CN105087636A - 基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，首先进行农杆菌菌液培养，再选取不同成熟期的果实进行农杆菌注射，分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，进行gus组织染色检测，最后检测gus基因表达量。本发明方法能够使基因在番茄果实中短时间内得到表达，比传统的转基因方法更快速，更便捷；因为本方法采用的是活体注射的方法，以往常规方法均不能够从根本上改变基因的表达量，也不能够在果实的生长发育过程中通过对某些基因的干扰或者超标达观察果实发育状况，本发明方法不仅仅简化了操作过程，而且能够通过对果实发育中一些基因表达量的改变来观察到番茄果实成熟发育中的变化，能够更加清楚的了解番茄果实成熟发育收那些基因的控制。

Description

基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种番茄果实基因转化方法。

背景技术

番茄(Fragaria×ananassa)是一种经济价值较高的作物，在全世界广泛种植，在我国也是一种常见的蔬菜，是人们生活不可缺少的。近年来随着番茄基因工程的发展，对番茄的一些基因功能研究逐渐成为热点，而基因的功能验证的一个重要途径就是通过转基因操作来进行。番茄转基因研究在园艺作物中开展较早，早在60年代就已经成功获得了番茄转基因的植株。而采用常规叶盘转化法进行转基因来研究基因的功能就需得到转基因植株，并在其开花结果后才能观察分析，而番茄转基因试验周期长，一般从开始转基因到获得转基因植株，到植株开花结果需要1年的时间，费时费力，对于研究一些功能尚未明确的基因来说时间周期过长，所需人力也很大。此外稳定基因转化也不适于研究一个家族大批量的基因功能，一般研究的基因数量比较小，因此需要寻求一种新的，快速的方法来研究与果实的形成发育以及成熟生理代谢等相关的重要基因的功能。

目前比较快速的方法多采用果实涂抹法来研究果实生理代谢，但是果实涂抹不能从根本上改变或者影响果实基因表达，近年来在许多作物上采用的果实注射法是一种新方法，该方法相对稳定的基因转化操作简便，周期短。一般注射后一周左右便可以可直接观察转化后果实的形态以及生理等方面的变化，也可以对果实进行分子生物学相关的检测研究来确定基因功能，从而研究导入基因的功能与作用。最初的果实注射法以注射某些药物来观察果实的生长发育状况，但是这些注射法多采用的是离体果实注射，这样就不能完全反应果实的生长以及发育过程的变化状况。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，注射时期按照番茄发育的不同时期进行细分，将农杆菌注射方法应用于番茄果实基因表达的研究方面，建立高效、快速、稳定的番茄果实注射方法体系。

技术方案：本发明所述的一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，包括以下步骤：

(1)农杆菌菌液培养

将农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线后挑取单菌落在YEB液体培养基中摇菌培养，YEB液体培养基中添加卡那霉素25～50mg/L和利福平50～100mg/L，用以避免杂菌污染，在28℃的条件下，180～200rmp振荡培养约12～16小时至OD600为0.4～0.8，将50mL菌液在离心机中5000rmp离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定OD600在0.4，将重悬后的菌液放于0～4℃的冷藏环境下备用；

(2)农杆菌注射

选取不同成熟期的果实进行注射，注射农杆菌悬浮液至果实中，从果柄处注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共连续注射三天；

(3)gus组织染色检测

分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，用刀片切成1～2毫米的薄片，放入gus染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用70％酒精去除叶绿素后统计转化效率，转化效率以gus染色率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50％以上为准统计出具有gus基因瞬时表达的数量也就是gus染色率：

gus染色率＝(染色的果实数量/总注射果实数)×100％；

(4)gus基因表达量检测

为了进一步检测农杆菌菌液的转化效率，取注射后第五天果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

进一步，所述农杆菌菌液选用根癌农杆菌C58、AGL0和EHA105。

进一步，所述YEB液体培养基的配方中包括：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L。

进一步，步骤(2)将番茄果实按照不同的发育时期分为五个不同的时期，其中前两个时期为番茄果实绿果期，第一个时期为果实刚刚形成，果实直径大约3～5毫米，为小绿果；第二个时期为果实发育一段时间后果实直径大约5～8毫米，为大绿果；第三个时期为番茄果实开始从绿果向白果转化，果实变白，为白果期；第四个时期是番茄果实由白变黄，为黄果期，直至果实完全变为黄色；第五个时期为红果期，果实完全为红色。

