CN106318895A

CN106318895A - 一种降解烟叶中叶绿素的方法

Info

Publication number: CN106318895A
Application number: CN201610867825.2A
Authority: CN
Inventors: 杨宗灿; 张展; 马宇平; 陈芝飞; 于建春; 彭玉富; 周浩; 郝辉; 聂聪
Original assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-01-11

Abstract

本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因降解烟叶中叶绿素方法的专利申请。该方法首先将AtCLH1基因整合进入大肠杆菌基因组中构建重组菌株，然后扩增该重组菌株制备处理菌剂，再将该菌剂喷施于烟叶表面，并适当发酵即可。实验表明，供试烟叶经处理后，烟叶中的叶绿素得以快速降解，叶绿素含量得到了明显降低，降解率可达20%以上，使烟叶化学成分更为协调。由于该处理方法技术较为成熟，处理成本较低，且处理周期较短，而对烟叶质量改善较为明显，能够明显提升烟叶品质（尤其是低次烟叶品质提升较为明显），因而在烟草制备领域具有较好的应用前景。

Description

一种降解烟叶中叶绿素的方法

技术领域

本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因降解烟叶中叶绿素方法的专利申请。

背景技术

叶绿素是高等植物进行光合作用、吸收光能和光能转化的主要色素类物质，包括叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素等几种类型；叶绿素也是烟草生长过程中烟叶进行碳氮代谢的基础。

一般而言，在烟叶成熟和调制过程中，烟叶中所含叶绿素会大量降解，其降解率可达99%，通常仅以痕量存在。但受限于烟草处理方式的工艺差别，烟叶中叶绿素降解不够充分的现象也偶有存在。当烟叶中叶绿素降解不完全时，烟叶烤后易形成不同程度的“青黄烟”，这种烟叶在燃吸时，会产生明显的青杂气，进而严重影响烟叶的外观品质与内在品质。由于叶绿素降解是否充分对烟草品质具有十分重要的潜在影响，因而极有必要采取适当措施以确保烟叶中叶绿素降解充分。

叶绿素酶是一种普遍存在于高等植物中，介导叶绿素降解反应的关键酶之一，主要位于植物叶绿体内膜上，质体外也有所分布。该酶由叶绿素酶基因编码，目前已经克隆出的叶绿素酶基因共有4种，分别是藜叶绿素酶基因CaCLH、柑桔叶绿素酶基因CHLASE1和拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1、AtCLH2。但现有研究中，尚未见到较好的商品化的叶绿素酶产品，及将相关叶绿素酶基因用于降解烟草中叶绿素的有关报道。

发明内容

本发明目的在于通过合理利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，从而确保烟叶中的叶绿素降解完全，进而确保烟叶品质的稳定。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种降解烟叶中叶绿素的方法，该方法利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因进行烟叶中叶绿素的降解，其技术思路为：

该方法首先将该基因整合进入大肠杆菌基因组中构建重组菌株，然后扩增该重组菌株制备处理菌剂，再将该菌剂喷施于烟叶表面，并适当发酵即可，具体包括如下步骤：

（1）克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，具体为：

取新鲜拟南芥叶，Trizol法提取总RNA，并反转录为cDNA；

设计引物，并以上制备的cDNA为模板进行PCR扩增，获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因扩增产物；

（2）构建重组表达载体，具体为：

利用EcoRI和XhoI酶对步骤（1）中扩增所得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因的扩增产物进行双酶切，回收酶切产物；

利用EcoRI和XhoI酶对pET28a质粒进行双酶切，回收酶切产物；

利用T4 DNA连接酶将AtCLH1基因和pET28a质粒的酶切产物进行连接构建重组质粒pET28a-AtCLH1；

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后涂布进行抗性筛选；

挑取单菌落进行菌落PCR鉴定与双酶切验证后，筛选验证正确的阳性克隆进行质粒提取获得大量的构建正确的重组表达载体pET28a-AtCLH1，备用；

（3）构建重组工程菌，具体为：

将步骤（2）中所提取重组表达载体pET28a-AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌；

（4）菌株扩增与诱导表达，具体为

将步骤（3）中构建正确的重组工程菌转接于LB液体培养基中，37℃、220 rpm摇床培养，培养至OD₆₀₀=0.6左右；

然后加入终浓度为0.5 mM/L的IPTG，30℃继续诱导培养12 h；

离心收集菌体，并加入离心前等体积LB液体培养基进行重悬，此时即可作为烟叶处理用菌剂；

（5）烟叶处理，具体为：

将步骤（4）中所制备菌剂按烟叶质量0.7%~1.0%的比例，均匀喷洒与烟叶表面，然后在37℃、60%湿度条件下贮藏10d，即可快速和有效的降解烟叶中叶绿素。

本发明中所述烟叶为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的烟叶，尤其适用于青黄烟、微带青烟等叶绿素含量较高的低次烟叶。

