CN109609514A - 梨转录因子PbrMYB169及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨转录因子PbrMYB169及其应用。一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的MYB家族成员PbrMYB169基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbrMYB169转录因子转化拟南芥，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrMYB169基因具有促进拟南芥花序茎木质素合成的功能，并且PbrMYB169转录因子具有能同时调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。为减少生物体木质素合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

梨转录因子PbrMYB169及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子PbrMYB169及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的MYB家族成员PbrMYB169基因。

背景技术

梨是蔷薇科(Rosaceae)桃亚科(Amygdaloideae)梨属(Pyrus L.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，有超过三千年的栽培历史(滕元文,2017)。除海南省外，其他各个地区均有梨的栽培，尤其是在我国的河北、安徽及江苏等省份，栽培面积甚广。2016年我国梨生产面积达到112万公顷，年产量1950万吨，占世界总量的71.3％。但是，我国梨果在国外市场的竞争力较弱，出口量和出口价格都远低于日本还有西方其他国家，究其原因主要是由于我国梨品质较差，果肉石细胞含量较高。因此，如何提升中国梨果实品质，减少果肉石细胞含量，以满足日益增长的消费者需求，这一问题迫在眉睫。

石细胞属于厚壁细胞，具有增厚的次生细胞壁，由薄壁细胞在细胞壁二次沉积木质素、纤维素等成分发育而来(Smith,1935)。梨果肉中特异积累的石细胞会降低果实品质。目前，已有的梨石细胞研究主要集中在生理学和解剖学这两方面，梨果肉石细胞的形成与木质素的生物合成、转运、积累具有很高相关性(Martin-Cabrejas et al.,2006)；石细胞木质素的组成成分与大部分双子叶植物一致，G-木质素含量大于S-木质素含量，且几乎不存在H-木质素(Cai et al.,2010；Jin et al.,2013)。

木质化是一类复杂的生物合成代谢，而且只存在于高等植物中。其主要功能是增加植物维管组织的机械强度和疏水性，并且在植物抵抗生物胁迫的过程中起到了重要的作用(Wainhouse et al.,1990)。但植物木质素含量及组成成分的不同，直接影响作物转化为纤维质产物和生物燃料的效率(Sarkanen,1976；Gnansounou and Dauriat,2005；Chen andDixon,2007)。三种木质素单体通过苯丙烷代谢途径合成，经偶联反应聚合形成木质素大分子。

发明内容

本发明的目的是提供一个调控梨果实石细胞发育的PbrMYB169基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种分离自‘砀山酥梨’具有促进石细胞中木质素合成的转录因子PbrMYB169基因，属于MYB家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含825bp的开放阅读框；编码275个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示，等电点为5.15，分子量为31.2kDa。

含有本发明所述PbrMYB169基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，以pCAMBIA1301为出发载体，所述PbrMYB169基因的插入位点为Xba I和BamH I之间。

含有本发明所述PbrMYB169基因的宿主菌。

克隆本发明所述PbrMYB169基因cDNA序列的引物对，上游引物PbrMYB169-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PbrMYB169-R1序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述PbrMYB169基因在促进石细胞中木质素合成中的应用。

本发明所述的重组表达载体在促进石细胞中木质素合成的应用。

有益效果

通过对梨高、低石细胞含量品种果实转录组进行分析，申请者发现了一个R2R3-MYB转录因子，该基因在不同品种果实中的表达量变化与石细胞含量高低呈显著地正相关，过量表达该基因的转基因植株，其木质素含量显著上升。申请者将该基因命名为PbrMYB169。该基因的发现补充完善了梨中MYB转录调控的木质素代谢调控机制，为改良梨果实石细胞含量提供理论基础，并为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低木质素含量提供基因资源。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.PbrMYB169基因的发现，为减少生物体木质素合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.通过农杆菌介导遗传转化方法将PbrMYB169基因转化拟南芥，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrMYB169基因具有同时调控多个基因编码木质素合成通路中的酶，从而促进拟南芥花序茎木质素合成的功能。PbrMYB169转录因子具有能同时调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。

