CN105078966A - Cephaloziellin A在制备治疗胃癌药物中的应用 - Google Patents
Cephaloziellin A在制备治疗胃癌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Cephaloziellin？A在制备治疗胃癌药物中的应用，属于药物领域。体外试验证明，PDTC与Cephaloziellin？A单独作用于胃癌细胞均可以抑制癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡；2种药物联合应用后促进胃癌细胞的凋亡效果更显著，细胞的生长抑制率及凋亡指数均较单独用药组升高。研究发现PDTC及Cephaloziellin？A2种药物联合应用对胃癌细胞的抑制作用更显著，且2种药物均为非传统意义的化疗药物，对机体损害小，而且避免了肿瘤细胞对传统化疗药物的耐药性。Cephaloziellin？A可进一步研究开发成制备治疗胃癌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及化合物CephaloziellinA的新用途，具体涉及CephaloziellinA在制备治疗胃癌药物中的应用。
背景技术
Rui-JuanLi等人首次分离纯化出化合物CephaloziellinA，并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(SecondaryMetabolitesfromtheChineseLiverwortCephaloziellakiaeri，J.Nat.Prod.，2013，76，1700-1708)。
目前尚未有该化合物的活性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CephaloziellinA的医药用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
CephaloziellinA在制备治疗胃癌药物中的应用，所述CephaloziellinA化学结构式如下，
进一步地，所述胃癌为SGC-7901胃癌。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
实施例1：CephaloziellinA的分离制备及结构确证
CephaloziellinA的制备方法同文献报道的制备方法(SecondaryMetabolitesfromtheChineseLiverwortCephaloziellakiaeri，J.Nat.Prod.，2013，76，1700-1708)。
结构确证：白色无定形粉末，分子式为C20H24O6，不饱和度为9。IR光谱数据显示化合物含有羟基(3444cm-1)和内酯(1770cm-1)基团。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(1.93，m)，H-1(2.05，m)，H-2(1.67，m)，H-2(2.89，m)，H-3(4.60，m)，H-4(2.00，br，s)，H-6(4.58，t，J＝8.90)，H-7(2.24，dd，J＝14.4，8.4)，H-7(1.77，dd，J＝14.4，9.6)，H-10(2.21，m)，H-11(2.24，dd，J＝14.4，8.4)，H-11(2.30，dd，J＝14.4，6.0)，H-12(5.31，dd，J＝8.4，6.0)，H-14(6.25，br，s)，H-15(7.40，br，s)，H-16(7.38，br，s)，H-17(1.19，s)，H-19(1.39，s)，H-20(5.23，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，600Hz)：18.5(CH2，1-C)，25.2(CH2，2-C)，71.9(CH，3-C)，55.1(CH，4-C)，39.4(C，5-C)，84.3(CH，6-C)，41.6(CH2，7-C)，73.5(C，8-C)，55.8(C，9-C)，42.6(CH，10-C)，40.3(CH2，11-C)，70.4(CH，12-C)，129.1(C，13-C)，108.0(CH，14-C)，143.8(CH，15-C)，138.7(CH，16-C)，27.1(CH3，17-C)，178.0(C，18-C)，29.9(CH3，19-C)，105.5(CH，20-C)。
结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的CephaloziellinA。
实施例2：CephaloziellinA的药理作用试验
一、材料和仪器
人胃癌细胞株SGC-7901购于赛尔试剂公司。CephaloziellinA自制，HPLC归一化纯度大于98％。PDTC、胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖、冰醋酸购于美国Sigma公司。RPMI-1640培养基、PBS磷酸盐缓冲溶液购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于山东银香伟业公司。台盼蓝(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TUNEL试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，甲醛(美国Fisher公司)，过氧化氢酶(天津市天新精细化工开发中心)。
WD-9403C紫外分析仪(德国Biometra公司)，梯度PCR仪(德国Biometra公司)，凝胶成像分析系统(上海天能公司)，电泳仪(北京六一)，电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)，RKI-1002型二氧化碳培养箱(日本Ikemoto公司)，超净工作台(苏州净化实验设备有限公司)，超速离心机(北京医疗器械厂)，低速离心机(北京医疗器械厂)，WilovertS型倒置显微镜(日本Olympus公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)，细胞计数板(上海精密仪器公司)，超纯水纯水器(英国PURELABulTRAGENETIC)。
