CN113528554A - 梨类纤维素合成酶基因PbrCSLD5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种梨类纤维素合成酶基因PbrCSLD5及其应用，该基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通过农杆菌介导遗传转化方法在拟南芥中过表达PbrCSLD5基因，获得转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrCSLD5基因具有调控梨花粉管细胞壁纤维素合成的作用。

Description

梨类纤维素合成酶基因PbrCSLD5及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨类纤维素合成酶基因PbrCSLD5及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个具有调控梨花粉管细胞壁纤维素合成酶合成的基因PbrCSLD5。

背景技术

梨是蔷薇科(Rosaceae)桃亚科(Amygdaloideae)梨属(Pyrus L.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，栽培历史悠久，种植面积广泛(滕元文,2017)。在开花植物中，花粉管是有性繁殖过程中负责将雄配子传递给雌配子体的重要器官(Hulskamp et al.,1995；Lord and Russell,2002)。花粉管细胞壁是维持花粉管细胞形态的重要因素之一(Edlund et al.,2004)。花粉管细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶、多糖和葡萄糖等组成，这些组成成分都拥有各自的分布和功能。研究表明，花粉管细胞壁的生物合成参与了花粉管生长的调节，纤维素作为细胞壁的重要组成部分，对花粉管的生长起重要作用。

纤维素是由纤维素合酶(cellulose synthase,CESA)复合物(cellulosesynthase complexes,CSCs)合成的，这些复合物在高尔基体中组装，然后运送到质膜，在质膜中合成纤维素(Kimura et al.,1999；Richmond and Somerville,2000；Taylor,2008)。已知烟草、拟南芥花粉管细胞壁纤维素含量分别为：5-10％、30％，且分布在花粉管的尖端和柄部(Amor et al.,1995；Schlupmann et al.,1994)。

在植物中，存在着蛋白序列结构相似的纤维素合酶超家族(Cellulose SynthaseSuperfamily)。纤维素合酶超家族包括CESA和纤维素合酶类似基因家族(CSL:CSLA/B/C/D/E/F/G/H/J)(Yin et al.,2009)，均属于糖基转移酶GT2家族，编码的蛋白质都具有糖基转移酶活性。在植物体细胞中发现几个CSL基因编码半纤维素多糖的多糖合成酶，如AtCSLA基因参与了甘露聚糖的形成(Dhugga et al.,2004；Liepman et al.,2005)、AtCSLC基因编码的酶催化木葡聚糖骨架的伸长(Cocuron et al.,2007)、CSLF和CSLH基因负责β-(1-3,1-4)-D-葡聚糖的合成(Burton et al.,2006；Doblin et al.,2009)。在拟南芥花粉管以及根中，CSLD基因的突变体表现出根毛、花粉管极性生长受抑制(Bernal et al.,2008)。但是到目前为止，尽管许多CESA基因已经被报道参与体细胞中纤维素的合成，在花粉管中负责纤维素合成的CESA/CSL基因仍然鲜有报道。

本研究通过寻找梨花粉管中参与纤维素合成的主要基因，进一步探索其参与花粉管细胞壁纤维素合成的作用、发掘调控纤维素合成基因的转录因子以及花粉管中纤维素合成和沉积方式等，以便更好地了解纤维素在梨花粉管细胞壁发育过程中扮演的角色，为进一步理解梨花粉管细胞壁的形成提供依据。

发明内容

本发明目的是提供一个调控梨花粉管细胞壁纤维素合成的纤维素合成酶基因PbrCSLD5。

本发明另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可以采用以下技术方案来实现：

一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨花粉管细胞壁纤维素合成功能的纤维素合成酶基因PbrCSLD5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，包含3381bp的开放阅读框；该基因编码1127个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，等电点为5.84。

克隆上述基因PbrCSLD5全长的引物对，该引物对由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5'-ATGGCAACTTCCCAGAATAGAGA-3'(SEQ ID No.3)

反向引物：5'-TCACGGAAATTGGAACCCG-3'(SEQ ID No.4)。

含有上述纤维素合成酶基因PbrCSLD5的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

上述的重组表达载体，是以pCAMBIA1301为出发载体，所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5的插入位点为XbaI和BamHI。

上述纤维素合成酶基因PbrCSLD5在调控花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。研究表明，敲低PbrCSLD5基因表达量会降低纤维素的含量，过表达PbrCSLD5基因能够促进纤维素的合成。

上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在促进花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。

本发明的有益效果：

通过对梨中花粉管不同生长时期转录组数据分析，申请者发现PbrCSLD5特异在花粉管中表达，且在花粉管生长后期表达量快速上升，表明PbrCSLD5在花粉管生长过程中起重要作用。用反义寡聚核苷酸实验(Antisense oligodeoxynucleotide，as-ODN)敲低PbrCSLD5基因表达量，并通过实时定量荧光PCR检验是否敲低PbrCSLD5表达量后，使用细胞壁纤维素专一染料(Fast Scarlet 4B)S4B对ODN处理后花粉管细胞壁纤维素染色，观察纤维素含量变化。通过农杆菌介导遗传转化方法在拟南芥中过表达PbrCSLD5基因，获得转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrCSLD5基因具有控制梨花粉管细胞壁纤维素合成。

