CN114018919A - 一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，包括如下步骤：(1)成熟花蕾，取花药，卡诺氏固定液固定后，取花粉；(2)在质量浓度40～50％醋酸溶液中加入洋红，煮沸1.5～2.5h，煮沸期间定时加入水维持溶液体积，煮沸冷却后，加入纳米铁络合物，搅拌，过滤，得醋酸洋红络合染色液；(3)将花粉进行浸染处理，采用醋酸洋红络合染色液染色后镜检。本发明通过改进醋酸洋红染色液的配制方法和花粉检测的处理方法，可有效避免醋酸洋红染色液用于二倍体香蕉花粉活力的染色困难等问题，使染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果，减少醋酸洋红染色的检测误差，操作简单，适用于野外取材和大量样品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及花粉活力检测技术领域，特别涉及一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法。
背景技术
大部分的栽培蕉都起源于两个种：尖叶蕉(Musa.acuminate,AA)和长梗蕉(Musa.balisiana,BB)。由于染色体结构变异等因素导致尖叶蕉在种内形成生殖隔离，从而形成不同亚种。不同的尖叶蕉亚种间杂交产生了具有品种特征的遗传和结构杂合性，杂交种融合了不育基因和单性结实基因，从而产生出食用二倍体栽培香蕉(AA)。通过现有的文献报道来看，不少香蕉野生种和栽培种都有一定的结实率，花粉还有一定的育性。目前已经有一些香蕉杂交育种方面的报道，而花粉活力鉴定和花粉保存方法是保证成功杂交的重要因素，但目前关于香蕉花粉活力鉴定还比较少。检测花粉活力的方法通常有染色法和离体萌发法，染色法检测虽然迅速便捷，但不同的染色方法结果有较大的偏差，因此有必要对香蕉花粉活力检测比较准确的方法进行筛选。离体萌发法检测花粉活力比较准确，但操作比较繁琐且成本高。
早期的香蕉细胞遗传学研究发现，醋酸洋红的染色方法并不适用于香蕉，而本发明采用特定的改进方法，可有效避免醋酸洋红染色困难等问题，使染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果；相比碘化钾和亚历山大染色法，醋酸洋红染色法在成本和使用难易程度上更具有优势，非常适合于野外取材，并减小检测的误差。但目前系统研究香蕉花粉离体萌发的研究资料很少，本研究将对香蕉花粉离体萌发的条件进行细致的探索，并以此为依据，对改进的香蕉花粉染色法进行验证，达到筛选适用于香蕉花粉活力检测的方法。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，减少传统采用醋酸洋红染色法检测二倍体香蕉花粉活力的偏差值，并提高染色结果的准确度，使改进后的醋酸洋红染色液染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，包括以下步骤：
(1)收集花粉：采集成熟花蕾，取花药，经卡诺氏固定液固定8～16h，取花粉；
(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比为(90～110)mL：(0.5～1.5)g，在质量浓度40～50％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸1.5～2.5h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.2～0.4，加入纳米铁络合物，以500～600r/min速率搅拌20～30min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；纳米铁形成的铁盐络合物，带有的电荷基团和极性分子，充分搅拌可使其络合效应更好地提高染色液助色基团的极性，但络合物过量则影响反应粒子和溶剂分子的反应速率和反应活性，易使溶液生成沉淀而破坏络合物的稳定性；
(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，浸染处理后，置于载玻片上，滴加1～3滴醋酸洋红络合染色液，染色5-10min后镜检；
进一步说明，卡诺氏固定液为由体积比为3：1～2的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成。
进一步说明，浸染处理为先采用乙酸-乙酸钠缓冲液浸染花粉后，取出花粉，再采用氯化铁溶液浸染花粉；先采用乙酸-乙酸钠缓冲液浸染，可稳定细胞的组织形态，且可进行部分的弱电离，与氯化铁协同增效，可增强正电荷基团，有助于提高染色液的助色基团的极性，并减少细胞内含物质对染色结果的影响；但若先加入强电解质则会抑制电离，不能实现充分的浸染；
进一步说明，浸染处理为：在花粉中加入pH值4.8～5.4、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，25～28℃浸染5～8min后，取出花粉，加入质量浓度20～30％氯化铁溶液，再次浸染5～8min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上。
进一步说明，花粉、乙酸-乙酸钠缓冲液和氯化铁溶液的用量比为(5～8)g：(30～40)mL：(30～40)mL。
进一步说明，纳米铁络合物为由按用量比为(100～120)mL：(2～3)g，在乙胺溶液中加入纳米铁，800～1000W超声4～6h而得。
进一步说明，乙胺溶液的质量浓度为15～18％。
进一步说明，纳米铁络合物为由按用量比为110mL：2.5g，在乙胺溶液中加入纳米铁，900W超声5h而得。
进一步说明，步骤(2)中，混合溶液和纳米铁络合物的体积比为1：0.3。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明科学配制醋酸洋红染色液，用于染色二倍体野生蕉的花粉，其染色的花粉活力结果与花粉离体萌发培养的结果接近，可减少染色结果的偏差，适用于二倍体野生蕉花粉的活力检测，尤其适用于野外取材和样品的检测。
