CN115812589B - 一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，涉及生物技术领域。该培养方法包括将加工型辣椒不易出胚基因型与加工型辣椒花培DH系杂交，获得杂交一代，再将所述杂交一代的花药进行花药培养的步骤。本发明以加工型辣椒花培DH系作为桥梁，与加工型辣椒不易出胚基因型进行杂交，以其杂交一代为花药培养的供体亲本，可以明显地提高加工型辣椒不易出胚基因型花药培养的出胚率。本发明提供的加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，步骤实用、效率高，特别适合加工型辣椒细胞工程领域方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)是世界上一种重要的经济作物，可作为蔬菜、香料、食用色素和医药用途。2020年全球用于干制的辣椒种植面积已达161.5万公顷，产量达415.7万吨(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。目前，便利的交通和经济的迅猛发展，加速了全球人口流动，导致嗜辣地区和人群越来越多。随着辣椒育种工作的深入开展，自然资源中辣椒种质已显现出匮乏和急剧衰退的趋势。因此，加快种质资源的创新效率是当前加工型辣椒育种工作者面临的亟待解决的问题。
花药培养能从细胞水平上快速创制单倍体植株，单倍体能在植株上较充分地呈现重组的配子类型，创制出新基因型植株，经秋水仙素加倍后可获得双单倍体纯系(DoubledHaploid,DH)。因此，通过花药培养可获得性状优良的、符合育种目标的DH系，根据育种目标进入常规育种程序，可直接作为育种的中间材料或亲本之一育成杂交品种。花药培养与南繁结合可以在1-2年内快速获得DH系，较传统方法缩短3-4年的时间，显著提高育种的效率。
有关辣椒花药培养的大量研究表明，供体植株的基因型对花药培养胚状体诱导的影响极为重要，不仅影响胚状体诱导率，而且也影响胚状体质量和成苗率(戈伟等,江苏农业科学,2011,39(5):27-28、张芳等,西北农业学报,2009,18(5):341-345、李健欣等,植物生理学通讯,2009,45(8):794-796)。申请号为200610042616.0的中国发明专利申请中公开了一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，主要涉及实行液固双层培养系统，采用麦芽糖作为碳源，低温处理，连续黑暗培养，以此方法提高胚状体的诱导效率。加工型辣椒花药培养近年来也取得了一定的成就，李怡斐等(分子植物育种,2020,18(19):6467-6473)、李怡斐等(分子植物育种，2017,15(06):2317-2321)、李怡斐等(中国园艺学会2018年学术年会会议论文集)通过辣椒花药培养创制了一些优异的DH系。但是由于加工型辣椒花药培养胚状体诱导率低，对不易出胚基因型效果更不理想，这极大地限制了加工型辣椒花药培养技术在育种上的应用。因此，寻找一种提高加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的培养方法可以有效提高加工型辣椒不易出胚基因型花药培养的出胚率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，包括将加工型辣椒不易出胚基因型与加工型辣椒花培DH系杂交，获得杂交一代，再将所述杂交一代的花药进行花药培养的步骤。
进一步地，所述辣椒花培DH系为渝辣选7-1或渝辣选3-2。
进一步地，所述杂交一代的花药进行花药培养的步骤包括：将所述花药接种于1#培养基或2#培养基进行培养；
所述1#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/LAgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.50mg/L 2,4-D+10g/L椰子汁，pH＝5.8；
所述2#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/LAgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.30mg/L 2,4-D，pH＝5.8。
进一步地，所述花药的培养条件包括：先在35℃条件下黑暗培养5天，然后在28±0.5℃条件下黑暗培养30-40天。
进一步地，所述杂交一代的花药进行花药培养的步骤包括：先将所述花药接种于1#培养基进行培养，再转接于2#培养基继续进行培养；
