CN104894162B - 外源基因转化浮萍并进行表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种将外源基因快速高效转化入浮萍并进行表达的方法。步骤一：将外源基因转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；然后配制农杆菌重悬液；步骤二：在所述浮萍叶状体割划若干处，然后将所述割划后的浮萍叶状体在所述农杆菌重悬液中浸泡10‑15min，通过所述重组农杆菌将所述外源基因转化到所述浮萍叶状体中；然后将所述浮萍叶状体移植入铺有无菌滤纸的共培养基中，室温下避光培养3天以上。最后进行选择性筛选。本发明的转化方法操作方便，转化效率高，大大简化了将外源基因转化到宿主植株浮萍的操作，转化阳性率大大提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种将外源基因快速高效转化入浮萍并进行表达的方法。
背景技术
浮萍为单子叶水生漂浮植物，为最小的开花植物之一。因其结构简单，增殖快，不仅被广泛应用于植物生理学、遗传学、生态学和环境检测等方面，而且被广泛应用于水体污染的治理。实验室培养的浮萍叶状体从分生细胞处以类似于酵母无性繁殖的营养出芽方式快速增殖，因此遗传非常稳定；浮萍生物量平均每2-3天繁殖1代，生物量增加快，生产周期短；表达产物产量高且容易分离纯化；浮萍可用来生产在细菌和酵母中不易表达的复杂蛋白质，浮萍还可用来表达在哺乳表达系统受限或耗资太高的蛋白；严格的无菌培养使其不易受病毒的感染，其表达的疫苗安全性高；浮萍相对于其他植物来说不需要田地来进行种植生长，可通过采用野外有营养的废水来低廉生产有价值的融合蛋白或肽，而且还能净化废水供再利用；浮萍可在发酵罐或生物反应器中生长，使其更容易整合入现存的蛋白质生产工业基础建设中；因此采用浮萍作为植物生物反应器系统在生产重组蛋白方面具有良好的应用前景。
目前已经有两种浮萍成功开发为商业化生物反应器，分别是美国BIOLEX公司的LEX SystemTM表达系统和法国Lemna Gene公司的Lemna Gene TM SA表达系统，二者价格都很昂贵。国内以浮萍作为表达系统还未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种外源基因转化浮萍并进行表达的方法，包括如下步骤：
步骤一：将外源基因转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；然后配制农杆菌重悬液；
步骤二：在所述浮萍叶状体区域割划若干处，然后将所述割划后的浮萍叶状体在所述农杆菌重悬液中浸泡10-15min，通过所述重组农杆菌将所述外源基因生长到所述浮萍叶状体中；然后将所述浮萍叶状体移植入铺有无菌滤纸的共培养基中，室温下避光培养3天以上。
优选地，所述农杆菌重悬液的配制步骤为：挑取重组农杆菌单菌落在YEB固体培养基上活化；活化完成后的重组农杆菌单菌落再接种到YEB液体培养基中，26～30℃生长过夜，获得重组农杆菌菌液；然后按照体积比为1:50～100将所述重组农杆菌菌液接种于含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液体培养基中形成接种液，于26～30℃振摇至使所述接种液在波长为600nm的吸光度值为1.0；最后将所述接种液重悬于含3％蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0.6M甘露醇的1/2MS液体培养基中，得到农杆菌重悬液。
优选地，所述步骤二还包括对浮萍的预处理：在SH培养基含1％蔗糖和10μM吲哚乙酸中于23℃，在光生物反应器中16h光照/8h黑暗，40μmol/m2·sec预培养2周以上。
优选地，还包括一正交试验，即选用抗生素水溶液，浓度分别为0、5、10、20和40mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次；植物激素水溶液，浓度分别各为0、0.5、1、2和5mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次，通过分析极差值找出未经过转化的浮萍在抗生素、植物激素影响下的最佳生长条件。
优选地，所述农杆菌重悬液中所述重组农杆菌的浓度为1×108cfu/mL～1×109cfu/mL。
