CN109722447A

CN109722447A - 一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法

Info

Publication number: CN109722447A
Application number: CN201910177732.0A
Authority: CN
Inventors: 王鹏蔚; 宫金礼; 田真; 程运江
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-03-10
Filing date: 2019-03-10
Publication date: 2019-05-07

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，包括以下步骤：S1.将含有目的基因的表达载体转化农杆菌，并制备农杆菌菌液；S2.农杆菌侵染：将制备的农杆菌菌液注入柑橘果实中；S3.将注入农杆菌菌液的柑橘果实放置一段时间后检测目的基因的表达。操作简单易控，周期短，转化效率高，表达强度好，成本低，可以用于进行蛋白的亚细胞定位。

Description

一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法。

背景技术

柑橘是我国一种重要的经济果树，柑橘产业已经成为我国的一项重要农产业，在增加农民收入，提高国民生产总值中起着非常重要的作用。近年来，我国柑橘产业持续增长，种植面积和总产量都已经位于世界第一位，但作为多年生木本植物，柑橘生命周期长，树体高大，基因高度杂合，童期长，最为关键的是大多数柑橘品种具有多胚特性，通过有性杂交很难得到杂种。目前，柑橘遗传转化主要采用农杆菌介导法和DNA直接导入法。农杆菌介导法具有费用低廉、操作简便等优点，广泛用于柑橘的遗传转化。柑橘遗传转化的第一例成功报道是Hidaka等(Hidaka T,Omura M,Ugaki M.Agrobacterium-mediatedtransformation and regeneration of Citrus spp.from suspension cells.JapanJournal of Breeding,1990,40:199-207)的工作,他们首次用农杆菌介导转化法获得华盛顿脐橙转基因植株。在此后，柑橘的遗传转化研究取得了长足的发展。

目前，在实验室中，柑橘的遗传转化主要用根瘤农杆菌介导的转化法，需要用柑橘外植体，比如上胚轴切断、子叶、茎段等。所用外植体需无菌培养，成本高，转化效率低，且柑橘童期长，观察果实表型需若干年，极大的限制了柑橘的种质创新和柑橘功能基因组的研究。利用柑橘的外植体作为转化材料，通过这些受体转化虽然均已得到转基因植株，但是，所花费时间漫长，工作量巨大，成本较高。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供了一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，包括以下步骤：

S1.将含有目的基因的表达载体转化农杆菌，并制备农杆菌菌液；

S2.农杆菌侵染：将制备的农杆菌菌液注入柑橘果实中；

S3.将注入农杆菌菌液的柑橘果实放置一段时间后检测目的基因的表达。

进一步，所述柑橘果实选用绿熟期柑橘果实。

进一步，所述柑橘果实选择金桔。

进一步，所述步骤S2中用注射器将农杆菌菌液注入柑橘果实中，菌液的注射量为0.2～0.5mL，注射器针头的长度为0.1～0.3cm。

进一步，所述表达载体为带有荧光蛋白的融合表达载体。

进一步，所述步骤S2中将制备的农杆菌菌液与辅助质粒P19菌液等量混合后注入柑橘果实中。

进一步，所述农杆菌为农杆菌EH105、农杆菌GV3101或农杆菌C58C3。

本发明的有益效果是：本发明的农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法操作简单易控，周期短，转化效率高，表达强度好，成本低，可以用于进行蛋白的亚细胞定位及基因功能研究。

附图说明

图1为本发明选取的金桔照片；

图2为本发明实施例标记内质网的marker蛋白(GFP-HDEL)农杆菌瞬时转化金桔后GFP基因pcr扩增的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例标记内质网marker蛋白(GFP-HDEL)农杆菌瞬时转化金桔后果实中绿色荧光蛋白的显微照片；