此外，花粉经浸染处理，缓冲液可起到稳定细胞组织和稳定溶液的作用，可使氯化铁溶液充分地浸染花粉，减少细胞内含物质对染色的影响；纳米铁络合物与浸染处理相互协同，有助于增强染色液助色基团的极性，促进助色基团与花粉发生作用，可使染色液快速地作用花粉，提高花粉活力的染色效率；纳米铁盐的络合物还可稳定染色液，有助于染色液的固定，缩短染色时间，进而使染色的检测误差降低。
附图说明
图1为本发明实施例3、对比例1和对比例2的三种二倍体香蕉花粉的染色结果，注：A-C为小果野蕉，D-F为海南野生蕉，G-I为长梗蕉；A、D和G为本发明实施例3的染色结果，B、E和H为对比例1的染色结果，C、F和I为对比例2的染色结果；Bar＝5μm。
图2为本发明采用不同蔗糖浓度、硼酸浓度和萌发温度下小果野蕉成熟花粉萌发率的结果，注：A为不同蔗糖浓度对小果野蕉花粉萌发的影响，B为不同硼酸浓度对小果野蕉花粉萌发的影响，C为不同温度对小果野蕉花粉萌发的影响，D小果野蕉花粉萌发的显微观察，箭头所指为萌发孔。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小果野蕉(Musa.acuminate,AA)，取材位置为中国热带农业科学院椰子研究所文昌实验基地；海南野生蕉(Musa.itinerans,AB)，取材位置为海南省五指山市百花岭；长梗蕉(Musa.balisiana,BB)，取材位置为中国热带农业科学院热作两院儋州组培厂。
实施例1-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
(1)收集花粉：在生长健壮的植株上剪取发育良好且成熟的花蕾，冰盒保存带回实验室，取花药，经过卡诺固定液固定8h，用解剖针和毛笔将开裂花药中的花粉剥离并刷下，收集花粉；其中，卡诺氏固定液为由体积比为3：2的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成；
(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比为90mL：0.5g，在质量浓度40％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸1.5h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.2，加入纳米铁络合物，以500r/min速率搅拌20min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；其中，纳米铁络合物为由按用量比为100mL：2g，在质量浓度为15％乙胺溶液中加入纳米铁，800W超声4h而得；
(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，进行浸染处理，浸染处理为：按用量比为5g：30mL：30mL，在花粉中加入pH值4.8、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，25℃浸染8min后，取出花粉，加入质量浓度20％氯化铁溶液，再次浸染8min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上，滴加1滴醋酸洋红络合染色液，染色5min后镜检。
实施例2-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
(1)收集花粉：在生长健壮的植株上剪取发育良好且成熟的花蕾，冰盒保存带回实验室，取花药，经过卡诺固定液固定16h，用解剖针和毛笔将开裂花药中的花粉剥离并刷下，收集花粉；其中，卡诺氏固定液为由体积比为3：1.5的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成；
(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比为110mL：1.5g，在质量浓度50％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸2.5h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.4，加入纳米铁络合物，以600r/min速率搅拌30min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；其中，纳米铁络合物为由按用量比为120mL：3g，在质量浓度为18％乙胺溶液中加入纳米铁，1000W超声6h而得；
(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，进行浸染处理，浸染处理为：按用量比为8g：40mL：40mL，在花粉中加入pH值5.4、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，28℃浸染5min后，取出花粉，加入质量浓度30％氯化铁溶液，再次浸染5min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上，滴加3滴醋酸洋红络合染色液，染色10min后镜检。
实施例3-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
(1)收集花粉：在生长健壮的植株上剪取发育良好且成熟的花蕾，冰盒保存带回实验室，取花药，经过卡诺固定液固定14h，用解剖针和毛笔将开裂花药中的花粉剥离并刷下，收集花粉；其中，卡诺氏固定液为由体积比为3：1的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成；
