CN110029193B

CN110029193B - 一种新型生物标记物在预测hiv-1感染患者病程发展中的应用

Info

Publication number: CN110029193B
Application number: CN201910099223.0A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 邓凯; 于霏
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN110029193A

Abstract

本发明公开了一种新型生物标记物在预测HIV‑1感染患者病程发展中的应用，TFH细胞（CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺)是X4嗜性HIV‑1病毒感染、复制及潜伏的主要场所，因此TFH是HIV‑1病毒治疗的靶点。进一步提出了外周血滤泡辅助性T淋巴细胞HIV‑1前病毒储藏库中X4嗜性病毒的比例与外周血CD4⁺ T细胞数目，恢复速率及艾滋病病程发展呈显著负相关关系。使用的外周血TFH细胞前病毒储藏库中X4嗜性HIV‑1病毒的比例作为预测HIV‑1患者接受cART治疗预后的生物标记物，比之前的预测手段所需样本量更小，耗时更短，且具有更广泛的适用范围，适用于各阶段HIV‑1患者。该生物标记物能够作为在临床治疗中预测HIV‑1治疗预后的精确指标。

Description

一种新型生物标记物在预测HIV-1感染患者病程发展中的应用

技术领域

本发明涉及病毒治疗诊断技术领域，更具体地，涉及一种新型生物标记物在预测HIV-1感染患者病程发展中的应用

背景技术

人类免疫缺陷病毒1型(human immunodificiency virus 1，HIV-1)是导致获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体。尽管联合抗逆转录病毒疗法(combined antiretroviral therapy，cART)可以有效地抑制HIV-1在病毒感染患者体内复制，但仍不能够达到根治疾病的目的。约有50％的HIV-1感染患者会在AIDS病程晚期出现X4型HIV-1，并常伴随有CD4⁺T细胞数量的急剧减少及AIDS病程的快速进展。但是，X4型病毒的产生机制和来源目前仍不清楚。病毒通过嗜性转换使得抗病毒药物失效风险升高，及病毒储藏库的存在是导致HIV-1感染难以被治愈的主要障碍，由于HIV-1能够整合至宿主细胞基因组并形成稳定的病毒潜伏感染并长期存在，一旦停止cART，患者体内病毒复制即能在短时间内再度反弹形成病毒血症。

目前用于测量HIV-1储存库的主要方法包括测量HIV-1细胞相关的DNA及通过体外病毒诱导实验测量可激活的病毒储藏库。但是，以PCR为基础的HIV细胞相关DNA检测无法区分缺陷型病毒，这会导致病毒储藏库被高估；而以细胞培养诱导病毒产生实验为基础的可激活病毒储藏库的检测，不仅样本需求量大，耗时长，更会导致病毒储藏库被低估。

目前，几乎没有方法可以量化或监测HIV-1病毒的潜伏储藏库。而用于预测HIV-1患者接受cART治疗预后的指标更是匮乏，且均与HIV-1初次感染时患者生理状态及病毒血症时期病毒载量相关，而这一信息的获取难度与准确性导致其难以成为能够被广泛应用的临床指标。因此，临床上迫切需要能够精确定量潜在储藏库或预测疾病进展的有效检测生物标志物。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新型生物标记物在预测HIV-1感染患者病程发展中的应用。

本发明的第一个目的是提供外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒的比例作为HIV病毒储藏库大小的生物标志物的应用。

本发明的第二个目的是提供外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒的比例作为评价对HIV病毒感染的治疗效果、免疫重建潜力或病程发展的生物标志物的应用。

本发明的第三个目的是提供一组检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的引物。

本发明的第四个目的是提供所述引物在检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例、制备一组检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的引物的试剂盒、制备评价对HIV病毒感染的治疗效果的试剂盒、制备评价免疫重建潜力的试剂盒或制备评价病程发展的试剂盒的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的检测方法

本发明的第六个目的是提供一个检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例、或评价对HIV病毒感染的治疗效果、评价免疫重建潜力或评价病程发展的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明利用流式分选技术，从患者PBMC(外周血单个核细胞)中分选出特定的CD4⁺T细胞亚群(pTFH、mCD4和Naive CD4)；取少部分细胞进行传统病毒诱导释放实验(VOA)作为对照，提取共培养上清液中病毒的RNA，并进行逆转录获得cDNA；其余细胞提取基因组DNA，然后利用巢式PCR的方法扩增病毒V3可变区序列，并进行二代测序通过生物信息学方法分析HIV-1病毒储藏库中病毒嗜性的构成(图1所示)。