附图说明

图1为梨PbrCSLD5基因分离克隆。

图2为敲除PbrCSLD5使梨花粉管中纤维素含量降低；

其中，A.qPCR分析表明，在反义寡核苷酸(as-ODN)处理下，花粉管PbrCSLD5的表达量显著降低。B.对照、cyotfectin、s-ODN-PbrCSLD5和as-ODN-PbrCSLD5处理下花粉管中纤维素含量的测定。C.S4B对照、cyotfectin、s-ODN-PbrCSLD5和as-ODN-PbrCSLD5处理下花粉管的染色。bar＝20μm。D.不同处理下花粉管顶端(从花粉管顶端到花粉管柄面积为10μm)S4B荧光强度的分析。

图3为转基因拟南芥鉴定。

图4为转基因拟南芥花粉管细胞壁纤维素染色分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：梨PbrCSLD5基因分离克隆与超表达载体构建

取3μg‘砀山酥梨’花粉RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesiskit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PbrCSLD5基因的编码区序列上的酶切位点分析，首先以‘砀山酥梨’花粉cDNA为模板，以SEQID No.3和SEQ ID No.4为引物，克隆得到基因PbrCSLD5全长。选择Xba I和BamH I作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Snapgene软件设计出带有酶切位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6。50μL的反应体系中包括：200ng PbrCSLD5Q全长DNA，1×缓冲液(TransStartFastPfu Buffer)，10mM dNTP，1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，500nM上述引物。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。结果如图1所示。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收DNA片段。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为50μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体质粒10μL，10×Buffer(购自NEB公司)5μL，Xba I 1μL，BamH I 1μL及水33μL。于37℃酶切3小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PbrCSLD5基因使用重组酶Exnase II(购自Vazyme公司)于37℃连接30分钟。反应总体积20μL，其中含有5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，PbrCSLD5基因的PCR回收产物2μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物6μL及水6μL。取连接产物10μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，重组质粒样品送生物公司测序。测序结果表明，PbrCSLD5基因全长为3381bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，能编码1127个氨基酸残基的蛋白，序列为SEQ ID NO.2所示。我们将重组载体命名为LAT52-PbrCSLD5-GFP，应用冻融法将重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例2：梨花粉管ODN实验及纤维素含量和基因表达量检测

(1)梨花粉管ODN实验

使用RNA折叠Web服务器(https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)设计PbrCSLD5的ODN序列，并使用Snap Gene 2.4.3(https://www.snapgene.com)评估候选的as-ODN序列与靶区的匹配。用磷代寡核苷酸合成候选as-ODN序列和相应的sense-ODN序列，其中as-ODN-PbrCSLD5对应的引物序列为SEQ ID No.9，s-ODN-PbrCSLD5对应的引物序列为SEQ ID No.10。ODN引物需要进行硫代修饰，并通过高效液相色谱进行纯化。将ODN序列与Lipofectamine 3000转染试剂(Thermo FisherScientific)的混合物在25℃的培养基中孵育15min后开始实验。将该混合物加入花粉管培养液中(预培养1h)，保持终浓度为20μM ODN。花粉管在25℃，120rpm下培养2h。400g离心后获得花粉管，保存于-80℃用于RNA分离。实验重复了三次。

as-ODN-PbrCSLD5：CCCCGTTCCCACGTACACGG(SEQ ID No.9)

s-ODN-PbrCSLD5：CCGTGTACGTGGGAACGGGG(SEQ ID No.10)。

(2)纤维素含量测定

取梨花花粉加入花粉培养液中，在23-25℃，100-130RPM的摇床中培养3-4h，离心收集，液氮快速冷冻。采集到的花粉在液氮环境中充分研磨，分别用80％乙醇、100％乙醇、甲醇-氯仿(1:1，v:v)和丙酮清洗磨粒。每次洗涤后，通过离心收集沉淀。产生的不溶性细胞壁馏分在通风柜中干燥2天并称重。将称量好的干物质加入0.1M乙酸钠，在80℃下放置20分钟。离心上清，采用Updegraff法测定纤维素含量(Updegraff,1969)。简单地说，细胞壁材料被三氟乙酸(TFA)水解，Updegraff试剂(乙酸:硝酸:水，8:1:2,v/v/v)水解剩余的木质素、果胶和半纤维素，产生结晶纤维素。用72％的硫酸将结晶纤维素水解为葡萄糖。用浓硫酸中新鲜制备的蒽酮试剂(2mg.mL^-1)显色，用比色法测定葡萄糖含量，用葡萄糖溶液(0.1mg.mL^-1)绘制标准曲线，计算花粉管细胞壁结晶纤维素含量。图2-B为纤维素含量测定结果，结果表明与对照相比，ODN处理之后纤维素含量明显降低，表明PbrCSLD5该基因通过控制纤维素合成酶的合成进而影响纤维素的合成。