优选地，所述外源基因为pcambia-1300-GFP双元质粒；所述农杆菌为EHA105。
有益效果：
1、本发明选用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体重组农杆菌EHA105，该载体具有插入片段长，转化效率高的特点，能够很方便地将复杂的外源基因整合到载体上；
2、本发明采用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体，该载体表达产物为绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下激发后发绿色荧光，可以方便观察阳性转化浮萍株。
3、本发明采用浮萍叶状体直接作为转化受体，不必经过愈伤组织，该方法操作方便，转化效率高，大大简化了将外源基因转化到宿主植株浮萍的操作，转化阳性率大大提高；
3、本发明选用浮萍作为表达宿主植株，其结构简单，增殖快，遗传稳定；可用来生产在细菌和酵母中不易表达的复杂蛋白质；严格的无菌培养使其不易受病毒的感染，其表达的疫苗安全性高；相对于其他植物来说不需要田地来进行种植生长，可通过采用野外有营养的废水来低廉生产有价值的融合蛋白或肽,而且还能净化废水供再利用；浮萍可在发酵罐或生物反应器中生长，使其更容易整合入现存的蛋白质生产工业基础建设中因此采用浮萍作为植物生物反应器系统来生产重组蛋白优越性是十分显著的。
附图说明
图1为本发明双元质粒基因转化农杆菌感受态细胞过程的提取质粒电泳图；
M1——DL2000 DNA Marker；1——pcambia-1300-GFP双元质粒；M2——λ/HindIII DNA marker。
图2为本发明双元质粒基因转化农杆菌感受态细胞阳性克隆鉴定图。
M1——DL2000 DNA Marker；1——GFP forward-GFP reverse引物扩增后的pcambia-1300-GFP双元质粒产物；2，3——GFP forward-GFP reverse引物扩增pcambia-1300-GFP双元质粒转化农杆菌后的克隆产物。
图3为本发明浮萍叶状体在含有不同浓度潮霉素，6-苄基嘌呤和萘乙酸培养基中生长4周后再生情况。
图4A、4B为本发明含有pcambia-1300-GFP双元质粒载体的浮萍植株中绿色荧光蛋白的表达图。
具体实施方式
下面，将结合具体实施例对本发明作详细说明。
现有技术中引入外源基因的方法大多集中在选用愈伤组织作为转化对象，增加了实验的难度和培养周期。本发明提供一种利用浮萍表达外源基因的方法。其中，本发明所选用的外源基因载体为pcambia-1300-GFP双元质粒；该双元载体上已经整合有报告基因GFP，并带有多克隆位点，方便外源基因的插入。转化的对象为农杆菌EHA 105。该农杆菌EHA 105含有辅助Ti质粒，具有转化效率高的特点。
本发明中采用了多种培养基，具体组分如下：
(1)YEB液体培养基：是用作农杆菌培养基。本发明根据分子克隆加以修改，即将下列组分溶解在0.9L水中：胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，营养肉汤5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O0.5g，各组分溶解后用1mol/LNaOH调整pH至7.2，再补足水至1L，高压灭菌。
YEB固体培养基，是在YEB液体培养基的基础上添加琼脂粉15-20g/L。
(2)1/2MS固体培养基：每升水中溶解有0.825g/L的NH4NO3、0.95g/L的KNO3、0.085g/L的KH2PO4、0.185g/L的MgSO4·7H2O、0.220g/L的CaCl2·2H2O、0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、27.8mg/L的FeSO4·7H2O、37.3mg/L的EDTA-Na2·2H2O、2.0mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)、0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、0.4％琼脂，0.2％植物凝胶。