由此发现，TFH细胞对X4嗜性的HIV-1更易感，同时，X4型嗜性HIV病毒能够具有倾向性地在TFH(CD3+CD4+CXCR5+)细胞中富集。TFH细胞是X4嗜性HIV-1病毒感染、复制及潜伏的主要场所，因此TFH是HIV病毒靶点或药物研发的靶点。另外，X4型嗜性HIV病毒TFH前病毒储藏库中的比例与接受cART治疗患者的CD4⁺T细胞数目及其增值能力呈显著负相关关系，因此本发明要求保护以下内容：

外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒的比例作为HIV病毒储藏库大小的生物标志物的应用。

外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒的比例作为评价对HIV病毒感染的治疗效果、免疫重建潜力或病程发展的生物标志物的应用。

X4嗜性HIV-1病毒在外周血TFH前病毒储藏库中比例与患者外周血CD4⁺T数目，恢复速度及艾滋病病程发展呈显著负相关。

优选地，所述对HIV病毒感染的治疗效果、免疫重建潜力或病程发展为CD4⁺T细胞的数量、CD4⁺T细胞的增殖量或合并感染中的一种或几种。

优选地，所述CD4⁺T细胞的数量为外周血CD4⁺T细胞的数量。

优选地，所述CD4⁺T细胞的增殖量为外周血述CD4⁺T细胞的增殖量。

本发明还要求保护一组检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。

SEQ ID NO：1为GAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAG；

SEQ ID NO：2为GTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTACCTGAGGTC；

SEQ ID NO：3为CTCTCTATTGGCAGTCTAGCAGAAGAAG；

SEQ ID NO：4为TATCCTCTCTGGGTCCCCTCCTGAGG。

SEQ ID NO：1～4所示引物为巢式PCR引物，SEQ ID NO：1～2为第一轮扩增引物，SEQ ID NO：3～4为第二轮扩增引物。本引物对V3区域序列进行扩增，最终产物的长度约为323bp。

所述引物在检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例、制备一组检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的引物的试剂盒、制备评价对HIV病毒感染的治疗效果的试剂盒、制备评价免疫重建潜力的试剂盒或制备评价病程发展的试剂盒的应用。也属于本发明的保护范围。

一种检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的检测方法，包括以下步骤：

S1.分选外周血TFH细胞；

S2.扩增HIV病毒的V3区域；

S3.对S1的扩增产物进行二代测序；

S4.将二代测序得到的结果Geno2pheno进行嗜性分析。

优选地，利用流式细胞术分选外周血TFH细胞。

更优选地，采用流式抗体，分选策略为CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺进行分选。

优选地，使用所述的引物进行HIV病毒的V3区域的扩增。

一个检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例、或评价对HIV病毒感染的治疗效果、评价免疫重建潜力或评价病程发展的试剂盒，包括病毒的V3区域的扩增引物；

优选地，所述扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID NO 1～4所示引物。

优选地，还含有流式抗体CD3，CD4，CXCR5。

最优选地，所述试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO 1～4所示引物、流式抗体CD3，CD4，CXCR5。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中首次证明TFH是X4嗜性HIV-1病毒感染、复制及潜伏的主要场所。

本发明提出了一种用以预测HIV-1抗病毒治疗预后的新型生物标记物。所述新型生物标记物为外周血滤泡辅助性T淋巴细胞HIV-1前病毒储藏库中X4嗜性病毒的比例，该比例与外周血CD4⁺T细胞数目，恢复速率及艾滋病病程发展呈显著负相关关系。使用的外周血TFH细胞前病毒储藏库中X4嗜性HIV-1病毒的比例作为预测HIV-1患者接受cART治疗预后的生物标记物，比之前的预测手段所需样本量更小，耗时更短，且具有更广泛的适用范围，适用于各阶段HIV-1患者。该生物标记物能够作为在临床治疗中预测HIV-1治疗预后的精确指标。