(3)基因表达量检测

提取ODN处理之后的花粉RNA,并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesis kit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量PCR所用引物为基因特异引物对：SEQ IDNo.7和SEQID No.8；以PbrUBP为内参基因，荧光定量试剂盒购自Roche公司。Real-timePCR所用仪器为Roche 480定量PCR仪，反应体系为：2×SYBR GreenI Master Mix 10μL，上下游引物(10μM)0.4μL，2μLcDNA，7.2μLPCR级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火10s，72℃延伸30s重复50个循环。图2-A为基因表达量的检测，结果表明与对照相比，ODN处理之后该基因的表达量降低。证明ODN引物有效，达到预期效果。

实施例3：拟南芥的遗传转化及转化植株分子鉴定

用含有PbrCSLD5过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染Col-0拟南芥(Cloughand Bent,1998)。具体方法如下：

1、用含有50mg/L K+和100mg/L R+的固体LB培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；

2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100mL锥形瓶中，加入30mL含有50mg/L K+和100mg/L R+的液体LB培养基，在28℃的摇床中200rpm培养12小时；

3、用50mL离心管5000rpm离心20分钟收集菌体；

4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2MS；5％蔗糖(w/v，g/100mL)；10μg/L 6-BA；用KOH调pH到5.7；0.025％表面活性剂(v/v)】中；

5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花；

6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中，用真空抽滤泵抽真空到380mm汞柱，浸泡5分钟；

7、放置在22℃的培养室中避光24小时，之后放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。

取潮霉素抗性两周大的拟南芥T1代阳性植株，取拟南芥叶片提取DNA后，用PCR检测PbrCSLD5表达量，引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。检测阳性苗用于后续实验。T3代纯合子种子与野生型种子经过消毒一起播到了发芽培养基【MS；3％蔗糖(w/v，g/100ml)；0.75％琼脂(w/v，g/100mL)】上。种子发芽后将幼苗移到营养土中，放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。图3为T3代转基因拟南芥鉴定。鉴定结果表明PbrCSLD5已稳定转入拟南芥中。

实施例4：花粉培养基的配置

梨花粉基础培养基成分如下：0.55mM Ca(NO₃)₂，1.60mM H₃BO₃，1.60mM MgSO₄，1.00mM KNO₃，440.00mM蔗糖和5.00mM MES，pH用Tris调至6.0-6.2。花粉于25℃，120rpm的摇床中培养。

拟南芥花粉基础培养基成分如下：0.01％(g/100ml)H₃BO₃，5mM KCl，1mM MgSO₄，5mM CaCl₂，10％(g/100ml)蔗糖，pH用NaOH调至7.5-7.6。使用固体培养基时，需加入1.5％(g/100ml)低熔点琼脂糖。

实施例5：花粉管细胞壁纤维素染色

收集‘砀山酥梨’梨花粉的开花期，收集花粉添加到花粉培养基中，孵化在23-25℃，100-130转3-4h，并收集花粉通过离心(3000转3分钟)使用4％多聚甲醛固定至少30分钟,用PBS洗涤3次(3000转3分钟)。使用Pontamine Fast Scarlet 4B(S4B；Sigma)，最终浓度为0.01％，至少染色5分钟，用PBS洗涤3次(3000rpm,3min)，染好花粉管。拟南芥花粉管的染色与梨花粉管类似。图2-C和D为ODN处理之后对正常培养的花粉管细胞壁纤维素进行染色，结果表明与对照相比，纤维素染色荧光强度降低，即纤维素含量降低，与测量纤维素含量结果一致。

实施例6：转基因拟南芥相关指标的测定

按照实施例5方法对转基因的拟南芥花粉染色，激光共聚焦显微镜观察纤维素分布情况。图4为T3代LAT52:PbrCSLD5-GFP过表达拟南芥花粉管染色观察纤维素分布，发现过表达PbrCSLD5会导致花粉管内纤维素的沉积和异常分布。