二、试验方法
1、胃癌细胞SGC-7901的培养
1.1细胞复苏
(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37℃-42℃，75％酒精中，然后移至同温水浴锅中；
(2)轻轻晃动l-3min冻存管，使冻存液融化，迅速移至超净台中；
(3)将含有细胞的冻存液吸入无菌离心管，加入适量RPIM-1640培养基；
(4)吹打混匀后放入低速离心机，800rpm/min离心3分钟，去除上清液；
(5)加入适量培养基吹匀，将细胞悬液依据浓度接种到10mL培养皿中；
(6)置于含5％二氧化碳、37℃饱和湿度的培养箱中培养。
1.2细胞传代
(1)待培养皿中的细胞贴壁约80％时，在超净台中用移液管吸取旧的培养基吹打数次培养皿中细胞，以吹掉死亡细胞；
(2)用移液管吸去旧培养基，加入适量0.25％胰酶消化细胞，置于30℃培养箱中消化；
(3)约3min后将培养皿置于倒置显微镜下观察，待细胞周边发亮、回缩变圆后则说明细胞已经从壁上脱离；
(4)迅速于超净台中吸去胰酶。加入适量培养基反复吹打细胞，使细胞完全脱离培养皿；
(5)将细胞悬液按浓度分别接种至不同的培养皿中，补足培养基；
(6)重新置于含5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养。
2、细胞计数
(1)准备好细胞计数板及盖玻片，二者均用酒精擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上；(2)待酒精挥发后，吸出适量细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，注意不要溢出盖玻片及两侧的玻璃槽，静置后计数；(3)在显微镜下找到4个大格，每个大格又分为16个小格，分别计数4个大格中的细胞数，取平均值。压线细胞计左侧和上方的，不计右侧和下方的；(4)细胞浓度(个/mL)＝每个方格的平均细胞数×10000；(5)将细胞悬液稀释成实验所需浓度。
3、细胞活力测定
(1)取待测定的SGC-7901胃癌细胞悬液0.9mL；(2)向细胞悬液中加入台盼蓝吹打混匀；(3)采用细胞计数板盲法计数至少200个细胞，倒置显微镜下观察；(4)镜下观察细胞染色情况，细胞内染成淡蓝色者为死细胞，未染色者为活细胞，以活细胞所占细胞总数的百分比反映细胞的活力(％)。
4、MTT检测细胞生长抑制率
实验分组：①阴性对照组；②CephaloziellinA组1，CephaloziellinA(50μmol/L)；③CephaloziellinA2，CephaloziellinA(100μmol/L)；④PDTC组1，PDTC(50μmol/L)；⑤PDTC组2，PDTC(100μmol/L)；⑥联合用药组1，CephaloziellinA(25μmol/L)+PDTC(25μmol/L)；⑦联合用药组2，CephaloziellinA(50μmol/L)+PDTC(50μmol/L)。
(1)取对数生长期的SGC-7901细胞，用细胞计数板计数，调节细胞浓度为5×l05/mL；(2)使用加样器以每孔100μL接种于96孔板。注意接种时只接种到中间的60个孔，周边36孔以PBS填充，同时铺3个96孔板；(3)将铺好的96孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，待24h细胞贴壁后取出；(4)将96孔板分为CephaloziellinA组，(0、50、100μmol/L)，PDTC组(0、50、100μmol/L)，2药联合组(0/0、25/25、50/50μmol/L)，同时设立不含细胞的空白对照组(只加培养基)分别予以不同处理；(5)各药物每个浓度设5个复孔，分别培养24、48及72h；(6)分别在特定的结束时间点取出96孔板，每孔加入MTT(5g/L)溶液20μL，放回培养箱继续培养4h，终止培养。(7)小心吸去孔内上清液，每孔加入150μLDMSO，平板摇床振荡10min使结晶充分溶解，显微镜下观察颗粒消失。(8)于酶标仪490nm波长处测定各孔的光密度(OD)值，计算各时间点的细胞生长抑制率。抑制率＝[1-(加药组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。
5、TUNEL法检测细胞调亡指数
5.1细胞爬片的制备
(1)盖玻片的处理：将盖玻片置于浓硫酸中浸泡过夜，次日先用自来水冲洗数次，再置于无水乙醇中浸泡4h，然后用去离子水冲洗干净，放在供干箱中烘干后进行高压消毒，取出直接放入超净台中备用。6孔板置于超净台内紫外线照射30min；
(2)放置盖玻片：在六孔板的每孔中准备放盖玻片的位置滴入少量培养基后再放置盖玻片，使得盖玻片与孔板考培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时盖玻片飘起，造成双层细胞贴壁；
(3)取对数生长期的SGC-7901细胞，消化吹打成细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度为l×106/mL。
(4)用加样器在放有盖玻片的每孔分别加入1mL细胞悬液，同时铺3板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h待细胞贴壁；
(5)24小时细胞贴壁后在超净台中将6孔板分为阴性对照组和实验组分别予以不同处理，阴性对照组加1mL培养基，实验组再分为CephaloziellinA组、PDTC组及联合用药组3个亚组，每孔加1mL药物。CephaloziellinA组终浓度为100μmol/L，PDTC组终浓度为100μmol/L，2药联合组终浓度为2种药物各为50μmol/L每组设2个复孔。
(6)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
5.2TUNEL法操作步骤