图4为表达内质网marker蛋白(GFP-HDEL)的三种农杆菌菌株侵染金桔果实后GFP蛋白的Western检测结果；

图5为用表达标记内质网的marker蛋白(GFP-HDEL)的农杆菌转化金桔果实3-8天内金桔果实中GFP蛋白的Western检测结果；

图6为用不同浓度的表达标记微丝marker蛋白(GFP-Lifeact)的农杆菌转化金桔果实后GFP蛋白的Western检测结果；

图7为confocal观察瞬时转化标记高尔基体marker蛋白(ST-GFP)到金桔果实的亚细胞定位；

图8为confocal观察共同瞬时转化内质网marker(GFP-HDEL)和高尔基体marker蛋白(ST-RFP)到金桔果实的亚细胞定位；

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1农杆菌介导的柑橘果实的转化

1.1农杆菌活化及农杆菌侵染液的准备

本实验分别选择标记内质网的marker(GFP-HDEL)、标记微丝的marker(GFP-Lifeact),以及标记高尔基体的marker(ST-GFP,ST-RFP)作为目的基因，具体marker信息可以参照http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm网站。农杆菌菌株可以选择农杆菌EH105、农杆菌GV3101或者农杆菌C58C3,分别将含有上述目的基因的质粒转化农杆菌，并将带有荧光蛋白的农杆菌在含有Kan抗性的LB培养基上划线，28℃暗培养2天后挑取单克隆于带有Kan抗性的LB液体培养基中，200rpm，280℃培养1～2d至菌液浑浊，将菌液4000rpm离心5min，弃去上清，用infiltration buffer(10mL中含有50mg葡萄糖，1ml 50mMMES,1ml 20Mm Na₃PO₄,1ul 1M乙酰丁香酮)重悬沉淀，洗涤一次后，将菌液用infiltrationbuffer调至OD600＝0.8，等量混合P19辅助质粒菌液，P19属于基因沉默抑制因子，可以防止转基因的柑橘果实中转录后基因沉默的发生，并促进目标蛋白高水平的瞬时表达。

1.2柑橘果实的准备

柑橘类果实包括橙、柚、金桔等，可以选用橙、柚以及金桔果实，由于金桔的果肉较橙、柚等果实汁胞较少，为农杆菌提供合适的寄主环境，利于注射后蛋白的超量表达，在一个优选的实施方案中，柑橘果实选择金桔，如图1所示，选择两种典型的金桔果实作为实验材料，含有油胞的普通金桔(1A)和不含油胞的滑皮金桔(1B)，挑选新鲜的(刚采摘或采后贮藏于冷库1周内)、无病虫害、无破损的七八成绿熟期的金桔果实，清洗干净后晾干，用于农杆菌侵染。

1.3农杆菌侵染

取1ml注射器，用剪刀剪去注射器的针头，留下约0.1～0.3cm的长度(约为柑橘果皮厚度)，吸取0.2～0.5mL等量混合有P19菌液的农杆菌菌液，缓慢注入金桔果实中，可肉眼观察到农杆菌渗透进金桔果实的部位，用记号笔画圈标注菌液注射的部位，以便后续取样。

1.4套袋室温贮藏

柑橘果实注射菌液后室温静置2天后，用保鲜袋包装贮藏减少失水，室温贮藏5～15d内，用于检测目标蛋白和代谢物的表达。

实施例2农杆菌转化后注射效果检测

2.1 PCR检测GFP基因的表达

检测方法：

取注射孔附近的柑橘组织，液氮速冻后-80℃保存或直接用于提DNA。根据GFP报告基因序列设计特异性引物，其中扩增GFP基因的引物序列如下：

正向引物：5’-ATCCCACCCCTACTCCAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)

反向引物：5’-CTCGATGTTGTGGCGGATC-3’(SEQ ID NO:2)

用上述引物扩增GFP基因的特异性DNA片段，片段约为800bp。以微管植物基因rcbL为阳性对照，引物rbcLa-F/R可以微管植物基因rcbL序列为模板扩增出长度650bp左右的片段，其中扩增rcbL序列的引物序列如下：

rbcLa-F：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC(SEQ ID NO:3)

rbcLa-R：GAAACGGTCTCTCCAACGCAT(SEQ ID NO:4)

结果：

随机挑选3个被注射含有标记内质网的marker蛋白(GFP-HDEL)表达载体的农杆菌的金桔果实，通过PCR对GFP进行扩增，以微管植物基因rcbL作为内参，PCR结果凝胶电泳图如图2所示，在3个果实中均检测出了GFP基因的表达，说明通过农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化方法的可行性。

2.2显微镜观察GFP绿色荧光信号的表达

沿注射孔切开果实直接将柑橘组织放在明美体式荧光显微镜下观察注射部位绿色荧光的表达情况。

结果：选择被注射含有标记内质网的marker蛋白(GFP-HDEL)表达载体的农杆菌的金桔果实，结果如图3所示，观察到了较强的绿色荧光信号，绿色荧光信号主要集中在果皮下较外层的果肉细胞中，图3c为图3b中虚线框中的柑橘组织的细微观察图，在图3c中观察到了较强的整个组织的绿色荧光信号，进一步为研究柑橘果实中亚细胞定位提供了可能。