SEQ ID No.1

ATGGCAACTTCCCAGAATAGAGAACCGTCGAAGAAGGCGATAAAAAGCCCTGGGGGTTCTGGTAGCTCTCAAGGCAAAACTAATTCGAGTGGCCAAACTGTTAAGTTTGCGCGAAGGACTTCAAGTGGACGATATGTGAGTCTGTCAAGAGAAGACCTTGATATGTCCGGGGAAATATCTGGGGACTATATGAACTACACAGTTCATATTCCACCCACCCCGGATAACCAGCCCATGGACACATCCGTGGCTGTCAAGGCAGAGGAGCAATATGTTTCGAATTCTTTATTTACCGGAGGGTTCAATAGCGTGACACGTGCACATCTCATGGATAAGGTGATTGATTCGGAGGTGACTCATCCTCAGATGGCTGGAGCCAAAGGCTCTGCATGCATGATGCCTGCTTGTGATGGTAAGGTGATGAAGGATGAGAGAGGAGTTGATATAACCCCTTGTGATTGCAGGTTCAAAATCTGTAGAGATTGCTATTTGGATGCACAGAAGGACACTGGCCTTTGTCCAGGCTGCAAGGAGCAATACAGAGTAGGAGACGAATATGATGAGCCATCGGATTACAACAGTGGAACGCTGCAATTGCCTGGTCCTGACGGAAAAAGGGATAACATGTCTGTGATGAAGAGGAACCAAACGGGAGAATTTGATCACAATAGGTGGTTGTTTGAGACCAAGGGGACTTATGGTGTTGGCAATGCTTTCAATCCCCAAGATGACGGGTATGGTGATGGCGGTGGTGATGGCTTCCCAGGGGGCTCGCTGGATGCAGATGACAAGCCCTGGAAGCCCCTCAGCAGGATATTGCCAATCCCGGCTGCCATTATCAGCCCCTACAGATTAATCGTGCTATCATTCTTTCTGCATTGGAGAATAGTCAATCCAAACAATGATGCAAGATGGCTGTGGCTCATGTCGATTATCTGCGAAATATGGTTCGCCTTCTCTTGGATTCTTGATCAGACTCCAAAGTTTTTCCCCATTAATCGTCAGACCGATCTTGAAGTCCTCCACGACAAGTTTGATATGCCATCACCATCCAATCCAACGGGCCGGTCTGACCTCCCTGGCATTGATTTCTATGTATCGACTGCTGATCCTGACAAAGAGCCACCTCTCACCACTGCCAATACCATCCTTTCAATCCTAGCCGTTGATTACCCGGTTGAAAAGATAGCGTGCTACATCTCTGATGATGGAGGTGCCCTCCTCACCTTCGAGGCAATGGCGGAGGCTGCTAGTTTTGCGGACTTGTGGGTCCCCTTCTGCCGGAAGCACGACATTGAGCCGAGGAATCCAGACAGTTACTTCGCGTTGAAAGTTGACCCAACAAAGAACAAGAGTAGTCTGGACTTTGTGAAGGATAGGAGGAAGATCAAGAGGGAGTATGATGAGTTCAAGGTGAGGATCAACGGGCTTCCGGATTCAATCAGGAGGCGGTCTGATGCTTTCCATGCCAGGGAGGAAATGAAGCAGTTGAAGAATATGAGGGAGAATGGAACTGACCCTTTGGAGCAAGTCAAAGTCCCCAAGGCTACATGGATGGCTGATGGCACACATTGGCCTGGTACTTGGGCGGTTCCTTCCTATGACCACGCCAAAGGTGACCATTCCGGAATTCTTCAGGTGATGTTGAAGCCTCCTAGTCCTGACTCACTATTGGGAAGTGCCGATGATGACAAACTCATAGATTTCACAGATGTGGATATACGCCTGCCGATGTTTGTCTACATGTCACGAGAAAAGCGGCCGGGCTATGATCACAACAAGAAAGCTGGCGCCATGAATGCGCTGGTGAGAGCATCCGCCATCTTGTCAAACGGCCCTTTCATTCTCAACCTTGACTGTGATCACTACATCAACAACTGCAAAGCTATCCGTGAAGGGATGTGCTTCATGATGGACAGAGGCGGTGAAAACATCTGCTACATTCAGTTTCCTCAGAGATTCGAAGGAATTGATCCCTCTGATCGCTATGCCAATCACAACACCGTGTTTTTCGACGGCAATATGCGTGCGCTTGATGGTTTGCAGGGTCCGATGTACGTGGGAACGGGGACCATGTTCCGGCGGTTTGCCTTGTACGGTTTTGATCCACCAAATCCTGACAAGCTGCCGGTGAAGAAGGATACTGAGACACCAGGAGAGCCTTTGACACAGTCGAACACAGAACCTTTGACAGCCTGTGACTTTGACGCGGATCTTGACACCAATCTACTTCCCAAGCGTTTTGGAAATTCGACAATGCTGGCGGAATCCATACCGGTTGCTGAGTACCAAGGCCGACCCCTAGCTGATCATCCCGCAGTGAAATTTGGACGGCCTCCAGGCATTCTCAGAGCTCCTCGTGATCCGCTAGATGCCACAAATGTTGCTGAAGCCGTGTCTTCCATTTCTTGCTGGTACGAGGACAAGACCGAATGGGGAGACCGTGTGGGGTGGATTTACGGGTCGGTGACAGAAGACGTGGTGACAGGGTACAGAATGCACAACCGAGGATGGCGCTCGGTGTACTGCGTTACCAAGCGTGACGCATTTCGAGGTTCAGCTCCCATTAATCTCACTGATCGACTTCACCAAGTGCTCCGTTGGGCAACAGGTTCTGTCGAAATTTTCTTCTCTCGGAACAATGCCCTCCTCGCCTCAATGCGCCTCAAATTACTACAGCGCCTTGCCTACGTCAATGTCGGTGTCTACCCTTTCACCTCGATCTTTCTCATCGTGTACTGCTTCCTCCCAGCACTCTCGCTCTTCACTGGACAGTTCATCGTGGCTAATCTCAACATCACGTTTTTGATCTACTTGCTAACCATCACCATATGCCTCATTGCTCTGGCCCTCCTGGAGGTGAGGTGGTCGGGGGTCGCGTTGGAAGACTGGTGGCGAAACGAGCAGTTTTGGCTCATCTCCGGAACCAGCGCTCACTTGGCTGCTGTGGTGCAAGGGCTTCTAAAAGTGATGGCAGGGATTGAAATTTCCTTTACCTTGACAGCCAAGTCAGCTGGAGAGGACAATGATGATATATATGCCGACCTCTACCTTGTGAAGTGGACTTCCCTCATGATCCCTCCAATTGTGATTGGAATGGTGAACATAATAGCCATAATCGTCGCATTTTCAAGGGAGGTTTATGCTCTGAATCCTCAGTGGGCGAGGTTTATCGGCGGTGCCTTCTTCAGCTTTTGGGTTTTGGCTCACTTGTATCCTTTTGCCAAGGGTTTGATGGGAAGAAGAAGGAAGACGCCTACCATTGTGTTTGTTTGGTCAGGTCTCATTGCCATTACACTTTCCTTGCTCTGGGTCGCCATTAACCCGCCAGCCCCTGGTGTTGTCGCTGGTGCTGCAGGAGGCGGGTTCCAATTTCCGTGA