附图说明

图1为本发明PbrMYB169基因在不同品种及组织中的时空表达模式分析。

其中：图A，36个品种花后35天果肉中，PbrMYB169的表达量及果肉石细胞含量。柱形图为PbrMYB169的表达量，圆点为果肉石细胞含量。‘台湾赤花’花后35天果肉中PbrMYB169的表达量被设为1。图B，‘砀山酥梨’不同组织中PbrMYB169的相对表达量。图C，高、低石细胞含量品种果肉和石细胞中PbrMYB169的相对表达量。

图2为本发明实施例3的载体构建流程示意图。

图3为本发明PbrMYB169基因在转基因植株的生理数据分析。

其中：图A，过表达PbrMYB169基因在转基因植株的表达量分析。WT为野生型，其余编号：转基因株系。图B，转基因植株发芽后7天的照片。图C，转基因植株发芽后20天及2个月的照片。图D，发芽7天后的根长。图E，发芽20天后的叶片数。图F，发芽20天后的叶面积。图G，发芽8周后的株高。发芽8周后花序茎的细胞残基含量(图H)、木质素含量(图I)、木质素单体含量(图J)。*表示差异显著。

图4为本发明PbrMYB169基因在转基因植株组织学分析。其中：WT：野生型；其余编号：转基因株系。图A，第一行为甲苯胺蓝染色的石蜡切片照片，第二行为405nm下木质素的自发荧光，第三行透射电镜照片。图B，维管细胞木质部次生细胞壁厚度的统计分析。*表示差异显著。

图5为PbrMYB169基因超表达影响木质素合成酶相关基因的表达。其中：WT：野生型；其余编号为转基因株系。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1 PbrMYB169基因时空表达模式分析

‘砀山酥梨’不同组织样品采自江苏省高邮果园(2015年)。高、低石细胞含量梨品种采自国家砂梨种质资源圃。总RNA的提取采用CTAB法(Porebski et al.,1997)，并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总RNA，用one-step gDNA removaland cDNA synthesis kit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量PCR所用引物为基因特异引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；以GAPDH为内参基因，荧光定量试剂盒购自Roche公司。Real-timePCR所用仪器为Roche 480定量PCR仪，反应体系为：2×SYBRGreenI Master Mix 10μL，上下游引物(10μM)0.4μL，2μLcDNA，7.2μLPCR级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火5s，72℃延伸10s重复45个循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5s升高1℃。

我们从高、低果肉石细胞含量品种中各选取了18个品种，检测花后35天果肉中PbrMYB169的相对表达量后发现，高果肉石细胞含量品种中PbrMYB169的表达量比低果肉石细胞含量品种中的高很多(图1A)。果肉石细胞含量与PbrMYB169表达量呈显著正相关，相关性达到0.77。PbrMYB169基因在茎杆和花后21-49天的果肉组织中存在较高的表达量，但在花药、叶片和花后63天之后的果肉组织中表达量相对较低(图1B)。之前有研究表明果肉石细胞中木质素的合成出现在果实发育的早期(Xue et al.,2018)。这表明PbrMYB169很有可能参与茎杆和果肉石细胞中木质素的合成。而且在高、低果肉石细胞含量品种中，石细胞中的PbrMYB169表达量显著高于果肉组织(图1C)。根据以上结果，我们推测PbrMYB169表达量的显著不同可能引起不同品种果肉石细胞含量的差异。

实施例2 PbrMYB169基因分离克隆

取3μg‘砀山酥梨’早期果肉RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesiskit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。扩增基因引物对为SEQ ID No.3和SEQID No.4。50μL的反应体系中包括200ng cDNA，1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer)，10mM dNTP，1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，500nM上述引物。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收DNA片段。回收纯化的DNA溶液与pEASY载体(购自Trangen公司)进行连接反应，按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是5μL，其中包括4.5μL纯化的PCR产物，0.5μL T载体。16℃连接10分钟。取5μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英俊生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PbrMYB169基因全长为825bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，能编码279个氨基酸残基的蛋白，序列为SEQ ID NO.2所示，预测蛋白的分子量大小为31.2kDa；等电点为5.15。通过蛋白序列的多重比对发现，PbrMYB169属于R2R3型MYB转录因子，在N-端具有保守的结构域，而C-端是高度特异的氨基酸序列。BLAST的结果分析表明，该基因是梨中新得到的一个MYB基因家族成员。同源性分析表明，PbrMYB169的氨基酸序列与苹果中预测的MYB氨基酸(基因号：XP_008343128.1)同源性达到96％。但并未见相关文献报道该苹果MYB基因的功能。

