CN101144083A - 播娘蒿DsCBF基因及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种播娘蒿新的DsCBF基因，DsCBF基因的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列以及制备这种DsCBF基因的方法；还提供了一种用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒pBIcbf，和重组质粒的构建方法；本发明还公开了该DsCBF基因在改善植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。本发明亦有利于对其它抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

Description

播娘蒿DsCBF基因及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种播娘蒿DsCBF抗寒基因及其制备方法；以及用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒及其在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。

背景技术

低温是地球上植物产量和地域分布的主要限制因素之一，全球每年因为低温造成的农作物损失达到上千亿美元，这已经是世界范围内普遍存在和关注的问题。

为了提高经济植物的抗寒性，扩大其耕种面积，提高经济植物在胁迫环境下的生存能力和产量，人们对植物抗寒机制进行了大量的研究。CBF基因又称DREB1转录因子，其本身是作为植物响应寒冷胁迫的总开关存在的。植物体受到冷刺激时，CBF基因大量表达，从而调控其下属的多种冷响应蛋白表达，产生一系列的保护作用，以减少寒冷对植物的损伤。

传统的植物改良如杂交、诱变等方法费时、费力、没有针对性，克隆抗寒相关基因并利用转基因技术，通过基因工程培育高效抗胁迫品种将成为一条重要的途径。转基因表达CBF基因不仅可以使植物抗寒性提高，而且还能增强植物对盐碱等胁迫的抗性。

十字花科植物播娘蒿(Descurainia sophia)分布范围广泛，适应性极强，其天然蕴藏量较为丰富，且极其耐寒，可以耐受冬天-40℃的低温，在春天低于0℃的条件下亦能抽苔开花。此外对盐碱也有较大的耐受能力，对土壤水份的需求量也不高。播娘蒿种子具有极强的种子繁殖能力以及良好的发芽能力，在4℃温度下，其种子发芽率仍可达70％以上。经各方面的调查研究结果均表明，播娘蒿具有极强的适应恶劣环境生长的能力。因此，研究播娘蒿的对恶劣环境适应的相关原理和分子机制，有利于对其它抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种播娘蒿新型DsCBF抗寒基因，以及该DsCBF抗寒基因的制备方法。

本发明的另一目的还提供一种用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，以及该DsCBF基因重组质粒的制备方法。

本发明的又一目的还提供制备的播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用；以及在抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

本发明的目的是由以下的技术方案来实现的。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因含有序列表SEQ ID NO：1中所述的核苷酸序列。此DsCBF抗寒基因由提取播娘蒿总RNA，对DsCBF基因进行全长克隆获得。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，所述的质粒含有上述所述的核苷酸序列。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因编码的蛋白，含有序列表SEQID NO：2中所述的氨基酸序列。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因的制备方法依次包含以下步骤：

(1)采用Trizol试剂(Gibco，NY，USA)提取播娘蒿总RNA；

(2)以总RNA为模板，进行RT-PCR(TaKaRa，Japan)扩增得到DsCBF基因的EST序列；

(3)采用RACE方法(ClonTech试剂盒，NY，USA)对DsCBF基因进行cDNA全长克隆获得。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒的制备方法，包含以下步骤：

(1)通过RT-PCR扩增得到播娘蒿DsCBF基因的开放阅读框；

(2)将上述播娘蒿DsCBF基因片段克隆至中间载体pMD18-T(TaKaRa，Japan)，然后进一步克隆至植物表达载体pBI121(ClonTech，NY，USA)；

(3)将带有播娘蒿DsCBF基因片段的表达载体pBIcbf转入根癌农杆菌中，通过农杆菌介导转染到模式植物的CBF缺陷型植株。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，亦能在抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明播娘蒿DsCBF抗寒基因通过转基因表达CBF基因，用于转化模式植物的CBF缺陷型植株，从而使植物具有抗寒性、抗旱性和抗盐碱性。