所述1#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/LAgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.50mg/L 2,4-D+10g/L椰子汁，pH＝5.8；
所述2#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/LAgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.30mg/L 2,4-D，pH＝5.8。
进一步地，所述花药先在1#培养基中培养15天，再转接于2#培养基。
进一步地，所述花药在所述1#培养基中，先在35℃条件下黑暗培养5天，然后在28±0.5℃条件下黑暗培养10天。
进一步地，所述花药在所述2#培养基中的培养条件包括：28±0.5℃条件下黑暗培养20-30天。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以加工型辣椒花培DH系作为桥梁，与加工型辣椒不易出胚基因型进行杂交，以其杂交一代为花药培养的供体亲本，可以明显地提高加工型辣椒不易出胚基因型的出胚率。本发明推测来自花药培养诱导出的胚状体获得的花培DH系携带易出胚基因，以加工型辣椒花培DH系与加工型辣椒不易出胚基因型的杂交一代为供体亲本进行花药培养，提高了加工型辣椒不易出胚基因型的出胚率，打破了基因型的限制。
本发明发现，接种花药后，先35℃黑暗处理5天，然后转至28±0.5℃的组织培养室黑暗培养10天，随后于超净工作台，将已培养的花药更换至2,4-D浓度稍低的2#培养基，继续于组织培养室黑暗培养，可以极大地提高胚状体的诱导效率，最高达19.33％，且胚状体发育正常，成苗率高(93.10％)。
本发明提供的加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，步骤实用、效率高，特别适合加工型辣椒细胞工程领域方面的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为从花药或愈伤组织中露出白色的胚状体；
图2为子叶型胚状体；
图3为花培苗图片；
图4为接种至生根培养基上培养的花培苗；
图5为练苗和移栽后的苗；
图6为移栽成活的花培苗；
图7为用保鲜膜包裹花培苗；
图8为加倍后辣椒花培植株。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用培养基的配方如下：
1#培养基的组成成分为：MS培养基(货号M519)+0.50mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+4mg/LAgNO3(硝酸银)+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.50mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+10g/L椰子汁，pH＝5.8。
2#培养基的组成成分为：MS培养基(货号M519)+0.50mg/L 6-BA+4mg/LAgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.30mg/L 2,4-D，pH＝5.8。
培养基于121℃下灭菌20min，待培养基冷却至50℃左右时，在无菌条件下分装至90×90mm的无菌培养皿，1L培养基分装30个培养皿，将装有培养基的培养皿置于无菌保鲜袋中，密封后于无菌黑暗的环境中保存待用。
以下实施例中的加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”已在文献“黄启中，黄任中，吕中华，张世才.单生朝天椒新品种艳椒425的选育[J].西南农业学报，2011，24(04):1460-1463”中公开，加工型辣椒花培DH系“渝辣选7-1”和“渝辣选3-2”已在文献“李怡斐，杨小苗，王春萍，段敏杰，黄任中，张世才.抗疫病加工型辣椒细胞质雄性不育恢复系的创制[J].西北植物育种，022，42(10):1637-1643”中公开，加工型辣椒自交系“1019-2-1-1-1-1”已在文献“李怡斐，张世才，杨小苗，蒋晓英，王春萍，林清，黄启中，黄任中.加工型辣椒新品种‘艳椒435’[J].园艺学报，2018，45(S2):2761-2762”中公开。
实施例1
试验材料：加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”
