CN112602597A - 一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法，(1)单性外植体的培养、获取，大麻开花季节，从健壮的雌性植株上选取顶端茎段，用消毒后的剪刀把顶部8‑12cm的茎段剪切下来消毒；(2)外植体材料灭菌；(3)灭菌后材料的培养；(4)分化培养；(5)继代扩繁培养；(6)生根培养；(7)温室驯化。该方法首次明确选用确定雌雄株后的带芽的嫩梢做外植体，所获得的试管苗即均为单性种苗，即全雌性种苗或全雄性种苗。

Description

一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法

技术领域

本发明涉及一种获得药用工业大麻单性植株(以雌性植株为例)种苗方法，属于植物的人工栽培技术领域。

背景技术

大麻(Cannabis sativa L.)，工业用途的大麻又称为hemp，属于大麻科大麻属一年生草本植物，植株高大，为雌雄异株。原产于亚洲中部，是人类最早种植的农作物之一，大麻浑身是宝，可从农业种植延伸到纺织、服装、造纸、军需、化工、新型建材、生物能源、食品保健、医药、饲料等十几个产业链，现今已经遍布世界各地。

大麻的主要有效化学成分是四氢大麻酚(简称THC)和二氢大麻酚(简称CBD)，其中THC其能够作用于人的神经系统，具有强烈的致幻成瘾性，CBD不仅可以作用于多种疑难疾病的治疗，还可以有效地消除四氢大麻酚(THC)对人体产生的致幻作用，被称为“反毒品化合物”(anti-marijuana compound)。国际上根据THC含量的不同，可将大麻分为药用型(THC＞0.5％)、中间型(0.3％＜THC＜0.5％)和纤维型(THC＜0.3％)，其中，纤维型大麻THC含量极低，不具有毒品利用价值，又被称为工业大麻。根据大麻的经济属性，为充分利用其为人类服务，1988年联合国明确规定不具备提取毒性成分(四氢大麻酚THC)价值或直接作为毒品吸食的，专供工业用途的工业大麻(其生长期大麻花叶中的四氢大麻酚含量(THC)<0.3％)可以合法进行规模化种植与工业化开发利用。

随着工业大麻产业的兴起，工业大麻品种培育工作也进入了一个新的发展阶段，例如在工业大麻的主产区云南，就先后有科研工作者培育出了高产、稳产、抗逆性强的工业大麻优良品种。由于大麻是雌雄异株植物，因此人工培育的工业大麻品种也为雌雄异株品种，并且雌株与雄株的比例也接近1：1。但是根据已有研究表明，大麻雄株纤维产量和品质均优于雌株，因此以收获纤维为目的时，宜多留雄株，而雌株花叶中CBD的含量明显高于雄株，若是想利用CBD，则在种植过程中就需要去掉雄株，因为雌株授粉后其花叶内的CBD含量会降低很多。因此，为了满足生产的需要，在已有的工业大麻优良种质基础上，大规模培育出子代为雌雄单一种性的种苗，即全部为雌株或者全部为雄株的种苗，以供生产所需。

目前有关大麻组织培养的报道相对较少，大麻工厂化育苗技术应用方面的报道也不是很多，二者结合的应用就更少了，这在一定程度上制约了工业大麻产业发展，尤其是当生产中需要单性种苗时，比如为获得二氢大麻酚CBD，现实生产中需要花费大量的人力物力去除雄株，和利用全雌性种苗进行生产相比，这种人工去雄的生产方式，其生产成本增加一倍不止。而随着大麻产业这两年全球的兴起，以获取CBD为目的大麻栽培面积迅速提升，未来三年，仅国内就业数十万亩的栽植需求，因此研发的这种能大规模获得工业大麻单性植株的快速育苗方法在实际生产上是十分迫切的需求。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，提供了一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法，该方法首次明确选用确定雌雄株后的带芽的嫩梢做外植体，所获得的试管苗即均为单性种苗，即全雌性种苗或全雄性种苗。

为实现上述发明目的，本发明通过如下技术方案实现：

一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法，包括以下步骤：

1.单性外植体的培养、获取

大麻开花季节，从健壮的雌性植株上选取顶端茎段，用消毒后的剪刀把顶部8-12cm的茎段剪切下来消毒；

2.外植体材料灭菌

先用流水冲洗，再用新洁尔灭浸泡，洗净后剪成茎段后进行消毒处理：无菌水震荡冲洗，75％的酒精震荡冲洗，无菌水震荡冲洗2～5min，0.1％的氯化汞溶液，滴入2～5滴吐温80，震荡冲洗，无菌水震荡；

优选的：先用流水冲洗3小时，再用新洁尔灭浸泡20min，洗净后剪成3-4cm的茎段后进行消毒处理。

优选的：所述消毒处理具体为：无菌水震荡冲洗2～5min；75％的酒精震荡冲洗5～20s；无菌水震荡冲洗2～5min；0.1％的氯化汞溶液，滴入2～5滴吐温80，震荡冲洗4～10min；无菌水震荡冲洗2～5min；重复无菌水冲洗7次。