附图说明

图1是含有DsCBF基因的重组质粒I的一种结构示意图，表达载体为pBIcbf。

具体实施方式

实施例1 播娘蒿DsCBF抗寒基因的制备

1、播娘蒿DsCBF抗寒基因克隆

(1)播娘蒿的来源(Collection)，播娘蒿(Descurainia sophia)种子购自四川省成都市种子公司；

(2)总RNA的分离(RNA isolation)

采用Trizol试剂提取播娘蒿总RNA；

(3)播娘蒿DsCBF抗寒基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据已知的Arabidopsis thaliana的CBF1、CBF2、CBF3；Brassica napus的662 CBFprotein、663 CBF-like protein等蛋白的氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源基因克隆的原理，采用RACE方法进行cDNA全长克隆，分为三个阶段进行：

第一阶段，使用简并引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增：

以寡核苷酸：5’CAYCCNATHTAYMGNGGNGT 3’为正向引物；寡核苷酸：5’GCNGCYTTYTGDATNTCYTT 3’为反向引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃ 5min，随后94℃ 1min、55℃1min、72℃2min进行35个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得的目的片段，回收片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa，Japan)上，用M13作为通用引物，ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)测序，获得约443bp序列。将该序列及其编码蛋白质序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥的CBF基因有高达84％的相似性。

第二阶段，DsCBF基因的3’和5’RACE扩增：

根据序列分析设计出5’RACE引物和3’RACE引物，如下：

5’RACE引物：5’GACGGCGGTGGCAATAGCATA 3’；

5’CGAAGCCGCCAAGCCGAATCAGC 3’：

使用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(ClonTech，NY，USA)；

3’RACE引物：5’GTTTCGTGAGACTCGTCATCCTATTTAC 3’；

使用RACE试剂盒按照操作手册进行，得到DsCBF基因的5’和3’端序列。

第三阶段，PCR扩增获得DsCBF基因的编码区，其过程同第一阶段。

(4)扩增得到的三段序列拼接得到全长序列，包括完整的开放阅读框，在此基础上，进一步设计正向引物和反向引物：

正向引物为：5’GCGGATCCATGAACTCATTCTCTGCTTTCGC 3’；

反向引物为：5’CGAGCTCTTAATAACTCCATAGCGACACATCC 3’；

以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序。所获得的播娘蒿DsCBF抗寒基因的全长序列如序列表SEQ ID NO：1中所述的核苷酸序列。

DSCBF基因编码一个由214个氨基酸构成的酶，其序列如下：

1 MNSFSAFAEM FGSDYESPVS SGNDYCPMLA SSCPKKPAGR KKFRETRHPI

51 YRGVRRRNSG KWVCEVREPN KKSRIWLGTF LTAEMAARAH DVAAIALRGR

101 SACLNFADSA WRLRIPESTC AKDIQKAASE AAIAFQDEMS ESTTDHGLDI

151 EETLVEAIVT AEQSDAFFMD EEAMFGMPRL LANTAEGMLL PPPS IQWNHN

201 HDGEGDEDVS LWSY

实施例2播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒的构建

根据播娘蒿DsCBF基因的全长序列，设计引物扩增其开放阅读框，在正向引物和反向引物上分别引入两个限制性酶切位点BamHI和SacI，以构建DsCBF基因表达载体；经PCR扩增后，将播娘蒿DsCBF基因克隆至中间载体pMD18-T，用限制性酶BamHI和SacI消化pMD18-T，回收到DsCBF基因；用BamHI和SacI消化植物表达载体pBI121，回收pBI121片段；将DsCBF基因插入到pBI121的BamHI和SacI之间，构成DsCBF基因表达载体pBIcbf；再将其转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(Pirece，USA)中，最后用于转化模式植物的CBF缺陷型植株。