附图说明

图1为外周血TFH细胞前病毒储藏库中X4嗜性HIV-1病毒比例的检测流程。

图2为pCM6载体结构示意图。

图3为外周血TFH的分离方法。

图4为外周血TFH细胞易感X4嗜性HIV-1病毒。

图5为X4嗜性HIV-1病毒体外原代潜伏感染模型的建立。

图6为X4嗜性HIV-1病毒具有倾向性地在外周血TFH中富集；A：不同CD4⁺T细胞亚群中，每10⁶细胞中整合的HIV-1前病毒DNA量，检测下限为0.800copies/106cells；B：经过计算得出在不同CD4⁺T细胞亚群中，每10⁶细胞能够释放出的具有感染活性单位(IUPM)，即HIV-1储藏库的大小，检测下限为0.80IUPM，**P<0.01；***P<0.001；C：pTFH中整合的HIV-1前病毒DNA所包含的X4型病毒比例显著高于mCD4；D：pTFH经过VOA诱导释放出的HIV-1所包含的X4型病毒比例显著高于mCD4，**P<0.01。

图7为X4嗜性HIV-1在外周血TFH细胞前病毒储藏库中的比例与患者外周血CD4⁺T数目，恢复速度及艾滋病病程发展呈显著负相关；A：pTFH中整合的X4型HIV-1比例与CD4⁺T淋巴细胞数量呈显著负相关关系。B和C中黑色折线为X4型病毒阴性组患者CD4⁺T细胞数量，红色折线为X4型病毒阳性组CD4⁺T细胞数量，黑色直线为X4型病毒阴性组患者CD4⁺T细胞数量均值拟合的线性回归线，红色直线为X4型病毒阳性组患者CD4⁺T细胞数量均值拟合的线性回归线；D：HIV-1感染患者经过一年ART治疗期间合并感染情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例以HIV-1型病毒为例对本发明的发明内容进行详细阐述。

假病毒HXB2：为一种具有X4嗜性包膜的HIV-1假病毒，其包膜质粒为pHXB2-env，其慢病毒载体骨架质粒为pCM6(图2)。

实施例1 外周血TFH细胞的鉴定及分离

一、实验方法

使用室温的PBS或0.9％NaC1溶液稀释采集的患者全血样本，将20ml全血样本稀释至50mL。将每25mL细胞悬浮液覆盖到20mLFicoll上(密度1.077g/mL)，注意不能破坏相连液面，20℃、450g离心25分钟。离心后，小心吸取中间层单个核细胞，使用1×PBS(含肝素0.5U/mL)洗3次，首次4℃、450g离心10分钟，后续均220g离心8分钟。将分离得到的PBMC用PBS重悬至10⁸细胞/ml。加入CD4enrichment cocktail抗体，用量按BD磁珠阴选CD4⁺T淋巴细胞试剂盒的说明书进行操作。获得的CD4⁺T细胞重悬于含有1％BSA血清的PBS中，进行偶联荧光素的特异性抗体的染色，如表1所示，根据抗体说明书的染色条件孵育完毕后，用PBS中止、离心并重悬，进行流式细胞术分选。

分选策略：pTFH圈门策略(CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺)，非pTFH的记忆性CD4⁺T细胞mCD4的圈门策略(CD3⁺CD4⁺CXCR5^-CD45RO⁺)，非pTFH非记忆性CD4⁺T细胞naive CD4的圈门策略(CD3⁺CD4⁺CXCR5^-CD45RO^-)；B：各亚群细胞的分选纯度均为99％以上。用流式抗体CD3，CD4，CXCR5对来自HIV-1感染患者或健康捐献者的外周血单核细胞进行染色。

分选所得细胞，室温350g离心5分钟收集，重悬于适量新鲜培养基，以备后续实验。

表1：流式细胞术用荧光抗体列表

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二、实验结果

通过流式分选技术，将外周血CD3⁺CD4⁺的淋巴细胞分为三个类群：CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺的pTFH(外周血中滤泡性辅助T细胞)；CD3⁺CD4⁺CXCR5^-CD45RO⁺的非TFH记忆性CD4⁺T细胞，后文简称为mCD4；以及CD3⁺CD4⁺CXCR5^-CD45RO^-的非TFH非记忆性CD4⁺T细胞，后文简称为NaiveCD4(图3左)。为了保证后续实验的准确性，我们将分选纯度均控制在99％以上(图3右)。