SEQ ID No.2

MATSQNREPSKKAIKSPGGSGSSQGKTNSSGQTVKFARRTSSGRYVSLSREDLDMSGEISGDYMNYTVHIPPTPDNQPMDTSVAVKAEEQYVSNSLFTGGFNSVTRAHLMDKVIDSEVTHPQMAGAKGSACMMPACDGKVMKDERGVDITPCDCRFKICRDCYLDAQKDTGLCPGCKEQYRVGDEYDEPSDYNSGTLQLPGPDGKRDNMSVMKRNQTGEFDHNRWLFETKGTYGVGNAFNPQDDGYGDGGGDGFPGGSLDADDKPWKPLSRILPIPAAIISPYRLIVLSFFLHWRIVNPNNDARWLWLMSIICEIWFAFSWILDQTPKFFPINRQTDLEVLHDKFDMPSPSNPTGRSDLPGIDFYVSTADPDKEPPLTTANTILSILAVDYPVEKIACYISDDGGALLTFEAMAEAASFADLWVPFCRKHDIEPRNPDSYFALKVDPTKNKSSLDFVKDRRKIKREYDEFKVRINGLPDSIRRRSDAFHAREEMKQLKNMRENGTDPLEQVKVPKATWMADGTHWPGTWAVPSYDHAKGDHSGILQVMLKPPSPDSLLGSADDDKLIDFTDVDIRLPMFVYMSREKRPGYDHNKKAGAMNALVRASAILSNGPFILNLDCDHYINNCKAIREGMCFMMDRGGENICYIQFPQRFEGIDPSDRYANHNTVFFDGNMRALDGLQGPMYVGTGTMFRRFALYGFDPPNPDKLPVKKDTETPGEPLTQSNTEPLTACDFDADLDTNLLPKRFGNSTMLAESIPVAEYQGRPLADHPAVKFGRPPGILRAPRDPLDATNVAEAVSSISCWYEDKTEWGDRVGWIYGSVTEDVVTGYRMHNRGWRSVYCVTKRDAFRGSAPINLTDRLHQVLRWATGSVEIFFSRNNALLASMRLKLLQRLAYVNVGVYPFTSIFLIVYCFLPALSLFTGQFIVANLNITFLIYLLTITICLIALALLEVRWSGVALEDWWRNEQFWLISGTSAHLAAVVQGLLKVMAGIEISFTLTAKSAGEDNDDIYADLYLVKWTSLMIPPIVIGMVNIIAIIVAFSREVYALNPQWARFIGGAFFSFWVLAHLYPFAKGLMGRRRKTPTIVFVWSGLIAITLSLLWVAINPPAPGVVAGAAGGGFQFP*

SEQ ID No.3

ATGGCAACTTCCCAGAATAGAGA

SEQ ID No.4

TCACGGAAATTGGAACCCG

SEQ ID No.5

AAAAATTCCAATTTATCTAGAATGGCAACTTCCCAGAATAGAGA

SEQ ID No.6

GCCCTTGCTCACCATGGATCCTCACGGAAATTGGAACCCG

SEQ ID No.7

GGGCGGTTCCTTCCTATGA

SEQ ID No.8

ATGAAGCACATCCCTTCACG

SEQ ID No.9

CCCCGTTCCCACGTACACGG

SEQ ID No.10

CCGTGTACGTGGGAACGGGG

主要参考文献

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<210> 1

<211> 3381

<212> DNA

<213> 梨(Pyrus L.)

