CN102706840B - 一种植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种植物组织培养技术的研究方法，系采用植物原生质体材料设定不同的外部环境条件参数，以钙离子荧光探针法测定胞内钙离子浓度变化产生的特定信号。具体还包括将植物清洁后制成原生质体，均匀点样于不同种类和梯度植物激素设置细胞板培养室内，2min后观测荧光变化，并用数字共聚焦显微镜或显微荧光分光光度计技术测定10min内Ca2+浓度变化特征；将Ca2+浓度升高幅度设置为“0-100nmol/L，101-200nmol/L，201-300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，得出“不显著，较显著，显著，极显著”培养条件参数。本发明可有效规避传统方法中因植物原生质体消毒不彻底造成污染或消毒过量失去活力等造成的损失，快速、精准地确定培养基配方，为实施企业赢得了时间和保险系数，具有很高的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及的是植物组织培养技术，尤其是一种植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法。
背景技术
自从1902年德国科学家Gottlieb Haberlandt提出植物细胞的全能性理论后，建立在细胞全能性基础上的植物组织培养技术从此逐渐兴起和发展。近年来，植物组织培养技术(PlantTissue Culture)作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，显示出巨大的应用潜力，被广泛应用于植物学、遗传学、育种学、栽培学等各个领域之中。20世纪70年代，已有学者尝试从细胞水平研究植物组织培养。80年代，植物组织培养的研究内容不再局限于选择和寻找合适的培养条件，以诱导外植体表现出全能性，最终形成完整植株，而是逐步从生理、生化水平研究植物组织培养的机理。90年代，微观研究以生理生化水平为主并逐步向分子水平过渡。近十年来，细胞、生理、生化水平的研究依然存在，但是植物组织培养技术与分子手段密切结合并快速发展。
Ca2+作为第二信使参与植物生长、发育与衰老，光合作用电子传递和光合磷酸化，细胞的向性运动和激素调控等生理过程已经得到肯定。植物细胞质内的Ca2+在时间、空间及浓度上会出现特异性变化，即诱发产生钙信号(Heilbrunn的“细胞刺激理论”)。Ca2+一方面依赖浓度的振荡传递信号，另一方面依赖其下游功能蛋白——钙依赖蛋白激酶完成参与信号转导过程。细胞溶质内Ca2+浓度变化引起一连串的下游事件，钙结合蛋白编码Ca2+信号在时间和空间的格局，并开始改变代谢和基因表达。而植物激素的统一作用方式在于Ca2+-CaM调节活细胞的生理功能。
近年来，荧光探针在生物检测和识别领域得到了广泛的应用，2002年，Marcotte等人合成了D-A-D型的钙离子探针2，Kim等人以萘的衍生物为荧光团合成了探针3——探针5。它们对钙离子具有高度的敏感性，激发波长为780nm时，与钙离子络合后荧光强度增加23——50倍，络合常数在(0.14±0.02)——(0.25±0.03)μM范围内，在大于100μm深度的血管中能检测到钙离子的信号，并且没有光漂白问题。
事实上，植物组织培养技术研究过程的核心，是摸索该种植物组织培养的培养基成分和培养条件，传统方式是采用各种因素组合的实验设计，配置出一系列不同的营养条件和培养条件的组合，然后通过无菌操作，将外植体接种，培养，观察和测定相关生长指数，评判分析适宜的营养条件和培养条件的组合。这种方式一般需要几个周期的重复验证和精细化作业，每个周期耗时两个月左右，人力、物力投入很大，但结果却会出现一部分定性的决定因素，这主要是由于组织块或器官消毒处理后经无菌操作接种到实验培养基上时，极易受到消毒不彻底造成污染或消毒过量失去活力等不可避免的客观影响。此外，传统的组织块或器官接种材料之间的差异性较大，普遍存在外植体材料形态、性质不均一现象。上述种种原因往往会直接导致实验数据缺失，毫无疑问地给相关单位带来巨大经济损失，而这种现象是亟待改善的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法，可快速地筛选出该种植物组织培养适宜的外部环境条件参数，从而便捷地获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件，建立相应的组培技术体系，保险系数高。
为实现所述目的，本发明采用植物原生质体材料，设定不同的外部环境条件参数，利用钙离子荧光探针法测定胞内钙离子浓度随环境条件参数变化产生的特定信号，进而通过精密数据判断该种植物组织培养适宜的参数，快速、便捷、高效的获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件。
本发明还包括：利用钙离子荧光探针法测定不同种类、不同浓度的植物营养物质或植物生长调节剂作用于植物组织或细胞后，该植物细胞内钙离子浓度变化情况(即Ca2+振荡频率，对于相同细胞或特定刺激剂来说，反应是相对恒定的，如同细胞的指纹)。
本发明方法还包括：将植物清洁后制成原生质体，均匀点样于不同种类和梯度植物激素设置细胞板培养室内，2min后观测荧光变化，并用数字共聚焦显微镜或显微荧光分光光度计技术测定10min内Ca2+浓度变化特征。将Ca2+浓度升高幅度设置为“0——100nmol/L，101——200nmol/L，201——300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”，进而在很段时间内获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件参数。本方法处理过程中对材料要求不严格，处理条件温和，时间短、操作便捷，能有效保、准确获得定量的评判结果，确定该植物组织培养基的配方。因此，本发明的主题名称也可更直观地更名为一种快速确定植物组织培养条件参数及其培养基配方的方法，则保护客体将更加明确。