(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比例为100mL：1.0g，在质量浓度45％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸2.0h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.3，加入纳米铁络合物，以550r/min速率搅拌25min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；其中，纳米铁络合物为由按用量比为110mL：2.5g，在质量浓度为16％乙胺溶液中加入纳米铁，900W超声5h而得；
(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，进行浸染处理，浸染处理为：按用量比为6g：35mL：35mL，在花粉中加入pH值5.0、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，26℃浸染7min后，取出花粉，加入质量浓度25％氯化铁溶液，再次浸染7min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上，滴加2滴醋酸洋红络合染色液，染色5min后镜检。
实施例4-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本实施例4与实施例3的区别在于，花粉浸染处理的方法不同，即，浸染处理为：按用量比为6g：35mL：35mL，在花粉中加入质量浓度25％氯化铁溶液，浸染7min，取出花粉，加入pH值5.0、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，26℃浸染7min后，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上，滴加2滴醋酸洋红络合染色液，染色5min后镜检。
实施例5-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本实施例5与实施例3的区别在于，花粉浸染处理的用量不同，即，浸染处理为：按用量比为6g：55mL：75mL，在花粉中加入pH值5.0、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，26℃浸染7min后，取出花粉，加入质量浓度25％氯化铁溶液，再次浸染7min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上，滴加2滴醋酸洋红络合染色液，染色5min后镜检。
实施例6-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本实施例6与实施例3的区别在于，纳米铁络合物的制备方法不同，即，纳米铁络合物为由按用量比为210mL：2.5g，在质量浓度为35％乙胺溶液中加入纳米铁，900W超声5h而得。
对比例1-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本对比例1与实施例3的区别在于，采用碘-碘化钾染色液替换醋酸洋红络合染色液，即：碘-碘化钾染色液的配制方法为：将1.3g碘化钾溶解于80mL水中，加入0.3g碘结晶，用水定容至100mL而得；其中，染色为紫黑色计为活性花粉，染色为橙色或黄色以及不能染色计为无活力花粉；其余步骤同实施例3。
对比例2-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本对比例2与实施例3的区别在于，采用亚历山大红染色液替换醋酸洋红络合染色液，以及收集花粉步骤不同，具体步骤：亚历山大染色液的配方为：1％酸性品红500μL、1％孔雀石绿500μL、甘油5ml、苯酚500μL、1％橙黄500μL、冰醋酸500μL、双蒸水5ml和水合氯醛0.5g；其中，染色为紫红色计为有活力花粉，染色为紫黑色计为无活力。
步骤(1)收集花粉：采集成熟花蕾，取花药，将花药加入盛有亚历山大红染色液的1.5mL离心管中，37℃烘箱染色30min后，挤出花粉粒，得花粉；后续步骤同实施例3。
对比例3-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本对比例3与实施例3的区别在于，采用亚历山大红染色液替换醋酸洋红络合染色液，具体步骤：亚历山大染色液的配方同对比例2；其中，染色为紫红色计为有活力花粉，染色为紫黑色计为无活力；其余步骤同实施例3。
对比例4-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本对比例4与实施例3的区别在于，花粉未经浸染处理，即：取花粉置于载玻片上，滴加2滴醋酸洋红络合染色液，染色5min后镜检；其余步骤同实施例3。
对比例5-一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法
本对比例5与实施例3的区别在于，醋酸洋红络合染色液的配制方法不同，即：按用量比例为100mL：1.0g，在质量浓度45％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸2.0h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.8，加入纳米铁络合物，以550r/min速率搅拌25min，过滤，得醋酸洋红络合染色液。
实施例7-花粉离体萌发培养
以小果野蕉成熟花粉为研究对象，将剥离的花粉加入培养液培养，以BK培养基为基础培养基，蔗糖设置5％、10％、15％、20％四个浓度梯度，硼酸设置0％、0.005％、0.01％、0.015％四个浓度梯度，在28℃下萌发10h，每个条件下，统计花粉粒数目不少于300个，探索花粉萌发的最佳条件；由于海南栽培香蕉分为冬蕉和夏蕉，花期可能遇到高温和低温两种情况，在BK培养基上，蔗糖浓度为15％，硼酸浓度为0.005％的条件下，设置8℃、18℃、28℃、38℃的萌发温度，研究不同温度对小果野蕉花粉萌发的影响，每个温度重复三次，每次统计花粉粒数目不少于300个，验证染色结果，结果如图2所示：