实施例3  表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒在拟南芥中的应用

利用花序转染法转化拟南芥，按下列步骤转化：

(1)种植拟南芥至花期，土壤表面用纱布或棉布覆盖；

(2)去掉顶生花序，以促进次生花序生长，在去顶生花序4-6d内植物将快速生长；

(3)在28℃培养农杆菌至对数生长期；

(4)4000rpm离心，用新鲜的5％蔗糖溶液重悬菌体至OD₆₀₀＝0.8；每2-3小盆(小盆直径9cm)需用400ml-500ml农杆菌液浸染；

(5)浸染前，加入表面活性剂Silwet L-77(500ul/L)混合均匀，如果Silwet L-77毒性过大，则降低浓度至0.02％或0.005％；

(6)将植株的上半部分浸入农杆菌菌液中2-3s，轻轻搅动，直至植株表面覆盖有一层液体；

(7)将浸染过的植株放在圆罩内或覆盖16-24h以保持湿度，避免阳光曝晒，保证正常温度；

(8)然后处于正常条件下培养，直至种子成熟时停止浇水；

(9)收获干燥的种子，每个植株的种子单独保存。

实施例4获得转基因阳性植株

(1)将转基因植物第一代种子(T₀)，将其置于有抗生素卡那(Kan⁺)的种子培养基上，在22℃下培养，发芽并生长至具有4片真叶的幼苗的种子，即为初步鉴定为带有重组质粒的载体；

(2)将第一步的阳性幼苗从种子培养基中移栽到MS培养基中生长，一个月后取其叶片；

(3)提取叶片的总RNA，反转录后用荧光定量PCR检测不同植株的DsCBF基因和DsCOR基因的表达状况，两者表达的植株即都为转基因阳性拟南芥；

(4)收获T₀代的阳性苗的种子，继续上述的鉴定，得到的T₃代的阳性苗为稳定表达DsCBF的转基因植株。

实施例5转基因阳性植株的抗性研究

(1)用荧光定量PCR检测不同株系阳性苗的DsCBF基因表达量；

(2)将10d大的阳性苗植株置于不同的低温梯度下培养4h然后回复室温培育，检测其存活率，温度梯度为-4，-5，-6，-7，-8，-9，-10℃；

(3)同时检测分离到的不同株系的阳性苗的极限生存温度；

(4)将10d大的阳性苗置于不同梯度的盐浓度的MS培养基上，培养4d，再置于不含盐的培养基上培养7d，观察不同株系植株的生长状况；

(5)将10d大的阳性苗干旱处理不同时间后，再回复最初的培养条件，察看不同株系植株的生长状况；

(6)测定叶片SOD酶活性、叶片脯氨酸含量、叶片电导率等能够反映植株抗寒性的生理指标的生理实验，通过这些生理指标说明转基因植株与野生型相比，其抗寒性有明显的提高。

a)上述植物叶片SOD酶活性测定：

采用比色法，在本试验中SOD活性以抑制50％的NBT光还原为一个酶活性单位(U)表示，

按下式计算SOD活性.

SOD总活性＝(AC-A)V/0.5×AC×W×VT

式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克(U/g)表示，AC为光照对照管的吸光度，A为样品管的吸光度，V为样品液总体积，单位mL，W为样品的鲜重，单位g，VT为测定时样品用量，单位mL。

b)上述叶片脯氨酸含量测定：

采用酸性茚三酮法。

c)上述叶片电导率测定：

取长势一致、部位相同的叶片用去离子水冲洗干净，将水分吸干，将0.4cm²的叶片小圆片按每组5片放于15mL具塞刻度试管中，分别放置于0，-2，-3，-4，-5，-6，-7℃中，用Thermometer Kit监测，保证温度±0.2℃的误差。低温处理30min后取出，放置4℃冰箱30min后，再向每管中加入10mL去离子水，以250rpm的速度在摇床上振荡30min。用DDS211A型电导常数0.98的电导率仪测定电导率之后，煮沸10min，补充去离子水至10mL，在250rpm下振荡30min，再次测定其电导率，计算各不同温度下相对电导率；

