稀释液为纯化水或TE缓冲液。
本发明合成的突变基因参考品的定量的方法可以直接按照理论分子量直接稀释，也可采用荧光定量PCR方法进行，定量方法可以用不同浓度的待测基因以定量序列为扩增目标，做校准曲线后进行定量。
作为一种实施方式，当突变序列的仅突变一个位点时，其对应的突变的基因序列与野生型基因序列的比例为2∶1时，所述序列片段只需要设计一组，依次包括野生型基因序列、随机序列1、突变型基因序列、随机序列2、突变型基因序列和定量序列相连接。
作为一种实施方式，当突变序列的突变两个位点时，所述序列片段需要设计两组，其对应的突变的基因序列与野生型基因序列的比例为2∶1时，所述序列片段包括第一组突变组合和第二组突变组合，所述第一组突变组合和第二组突变组合用随机序列连接；整个序列片段依次包括野生型基因序列1、随机序列1、突变型基因序列1、随机序列2、突变型基因序列1、随机序列3、野生型基因序列2、随机序列4、突变型基因序列2、随机序列5、突变型基因序列2和定量序列相连接。
作为一种实施方式，当突变序列的突变为100个位点时，所述序列片段需要设计100组，其对应的突变的基因序列与野生型基因序列的比例为2∶1时，所述序列片段包括第一组突变组合、第二组突变组合、第三组突变组合……一直到第100组突变组合，所述第一组突变组合、第二组突变组合……一直到第100组突变组合用随机序列连接；整个序列片段依次包括野生型基因序列1、随机序列1、突变型基因序列1、随机序列2、突变型基因序列1、随机序列3、野生型基因序列2、随机序列4、突变型基因序列2、随机序列5、突变型基因序列2、随机序列6、野生型基因序列3、随机序列7、突变型基因序列3、随机序列8、突变型基因序列3、……突变型基因序列100和定量序列相连接。
作为一种实施方式，当突变序列的序列突变n个位点时，所述序列片段需要设计n组，其对应的突变的基因序列与野生型基因序列的比例为2∶1时，所述序列片段包括第一组突变组合、第二组突变组合、……一直到第n组突变组合，所述第一组突变组合、第二组突变组合、……第n组突变组合分别用随机序列连接；整个序列片段依次包括野生型基因序列1、随机序列1、突变型基因序列1、随机序列2、突变型基因序列1、随机序列3、野生型基因序列2、随机序列4、突变型基因序列2、随机序列5、突变型基因序列2、……突变型基因序列n和定量序列相连接。
本方法的关键在于序列的设计，即将野生序列和突变序列同时设计在一个序列上，各个序列之间用随机序列，或者与目标参考品序列类似的序列进行填充；通过设计总序列上野生序列和突变序列重复的数量，来控制野生和突变序列的混合比例。使理论要求的比例和实际的混合比例完全一致，同时，如果参考品发生降解，也不会对混合比例造成影响。另外，在该序列上设计一个定量序列，该序列可以通过荧光定量PCR和真实样本进行关联比对，从而达到对整个片段定量的目的。设计合成好序列后，只需要按照理论计算直接稀释即可以使用。当然，为了增加参考品的稳定性，也可与加入基因组等核酸成分，或者在其中加入核酸保护剂等物质。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下显著优点：本发明通过将一组或多组野生序列、突变序列设计在同一个序列上，中间用无关序列隔开的方法，可以使野生/突变序列的理论比例完全和实际一致，且能有效规避因为核酸降解所带来的误差和风险。
附图说明
图1、现有技术中的突变基因采用质粒的方式合成全基因组进行混合制备成参考品时的发生降解的情形；
图2、该序列设计针对含有一个突变基因位点的杂合型基因组，其中野生和突变基因的比例为1∶2，同时包含一个定量序列，用于监控或者把控整体参考品的浓度或降解程度；
图3、该序列设计针对两个突变基因位点设计的序列，每个位点野生和突变基因的比例都为1∶2，同时包含一个定量序列；
图4、该图为真实参考品荧光定量PCR扩增曲线；
图5、该图为合成参考品荧光定量PCR扩增曲线；
图6、该图为合成参考品稳定性CT值变化情况；
图7、该图为真实样本稳定性CT值变化情况。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1一个突变位点的基因序列的参考品的制备
本实施例拟制备一个包含有一个乙肝耐药突变基因位点(GenBank ACCESSION：OK274310.1)，且野生基因比例和突变基因比例为1∶2的人基因组参考品，并同时带有定量序列，采用方案如图2所示。本实施例中的真实样本为本公司已经明确其产生了该基因突变的乙肝病人的全血提取的人基因组DNA。
在图2中，本实施例选择的野生型基因序列如下：
突变型基因序列如下：
其中两段随机序列采用excel随机生成很多1～4的随机数，公式为INT(RAND()*4+1)；然后将1、2、3、4分别用A、T、C、G来替换，并连接起来，形成随机碱基序列，并在NCBI上进行比对，在现有数据库中查询无类似序列，筛选得到如下两个随机序列：
随机序列1：GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCC
随机序列2：GTTGGCTAGGAACTGCAAGCAC
定量序列为保守序列，在上下游引物上均无突变位点，用以把控参考品的浓度，其定量序列为：
综合以上，总序列设计如下：
送生工生物工程(上海)股份有限公司进行质粒合成。
合成后即为该突变位点的参考品，按照一定比例稀释后(一般稀释比例为100000倍)可采用商品化的试剂盒进行检测。
在试剂盒中，上下游扩增引物序列如下：
上游引物：GAGTGGGCCTCAGTCC；
下游引物：CCTGGTGGCTCCAGTTC；
定量探针：FAM-TCAGTGGTTCG-MGB；
突变探针：VIC-CACATGGCTCA-MGB；
扩增体系配方如表1：
表1
检测时的加样体系如表2：
表2
扩增程序如表3：
表3
扩增的曲线图如图4和图5所示，本方法设计的参考品，能够模拟真实样本。