(1)杂交：以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为母本，以加工型辣椒花培DH系“渝辣选7-1”为父本，杂交后获得杂交一代，即“(750-1-1-1×渝辣选7-1)F1”，将其作花药培养供体亲本。
(2)选取花蕾：在“(750-1-1-1×渝辣选7-1)F1”开花初期或盛期，早上7-9点选择外观形态特征为花瓣与花萼等长或花瓣略长于花萼的花蕾，将花蕾剥开，花药微微呈淡紫色，定期摘除已开放的花朵和嫩辣椒，使植株一直保持开花状态。
(3)剥花萼：在超净工作台上，将花蕾置于垫两层无菌滤纸的培养皿中，然后将培养皿置于冰上，左手拇指和食指捏着花蕾与花柄交接处，用镊子轻轻将花蕾的花萼剥掉，将已去掉花萼的花蕾放入自封袋中，写上编号，待用；
(4)花蕾消毒：已去掉花萼的花蕾先用体积分数75％的酒精表面消毒30s，之后用0.1wt％升汞消毒7min，然后用无菌水冲洗4次，每次30s，然后将消毒后的花蕾倒入垫有双层无菌滤纸的培养皿中，吸取花蕾表面水分，用于接种；
(5)无菌剥取花药：在超净工作台上，手戴无菌手套，然后用体积分数75％的酒精喷洒双手进行消毒，随后用左手拇指和食指捏住花柄与花蕾交接处，右手持已消毒的镊子尖端轻轻剥花蕾，将花药取出，尽量保持花药的完整性；
(6)花药接种：将花药接种于装有1#培养基的90×90mm培养皿中，每个培养皿接种30个花药，将花药均匀分布在培养基上，用Parafilm封口；
(7)花药培养：将已接种花药的培养皿置于恒温培养箱中，35℃条件下黑暗培养5天，然后转入组织培养室(28±0.5℃)进行黑暗培养；
(8)胚状体形成：花药接种后培养30-40天，可观察到从花药或愈伤组织中露出白色的胚状体(图1)，然后将已诱导出胚状体的培养皿转移至光照培养室照光培养(白天28±0.5℃，夜间20±0.5℃)，得到子叶型胚状体(图2)。经统计，胚状体诱导率为10.67％。
(9)成苗：将子叶型胚状体接种到MS培养基中继续培养，形成完整植株，即花培苗(图3)。
(10)生根：待花培苗长出5-6片真叶时，将其接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的花培苗(图4)进行练苗、移栽(图5)；
(11)人工加倍：将移栽成活的花培苗进行人工加倍，脱脂棉蘸取0.2wt％秋水仙碱+饱和对二氯苯，用脱脂棉(已蘸取0.2wt％秋水仙碱+饱和对二氯苯)包裹花培苗的生长点，用移液器在脱脂棉上补加10微升的0.2wt％秋水仙碱+饱和对二氯苯(图6)，最后用保鲜膜包裹花培苗(图7)，保湿3d，然后用无菌水冲洗3次。
(12)倍性鉴定：用流式细胞仪测定加倍后辣椒花培植株(图8)的DNA含量分布，鉴定结果显示花培植株均是双倍体。
实施例2
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为父本，以加工型辣椒花培DH系“渝辣选7-1”为母本，杂交后获得杂交一代，即“(渝辣选7-1×750-1-1-1)F1”，将其作花药培养供体亲本。
实施例3
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为母本，以加工型辣椒花培DH系“渝辣选3-2”为父本，杂交后获得杂交一代，即“(750-1-1-1×渝辣选3-2)F1”，将其作花药培养供体亲本。
实施例4
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为父本，以加工型辣椒花培DH系“渝辣选3-2”为母本，杂交后获得杂交一代，即“(渝辣选3-2×750-1-1-1)F1”，将其作花药培养供体亲本。
实施例5
同实施例1，区别仅在于，在步骤(6)中，将1#培养基替换为2#培养基。
实施例6
同实施例1，区别仅在于，在步骤(7)中，加入转培养基的步骤，即在组织培养室(28±0.5℃)培养10天后，将1#培养基中培养的花药转移至2#培养基上，继续于28±0.5℃的组织培养室黑暗培养。
对比例1
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，未经杂交，直接以“750-1-1-1”作花药培养供体亲本。
对比例2
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为母本，以自交系“1019-2-1-1-1-1”为父本，杂交后获得杂交一代，即“(750-1-1-1×1019-2-1-1-1-1)F1”，将其作花药培养供体亲本。
对比例3
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中，以加工型辣椒不易出胚基因型“750-1-1-1”为父本，以自交系“1019-2-1-1-1-1”为母本，杂交后获得杂交一代，即“(1019-2-1-1-1-1×750-1-1-1)F1”，将其作花药培养供体亲本。