有益效果：本发明建立了高效快速的农杆菌注射转化番茄果实细胞体系，提供一种新的番茄转基因方法，本方法能够使基因在番茄果实中短时间内得到表达，比传统的转基因方法更快速，更便捷；因为本方法采用的是活体注射的方法，而非以往常用的离体注射，或者是离体涂抹，以往常规方法均不能够从根本上改变基因的表达量，也不能够在果实的生长发育过程中通过对某些基因的干扰或者超标达观察果实发育状况，本发明方法不仅仅简化了操作过程，而且能够通过对果实发育中一些基因表达量的改变来观察到番茄果实成熟发育中的变化，能够更加清楚的了解番茄果实成熟发育收那些基因的控制。

说明书附图

图1为不同菌株和不同发育时期对转化效率影响的柱状对比图；

图2为不同菌液OD值对转化效率影响的柱状图；

图3为不同取样时间对转化效率影响的柱状图。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例：

本实施例的试验对象选用番茄品种‘Micro-Tom’的果实作为农杆菌注射的植物受体，种植于日光温室中。Micro-Tom是一种番茄突变体，它保留了普通番茄作为模式植物的基本特征，但植株矮小、生命周更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的巨大优势，能够在短时间内使目的基因在番茄果实中得到表达，并且研究分析相关的基因功能。试验过程中同样的试验至少重复5次以上，以保证试验的稳定性和可重复性。

本实施例选用的三种根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)为C58、AGL0和EHA105。这三种菌株都是番茄转基因中常用的农杆菌菌株，通过注射后相关基因的表达量可以确定在番茄果实的农杆菌注射中使用哪一个菌株效果最好，三个菌株中都携带包含gus基因的pBI121质粒。

具体试验方法包括以下步骤：

(1)将上述三种菌株的菌液分别在YEB固体培养基上划线后挑取单菌落在YEB液体培养基中摇菌培养，YEB液体培养基中添加卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L，具体的，YEB液体培养基的配方中含有酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L。在28℃的条件下，180～200rmp振荡培养约12～16小时至OD600约为0.4～0.8，将50mL菌液在离心机中5000rmp离心后倒去上清液，收集菌体沉淀。将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定OD600在0.4，将重悬后的三种菌液放于冰箱备用。

(2)每种菌液分别注射五个个不同时期的番茄果实，其中前两个时期为番茄果实绿果期，第一个时期为果实刚刚形成，果实直径大约3～5毫米，为小绿果；第二个时期为果实发育一段时间后果实直径大约5～8毫米，为大绿果；第三个时期为番茄果实开始从绿果向白果转化，果实变白，为白果期；第四个时期是番茄果实由白变黄，为黄果期，果实完全变为黄色；第五个时期为红果期，果实完全为红色。分析不同类型的菌株对转化效率的影响以及不同果实发育时期对转化效率的影响。

(3)根据第一步结果筛选出的菌株，以及果实发育时期分析菌液浓度对转化效率的影响，菌液浓度以OD600值表示，设定四个不同梯度，分别是0.2、0.4、0.6、0.8。