从另一个角度而言，本申请主要涉及拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因在降解烟叶中叶绿素方面的应用的专利申请，利用该基因可有效降解烟叶中的叶绿素成分。

本发明采用分子生物学方法，将拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1进行克隆，构建了表达载体pET28a-AtCLH1，将其转化大肠杆菌后，从而获得了特定表达叶绿素酶的重组工程菌株。将该重组工程菌株扩增并诱导表达后，即可用于处理烟叶。实验表明，供试烟叶经处理后，烟叶中的叶绿素得以快速降解，叶绿素含量得到了明显降低，降解率可达20%以上，使烟叶化学成分更为协调。由于该处理方法技术较为成熟，处理成本较低，且处理周期较短，而对烟叶质量改善较为明显，能够明显提升烟叶品质（尤其是低次烟叶品质提升较为明显），因而在烟草制备领域具有较好的应用前景。

附图说明

图1为AtCLH1基因片段的PCR产物电泳图；其中M: Trans DNA marker III；1为AtCLH1基因片段的扩增产物；

图2为表达载体pET28a-AtCLH1的鉴定图；其中M: Trans DNA marker III；A为菌落PCR鉴定结果；B为双酶切鉴定结果；

图3为目的蛋白AtCLH1的SDS-PAGE电泳图；其中M：Marker，蛋白标准分子量；1：对照组，为含有空载体pET28a的大肠杆菌（E. coli）全细胞液；2~6：为含有表达载体pET28a-AtCLH1的E. coli全细胞液，其中2~6的IPTG浓度依次为0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0mmol/L、2.5 mmol/L；

图4为不同处理时间下烟叶叶绿素降解率变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分物料、实验试剂、实验设备等背景情况简要介绍如下。

生物材料：

拟南芥为Columbia 0野生型，由上海交通大学生命科学技术学院许平教授惠赠；

质粒pET28a、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21等均购自天根生化科技有限公司；

烟叶样品为2014年河南南阳GY1（青黄烟1级），由河南中烟工业有限责任公司提供；

相关引物合成及测序由上海博尚生物技术有限公司进行。

实验试剂：

LB液体培养基配方为：每1000 mL 去离子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10g，用NaOH 溶液调pH为7.0；

LB固体培养基配方为：每1000 mL 去离子水中含有：琼脂粉15 g，酵母膏5 g，蛋白胨10g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液调pH为7.0；

培养基在使用前于121℃灭菌15 min。

Trizol试剂、反转录试剂盒、EcoRI、XhoI酶等均购自宝生物工程有限公司。

实验设备：

5417R高速冷冻离心机，为德国Eppendorf公司产品；

UV-2550紫外分光光度计，为Shimadzu公司产品；

DYCZ-20F电泳仪，为北京六一生物科技有限公司产品；

VeritiDX96 PCR仪，为AppliedBiosystems公司产品。

实施例1

由于利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因构建重组菌株是本申请的关键过程，因而本实施例就该重组菌株的构建过程简要介绍如下。

（1）克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，具体为：

取生长10~15d的新鲜拟南芥叶片约100 mg，放入液氮预冷过的研钵中，迅速将叶片研磨成粉末，将粉末转移至1.5 mL离心管中，采用Trizol法进行总RNA的提取，并对提取的拟南芥总mRNA进行反转录获得cDNA。

从基因数据库中获取拟南芥叶绿素酶基因AtCLH1全长CDS序列（碱基序列如SEQID NO.1所示），以此为基础，设计如下引物对，

引物1：5'-GCGGAATTCATGGCGGCGATAGAGGACAG-3'（加EcoR I酶切位点），

引物2：5'-CCGCTCGAGCTAGACGAAGATACCAGAAG-3'（加Xho I酶切位点）；

以上述所制备的拟南芥全cDNA为模板进行PCR扩增，50 µL扩增体系设计如下：

10×高保真PCR buffer，5 µL；

dNTP mix，10 mmol/L、1 µL；

MgSO₄ ，50 mmol/L、2 µL；

引物1，10 µmol/L、1.5 µL；

引物2，10 µmol/L、1.5 µL；

cDNA ，2.0 µL；

Pfu DNA polymerase，0.2 µL；

ddH₂O，36.8 µL；

PCR程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火40 s，68℃延伸75 s，35个循环；68℃延伸10 min；PCR扩增产物进行检测分析或4℃保存备用。