实施例2 CD4⁺T细胞亚群对X4嗜性的HIV-1病毒的易感性

一、实验方法

分离健康捐献者的pTFH及mCD4两个亚群的细胞(方法同实施例1)，使用了X4嗜性的假病毒HXB2及X4嗜性野生型HIV-1分别感染正常人激活的pTFH及mCD4。经过5天感染后分别对不同组的细胞进行检测。具体步骤为：假病毒HXB2感染组利用流式分析技术进行检测，GFP⁺细胞即为感染细胞。野生型病毒感染组，利用GFP耦连的anti-P24抗体进行胞内染色，然后利用流式分析技术进行检测，GFP⁺细胞即为感染细胞。

二、实验结果

结果如图4所示，X4嗜性假病毒及野生型HIV-1对pTFH的感染率都显著高于mCD4。***P<0.001。

实施例4 HIV-1体外原代细胞潜伏感染模型的构建及再激活

一、实验方法

分离健康捐献者的pTFH及mCD4两个亚群的细胞(方法同实施例1)，重悬于超级T细胞培养基(STCM)中，密度达到10⁶细胞每毫升，在6孔板中进行激活。用包装好的Bcl-2病毒感染激活的CD4⁺T细胞，37℃培养培养过夜后，将细胞转入T-150培养瓶中，补充足量STCM，细胞密度为0.5×10⁶细胞每毫升，37℃培养2天。离心后更换为普通悬浮细胞培养基(CFM)，密度为0.5×10⁶细胞每毫升。第十天的时候半量换液，37℃培养3周。用Ficoll-Paque分离可以获得稳定表达Bcl-2的原代CD4⁺T细胞，此后称为Bcl-2CD4⁺T细胞。将Bcl-2CD4⁺T细胞重悬于STCM，在6孔板中进行激活。使用假病毒HXB2，对经过激活的表达Bcl-2的原代CD4⁺T细胞系进行感染，每两周半量换液，37℃培养4～6周。等待细胞恢复静息状态后，用Ficoll-Paque分离活细胞。利用流式分选出GFP阴性的细胞，重悬于CFM，再重新对其进行激活，获得HIV-1原代细胞潜伏模型用以检测，检测假病毒的表达水平。

具体激活包括CD3/CD28抗体、SAHA及Bryostration-1，对恢复静息状态的原代潜伏细胞系进行激活。

二、实验结果

结果显示，这些不同的激活方式下，pTFH的再激活水平都显著高于mCD4(图5)。这说明X4型HIV-1不但能够形成稳定的病毒储藏库，同时，可能能够具有倾向性地在TFH中富集。

实施例5 pTFH与HIV病毒储藏库的关系

一、实时荧光定量Alu-PCR检测

1、实验方法

为了检测HIV-1在不同CD4⁺T细胞亚群中的储藏库大小及整合前病毒DNA量是否有不同，对三个细胞类群实施例1分离的患者pTFH，mCD4与

CD4分别进行了实时荧光定量Alu-PCR检测。/>

具体步骤为：

使用KAPAProbe Fast Universal qRCR Kit试剂盒对HIV-1整合量进行定量检测。

提取HIV-1感染患者基因组DNA，并利用野生型HIV-1质粒制作qPCR的标准曲线。按照说明书操作，加入对应的引物(HIV-QPCR-F与HIV-QPCR-R)、探针(HIV-QPCR-PROBE)及DNA样本。然后将反应体系置于QPCR仪内进行反应及数据收集。

表2 qPCR所用引物及探针列表：

2、实验结果

结果显示，在pTFH与mCD4中整合的HIV-1前病毒DNA量显著高于

CD4，其中

CD4中的整合前病毒DNA量几乎接近检测下限，而在pTFH与mCD4两群细胞之间，整合的前病毒DNA量并没有显著差异(图6A)。

二、病毒诱导释放实验(VOA)

1、实验方法

利用传统VOA方法检测患者不同亚群CD4⁺T细胞中HIV-1储藏库的大小。

具体步骤为：

(1)将分选出的HIV-1感染者不同亚群的CD4⁺T细胞以5倍为单位进行极限稀释(如，每毫升细胞密度依次为1×10⁶，2×10⁵，4×10⁴，8×10³，1600)重悬在500μl新鲜培养基中，置于24孔板。