(4)注射农杆菌悬浮液至果实中，从果柄及果尖处注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共连续注射三天。分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，用刀片切成1～2毫米的薄片，放入gus染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用70％酒精去除叶绿素后统计转化效率，转化效率以gus染色率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50％以上为准统计出具有gus基因瞬时表达的数量也就是gus染色率：

gus染色率＝(染色的果实数量/总注射果实数)×100％；

(5)取注射后第五天果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

实施例结果分析：

1、不同菌株类型对番茄果实转化效率的影响

综合分析结果，三种不同的菌株类型对转化效率的影响比较大，而且对果实发育不同时期也有一定的影响。从图1中能够看出其中菌株AGL0无论与其他两个菌株相比，转化效率都是显著增高的，而且在果实发育每一个时期，转化效率都明显高于其他两个菌株，故农杆菌注射选用的最合适菌株为AGL0。而对于番茄果实发育时期而言，最合适的时期应该是在第三个时期，也就是白果期，此时注射，转化效率最高。

2、不同的菌液浓度对番茄果实转化效率的影响

菌液浓度对转化效率的影响是比较大的，菌液浓度在0.4～0.6时转化效率都比较高，从图2中能够看出，菌液浓度在这个范围，转化效率都能够达到80％以上，而菌液浓度过高，不仅转化效率虽然能够达到50％，但是相对在0.4～0.6时转化效率还会有大幅度下降，而且注射后会导致果实腐烂坏死，菌液浓度过低时转化效率也会非常低，只有20％左右因此注射时选用最佳菌液浓度是OD600＝0.4～0.6。

3、不同取样时间对转化效率的影响

注射后的不同取样时间对转化效率有一定影响，从试验结果来看，在注射以后第五天取样，转化效率能过达到85％以上，但是，实际上和取样三天以及七天的转化效率相比，虽然高于这两个时间，但是三天和七天时取样的转化效率也都达到75％以上，因此如果在试验中，可根据果实生长需要，以及自己的实验需求，在这三个时间段取样都是可以的。其中，五天时取样效果更好。

4、注射位置对转化效率的影响

分别从果柄和果尖处注射菌液，分析不同的注射位置不同对转化效率的影响。分别选取20个果实从果柄处注射，20个果实从果尖处注射，结果发现从果尖注射的20个果实中，有8个在发育过程由于注射伤害，会导致果实腐烂，而从果柄注射的果实都是完好的。因此选择从果柄处注射效果较好，因为从果尖注射多果实会有一定程度的伤害，从而会造成实验结果不准确，因此，注射位置选择果柄处。

Claims (4)

1.一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)农杆菌菌液培养

将农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线后挑取单菌落在YEB液体培养基中摇菌培养，YEB液体培养基中添加卡那霉素25～50mg/L和利福平50～100mg/L，在28℃的条件下，180～200rmp振荡培养约12～16小时至OD600为0.4～0.8，将50mL菌液在离心机中5000rmp离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定OD600在0.4，将重悬后的菌液放于0～4℃的冷藏环境下备用；

(2)农杆菌注射

选取不同成熟期的果实进行注射，注射农杆菌悬浮液至果实中，从果柄处注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共连续注射三天；

(3)gus组织染色检测

分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，用刀片切成1～2毫米的薄片，放入gus染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用70％酒精去除叶绿素后统计转化效率，转化效率以gus染色率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50％以上为准统计出具有gus基因瞬时表达的数量也就是gus染色率：

gus染色率＝(染色的果实数量/总注射果实数)×100％；

(4)gus基因表达量检测

取注射后第五天果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

2.根据权利要求1所述的基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：所述农杆菌菌液选用根癌农杆菌C58、AGL0和EHA105。

3.根据权利要求1所述的基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：所述YEB液体培养基的配方中包括：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L。

4.根据权利要求1所述的基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：步骤(2)将番茄果实按照不同的发育时期分为五个不同的时期，其中前两个时期为番茄果实绿果期，第一个时期为果实刚刚形成，果实直径大约3～5毫米，为小绿果；第二个时期为果实发育一段时间后果实直径大约5～8毫米，为大绿果；第三个时期为番茄果实开始从绿果向白果转化，果实变白，为白果期；第四个时期是番茄果实由白变黄，为黄果期，直至果实完全变为黄色；第五个时期为红果期，果实完全为红色。