<400> 1

atggcaactt cccagaatag agaaccgtcg aagaaggcga taaaaagccc tgggggttct 60

ggtagctctc aaggcaaaac taattcgagt ggccaaactg ttaagtttgc gcgaaggact 120

tcaagtggac gatatgtgag tctgtcaaga gaagaccttg atatgtccgg ggaaatatct 180

ggggactata tgaactacac agttcatatt ccacccaccc cggataacca gcccatggac 240

acatccgtgg ctgtcaaggc agaggagcaa tatgtttcga attctttatt taccggaggg 300

ttcaatagcg tgacacgtgc acatctcatg gataaggtga ttgattcgga ggtgactcat 360

cctcagatgg ctggagccaa aggctctgca tgcatgatgc ctgcttgtga tggtaaggtg 420

atgaaggatg agagaggagt tgatataacc ccttgtgatt gcaggttcaa aatctgtaga 480

gattgctatt tggatgcaca gaaggacact ggcctttgtc caggctgcaa ggagcaatac 540

agagtaggag acgaatatga tgagccatcg gattacaaca gtggaacgct gcaattgcct 600

ggtcctgacg gaaaaaggga taacatgtct gtgatgaaga ggaaccaaac gggagaattt 660

gatcacaata ggtggttgtt tgagaccaag gggacttatg gtgttggcaa tgctttcaat 720

ccccaagatg acgggtatgg tgatggcggt ggtgatggct tcccaggggg ctcgctggat 780

gcagatgaca agccctggaa gcccctcagc aggatattgc caatcccggc tgccattatc 840

agcccctaca gattaatcgt gctatcattc tttctgcatt ggagaatagt caatccaaac 900

aatgatgcaa gatggctgtg gctcatgtcg attatctgcg aaatatggtt cgccttctct 960

tggattcttg atcagactcc aaagtttttc cccattaatc gtcagaccga tcttgaagtc 1020

ctccacgaca agtttgatat gccatcacca tccaatccaa cgggccggtc tgacctccct 1080

ggcattgatt tctatgtatc gactgctgat cctgacaaag agccacctct caccactgcc 1140

aataccatcc tttcaatcct agccgttgat tacccggttg aaaagatagc gtgctacatc 1200

tctgatgatg gaggtgccct cctcaccttc gaggcaatgg cggaggctgc tagttttgcg 1260

gacttgtggg tccccttctg ccggaagcac gacattgagc cgaggaatcc agacagttac 1320

ttcgcgttga aagttgaccc aacaaagaac aagagtagtc tggactttgt gaaggatagg 1380

aggaagatca agagggagta tgatgagttc aaggtgagga tcaacgggct tccggattca 1440

atcaggaggc ggtctgatgc tttccatgcc agggaggaaa tgaagcagtt gaagaatatg 1500

agggagaatg gaactgaccc tttggagcaa gtcaaagtcc ccaaggctac atggatggct 1560

gatggcacac attggcctgg tacttgggcg gttccttcct atgaccacgc caaaggtgac 1620

cattccggaa ttcttcaggt gatgttgaag cctcctagtc ctgactcact attgggaagt 1680

gccgatgatg acaaactcat agatttcaca gatgtggata tacgcctgcc gatgtttgtc 1740

tacatgtcac gagaaaagcg gccgggctat gatcacaaca agaaagctgg cgccatgaat 1800

gcgctggtga gagcatccgc catcttgtca aacggccctt tcattctcaa ccttgactgt 1860

gatcactaca tcaacaactg caaagctatc cgtgaaggga tgtgcttcat gatggacaga 1920

ggcggtgaaa acatctgcta cattcagttt cctcagagat tcgaaggaat tgatccctct 1980

gatcgctatg ccaatcacaa caccgtgttt ttcgacggca atatgcgtgc gcttgatggt 2040

ttgcagggtc cgatgtacgt gggaacgggg accatgttcc ggcggtttgc cttgtacggt 2100

tttgatccac caaatcctga caagctgccg gtgaagaagg atactgagac accaggagag 2160

cctttgacac agtcgaacac agaacctttg acagcctgtg actttgacgc ggatcttgac 2220

accaatctac ttcccaagcg ttttggaaat tcgacaatgc tggcggaatc cataccggtt 2280

gctgagtacc aaggccgacc cctagctgat catcccgcag tgaaatttgg acggcctcca 2340

ggcattctca gagctcctcg tgatccgcta gatgccacaa atgttgctga agccgtgtct 2400

tccatttctt gctggtacga ggacaagacc gaatggggag accgtgtggg gtggatttac 2460

gggtcggtga cagaagacgt ggtgacaggg tacagaatgc acaaccgagg atggcgctcg 2520

gtgtactgcg ttaccaagcg tgacgcattt cgaggttcag ctcccattaa tctcactgat 2580

cgacttcacc aagtgctccg ttgggcaaca ggttctgtcg aaattttctt ctctcggaac 2640

aatgccctcc tcgcctcaat gcgcctcaaa ttactacagc gccttgccta cgtcaatgtc 2700

ggtgtctacc ctttcacctc gatctttctc atcgtgtact gcttcctccc agcactctcg 2760

ctcttcactg gacagttcat cgtggctaat ctcaacatca cgtttttgat ctacttgcta 2820

accatcacca tatgcctcat tgctctggcc ctcctggagg tgaggtggtc gggggtcgcg 2880

ttggaagact ggtggcgaaa cgagcagttt tggctcatct ccggaaccag cgctcacttg 2940

gctgctgtgg tgcaagggct tctaaaagtg atggcaggga ttgaaatttc ctttaccttg 3000

acagccaagt cagctggaga ggacaatgat gatatatatg ccgacctcta ccttgtgaag 3060

tggacttccc tcatgatccc tccaattgtg attggaatgg tgaacataat agccataatc 3120

gtcgcatttt caagggaggt ttatgctctg aatcctcagt gggcgaggtt tatcggcggt 3180

gccttcttca gcttttgggt tttggctcac ttgtatcctt ttgccaaggg tttgatggga 3240

agaagaagga agacgcctac cattgtgttt gtttggtcag gtctcattgc cattacactt 3300

tccttgctct gggtcgccat taacccgcca gcccctggtg ttgtcgctgg tgctgcagga 3360

ggcgggttcc aatttccgtg a 3381

<210> 2

<211> 1126

<212> PRT

<213> 梨(Pyrus L.)