(2)将来自健康捐献者的PBMC经过50Gy辐照，重悬于新鲜细胞培养基中，密度为5×106细胞每毫升，每孔加入500μl，与步骤1所得细胞混合。

(3)用anti-CD3及anti-CD28抗体对细胞进行激活，加入IL-2使终浓度达到50U/ml，37℃培养过夜。

(4)将提前激活好的来自健康捐献者的CD4+T细胞，重悬在新鲜培养基中，密度为10⁶细胞每毫升，每孔加入1ml，与步骤2中得到的细胞混合，37℃培养。

(5)从激活开始，每3天收取细胞培养上清，18天完成培养周期。第6、12天换液，并补充激活好的来自健康捐献者的CD4⁺T细胞及细胞因子。

(6)利用P24检测试剂盒对细胞培养上清进行检测。

(7)利用http://silicianolab.johnshopkins.edu/对样本储藏库的大小进行计算。

2、实验结果

结果显示，mCD4及pTFH能够释放的具有感染性的HIV-1颗粒RNA显著高于

CD4。/>

CD4所能诱导释放的病毒RNA接近检测下限。同时，pTFH是三个亚群中具有最高释放活性病毒能力的一个亚群，显著高于mCD4及/>

CD4，这说明pTFH相较于其他CD4⁺T细胞亚型具有更大的病毒储藏库(图6B)。/>

三、二代测序分析X4嗜性HIV-1病毒占前病毒储藏库比例

1、实验方法

为了探索pTFH具有更大潜伏库的原因，对不同CD4⁺T细胞亚群中整合的前病毒与释放出的活病毒进行了深度测序。

当VOA实验进行至第18天后，分别收集了各亚群细胞的VOA培养上清，提取病毒RNA并进行反转。对基因组中整合的HIV-1前病毒DNA序列与经过激活诱导后释放出的HIV-1的RNA反转所得的cDNA序列，分别进行了二代测序，并对结果进行了病毒嗜性的分析。

(1)基因组DNA的提取

使用Quick-DNA Microprep Kit(ZYMO research)试剂盒提取细胞基因组DNA，具体步骤如说明书操作。

(2)扩增病毒的V3区域

获得的DNA进行巢式PCR，使用特异性引物SEQ ID NO：1Env-F(GAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAG)及SEQ ID NO：2Env-R(GTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTACCTGAGGTC)扩增HIV-1的包膜区，以其产物作为巢式PCR第二轮的模板，以引物SEQ ID NO：3V3F(CTCTCTATTGGCAGTCTAGCAGAAGAAG)及SEQ ID NO：4V3R(TATCCTCTCTGGGTCCCCTCCTGAGG)为第二轮巢式PCR的引物，对V3区域序列进行扩增，最终产物的长度约为323bp。为了尽可能减小PCR带来的差异，对同一样本进行了3次独立的巢式-PCR，并将产物混合。为了进一步排除PCR或模板用量多少带来的差异，对同一样本进行了2次独立的基因组DNA及病毒RNA提取，cDNA合成及巢式-PCR，并将产物分别进行二代测序。

(3)二代测序及HIV共受体嗜性的预测

使用TrueLib DNA Library Rapid Prep Kit for Illumina试剂盒对上一步获得的病毒的V3区域进行样本建库，使用Qubit2.0进行文库定量后，使用Illumina Hiseq2500平台PE250的方法进行测序。考虑到时间可行性及数据库的普及性，HIV的共受体嗜性检测一般通过基因型分析完成。将二代测序得到的结果录入www.genafor.org中Geno2pheno[coreceptor]或Geno2pheno进行分析。这是一个基于基因型对HIV共受体嗜性进行预测的生物信息学软件，该算法对每个HIV血症样本都进行了随访。我们选用了10％作为检测X4嗜性病毒假阳性率(false positive rate，FPR)的截止值。