(1)细胞爬片加药培养24h时取出6孔板，按照TUNEL说明书依次进行如下步骤；(2)小心吸弃每孔里的上清液；(3)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次；(4)每孔加入1mL预冷细胞固定液，4℃冰箱固定30min。(5)吸弃固定液，每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(6)浸入封闭液中，室温(15℃-25℃)封闭10min。(7)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。(8)每个样本滴加50μLUTdT酶反应液，37℃，避光湿润反应60min。(9)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。(10)滴加50μLStreptavidin-HRP工作液，37℃，避光湿润反应30min。(11)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(12)滴加100μLDAB工作液，室温显色反应10min。(13)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(14)光学显微镜下观察拍照:随机选取10个高倍(×100)视野，每个视野计数100个细胞，计算调亡指数的平均值。凋亡指数(AI)＝(阳性细胞数/总细胞数×100％)。阳性细胞的细胞核呈棕褐色。
6、统计学分析
采用SPSS11.5进行分析，符合JH态分布的计量资料以表示，组间比较用Oneway-ANOVA法进行分析，两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。
三、结果及结论
1、MTT检测药物对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制率
经3次重复MTT，检测结果显示，单个药物作用于胃癌细胞72h后，100μmol/L的药物组较50μmol/L的药物组对胃癌细胞的生长抑制率均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。50μmol/L的CephaloziellinA对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)。50μmol/L的PDTC对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药50/50μmol/L组对胃癌细胞的生长抑制率高于各个高浓度单药组(100μmol/L)对胃癌细胞的生长抑制率，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1(*P<0.05，**P<0.01)。
2、TUNEL法检测各组凋亡指数
CephaloziellinA、PDTC及联合用药组均对胃癌细胞SGC-7901有抑制生长的作用，各组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.001)，阴性对照组有少量细胞的胞核被染成棕褐色，各个单药组与联合用药组凋亡细胞较阴性对照组相比均有增加，联合用药组细胞的凋亡指数最高，对胃癌细胞的抑制效果更显著。见表2(**P<0.01)。
结论，PDTC与CephaloziellinA单独作用于胃癌细胞均可以抑制癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势，2种药物联合应用后促进胃癌细胞的凋亡效果更显著，细胞的生长抑制率及凋亡指数均较单独用药组升高。研究发现PDTC及CephaloziellinA2种药物联合应用对胃癌细胞的抑制作用更显著，且2种药物均为非传统意义的化疗药物，对机体的损害小，而且避免了肿瘤细胞对传统化疗药物的耐药性，可以为今后胃癌的临床治疗提供参考。
表1各药物组不同时间点对胃癌细胞的生长抑制率(n＝5，)
| 组别 | n | 24h | 48h | 72h |
| Cephaloziellin A 50μmol/L(1) | 5 | 14.87±5.19 | 16.29±4.53 | 55.70±6.67 |
| Cephaloziellin A 50μmol/L(2) | 5 | 31.00±6.36 | 59.42±7.74 | 74.32±5.84 |
| PDTC 50μmol/L(3) | 5 | 24.87±9.04 | 36.83±5.21 | 40.58±7.15 |
| PDTC 100μmol/L(4) | 5 | 42.86±6.28 | 44.21±8.44 | 50.31±4.63 |
| 联合用药25/25μmol/L(5) | 5 | 36.43±8.13 | 38.76±10.87 | 58.55±9.53 |
| 联合用药50/50μmol/L(6) | 5 | 49.38±2.24 | 74.56±10.59 | 96.12±2.25 |
| F | 17.918** | 29.646** | 47.625** | |
| P(1):(2) | 0.001 | <0.001 | <0.001 | |
| (3):(4) | <0.001 | 0.169 | 0.025 | |
| (5):(6) | 0.005 | <0.001 | <0.001 | |
| (1):(5) | <0.001 | <0.001 | 0.49 | |
| (3):(5) | 0.01 | 0.713 | <0.001 | |
| (2):(6) | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |
| (4):(6) | 0.13 | <0.001 | <0.001 |
表2药物作用24h后各组细胞的凋亡指数(n＝3，)
Claims (2)
1.CephaloziellinA在制备治疗胃癌药物中的应用，所述CephaloziellinA化学结构式如下，
2.根据权利要求1所述的CephaloziellinA在制备治疗胃癌药物中的应用，其特征在于：所述胃癌为SGC-7901胃癌。
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| WO2017071380A1 (zh) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | 李淑兰 | 一种用于治疗肝癌的肿瘤疫苗及其制备方法 |
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