同时，对该参考品进行稳定性测试，在室温下连续放置一个半月，每周测定一次，并同步带上真实的具有突变位点的临床样本进行对比，并分别做曲线图，如图6和7，发现该人工合成的参考品和真实样本进行荧光定量PCR检验，CT值都有增加，说明核酸都存在一定程度的降解，但两者都呈现出相同的降解曲线，且定量序列与突变序列的比例整体升高趋势也基本一致，说明突变序列在参考品中的比例较为稳定，与真实参考品一致。(如果采用合成质粒与野生样本混合的方式，则会出现定量序列的CT值和突变序列的CT值发生偏离的情况)
因此，采用该设计思路合成的参考品能够替代真实参考品，且人工合成的参考品因加入了稳定剂、保护剂等，在稳定性上优于真实参考品。
实施例2两个突变位点的基因序列的参考品的制备
本实施例在实施例1的基础上，由一个乙肝耐药突变基因位点，增加为两个突变基因位点，且野生基因比例和突变基因比例均为1∶2的人基因组参考品，并同时带有定量序列，采用方案如图3所示。
在图3中，两条野生序列分别如下：
野生基因序列1：
野生基因序列2：
两条野生序列对应的突变序列如下：
突变基因序列1：
突变基因序列2：
其中两段随机序列采用实施例1的方法excel自动生成，并在NCBI上进行比对，在现有数据库中查询无类似序列，生成如下：
随机序列1：GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCC
随机序列2：GTTGGCTAGGAACTGCAAGCAC
随机序列3：GCATAGACGTGGCTCAACTGTC
随机序列4：AGCTAGACCACTCAGCAGACTG
随机序列5：CCGACTCTTACGCTCCTACC
定量序列为保守序列，在上下游引物上均无突变位点，用以把控参考品的浓度，其定量序列为：
综合以上，总序列设计如下：
以上为多个突变位点的序列的设计方案，后续的检测过程以及检测结果与实施例1类似，不再赘述。
序列表
<110> 无锡博奥玛雅医学科技有限公司
<120> 一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> DNA
<213> 野生型基因序列(Artificial Sequence)
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<213> 突变型基因序列(Artificial Sequence)
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<400> 3
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<212> DNA
<213> 总序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt 60
ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg tgttagggtc 120
gcgccaaact ctcctatggg agtgggcctc agtccgtttc acatggctca gtttactagt 180
gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat 240
gatgtgttgg ctaggaactg caagcactat gggagtgggc ctcagtccgt ttcacatggc 300
tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt 360
cagttatatg gatgatgtaa attgcacttg tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc 420
aaaattccta tgggagtggg cctcagtccg tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt 480
tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg 540
gt 542
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 7
gagtgggcct cagtcc 16
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 8
cctggtggct ccagttc 17
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> 定量探针(Artificial Sequence)
<400> 9
tcagtggttc g 11
<210> 10
<211> 11
<212> DNA
<213> 变量探针(Artificial Sequence)
<400> 10
cacatggctc a 11
<210> 11
<211> 111
<212> DNA
<213> 野生基因序列1(Artificial Sequence)
<400> 11
tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt 60
ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg t 111
<210> 12
<211> 237
<212> DNA
<213> 野生基因序列2(Artificial Sequence)
<400> 12
tctgcggcgt tttatcatct tcctccgcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt 60
tcttctggac tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat catcaacaac 120
cagcaccgga ccatgcaaaa cctgcacaac tcctgctcaa ggaacctcta tgtttccctc 180