本发明方法的具体步骤如下：
一、材料准备：选取植物新鲜材料(叶子、茎尖、根尖等细胞活力强的植物组织器官)，清洗、酶法或机械法获得原生质体。
二、设计不同的营养条件和环境条件参数组合：根据实验设计，在细胞培养板上设置不同种类和梯度的营养物质和植物激素。
三、钙离子荧光探针的添加：将原生质体加入Fura22AM母液(1mmol/L，用无水DMSO配制)至终浓度20μmol/L，混匀于25℃避光孵育30min，缓冲液洗涤多次后用点样器均匀添加至各培养小室。
四、荧光信号检测：将细胞培养板放在数字共聚焦显微镜的载物台上，用数字比率荧光测定系统(美国UIC公司)观察装载了Fura22AM的细胞质游离钙离子荧光，分别采用340nm和380nm激发，用Metaflour软件控制扫描和数据采集系统，以图像和数据记录[Ca2+]i的变化。测定后软件处理可得到340nm/380nm的荧光强度比值(R)，根据公式计算：
[Ca2+]i＝Kd(Fd/Fs)(R-Rmin)/(Rmax-R)
式中Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值。Fd和Fs分别代表Ca2+为零和饱和状态下，在380nm波长测得的荧光强度，Kd值是指示剂与的Ca2+解离常数。
五、结果判定：将Ca2+浓度升高幅度设置为“0～100nmol/L，101～200nmol/L，201～300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”，进而在短时间内获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件参数。本方法处理过程中对材料要求不严格，处理条件温和，时间短、操作便捷，能有效保、准确获得定量的评判结果。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例一：1、选取1～3年生霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)鲜条(可带叶子)，清洗、机械法制备原生质体。
2、设计不同的营养条件和环境条件参数组合：根据实验设计，在细胞培养板上设置不同种类和梯度的营养物质和植物激素，见下表。
表1实验因素、水平
表2实验设计表
| MS大量元素 | NAA | 6-BA | 评判结果 |
| 1 | 1 | 2.0 | 2.0 | 较显著 |
| 2 | 1 | 1.0 | 1.0 | 显著 |
| 3 | 1 | 0.1 | 0.1 | 显著 |
| 4 | 1/2 | 2.0 | 0.1 | 较显著 |
| 5 | 1/2 | 1.0 | 2.0 | 显著 |
| 6 | 1/2 | 0.1 | 1.0 | 极显著 |
| 7 | 1/4 | 2.0 | 1.0 | 较显著 |
| 8 | 1/4 | 1.0 | 0.1 | 显著 |
| 9 | 1/4 | 0.1 | 2.0 | 显著 |
3、钙离子荧光探针的添加：将原生质体加入Fura22AM母液(1mmol/L，用无水DMSO配制)至终浓度20μmol/L，混匀于25℃避光孵育30min，缓冲液洗涤多次后用点样器均匀添加至各培养小室。
4、荧光信号检测：将细胞培养板放在数字共聚焦显微镜的载物台上，用数字比率荧光测定系统(美国UIC公司)观察装载了Fura22AM的细胞质游离钙离子荧光，分别采用340nm和380nm激发，用Metaflour软件控制扫描和数据采集系统，以图像和数据记录[Ca2+]i的变化。测定后软件处理可得到340nm/380nm的荧光强度比值(R)，根据公式计算：
[Ca2+]i＝Kd(Fd/Fs)(R-Rmin)/(Rmax-R)
式中Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值。Fd和Fs分别代表Ca2+为零和饱和状态下，在380nm波长测得的荧光强度，Kd值是指示剂与的Ca2+解离常数。
5、将Ca2+浓度升高幅度设置为“0～100nmol/L，101～200nmol/L，201～300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”，填入表2，进而获得该种植物组织培养的初步培养基配方为1/2MS+NAA0.1mmol/L+6-BA1.0mmol/L。
实施例二：1、选取1～3月生断血流(Clinopodium polycephalum(Vaniot)C.Y.Wu et Hsuan)新鲜植株，清洗、机械法制备原生质体。
2、设计不同的营养条件和环境条件参数组合：根据实验设计，在细胞培养板上设置不同种类和梯度的营养物质和植物激素，见下表。
表1实验因素、水平
表2实验设计表
| MS大量元素 | NAA | 6-BA | 评判结果 | |
| 1 | 1 | 1.0 | 1.0 | 显著 |
| 2 | 1 | 0.5 | 0.5 | 显著 |
| 3 | 1 | 0.1 | 0.1 | 不显著 |
| 4 | 1/2 | 1.0 | 0.1 | 较显著 |
| 5 | 1/2 | 0.5 | 1.0 | 较显著 |
| 6 | 1/2 | 0.1 | 0.5 | 较显著 |