实施例3植物转化超表达载体的构建

根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PbrMYB169基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择Xba I和BamH I作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Snapgene软件设计出带有酶切位点的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。PCR扩增的退火温度为55℃，PCR反应体系及扩增程序同实施例2。回收目的条带，再连接pEASY载体上。

双酶切体系总体积为40μL，其中含有pEASY-PbrMYB169质粒12μL，10×Buffer(购自NEB公司)4μL，Xba I 0.8μL，BamH I 0.8μL及水22.2μL。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为40μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体质粒8μL，10×Buffer(购自NEB公司)4μL，Xba I 0.8μL，BamH I 0.8μL及水26.2μL。于37℃酶切2小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PbrMYB169基因使用T4 DNA连接酶(购自NEB公司)于16℃连接14-16小时。反应总体积5μL，其中含有10×T4 DNA Ligase Buffer 0.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL，PbrMYB169基因的双酶切回收产物3.5μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物0.5μL。取连接产物5μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序结果确定没有碱基突变，获得含有插入目的片段的重组载体，将其命名为pCAMBIA1301-PbrMYB169重组载体，构建完成的载体图见图2所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例4拟南芥的遗传转化及转化植株分子鉴定

用含有PbrMYB169过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染Col-0拟南芥(Cloughand Bent,1998)。具体方法如下：

1、用含有50mg/L K⁺和100mg/L R⁺的固体LB培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；

2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100mL锥形瓶中，加入30mL含有50mg/L K⁺和100mg/L R⁺的液体LB培养基，在28℃的摇床中200rpm培养12小时；

3、用50mL离心管5000rpm离心20分钟收集菌体；

4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2MS；5％蔗糖(W/V)；10μg/L 6-BA；用KOH调pH到5.7；0.025％表面活性剂(V/V)】中；

5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花；

6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中，用真空抽滤泵抽真空到380mm汞柱，浸泡5分钟；

7、放置在22℃的培养室中避光24小时，之后放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。

取潮霉素抗性两周大的拟南芥T1代阳性植株，取花序茎杆提取RNA后，用荧光定量PCR检测PbrMYB169表达量，引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。其中有3个株系(OE-8、OE-10、OE-16)存在较高的表达量(图3A)，它们的纯合子用于后续实验。T3代纯合子种子与野生型种子经过消毒一起播到了发芽培养基【MS；3％蔗糖(W/V)；0.75％琼脂(W/V)】上。种子发芽后每个株系随机选取8株，第7天测量根的长度。之后将幼苗种到营养土中，放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。

实施例5转基因植株的表型观察及木质素相关生理指标测定

(1)转基因拟南芥生物量测定

发芽后每个株系随机选取取8株，第20天测定叶片数，第八周测量初生花序茎的长度。转基因系发芽后第7天根的长度明显短于对照组(图3B、3D)，但第20天莲座叶的数量与对照组相比差异不显著(图3C、3E)，莲座叶的叶面积相对于对照组显著下降(图3F)，第8周初生花序茎的长度显著短于野生型(图3C、3G)。

(2)转基因拟南芥木质素含量及单体含量的测定

取野生型和T3代转基因系各5株，收集花序茎下部10cm长的茎，切成2mm长度，并混合样品烘干至恒重。取5mg干燥过后的样品提取CWR用于木质素分析，步骤如下：样品放在2mL离心管中，每步处理各30分钟，经过水(98℃)、乙醇(76℃)、氯仿(59℃)、丙酮(54℃)，最后干燥至恒重。溴乙酰可溶木质素含量测定，参照(Acker et al.,2013)。木质素组成成分用thioacidolysis法测定，方法参照(Lapierre et al.,1995)。木质素经过thioacidolysis作用形成的派生物用三甲基硅烷衍生化后，用GC-MS检测。试验重复四次，每次都用相同量的样品。