(7)对转基因植株和野生型植株进行温度梯度冷驯化以及恢复试验，测定植株能耐受的最低温度，观察转基因植株的最低耐受温度。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>播娘蒿DsCBF基因及其制备方法与应用

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>642

<212>DNA

<213>播娘蒿种(Descurainia sophia)

<400>1

atgaactcat tctctgcttt cgctgagatg tttggttctg attacgagtc tccggtttcc    60

tcaggcaacg attattgtcc gatgctagca tcaagctgtc ccaagaaacc agcgggtcgt    120

aagaagtttc gtgaaactcg tcacccaatt tacagaggag ttcgtcggag aaactccggt    180

aagtgggtgt gtgaggttag agagccaaac aagaaatcta ggatttggct cggaactttt    240

ctaactgctg agatggcagc tcgtgctcac gacgttgccg ccatagccct gcgtggccga    300

tccgcctgcc ttaattttgc tgattcggct tggcggcttc gaatcccaga gtcaacatgc    360

gctaaagata tccaaaaagc ggcgtctgaa gccgcgatag cttttcagga tgaaatgagt    420

gaatcaacta cagatcatgg cctagacata gaggaaacgt tggtggaagc tattgtaacg    480

gcggaacaaa gtgatgcatt ttttatggac gaagaggcga tgtttgggat gccgagatta    540

ctagctaata cggccgaagg tatgctattg ccaccgccgt ccattcaatg gaatcacaat    600

catgacggcg agggagatga ggatgtgtcg ctatggagtt at                       642

<210>2

<211>214

<212>PRT

<213>播娘蒿种(Descurainia sophia)

<400>2

Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ala Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr

1                5                   10                  15

Glu Ser Pro Val Ser Ser Gly Asn Asp Tyr Cys Pro Met Leu Ala

                20                   25                  30

Ser Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu

                35                   40                  45

Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly

                50                  55                  60

Lys Trp Val Cys Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile

                65                   70                  75

Trp Leu Gly Thr Phe Leu Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His

                80                   85                  90

Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn

                95                  100                  105

Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys

                110                  115                 120

Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ser Glu Ala Ala Ile Ala Phe

                125                 130                 135

Gln Asp Glu Met Ser Glu Ser Thr Thr Asp His Gly Leu AspIle

                140                 145                 150

Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Val Thr Ala Glu Gln Ser Asp

                155                 160                 165

Ala Phe Phe Met Asp Glu Glu Ala Met Phe Gly Met Pro Arg Leu

                170                 175                  180

Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Ser Ile

                185                 190                 195

Gln Trp Asn His Asn His Asp Gly Glu Gly Asp Glu Asp Val Ser

                200                 205                 210

Leu Trp Ser Tyr

Claims (7)

1.一种播娘蒿DsCBF基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种播娘蒿DsCBF的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种权利要求1所述的播娘蒿DsCBF基因的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)提取播娘蒿总RNA；

(2)以总RNA为模板，用简并引物5’CAYCCNATHTAYMGNGGNGT 3’，5’GCNGCYTTYTGDATNTCYTT 3’进行RT-PCR扩增得到DsCBF基因的EST序列；

(3)进行RACE扩增得到DsCBF基因的cDNA全长。

5.一种权利要求2所述的用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)通过RT-PCR扩增得到播娘蒿DsCBF基因的开放阅读框；

(2)将上述播娘蒿DsCBF基因片段克隆至中间载体pMD18-T，然后进一步克隆到植物表达载体pBI121；

(3)将带有播娘蒿DsCBF基因片段的表达载体pBIcbf转入根癌农杆菌中，通过农杆菌介导转染到模式植物的CBF缺陷型植株。

6.一种权利要求2所述的用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒，其特征在于，在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。

7.一种权利要求2所述的用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒，其特征在于，在抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

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