PCR产物进行凝胶电泳检测后，结果如图1所示，从图1中可以看出，其在目标位置有很清晰的条带，回收后送至上海博尚生物技术有限公司进行进一步测序验证。

（2）构建重组表达载体，具体为：

利用EcoRI和XhoI酶对步骤（1）中扩增所得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因的扩增产物进行双酶切，回收酶切产物；利用EcoRI和XhoI酶对pET28a质粒进行双酶切，回收酶切产物；具体50 µL酶切反应体系设计如下：

EcoR I，1µL；

Xho I，1µL；

10xH buffer，5µL；

pET28a，5µL；（酶切pET28a质粒时，采用20µL）

ddH₂O加至50µL；

37℃水浴中双酶切3~4 h，之后对酶切后的pET28a质粒和AtCLH1基因片段分别进行回收。

利用T4 DNA连接酶将酶切后的AtCLH1基因片段和pET28a质粒进行连接，构建重组质粒pET28a-AtCLH1；10 µL连接体系设计如下：

10x Ligase buffer，1 µL；

AtCLH 1酶切产物，5 µL；

pET28a 质粒酶切产物，3 µL；

Ligase Mix，1 µL；

16℃恒温水浴中，连接过夜。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体步骤为：

-80℃冰箱中取出200 µL DH5α感受态细胞悬液，冰上解冻；

将过夜连接产物放入解冻后的感受态细胞中，充分混匀；

置于冰上30 min后，42℃水浴热激30 s，冰浴2 min；

加入200 µL的LB液体培养基，37℃培养l h；

取80 µL培养物涂布于含有kan (卡那霉素，100 µg mL^-1)的LB平板上进行抗性筛选，于37℃条件下下倒置培养过夜。

在kan⁺抗性LB平板上挑取几个生长良好的单菌落进行菌落PCR鉴定与双酶切验证，菌落PCR鉴定方法参考步骤（1）中基因片段PCR扩增方法，双酶切验证方法参考上述步骤（2）中pET28a质粒双酶切方法。

结果表明，筛选得到的阳性克隆可在目标位置扩增出明显条带，且在目标位置双酶切出正确大小的条带（如图2），将筛选验证正确的阳性克隆进行质粒提取，获得重组表达载体pET28a-AtCLH1，备用。

（3）构建重组工程菌，具体为：

将步骤（2）中所提取重组表达载体pET28a-AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，方法参考步骤（2）中DH5α感受态细胞转化方法，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌落，菌落筛选与鉴定方法参考步骤（2）中的单菌落筛选、鉴定方法。

实施例2

针对实施例1中所制备的重组工程菌株，在将其用于降解烟叶中叶绿素时，尚需适当诱导重组表达载体pET28a-AtCLH1以充分表达叶绿素酶，才能较为有效降解烟叶中所含叶绿素。为确定较佳的诱导条件，发明人进一步进行了有关实验，简要介绍如下。

挑取实施例1中所制备的重组工程菌，置于LB液体培养基中，37℃、220 rpm摇瓶培养，培养至OD₆₀₀=0.6时，分别加入不同终浓度梯度的IPTG（0.2 mM/L、0.5 mM/L、1.0 mM/L、2.0 mM/L、2.5 mM/L），30℃继续诱导培养12 h，12000 rpm离心5 min，收获菌体；将菌体用LB液体培养基重悬，调整菌液OD₆₀₀=2.0；然后沸水浴与冰浴交替处理5次，用SDS-PAGE电泳检测特异蛋白的表达情况。结果如如图3所示。

对图3分析可以看出，当IPTG浓度为0.5 mM/L时，重组蛋白AtCLH1的表达量最高，分子量为35 kDa，说明构建的工程菌株能很好的表达目的基因AtCLH1。

基于上述诱导表达结果，在将实施例1中所构建重组工程菌具体用于处理烟叶时，菌剂具体制备步骤如下：

（1）菌种活化，首先将实施例1中所构建的重组菌株置于LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养15 h；