(3)共培养基：含3％蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0.5mg/L 6-苄基嘌呤的1/2MS固体培养基。
具体包括如下步骤：
步骤一：将双元载体质粒转化至农杆菌中，得到重组农杆菌；然后配制形成农杆菌悬液。
(1)将双元载体质粒转化至农杆菌中。根据分子克隆手册，制作农杆菌感受态细胞，然后将50～100ng pcambia-1300-GFP双元质粒加入100μL所述农杆菌感受态中，混匀成菌悬液，冰上放置30min；放于液氮或-70℃预冷的工业酒精中速冻3～5min，再放于28℃水浴5min。然后在所述菌悬液中进一步加入YEB液体培养基800μL，在28℃下，150～180rpm振荡培养3～5h；4000rpm离心2～4min。最后，弃去800μL上清液，剩余的悬浮菌体涂于含10mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上，26～30℃培养1-2天直到形成单菌落，获得重组农杆菌。
pcambia-1300-GFP载体转化农杆菌EHA 105感受态细胞验证结果：对转化后的重组农杆菌提取质粒，并经过1.5％琼脂糖电泳，结果见图1，其中，M1代表DL2000DNA梯度；M2代表λ噬菌体DNA经Hind III完全酶切后产物。可见有明显的质粒条带，分子量大小约为9k，与该双元载体的大小一致。采用所述双元质粒载体的特异引物“上下游引物(GFP forward-GFP reverse)”扩增，随机挑选2个农杆菌EHA 105单菌落为模板进行阳性克隆鉴定，产物经1.5％琼脂糖电泳，结果见图2。可见2个样品均有长度约为750bp的目的条带，跟预期相符合。说明成功地将双元质粒载体转入农杆菌中，得到了重组农杆菌。
(2)农杆菌重悬液的制备：挑取重组农杆菌单菌落在YEB固体培养基(pH 7.2)上活化2次。活化完成后再接种单菌落到YEB液体培养基中，在26～28℃培养12～16h。然后按照体积比为1:100(即重组农杆菌菌液：YEB液体培养基)将所述重组农杆菌菌液接种于含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液体培养基中，形成接种液，于26～30℃振摇至使所述接种液在波长为600nm的吸光度值为1.0；最后将所述接种液重悬于含3％蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0.6M甘露醇的1/2MS液体培养基中，得到农杆菌重悬液。
步骤二：双元质粒在浮萍组织中的转化与表达。
(1)为了获得浮萍生长的最佳状态，该步骤中还包括对浮萍进行预处理，即对待转化浮萍组织(主要是叶状体和分生组织，其中包括愈伤组织)的培养，包括如下流程：
浮萍叶状体预培养：20～25℃下，叶状体在含1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的SH培养基中培养，在光生物反应器中16h光照/8h黑暗，40μmol/m2·sec预培养2周。
(2)为了在后续实验中分析不同浓度抗生素、植物激素对经过外源基因转化的浮萍其再生能力与状况，本发明中还设计了正交实验选择培养最适条件筛选流程。
设计正交实验采用的为浮萍叶状体，抗生素为潮霉素水溶液，浓度分别为0、5、10、20和40mg/L；植物激素包括6-苄基嘌呤、萘乙酸水溶液，浓度分别各为0、0.5、1、2和5mg/L。每个浓度处理组含10个浮萍叶状体，重复3次，如表1所示。
表1.正交分析植物激素和抗生素对浮萍叶状体再生的影响
根据表1以及图3结果分析，每个浓度的各个叶状体再生后生成的叶状体数统计分析来看，极差值表明三种影响因素中，萘乙酸的浓度对浮萍生长影响最大，其次是潮霉素和6-苄基嘌呤。其中实验组6的条件，相对应为0.5mg/L 6-苄基嘌呤、0mg/L萘乙酸、5mg/L潮霉素对于浮萍叶状体再生是最适条件。为了提高抗生素对浮萍叶状体转化后的选择性，又进行了抗生素植物毒性实验，结果表明20mg/L潮霉素对于浮萍叶状体再生筛选是最适的条件。
图3是不同浓度抗生素、植物激素实验组叶状体再生后叶状体片数。本发明将单个浮萍叶状体再生后生成的叶状体群体称为一簇，每个浓度做了10个单一叶状体，相当于每个浓度有10簇叶状体群体。则：
柱状区域——表示将每个浓度组10个叶状体生成的叶状体片数/10所得的数值，即，每簇的平均叶状体片数；