通过一系列试剂去除主茎中可溶性化合物，不同株系之间CWR的得率没有显著差异，表明过量表达PbrMYB169并没有改变植株茎杆中的可溶性化合物含量(图3H)。通过Klason木质素法分析比较了CWR中木质素含量差异，转基因系的木质素含量显著上升(图3I)。且转基因系G型和S型单体的含量都显著上升(图3J)。

(3)转基因拟南芥花序茎组织结构观察

1石蜡切片

取野生型和转基因系8周大的植株初生花序茎的底端用FAA固定液在4℃固定一周时间以上，经过以下步骤制作石蜡切片：

1、脱水：依次用85％、95％、100％、100％乙醇脱水2小时，再用体积比为1：1的无水乙醇和二甲苯脱乙醇2小时；

2、透明：用二甲苯浸泡2小时，再重复一次；

3、渗蜡：将1/2体积二甲苯加入固定瓶，再加1/2体积熔蜡。在干燥箱中升温至高于石蜡熔点3℃左右，石蜡熔化后取盖，2小时后用熔化的纯蜡渗蜡2小时，重复一次；

4、包埋：将渗蜡过的材料用高于熔点温度3℃左右的纯蜡溶液包埋在叠好的纸盒里；

5、切片：用Leica RM 2015超微切片机(Leica Mikrosysteme,Germany)将样品切成5μm厚度；

6、展片：把切下的蜡带用毛笔轻轻挑起，放入35℃水浴锅中展片，待完全展开后，用载玻片挑起切片，放入37℃培养箱中干燥；

7、脱蜡：将干燥后的材料依次放入纯二甲苯10分钟(重复一次)、无水乙醇4分钟(重复一次)、95％乙醇4分钟、85％乙醇4分钟、70％乙醇2分钟；

8、甲苯胺蓝染色：使用1％甲苯胺蓝硼酸溶液(W/V)对切片进行染色5分钟，然后95％乙醇2分钟、100％乙醇3分钟(重复一次)、二甲苯10分钟、二甲苯5分钟，中性树胶盖片，放在37℃培养箱中干燥。

用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察甲苯胺蓝染色切片并拍照。

2木质素自发荧光观察

未染色的切片用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察，二极管激光器发射405nm激光，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。

3透射电镜

与石蜡切片相同的样品用2.5％戊二醛固定液4℃固定12小时，取材后要迅速投入到新鲜的2.5％戊二醛固定液中；取材应在0-4℃低温下操作，取材的器械和固定液也要遇冷；由于固定液的渗透性较差，戊二醛渗透深度为0.5mm，锇酸的渗透深度为0.25mm，所以样品大小约为1.5mm×3mm，厚度不超过2mm；对于漂浮在固定液上面的材料，需要抽气使其完全浸渍于固定液下面，充分固定。方法参照(Whitehill et al.,2016)。用Image-Pro Plus软件测量木质部细胞次生细胞壁的厚度。

通过石蜡切片、木质素自发荧光检测、透射电镜检测发现，转基因拟南芥茎杆木质部细胞形态正常，但木质素自发荧光较强且次生细胞壁更厚(图4)。

(3)转基因拟南芥花序茎木质素合成相关基因相对表达量检测

取野生型和转基因系4周大的植株初生花序茎，RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例1。

过量表达PbrMYB169拟南芥植株中的内源木质素合成代谢基因的表达量变化发现，木质素合成相关基因的表达量都极显著上升(图5)，表明PbrMYB169通过激活木质素合成相关基因的表达，引起茎杆中过度积累木质素，导致根尖和茎尖的伸长生长受到阻碍。

表1实时荧光定量引物

主要参考文献

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滕元文.2017.梨属植物系统发育及东方梨品种起源研究进展.果树学报,370-378.