<400> 2

Met Ala Thr Ser Gln Asn Arg Glu Pro Ser Lys Lys Ala Ile Lys Ser

1 5 10 15

Pro Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gln Gly Lys Thr Asn Ser Ser Gly Gln

20 25 30

Thr Val Lys Phe Ala Arg Arg Thr Ser Ser Gly Arg Tyr Val Ser Leu

35 40 45

Ser Arg Glu Asp Leu Asp Met Ser Gly Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Met

50 55 60

Asn Tyr Thr Val His Ile Pro Pro Thr Pro Asp Asn Gln Pro Met Asp

65 70 75 80

Thr Ser Val Ala Val Lys Ala Glu Glu Gln Tyr Val Ser Asn Ser Leu

85 90 95

Phe Thr Gly Gly Phe Asn Ser Val Thr Arg Ala His Leu Met Asp Lys

100 105 110

Val Ile Asp Ser Glu Val Thr His Pro Gln Met Ala Gly Ala Lys Gly

115 120 125

Ser Ala Cys Met Met Pro Ala Cys Asp Gly Lys Val Met Lys Asp Glu

130 135 140

Arg Gly Val Asp Ile Thr Pro Cys Asp Cys Arg Phe Lys Ile Cys Arg

145 150 155 160

Asp Cys Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Asp Thr Gly Leu Cys Pro Gly Cys

165 170 175

Lys Glu Gln Tyr Arg Val Gly Asp Glu Tyr Asp Glu Pro Ser Asp Tyr

180 185 190

Asn Ser Gly Thr Leu Gln Leu Pro Gly Pro Asp Gly Lys Arg Asp Asn

195 200 205

Met Ser Val Met Lys Arg Asn Gln Thr Gly Glu Phe Asp His Asn Arg

210 215 220

Trp Leu Phe Glu Thr Lys Gly Thr Tyr Gly Val Gly Asn Ala Phe Asn

225 230 235 240

Pro Gln Asp Asp Gly Tyr Gly Asp Gly Gly Gly Asp Gly Phe Pro Gly

245 250 255

Gly Ser Leu Asp Ala Asp Asp Lys Pro Trp Lys Pro Leu Ser Arg Ile

260 265 270

Leu Pro Ile Pro Ala Ala Ile Ile Ser Pro Tyr Arg Leu Ile Val Leu

275 280 285

Ser Phe Phe Leu His Trp Arg Ile Val Asn Pro Asn Asn Asp Ala Arg

290 295 300

Trp Leu Trp Leu Met Ser Ile Ile Cys Glu Ile Trp Phe Ala Phe Ser

305 310 315 320

Trp Ile Leu Asp Gln Thr Pro Lys Phe Phe Pro Ile Asn Arg Gln Thr

325 330 335

Asp Leu Glu Val Leu His Asp Lys Phe Asp Met Pro Ser Pro Ser Asn

340 345 350

Pro Thr Gly Arg Ser Asp Leu Pro Gly Ile Asp Phe Tyr Val Ser Thr

355 360 365

Ala Asp Pro Asp Lys Glu Pro Pro Leu Thr Thr Ala Asn Thr Ile Leu

370 375 380

Ser Ile Leu Ala Val Asp Tyr Pro Val Glu Lys Ile Ala Cys Tyr Ile

385 390 395 400

Ser Asp Asp Gly Gly Ala Leu Leu Thr Phe Glu Ala Met Ala Glu Ala

405 410 415

Ala Ser Phe Ala Asp Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His Asp Ile

420 425 430

Glu Pro Arg Asn Pro Asp Ser Tyr Phe Ala Leu Lys Val Asp Pro Thr

435 440 445

Lys Asn Lys Ser Ser Leu Asp Phe Val Lys Asp Arg Arg Lys Ile Lys

450 455 460

Arg Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Val Arg Ile Asn Gly Leu Pro Asp Ser

465 470 475 480

Ile Arg Arg Arg Ser Asp Ala Phe His Ala Arg Glu Glu Met Lys Gln

485 490 495

Leu Lys Asn Met Arg Glu Asn Gly Thr Asp Pro Leu Glu Gln Val Lys

500 505 510

Val Pro Lys Ala Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr His Trp Pro Gly Thr

515 520 525

Trp Ala Val Pro Ser Tyr Asp His Ala Lys Gly Asp His Ser Gly Ile

530 535 540

Leu Gln Val Met Leu Lys Pro Pro Ser Pro Asp Ser Leu Leu Gly Ser

545 550 555 560

Ala Asp Asp Asp Lys Leu Ile Asp Phe Thr Asp Val Asp Ile Arg Leu

565 570 575

Pro Met Phe Val Tyr Met Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Tyr Asp His