2.3 Western blot检测GFP蛋白表达

分别用Western blot检测不同农杆菌菌株对于金桔果实的表达效果，取标记内质网marker(GFP-HDEL)的质粒分别转化三种不同的农杆菌菌株(农杆菌EH105、农杆菌GV3101或者农杆菌C58C3)侵染后的金桔果实，检测金桔果实中GFP蛋白的表达，结果如图4所示，三种农杆菌菌株侵染后的柑橘果实均能表达，使用不同的菌株蛋白质的表达丰度略有不同，农杆菌GV3101的侵染效果优于农杆菌EH105和农杆菌C58C3。

为了确定在柑橘果实瞬时注射多长时间后可以取样用于后续研究，用标记内质网marker(GFP-HDEL)的农杆菌侵染金桔果实，并从注射菌液第3天开始取样，通过Western杂交检测不同时间GFP蛋白的表达量，结果如图5所示，注射后第5天开始GFP蛋白开始大量表达。

为了确定在柑橘果实中用于瞬时转化的农杆菌的合适浓度，将标记微丝的marker蛋白(GFP-Lifeact)的农杆菌悬浮液分别稀释成OD600分别为0.05/0.1/0.2/0.5/0.8的菌悬液侵染金桔果实，并于注射第5天后取样，通过Western blot检测GFP蛋白的表达，结果如图6所示，当OD600低于0.1时，GFP蛋白几乎没有表达，OD600高于0.1时，随着注射菌液浓度的提高，蛋白表达量逐渐增高。

Western blot方法如下：取注射孔附近的柑橘组织液氮充分研磨，加入等量的2XSDS-PAGE上样缓冲液，95℃煮沸10min，13000rpm离心3min，取上清10～30μL点样于10％-15％的PAGE胶，首先在80V条件下电泳15min，随后改为180V电泳约60min(溴酚蓝即将跑出胶底部时停止)，电泳完成后将胶转膜，100v恒压湿转1h，转膜完成后用1XTBST(含5％脱脂奶粉)4℃封闭16h或室温封闭2h，然后用标签抗体GFP一抗室温杂交2h或4℃过夜。用1XTBST在摇床轻轻漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min，然后二抗孵育1h，TBST洗3次，各10min，洗完后加显影剂于化学发光仪下曝光显影。

实施例3转化基因在柑橘果实中亚细胞定位

分别选择转入目的基因高尔基体marker蛋白(ST-GFP)、内质网marker(GFP-HDEL)、高尔基体marker蛋白(ST-RFP)成功表达的金桔果实，选择表达目标蛋白的柑橘组织，徒手切片，尽量切薄，并尽量减轻此过程中对样品施加的外界压力，将切取的柑橘组织放入酶解液中，于室温40rpm的摇床中酶解1～2h，使柑橘组织酶解分散后，confocal观察目标蛋白的细胞定位，酶解液(10ml)的配方如下：7.5ml 0.93M甘露醇、1ml 0.1M MES、0.12gCellulose R10、0.06g Macerozyme R10、0.01g BSA、10μl 1M CaCl₂，ddH₂O定容至10ml，必要时可采用0.22μm纤维素微孔滤膜在超净台内过滤得无菌酶液。(55℃水浴10分钟后，待其冷却后加入0.01g BSA和10ul1M CaCl₂，用无菌蒸馏水定容至10ml)

如图7所示，我们以高尔基体marker蛋白(ST-GFP)瞬时转化柑橘果实，在激光显微镜下可清晰观察到高尔基体的结构。为了进一步研究该体系是否可用来观察多个蛋白在柑橘果实中的共定位情况，我们以内质网marker蛋白(GFP-HDEL)和高尔基体marker蛋白(ST-RFP)共同瞬时转化柑橘果实(如图8所示)，在激光显微镜下可清晰观察到高尔基体和内质网二者共表达的结构。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcccacccc tactccaaaa a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgatgttg tggcggatc 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcaccac aaacagagac taaagc 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaacggtct ctccaacgca t 21

Claims

1.一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2.农杆菌侵染：将制备的农杆菌菌液注入柑橘果实中；

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，所述柑橘果实选用绿熟期柑橘果实。

3.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，所述柑橘果实选择金桔。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，所述步骤S2中用注射器将农杆菌菌液注入柑橘果实中，菌液的注射量为0.2～0.5mL，注射器针头的长度为0.1～0.3cm。

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，所述表达载体为带有荧光蛋白的融合表达载体。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，步骤S2中将制备的农杆菌菌液与辅助质粒P19菌液等量混合后注入柑橘果实中。

7.根据权利要求1-6任一项所述的农杆菌介导的柑橘果实瞬时转化的方法，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌EH105、农杆菌GV3101或农杆菌C58C3。