（2）制备种子液，挑取步骤（1）中单菌落置于5 mL、LB液体培养基中，37℃、220 rpm摇床振荡培养过夜；

（3）制备发酵液，将步骤（2）中种子液按1:150的体积比，接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=0.6左右；

（4）诱导表达，在步骤（3）培养结束后菌液中加入终浓度为0.5 mM/L的IPTG，30℃继续诱导培养12 h，12000 rpm离心5 min，收获菌体，弃上清；

LB液体培养基重悬菌体沉淀，12000 rpm离心5 min，收获菌体，弃上清；重复此步骤数次（一般为3次），最后用LB液体培养基重悬后即获得处理用菌剂。

进一步地，发明人对于所获得菌剂中的叶绿素酶活性进行了检测，具体检测过程简介如下。

（1）首先制备酶作用的叶绿素底物

用刀片将刚从大田中采收的新鲜烟叶（品种为中烟100）叶片切成直径小于1 mm的细丝，取3.0 g切好的叶丝加入30 mL无水乙醇中，用铝箔纸将其包裹，以防叶绿素见光分解；

黑暗条件下浸泡提取过夜，离心后取上清液与蒸馏水混合（比例为1:1），作为酶作用的叶绿素底物溶液。

（2）测定叶绿素酶活性

取1 mL上述所制备的处理用菌剂，加入到2 mL叶绿素底物溶液中，混匀后立即用分光光度计检测720 nm处吸光值，读取起始数据记录为A；准确计时20 min后，读取并记录OD₇₂₀值B；

对照样品为相同处理条件下含有空载体pET28a质粒的大肠杆菌 BL21感受态转化菌株（制备方法参考实施例1及本实施例中相关步骤）；

实验组与对照组分别测量6次，取平均值。

叶绿素酶的酶活定义为单位时间内（1 min）反应体系的OD₇₂₀值变化0.001为1个酶活力单位，定义为1 U；

酶活力通过计算公式：E(U) = N(A-B)×1000/20得到，其中N为样品稀释倍数。

测定结果表明，所构建的重组工程菌株具有较高的叶绿素酶活（24.9 U/mL），具体结果如下表所示：

。

实施例3

将实施例2中所制备菌剂处理烟叶样品时，按烟叶一定质量比例（0.7%~1.0%），均匀喷洒于烟叶表面后，37℃、60%湿度条件下作用10~15d即可。为确定较佳处理工艺及处理后烟叶品质改善效果，发明人进行了进一步的实验，具体过程简介如下。

（一）烟草预处理

采用2014年河南南阳GY1（青黄烟1级）的青黄烟叶，抽取烟梗后，将烟叶分割成片状（3cm×3 cm），然后均匀分成2组，1组为待处理组，另1组为对照组（CK），每组处理均为300 g。

（二）降解处理

将实施例2中所制备的处理用菌剂按烟叶质量0.8%的比例，均匀喷洒于烟叶上，对照组喷洒同等质量（0.8%的比例）的蒸馏水作为对照；

喷洒后，将处理组和对照组均置于37℃、60%湿度条件下贮藏12d，其中每2d取样一次，对其叶绿素含量进行测定，同时分别取样，将烟叶按现有烟支制备工艺制备成成品卷烟进行感官质量评价，以确定叶绿素降解效果。

叶绿素降解率测定

叶绿素降解率测定及计算方法如下：

（1）取烟叶样品，烘干后过40目筛，制成烟末，称取0.5 g烟末，加入30 mL 无菌水，于70℃避光浸泡处理4 h，之后抽滤，充分洗涤残渣，将残渣转入锥形瓶中，加入25 mL 、90%体积比例的丙酮，超声处理20 min，抽滤取滤液；

（2）对步骤（1）中滤液，分别测定646 nm、663 nm处吸光值；按照下述公式计算烟叶中叶绿素含量，最后与初始对照对比换算获得叶绿素降解率；

Ca（mg/L）=12.21OD₆₆₃-2.81OD₆₄₆；

Cb（mg/L）=20.16 OD₆₄₆-5.03 OD₆₆₃；

式中，Ca：叶绿素a，Cb：叶绿素b；叶绿素含量（mg/L）= Ca+ Cb。

不同处理时间时烟叶中叶绿素降解率测定结果如图4所示。从图4中可以看出，烟叶经菌液制剂处理后，叶绿素降解率随处理时间延长逐渐增高，当处理10天时，烟叶中叶绿素降解率可达最高值（23%），之后趋于稳定。