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨转录因子PbrMYB169及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> 砀山酥梨’(Pyrus spp)

<400> 1

atgggaaggc aaccgtgctg tgacaaagtt gggttgaaga agggaccatg gacagctgaa 60

gaggacaaga agctcattaa gttcatcctc gccaatggcc aatgctgctg gagagctgtc 120

cctaagcttg caggattatt aaggtgtgga aaaagttgca ggctgaggtg gaccaattat 180

ctgaggccag acttgaagag aggtctttta tcagaatatg aagagaaaat ggtcattgat 240

cttcatgctc aacttggcaa cagatggtct aagattgcct ctcatctccc tggaagaaca 300

gataatgaga taaaaaatca ttggaacacc cacatcaaga agaagttgag aaaaatgggg 360

attgatcctc tcacccacaa accaattgct aatgtcaatg atcaaagcca ccaatcacaa 420

agtcaaaaac aagaaggaga agaagaacaa tcttgtgtag ctaatgacag ctttgaaatt 480

ggccaaaaca accctattca agccaaagag gaagattcca aaaacatggg aggtgatgaa 540

ttggataaaa tggagttctt gattgatgga ttctgcatag atgaagttcc actaattgag 600

ccccatgaga ttttagttcc ttgtgctcct tcttcatcaa cctcttcatc ttcttcttca 660

aattcatcat ccatttttct tgaagacttg tatctcccag attttgagtg gcctgactgt 720

gattacagca acaacaacaa caacaaccag aacaatgaca gcatgggctt gtgggatgat 780

gacttcagca gctggggtca agattcttgg gcatatgggc ttttg 825

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 砀山酥梨’(Pyrus spp)

<400> 2

Met Gly Arg Gln Pro Cys Cys Asp Lys Val Gly Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Ile Lys Phe Ile Leu Ala Asn

20 25 30

Gly Gln Cys Cys Trp Arg Ala Val Pro Lys Leu Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Leu Leu Ser Glu Tyr Glu Glu Lys Met Val Ile Asp

65 70 75 80

Leu His Ala Gln Leu Gly Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Ser His Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn His Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Arg Lys Met Gly Ile Asp Pro Leu Thr His Lys Pro

115 120 125

Ile Ala Asn Val Asn Asp Gln Ser His Gln Ser Gln Ser Gln Lys Gln

130 135 140

Glu Gly Glu Glu Glu Gln Ser Cys Val Ala Asn Asp Ser Phe Glu Ile

145 150 155 160

Gly Gln Asn Asn Pro Ile Gln Ala Lys Glu Glu Asp Ser Lys Asn Met

165 170 175

Gly Gly Asp Glu Leu Asp Lys Met Glu Phe Leu Ile Asp Gly Phe Cys

180 185 190

Ile Asp Glu Val Pro Leu Ile Glu Pro His Glu Ile Leu Val Pro Cys

195 200 205

Ala Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser

210 215 220

Ile Phe Leu Glu Asp Leu Tyr Leu Pro Asp Phe Glu Trp Pro Asp Cys

225 230 235 240

Asp Tyr Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gln Asn Asn Asp Ser Met Gly

245 250 255

Leu Trp Asp Asp Asp Phe Ser Ser Trp Gly Gln Asp Ser Trp Ala Tyr

260 265 270

Gly Leu Leu

275

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctagaatgg gaaggcaacc gtgc 24

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatcccaaa agcccatatg cccaagaat 29

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaaaacaa ccctattcaa gc 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtaatcaca gtcaggccac tca 23

Claims (8)

1.一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的转录因子PbrMYB169基因，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的转录因子PbrMYB169基因编码的蛋白，其特征正在于氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA1301为出发载体，权利要求1所述PbrMYB169基因的插入位点为Xba I和BamH I之间。

5.含有权利要求1所述基因的宿主菌。

6.克隆权利要求1所述基因序列的引物对，其特征在于上游引物PbrMYB169-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PbMYB169-R1序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1所述的PbrMYB169基因在木质素合成中的应用。

8.权利要求3所述的重组表达载体在促进拟南芥花序茎木质素合成中的应用。