黑色竖线——代表标准差；★代表实验组6与其他实验组比较P<0.01(P代表结果可信程度指标，值越大，结果可信度越低)。黑色竖线越短说明该实验组以内的各对象所得数值越接近。
(3)农杆菌转化浮萍组织及共培养：
将预培养的叶状体上用无菌解剖刀在分生组织区域割划若干处，然后在农杆菌重悬液(1×108cfu/ml～1×109cfu/ml)中浸泡10-15min左右。然后在无菌滤纸上吸干菌液，移植入铺有无菌滤纸的共培养基(含3％蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0.5mg/L 6-苄基嘌呤的1/2MS固体培养基)中，23℃，避光培养3天。此时，完成双元质粒至浮萍叶状体上的转化与瞬时表达。
此时，可以将完成双元质粒转化与表达的浮萍叶状体进行报告基因的表达检测。由于pcambia-1300-GFP载体含有GFP基因，能够产生绿色荧光蛋白，因此通过荧光显微镜观察转化后的浮萍植株来进行筛选。阳性转化植株经蓝色激发光照射能够发出绿色荧光，可以用于绿色荧光蛋白检测和定位。
见图4所示，在荧光显微镜下，采用蓝色激发光，图4A所示，暗视野下，可见叶片中有大量颗粒状的荧光点，表明外源的GFP基因在浮萍中大量表达；结合图4B所示，明视野下，浮萍叶片上的气孔清晰可见，荧光蛋白所发出的绿色荧光被白光掩盖。可以看到阳性浮萍植株叶片和新生芽上具有绿色荧光蛋白表达。表明外源蛋白成功的在浮萍中得到表达。在25个转化浮萍叶状体中有23个叶状体有绿色荧光蛋白表达，转化率达到92％。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有同等知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许变更和润饰，因此本发明的保护范围当视本发明的权利要求的范围所界定的为准。
Claims (4)
1.一种外源基因转化浮萍并进行表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将外源基因pcambia-1300-GFP双元质粒转化至农杆菌EHA 105中，获得重组农杆菌；然后配制农杆菌重悬液；所述农杆菌重悬液的配制步骤为：挑取重组农杆菌单菌落在YEB固体培养基上活化；活化完成后的重组农杆菌单菌落再接种到YEB液体培养基中，26~30℃生长过夜，获得重组农杆菌菌液；然后按照体积比为1:50~100将所述重组农杆菌菌液接种于含有50 mg/L卡那霉素，10 mg/L利福平和20 mg/L乙酰丁香酮的YEB液体培养基中形成接种液，于26~30℃振摇至使所述接种液在波长为600 nm的吸光度值为1.0；最后将所述接种液重悬于含3%蔗糖，20 mg/L乙酰丁香酮和0.6 M甘露醇的1/2 MS液体培养基中，得到农杆菌重悬液；
步骤二：在所述浮萍叶状体区域割划若干处，然后将所述割划后的浮萍叶状体在所述农杆菌重悬液中浸泡10-15 min，通过所述重组农杆菌将所述外源基因生长到所述浮萍叶状体中；然后将所述浮萍叶状体移植入铺有无菌滤纸的共培养基中，室温下避光培养3天以上；所述共培养基为含3%蔗糖、20 mg/L乙酰丁香酮、0.5 mg/L 6-苄基嘌呤的1/2 MS固体培养基。
2.根据权利要求1所述的表达的方法，其特征在于，所述步骤二还包括对浮萍的预处理：在SH培养基含1%蔗糖和10 μM吲哚乙酸中于20~25℃，在光生物反应器中16 h光照/8 h黑暗，40 μmol/m2·sec预培养2周以上。
3.根据权利要求1所述的表达的方法，其特征在于，还包括一正交试验，即选用抗生素水溶液，浓度分别为0、5、10、20和40 mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次；植物激素水溶液，浓度分别各为0、0.5、1、2和5 mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次，通过分析极差值找出未经过转化的浮萍在抗生素、植物激素影响下的最佳生长条件。
4.根据权利要求1-3任一项所述的表达的方法，其特征在于，所述农杆菌重悬液中所述重组农杆菌的浓度为1×108 cfu/mL~1×109 cfu/mL。
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