atgttgctgt acaaaaccta cggacggaaa ctgcacctgt attcccatcc catcatc 237
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> 突变基因序列1(Artificial Sequence)
<400> 13
tatgggagtg ggcctcagtc cgtttcacat ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt 60
ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg t 111
<210> 14
<211> 237
<212> DNA
<213> 突变基因序列2(Artificial Sequence)
<400> 14
tctgcggcgt tttatcatct tcctccccat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt 60
tcttctggac tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat catcaacaac 120
cagcaccgga ccatgcaaaa cctgcacaac tcctgctcaa ggaacctcta tgtttccctc 180
atgttgctgt acaaaaccta cggacggaaa ctgcacctgt attcccatcc catcatc 237
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 随机序列1(Artificial Sequence)
<400> 15
gttagggtcg cgccaaactc tcc 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 随机序列2(Artificial Sequence)
<400> 16
gttggctagg aactgcaagc ac 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 随机序列3(Artificial Sequence)
<400> 17
gcatagacgt ggctcaactg tc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 随机序列4(Artificial Sequence)
<400> 18
agctagacca ctcagcagac tg 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 随机序列5(Artificial Sequence)
<400> 19
ccgactctta cgctcctacc 20
<210> 20
<211> 164
<212> DNA
<213> 定量序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaattgcact tgtattccca tcccatcatc ttgggctttc gcaaaattcc tatgggagtg 60
ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg 120
gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggt 164
<210> 21
<211> 1317
<212> DNA
<213> 总序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt 60
ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg tgttagggtc 120
gcgccaaact ctcctatggg agtgggcctc agtccgtttc acatggctca gtttactagt 180
gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat 240
gatgtgttgg ctaggaactg caagcactat gggagtgggc ctcagtccgt ttcacatggc 300
tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt 360
cagttatatg gatgatgtgc atagacgtgg ctcaactgtc tctgcggcgt tttatcatct 420
tcctccgcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcaaggta 480
tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat catcaacaac cagcaccgga ccatgcaaaa 540
cctgcacaac tcctgctcaa ggaacctcta tgtttccctc atgttgctgt acaaaaccta 600
cggacggaaa ctgcacctgt attcccatcc catcatcagc tagaccactc agcagactgt 660
ctgcggcgtt ttatcatctt cctccccatc ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt 720
cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa ttccaggatc atcaacaacc 780