通过图2-A可知，在蔗糖浓度为15％时，花粉萌发效率最高，达56.26±5.33％，过高或过低蔗糖水平会抑制花粉萌发；
通过图2-B可知硼酸浓度为0.005％时，萌发效果最好，随着硼酸浓度增高，花粉萌发水平没有明显变化，说明硼酸对小果野蕉花粉萌发有一定的促进作用，但随着浓度升高到一定水平，促进作用不明显；
通过图2-C可知，28℃下，小果野蕉花粉萌发效率最高，过高和过低的温度均会抑制香蕉花粉的萌发，低温对花粉萌发的影响大于高温，且低温条件下花粉管延伸缓慢。
综上，小果野蕉花粉萌发的最佳条件为蔗糖浓度15％，硼酸浓度0.005％，28℃培养10h，达到59.03％的萌发率。
试验例
实施例1～6和对比例1～5的每个香蕉品种染色统计不少于500个花粉粒，结果如表1：
由上表1可知，实施例1～3小果野蕉、海南野生蕉和长梗蕉的染色率范围分别为73.22～75.02％、67.22～68.08％和68.38～69.62％，离体萌发率分别为59.03％、56.67％和57.99％，实施例1～3的染色结果相较于接近花粉离体萌发率，表明本发明采用科学配制醋酸洋红染色液，并结合花粉的浸染处理，染色结果稳定，有利于减少染色法的检测误差，可有效避免醋酸洋红染色困难等问题。
对比例1采用碘-碘化钾染色法，三种花粉的染色率均较高，达到94.86％；对比例2和对比例3采用亚历山大红染色法，染色结果与本发明实施例1～3较接近；对比例4花粉未经浸染处理，染色率有所提高；对比例5的染色率提高较多。
通过与花粉离体萌发率的结果对比，表明改进后的醋酸洋红染色法和亚历山大红染色法均适合于做二倍体野生香蕉花粉活力的检测，但改进后的醋酸洋红染色法更接近花粉离体萌发率。因此，改进后的醋酸洋红染色法更适合于二倍体野生蕉花粉活力的检测。
综上所述，本发明科学配制醋酸洋红络合染色液，并采用特定的检测方法，可有效避免传统采用醋酸洋红染色困难等问题，使染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果；相比碘化钾和亚历山大染色法，改进后的醋酸洋红染色法在成本和使用难易程度上更具有优势，非常适合于野外取材，并减小检测的误差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集花粉：采集成熟花蕾，取花药，经卡诺氏固定液固定后，取花粉；
(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比为(90～110)mL：(0.5～1.5)g，在质量浓度40～50％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸1.5～2.5h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.2～0.4，加入纳米铁络合物，以500～600r/min速率搅拌20～30min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；
(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，浸染处理后，置于载玻片上，滴加1～3滴醋酸洋红络合染色液，染色5-10min后镜检。
2.根据权利要求1的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卡诺氏固定液为由体积比为3：1～2的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成；所述经卡诺氏固定液固定的时间为8～16h。
3.根据权利要求1的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述浸染处理为先采用乙酸-乙酸钠缓冲液浸染花粉后，取出花粉，再采用氯化铁溶液浸染花粉。
4.根据权利要求3的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，所述浸染处理为：在花粉中加入pH值4.8～5.4、0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，25～28℃浸染5～8min后，取出花粉，加入质量浓度20～30％氯化铁溶液，再次浸染5～8min，取出花粉，吸干水分后置于载玻片上。
5.根据权利要求3的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，花粉、乙酸-乙酸钠缓冲液和氯化铁溶液的用量比为(5～8)g：(30～40)mL：(30～40)mL。
6.根据权利要求1的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，纳米铁络合物为由按用量比为(100～120)mL：(2～3)g，在乙胺溶液中加入纳米铁，800～1000W超声4～6h而得。
7.根据权利要求6的一种二倍体香蕉花粉离体培养的方法，其特征在于，所述乙胺溶液的质量浓度为15～18％。
8.根据权利要求6的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，纳米铁络合物为由按用量比为110mL：2.5g，在乙胺溶液中加入纳米铁，900W超声5h而得。
9.根据权利要求1的一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，混合溶液和纳米铁络合物的体积比为1：0.3。
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