| 7 | 1/4 | 1.0 | 0.5 | 极显著 |
| 8 | 1/4 | 0.5 | 0.1 | 较显著 |
| 9 | 1/4 | 0.1 | 1.0 | 不显著 |
3、钙离子荧光探针的添加：将原生质体加入Fura22AM母液(1mmol/L，用无水DMSO配制)至终浓度20μmol/L，混匀于25℃避光孵育30min，缓冲液洗涤多次后用点样器均匀添加至各培养小室。
4、荧光信号检测：将细胞培养板放在数字共聚焦显微镜的载物台上，用数字比率荧光测定系统(美国UIC公司)观察装载了Fura22AM的细胞质游离钙离子荧光，分别采用340nm和380nm激发，用Metaflour软件控制扫描和数据采集系统，以图像和数据记录[Ca2+]i的变化。测定后软件处理可得到340nm/380nm的荧光强度比值(R)，根据公式计算：
[Ca2+]i＝Kd(Fd/Fs)(R-Rmin)/(Rmax-R)
式中Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值。Fd和Fs分别代表Ca2+为零和饱和状态下，在380nm波长测得的荧光强度，Kd值是指示剂与的Ca2+解离常数。
5、将Ca2+浓度升高幅度设置为“0～100nmol/L，101～200nmol/L，201～300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”，填入表2，进而获得该种植物组织培养的初步培养基配方为1/4MS+NAA1.0mmol/L+6-BA0.50mmol/L。
Claims (3)
1.一种植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法，其特征在于：采用植物原生质体材料设定不同的外部环境条件参数，以钙离子荧光探针法测定胞内钙离子浓度变化产生的特定信号并通过获得的数据判断该种植物组织培养适宜的培养基配方和培养条件参数；
其中，所述特定信号是指不同种类、不同浓度的植物营养物质或植物生长调节剂作用于植物组织或细胞后，该植物细胞内钙离子浓度变化情况；
所述植物营养物质为MS大量元素、NAA；所述植物生长调节剂为6-BA。
2.如权利要求1所述的植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法，其特征在于：还包括将植物清洁后制成原生质体，均匀点样于不同种类和梯度植物激素设置细胞板培养室内，2min后观测荧光变化，并用数字共聚焦显微镜或显微荧光分光光度计技术测定10min内Ca2+浓度变化特征，从而根据Ca2+浓度的升高幅度获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件参数。
3.如权利要求1所述的植物组织培养基配方和培养条件参数的确定方法，其特征在于还包括如下步骤：
(1)选取植物新鲜材料中的细胞活力强的植物组织器官，清洗、酶法或机械法获得原生质体；
(2)根据实验设计，在细胞培养板上设置不同种类和梯度的营养物质和植物激素；
(3)将原生质体加入Fura22AM母液至终浓度20μmol/L，混匀于25℃避光孵育30min，缓冲液洗涤多次后用点样器均匀添加至各培养小室；
(4)将细胞培养板放在数字共聚焦显微镜的载物台上，用数字比率荧光测定系统观察装载了Fura22AM的细胞质游离钙离子荧光，分别采用340nm和380nm激发，用Metaflour软件控制扫描和数据采集系统，以图像和数据记录[Ca2+]i的变化，测定后软件处理可得到340nm/380nm的荧光强度比值(R)，根据公式计算：[Ca2+]i＝Kd(Fd/Fs)(R-Rmin)/(Rmax-R)式中Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值；Fd和Fs分别代表Ca2+为零和饱和状态下，在380nm波长测得的荧光强度，Kd值是指示剂与的Ca2+解离常数。
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| CN101806736A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-08-18 | 南京农业大学 | 棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法 |
| CN102183499A (zh) * | 2011-02-24 | 2011-09-14 | 中国科学院植物研究所 | 全内反射荧光显微镜测量植物细胞中钙离子浓度的方法 |
| CN101477000B (zh) * | 2009-01-05 | 2011-11-23 | 南京农业大学 | 棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法 |
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2012
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Patent Citations (3)
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| CN101477000B (zh) * | 2009-01-05 | 2011-11-23 | 南京农业大学 | 棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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