agcaccggac catgcaaaac ctgcacaact cctgctcaag gaacctctat gtttccctca 840
tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac tgcacctgta ttcccatccc atcatcccga 900
ctcttacgct cctacctctg cggcgtttta tcatcttcct ccccatcctg ctgctatgcc 960
tcatcttctt gttggttctt ctggactatc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc 1020
caggatcatc aacaaccagc accggaccat gcaaaacctg cacaactcct gctcaaggaa 1080
cctctatgtt tccctcatgt tgctgtacaa aacctacgga cggaaactgc acctgtattc 1140
ccatcccatc atcaaattgc acttgtattc ccatcccatc atcttgggct ttcgcaaaat 1200
tcctatggga gtgggcctca gtccgtttct cctggctcag tttactagtg ccatttgttc 1260
agtggttcgt agggctttcc cccactgttt ggctttcagt tatatggatg atgtggt 1317
Claims (10)
1.一种突变基因参考品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）当待测基因的突变位点为n个时，将含有n个突变位点的基因序列的n个突变基因片段作为n个突变型基因序列，其对应的n个野生型基因片段作为n个野生型基因序列；所述n=1~100的自然数；
2）随机序列的获得：所述随机序列为无关序列，包括人基因组序列、微生物基因组序列或其他与野生、突变基因不相互干扰的序列；
3）定量序列的选择：所述定量序列为待测基因对应的基因组上1个无突变位点的保守序列；
4）依次将n个野生型基因序列、n个突变型基因序列、随机序列间隔设计得到n个序列片段，将n个序列片段采用随机序列连接起来得到一个序列，在序列最后连接1个定量序列即得突变基因参考品。
2.根据权利要求1所述的突变基因参考品的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述随机序列的获得方式为：
21）采用excel随机生成多个1~4的随机数，公式为INT(RAND()*4+1)；
22）然后将1、2、3、4分别用A、T、C、G来替换，并连接起来，形成随机碱基序列；
23）将得到的随机碱基序列导入NCBI数据库中进行比对，如没有相同或类似序列即可。
3.根据权利要求1所述的突变基因参考品的制备方法，其特征在于，所述野生型基因序列和突变型基因序列、定量序列和随机序列的长度均为20~500bp，所述野生型基因序列和突变型基因序列的比例为0.01:1~100:1。
4.根据权利要求1所述的突变基因参考品的制备方法，其特征在于，所述野生型基因序列和突变型基因序列的比例为是1:1、1:2、2:1或3:1。
5.权利要求1~4任一项所述的制备方法获得的突变基因参考品。
6.根据权利要求5所述的突变基因参考品，其特征在于，所述突变基因参考品包括人工合成的一个序列片段，所述一个序列片段包括n个突变基因序列组合，所述n个突变基因序列组合包括n个野生型基因序列、n个突变型基因序列、随机序列和1个定量序列，所述野生型基因序列和突变型基因序列之间用随机序列进行连接。
7.权利要求5或6所述的突变基因参考品在制备试剂盒对照品或质控品中的应用。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求5或6所述的突变基因参考品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸保护剂，所述的核酸保护剂包括海藻糖、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、山梨醇、甘氨酸、谷氨酰胺或氟化钠中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括稀释液，所述稀释液为纯化水或TE缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210559747.5A CN115094117A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210559747.5A CN115094117A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115094117A true CN115094117A (zh) | 2022-09-23 |
Family
ID=83288571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202210559747.5A Pending CN115094117A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种突变基因参考品的制备方法及其产品和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115094117A (zh) |
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2022
- 2022-05-20 CN CN202210559747.5A patent/CN115094117A/zh active Pending
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