对比例4
同对比例1，区别仅在于，在步骤(6)中，将1#培养基替换为2#培养基。
对比例5
同对比例1，区别仅在于，在步骤(7)中，加入转培养基的步骤，即在组织培养室(28±0.5℃)培养10天后，将1#培养基中培养的花药转移至2#培养基上，继续于28±0.5℃的组织培养室黑暗培养。
对实施例1-4和对比例1-3的出胚和成苗结果进行统计，结果见表1。结果显示，以加工型辣椒花培DH系作为桥梁，与加工型辣椒不易出胚基因型进行杂交，以其杂交一代为花药培养的供体亲本，可以明显地提高加工型辣椒不易出胚基因型的出胚率。本发明推测来自花药培养诱导出的胚状体获得的加工型辣椒花培DH系携带易出胚基因，以加工型辣椒花培DH系与加工型辣椒不易出胚材料的杂交一代为供体亲本进行花药培养，提高了加工型辣椒不易出胚基因型的出胚率，打破了基因型的限制。
需要说明的是，上述实施例1选取(750-1-1-1×渝辣选7-1)F1作为供体亲本，该杂交一代的母本为不易出胚的加工型辣椒基因型“750-1-1-1”，父本为通过花药培养获得的加工型辣椒花培DH系“渝辣选7-1”，但并不局限于“渝辣选7-1”，该方法对于其他花培DH系的杂交一代辣椒材料亦可实现本发明的目的，如实施例3和4的“渝辣选3-2”。
表1基因型对加工型辣椒花药培养成胚的影响
对实施例1、5和6，以及对比例1、4和5的出胚和成苗结果进行统计，结果见表2。本发明在实验过程中发现，接种花药后，先35℃黑暗处理5天，然后转至28±0.5℃的组织培养室黑暗培养10天，随后于超净工作台，将已培养的花药更换至2,4-D浓度稍低的2#培养基，继续于组织培养室黑暗培养，可以极大地提高胚状体的诱导效率，最高达19.33％，且胚状体发育正常，成苗率高(93.10％)。本发明推测花药接种至1#培养基，该培养基中较高浓度的生长素和椰子汁为花药提供了有利于花药分化的条件，随后更换至2#培养基，促进了胚状体的诱导。
表2培养基对加工型辣椒花药培养成胚的影响
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种加工型辣椒不易出胚基因型花药培养获得胚状体的培养方法，其特征在于，包括将加工型辣椒不易出胚基因型与加工型辣椒花培DH系杂交，获得杂交一代，再将所述杂交一代的花药进行花药培养的步骤；
所述加工型辣椒花培DH系为渝辣选7-1或渝辣选3-2；
所述加工型辣椒不易出胚基因型为750-1-1-1；
按照以下(1)-(3)任一项所述的方法，对所述杂交一代的花药进行花药培养：
(1)将所述花药接种于1#培养基进行培养；
(2)将所述花药接种于2#培养基进行培养；
(3)先将所述花药接种于1#培养基进行培养，再转接于2#培养基继续进行培养；
所述1#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/L AgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.50mg/L 2,4-D+10g/L椰子汁，pH＝5.8；
所述2#培养基为MS培养基+0.50mg/L 6-BA+4mg/L AgNO3+4g/L活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.30mg/L 2,4-D，pH＝5.8。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，按照(1)或(2)所述的方法对所述杂交一代的花药进行花药培养时，培养条件包括：先在35℃条件下黑暗培养5天，然后在28±0.5℃条件下黑暗培养30-40天。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，按照(3)所述的方法进对所述杂交一代的花药进行花药培养时，所述杂交一代的花药先在1#培养基中培养15天，再转接于2#培养基。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述杂交一代的花药在所述1#培养基中，先在35℃条件下黑暗培养5天，然后在28±0.5℃条件下黑暗培养10天。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述杂交一代的花药在所述2#培养基中的培养条件包括：28±0.5℃条件下黑暗培养20-30天。
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