580 585 590

Asn Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Val Arg Ala Ser Ala Ile

595 600 605

Leu Ser Asn Gly Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Ile

610 615 620

Asn Asn Cys Lys Ala Ile Arg Glu Gly Met Cys Phe Met Met Asp Arg

625 630 635 640

Gly Gly Glu Asn Ile Cys Tyr Ile Gln Phe Pro Gln Arg Phe Glu Gly

645 650 655

Ile Asp Pro Ser Asp Arg Tyr Ala Asn His Asn Thr Val Phe Phe Asp

660 665 670

Gly Asn Met Arg Ala Leu Asp Gly Leu Gln Gly Pro Met Tyr Val Gly

675 680 685

Thr Gly Thr Met Phe Arg Arg Phe Ala Leu Tyr Gly Phe Asp Pro Pro

690 695 700

Asn Pro Asp Lys Leu Pro Val Lys Lys Asp Thr Glu Thr Pro Gly Glu

705 710 715 720

Pro Leu Thr Gln Ser Asn Thr Glu Pro Leu Thr Ala Cys Asp Phe Asp

725 730 735

Ala Asp Leu Asp Thr Asn Leu Leu Pro Lys Arg Phe Gly Asn Ser Thr

740 745 750

Met Leu Ala Glu Ser Ile Pro Val Ala Glu Tyr Gln Gly Arg Pro Leu

755 760 765

Ala Asp His Pro Ala Val Lys Phe Gly Arg Pro Pro Gly Ile Leu Arg

770 775 780

Ala Pro Arg Asp Pro Leu Asp Ala Thr Asn Val Ala Glu Ala Val Ser

785 790 795 800

Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Glu Asp Lys Thr Glu Trp Gly Asp Arg Val

805 810 815

Gly Trp Ile Tyr Gly Ser Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg

820 825 830

Met His Asn Arg Gly Trp Arg Ser Val Tyr Cys Val Thr Lys Arg Asp

835 840 845

Ala Phe Arg Gly Ser Ala Pro Ile Asn Leu Thr Asp Arg Leu His Gln

850 855 860

Val Leu Arg Trp Ala Thr Gly Ser Val Glu Ile Phe Phe Ser Arg Asn

865 870 875 880

Asn Ala Leu Leu Ala Ser Met Arg Leu Lys Leu Leu Gln Arg Leu Ala

885 890 895

Tyr Val Asn Val Gly Val Tyr Pro Phe Thr Ser Ile Phe Leu Ile Val

900 905 910

Tyr Cys Phe Leu Pro Ala Leu Ser Leu Phe Thr Gly Gln Phe Ile Val

915 920 925

Ala Asn Leu Asn Ile Thr Phe Leu Ile Tyr Leu Leu Thr Ile Thr Ile

930 935 940

Cys Leu Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Val Arg Trp Ser Gly Val Ala

945 950 955 960

Leu Glu Asp Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Leu Ile Ser Gly Thr

965 970 975

Ser Ala His Leu Ala Ala Val Val Gln Gly Leu Leu Lys Val Met Ala

980 985 990

Gly Ile Glu Ile Ser Phe Thr Leu Thr Ala Lys Ser Ala Gly Glu Asp

995 1000 1005

Asn Asp Asp Ile Tyr Ala Asp Leu Tyr Leu Val Lys Trp Thr Ser Leu

1010 1015 1020

Met Ile Pro Pro Ile Val Ile Gly Met Val Asn Ile Ile Ala Ile Ile

1025 1030 1035 1040

Val Ala Phe Ser Arg Glu Val Tyr Ala Leu Asn Pro Gln Trp Ala Arg

1045 1050 1055

Phe Ile Gly Gly Ala Phe Phe Ser Phe Trp Val Leu Ala His Leu Tyr

1060 1065 1070

Pro Phe Ala Lys Gly Leu Met Gly Arg Arg Arg Lys Thr Pro Thr Ile

1075 1080 1085

Val Phe Val Trp Ser Gly Leu Ile Ala Ile Thr Leu Ser Leu Leu Trp

1090 1095 1100

Val Ala Ile Asn Pro Pro Ala Pro Gly Val Val Ala Gly Ala Ala Gly

1105 1110 1115 1120

Gly Gly Phe Gln Phe Pro

1125

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaactt cccagaatag aga 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacggaaat tggaacccg 19

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaattcca atttatctag aatggcaact tcccagaata gaga 44

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcccttgctc accatggatc ctcacggaaa ttggaacccg 40

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggcggttcc ttcctatga 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaagcaca tcccttcacg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccccgttccc acgtacacgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgtgtacgt gggaacgggg 20

Claims (7)

1.一种纤维素合成酶基因PbrCSLD5，该基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5编码的蛋白，该蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.克隆权利要求1所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5全长的引物对，其特征在于，该引物对由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成。

4.含有权利要求1所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

5.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是以pCAMBIA1301为出发载体，所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5的插入位点为XbaI和BamHI。

6.权利要求1所述纤维素合成酶基因PbrCSLD5在调控花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。

7.权利要求4中所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在调控花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。

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