3.灭菌后材料的培养

将消毒后的茎段用剪去伤口，将茎段剪成带有1-2个芽的茎段，接种于空白MS培养基中，接种完的外植体放置于培养间，进行培养；

优选的：培养条件如下：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度2500lx-4000lx，光照时间14h-16h；20-25d转瓶继续培养，直至分化出新芽。

4.分化培养

将步骤3培养后带有幼芽的茎段，用手术剪剪去上下两端，然后插入到分化培养基中，分化培养基配方如下：MS+0.5～1.2mg·L^-16-BA+0.2～0.5mg·L^-1ZT+0.1～0.5mg·L^{- 1}KT+25g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)；将接种后的幼苗放置于培养间培养；优选的：培养条件：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度2500lx-4000lx，光照时间14h-16h，培养周期25-30d。

5.继代扩繁培养

分化培养结束后，幼苗转接到继代培养基中进行继代扩繁培养；继代扩繁培养基为：MS+0.2～1.0mg·L^-16-BA+0.3～1.5mg·L^-1IAA+0.1～0.5mg·L^-1ZT+0.1～0.2mg·L^-1KT

+25g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉；

优选的：培养条件：温度25℃±2℃，湿度30％-60％，光照强度2500lx-5000lx，光照时间14h-17h，培养周期25-35d。每颗幼苗分化出3-5颗新苗，多者七八个新芽。

6.生根培养

将4cm以上健壮的幼苗分成单棵，接到生根培养基中；生根培养基如下：WH+0.1～1.0mg·L^-1IAA+0.05～0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)+0.2g·L^-1活性炭(创造有利生根的黑暗环境)；

优选的：培养条件如下：温度25℃±2℃，湿度35％-60％，光照强度2500-4500lx，光照时间14-16h。培养25-35d，便可有根生出。

7.温室驯化

当80％幼苗根长度大于3cm时，进行洗苗并定植到50孔的穴盘内，基质配比为草炭：珍珠岩：蛭石＝5-7：1-2：0.5-1，35天左右就可获得能定植到大田全雌或全雄工业大麻种苗。

本发明的有益效果如下：

(1)选用确定雌雄株的茎段作为外植体，可活动单性种苗。本发明首次明确选用确定雌雄株后的带芽的嫩梢做外植体，所获得的试管苗即均为单性种苗，即全雌性种苗或全雄性种苗，相比以种子为外植体形成幼苗雌雄混杂，不利于选择出雌性或雄性种苗，无法在生产中使用单性种苗，这对医药用途的工业大麻(提取大麻二酚CBD)即为不利，因为药用工业大麻提取的有效成分即大麻二酚CBD主要在雌株上提取，一旦雌株被雄株授粉后大麻二酚CBD含量大大降低，顾药用工业大麻的生产中需要的是单性雌株种苗，不需要雄性种苗。

(2)本发明以单性大麻，如雌性植株的嫩梢为外植体，通过诱导后，不定芽的增殖系数在3.2-6.5，平均4.5左右。现有的工业大麻离体再生体系，以种子为外植体，诱导不定芽，时间长，一般要40天左右，而且不定芽的增殖系数一般都在3以下，繁殖速度慢。

(3)本发明中组培苗生根主根发达，且主根上往往能长出侧根，根系发达，而现有的再生体系生根方面侧根基本没有，影响炼苗成活率。

附图说明

图1为工业大麻嫩梢外植体在分化培养基培养的分化苗；

图2为工业大麻继代扩繁中的继代苗；

图3为工业大麻在生根培养基培养的生根苗；

图4为工业大麻生根苗在温室驯化的穴盘苗。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一.工业大麻组织培养快速育苗方法

第一，确定雌雄后的外植体嫩梢行消毒获得雌性或雄性的单性无菌苗。做法是：1、从工业大麻雌株或雄株上，采剪15-20cm的健壮嫩梢，用新洁尔灭浸泡20min、用毛刷将枝条表面刷洗干净(特别是芽附近)，然后用流水冲洗干净。2、用手术剪在水中剪成3-4cm的茎段，确保每段上带有2-3个芽，放置在干净的组培瓶内。3、用250ml规格的三角瓶装入四分之三纯净水，用不带透气孔的封口膜扎紧封口，用高压灭菌锅125℃灭菌30min制得无菌水，冷却备用。4、将放置在超净工作台内的接种器灭菌器打开，手术剪、手术刀、枪状镊等工具插入接种器灭菌器灭菌，将75％的酒精、无菌水等工具放入超净工作台内，将接种间和超净工作台的紫外灯打开，密闭灭菌30min。5、穿戴好无菌服，戴好无菌乳胶手套正坐于超净工作台前，将冲洗好的茎段放入超净工作台。6、将冲洗好的工业大麻茎段倒入1瓶无菌水中，震荡冲洗1min，倒掉无菌水。7、倒入75％的酒精至四分之三瓶处，震荡冲洗5-20s，时间长短视茎段的幼嫩程度而定，幼嫩的时间短一点，5-10s，老成一点的茎段震荡10-20s，然后倒掉酒精。8、倒入无菌水，盖好瓶盖，震荡冲洗2-5min，倒掉无菌水。9、倒入0.1％的氯化汞溶液，滴入两三滴吐温80，盖好瓶盖，震荡冲洗5-10min，倒掉溶液。10、将消毒后的茎段倒入装有无菌水的三角瓶中，震荡冲洗2-5min，倒掉无菌水，再转到新无菌水瓶中震荡冲洗2-5min，如此重复此操作7次。