烟叶感官质量评价

对所制备的烟支，经恒温恒湿箱平衡后，由专业评委对香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激性（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，感官评吸总分（T）=（A+B）× 2.3 + C × 1.5 + D + E + F + G。

对不同处理时间时烟叶的感官评吸进行统计，结果如下表所示：

。

对上表数据进行分析，可以看出，经过菌液制剂处理过的烟叶，在处理10天时评吸总分达到最高值，总分相比对照增加了1.13分，但与处理12天时评吸总分相差不大，结合上述烟叶叶绿素降解率结果，可确定菌液制剂的最佳处理时间为10天，此时可使烟叶叶绿素降解23%，评吸总分相比对照提高1.13分，使烟叶整体提高了一个等级，因而本发明在快速高效降解烟叶叶绿素，改善烟叶（尤其是青黄烟叶、微带青烟叶等低次烟叶）整体质量方面具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南中烟工业有限责任公司

<120> 一种降解烟叶中叶绿素的方法

<130> none

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<170> PatentIn version 3.5

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<211> 1003

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

gcaaacagac cccataatcc ttaaaagaga gctgtaatga atatgtctta cacaatctcc 60

attggtggtg cttcctaatc taccactgaa gaacttatca cagtagcaaa ccacaattct 120

gcatataaac aaacagaatg tgaacttcga atcagagcca ttataataca tagaggtgaa 180

ggcagagacc tcaaaatcta acgcagaaat catcaatgga acggaattaa agtaaataca 240

atagatgatt ctaaaatccg ggggttcacc agggactcac cagagcaact agggttccgc 300

aggattgaaa cgaggtatat gaagatgcgg cggaattcga atccaacggc tgagagagat 360

ttcaattact cgacggagat ggccgccgat ctgagagaga gagagacgga ggttgggtgc 420

gtcgcaggga aattgtgcca cgtcaccctt cctctcttct ttttctgttc tctgtttttc 480

ttgtgctact atttgttttt ggtcaaattt tacttttttg gtcaatttgt ttcttttttt 540

tttacataac aatttttttt ttttttttac tgaacaaaca taacaaaatg ttttttttaa 600

caaacataac aatatgtttc ctaatgcaat ttgattatat tttttagtag tacttagtaa 660

gtcttggtat gtgtttatgg acacatcgtt ttcgggaaac gaattaaatt gtactccgaa 720

aatgataaat gcatggagta attgtatacc aactaacttg taataatttg aatcaacaca 780

tgctcttttg tttacgcagc ccatgcattt atcgttttcg aaagtattta attcattttg 840

ttataactac gatgagaagc cgagagaacc acagaattat aatgaatcgg ataagaaaaa 900

tcaacattct ccccctataa atacaaaaca actagctaaa gttcgaagga ttcatacata 960

aatcttcaac acaactcttt aattatctag tttaatacaa atg 1003

Claims

1.一种降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，该方法利用拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因进行烟叶中叶绿素的降解，具体包括如下步骤：

（1）PCR克隆获得拟南芥叶绿素酶AtCLH1基因，

（2）构建重组表达载体pET28a-AtCLH1；

（3）构建重组工程菌，具体为：

将步骤（2）中重组表达载体pET28a-AtCLH1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选、鉴定后获得转化正确的重组工程菌；

（4）菌株扩增与诱导表达，具体为：

将步骤（3）中构建正确的重组工程菌转接于LB液体培养基中，培养，并加入IPTG诱导表达；

诱导表达结束后，离心收集菌体，并加入LB液体培养基进行重悬，以此可作为烟叶处理用菌剂；

（5）烟叶处理，具体为：

将步骤（4）中所制备菌剂均匀喷洒于烟叶表面。

2.如权利要求1所述降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，步骤（4）中，IPTG浓度为0.5 mM/L。

3.如权利要求1所述降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，步骤（5）中，菌剂喷施量为烟叶质量的0.7%~1.0%。

4.如权利要求1所述降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，步骤（5）中，喷施后烟叶于37℃、60%湿度条件下贮藏10d。

5.如权利要求1所述降解烟叶中叶绿素的方法，其特征在于，所述烟叶为青黄烟或微带青烟烟叶。