2、实验结果

结果显示，对二代测序的结果进行病毒嗜性的分析后，相较于mCD4亚群，pTFH亚群中无论是整合的前病毒DNA，还是释放的HIV-1都具有更高比例的X4型病毒，接受过cART治疗的HIV-1患者中，X4嗜性HIV-1会具有倾向性地在pTFH中富集，且经过诱导后相较于其他CD4⁺T细胞亚群，pTFH能够释放出更多的X4嗜性HIV-1，是X4嗜性HIV-1最主要的储藏库。(图6C和图6D)。

实施例6 X4型HIV-1病毒与免疫重建的关系

为了验证pTFH中X4型HIV-1是否与患者免疫重建的情况有相关关系，收集了患者在治疗期间的临床信息。为了保证患者是经过药物治疗后，处于稳定的HIV-1潜伏期，收录的样本在取样点前均已维持血浆中无法检测到病毒RNA拷贝至少6个月，在取样点及取样点后1年内，每个3个月进行检测(取样点)，均无法检测到血浆中存在病毒RNA。收录了患者自取样点开始每3个月至1年的CD4⁺T细胞数量，在此期间病人持续接受ART治疗。同时也收录了患者是否具有合并感染的信息。

一、X4型HIV-1病毒与CD4⁺T细胞数量的关系

1、实验方法

为了验证X4型HIV-1病毒是否与CD4⁺T细胞数量具有关系，分别将患者来源的pTFH或mCD4中整合的X4型HIV-1比例与取样点的CD4⁺T细胞数量进行了相关性分析。

2、实验结果

结果显示，pTFH中整合的X4型HIV-1所占比例与CD4⁺T细胞数量呈显著负相关关系(图7A)。

二、X4型HIV-1病毒与免疫重建能力及AIDS病程进展的关系

1、实验方法

为了进一步验证pTFH亚群中整合的X4型HIV-1是否与患者的免疫重建能力及AIDS病程进展相关，将患者划分为X4型病毒阳性组及X4型病毒阴性组两组，并比较两组患者在收样检测点(第0月)前后30个月内CD4⁺T细胞数量的变化规律；以及在接受cART治疗1年内，同一患者体内CD4⁺T细胞数量相对于上一检测点的变化值，

2、实验结果

结果显示，在X4型病毒阴性组，CD4⁺T细胞数量及增值显著高于X4型病毒阳性组(图7B)。图6B中黑色折线为X4型病毒阴性组患者CD4⁺T细胞数量，红色折线为X4型病毒阳性组CD4⁺T细胞数量，而对应颜色的直线则分别为两组患者组内样本CD4⁺T细胞数量均值拟合的线性回归线，X4型病毒阴性组的斜率远大于X4型病毒阳性组(图7B)，这说明X4型病毒阴性组患者的CD4数目及增值能力都远高于X4型病毒阳性组患者。

结果显示，X4型病毒阴性组的CD4⁺T细胞数量恢复速度显著高于X4型病毒阳性组(图7C)。此外，在X4病毒阴性组10人中仅有1人在接受ART治疗的1年期间均无共患病情况。而X4病毒阳性组的21位患者中则有9位患有不同程度的共患病，如肺结核与肺炎(图7D)这一现象提示我们，pTFH亚群细胞中整合的X4型HIV-1比例可能能够成为一个比CD4数更灵敏更具前瞻性的临床指标，预测HIV-1感染患者的免疫重建潜力与AIDS病程的进展。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种新型生物标记物在预测HIV-1感染患者病程发展中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaagagcag aagacagtgg caatgagag 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaagtcatt ggtcttaaag gtacctgagg tc 32

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctctattg gcagtctagc agaagaag 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatcctctct gggtcccctc ctgagg 26

Claims

1.引物和抗体的组合物在制备检测外周血TFH前病毒储藏库中X4嗜性HIV病毒占前病毒储藏库病毒比例的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1～4所示；所述抗体为CD3抗体、CD4抗体和CXCR5抗体，用于分选CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺的pTFH细胞。

2.引物和抗体的组合物在制备评价对HIV病毒感染的治疗效果的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1～4所示；所述抗体为CD3抗体、CD4抗体和CXCR5抗体，用于分选CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺的pTFH细胞。

3.引物和抗体的组合物在制备检测HIV-1感染患者的AIDS病程的进展的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1～4所示；所述抗体为CD3抗体、CD4抗体和CXCR5抗体，用于分选CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺的pTFH细胞。