第二，进行接种操作。具体步骤是：1、将灭好菌的工业大麻茎段置于灭菌过的空组培瓶中，备用。2、用插在接种器灭菌器中灭完菌的枪状镊夹取不锈钢接种盘用酒精灯烧烤灭菌，每个部位都要烧烤充分，以达到灭菌效果。3、用浸满75％酒精的干净小手绢浸满75％的酒精，擦拭装有空白MS培养基的培养瓶(240ml的组培瓶)，整齐的排放在超净工作台的边缘。4、夹取灭好菌的茎段，放置在接种盘中，用手术剪剪去伤口，将茎段剪成带有1-2个芽的两段。5、拧开培养瓶，在酒精灯上烧烤瓶口，边烤边均匀旋转瓶口。6、右手握枪状镊夹取剪好的茎段，左手执培养瓶，使瓶口向内，将茎段轻轻插入培养基，保持茎段能站立在培养基中，确保茎段的生物学下端朝下，每瓶可接种1-2棵，盖好瓶盖，将接种后的培养基放置一旁。7按照上述方法，将所有消毒处理后的茎段都接种于空白MS培养基中，在组培瓶上标明材料名称、消毒时间和日期。

第三，接种完的外植体放置于培养间，进行培养，培养条件如下：1培养间温度应在25℃±1℃。2培养间湿度应在30％-50％之间。3、光照强度应在2500lx-4000lx之间，光照时间在14h-16h之间。4、瓶苗应排放整齐，瓶间距5cm左右即可。

第四，应每天观察培养间接种的茎段褐化及污染情况。当严格按照上述步骤进行操作时，染菌率一般可以控制在70％以下。当出现褐化时，及时更新培养基；当出现细菌或者真菌污染时，应及时清除，并做灭菌处理。按照上述条件，一般在20-25d左右，茎段的芽会萌发，待幼芽逐渐长大，便可以进行转瓶，继续培养。

第五，分化阶段。所需的接种条件与外植体消毒相同，具体步骤如下:1、用灭好菌的枪状镊夹取带有幼芽的茎段，用手术剪剪去上下两端的伤口，然后插入到分化培养基中，分化培养基配方如下：MS+0.5～1.2mg·L^-16-BA+0.2～0.5mg·L^-1ZT+0.1～0.5mg·L^-1KT+25g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)。2、将接种后的幼苗放置于培养间培养，周期大约25-30d左右，培养条件：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度2500lx-4000lx，光照时间14h-16h。3、每天观察幼苗生长状况，将污染苗及时清除并灭菌；长到25天左右，及时更换新培养基继续培养。4、待有新芽长出幼苗逐渐长高的3cm左右时，可以转接到继代培养基中，进行继代培养。所获得的组培苗如图1所示。

第六，继代扩繁阶段。

继代培养基为：MS+0.2～1.0mg·L-16-BA+0.3～1.5mg·L-1IAA

+0.1～0.5mg·L-1ZT+0.1～0.2mg·L-1KT+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉；培养条件：温度25℃±2℃，湿度30％-60％，光照强度2500lx-5000lx，光照时间14h-17h，培养周期25-35d。每颗幼苗分化出3-5颗新苗，多者七八个新芽，可进行大规模扩繁生产。所获得的组培苗如图2所示。

第七，生根培养。步骤如下：1、用枪状镊和手术剪将分化培养基中3cm以上健壮的大麻幼苗分成单棵，接到生根培养基中。生根培养基如下：WH+0.1～1.0mg·L^-1IAA+0.05～0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)+0.2g·L^-1活性炭(创造有利生根的黑暗环境)。2、将接种后的幼苗放置于培养间培养，培养条件如下：温度25℃±2℃，湿度35％-60％，光照强度2500-4500lx，光照时间14-16h。培养25-35d左右，便可有根生出。3、每天观察幼苗生根情况，接种于本培养基中的大麻幼苗生根率可达到80％以上，平均每颗幼苗生根条数大于3。当80％幼苗根长度大于3cm时，就要进入大棚进行驯化炼苗。生根苗如图3所示。

第八，组培苗的大棚驯化炼苗：1、温室内大环境的控制为：温度控制白天在23-28℃左右，夜间不低于18℃，相对湿度一般在60％-80％。2、定植前的基质准备：基质配比为草炭：珍珠岩：蛭石＝5-7：1-2：0.5-1，用2‰多菌灵消毒放太阳下暴晒10-15d。消毒好的基质装入50孔穴盘中，定植前浇透水后，放置到基质达到半干半湿待用。3、洗苗：洗苗时注意不要伤到根系，洗好的苗用1000倍的多菌灵消毒5min，放在水里备用。4、定植：定植时注意不要窝根和定植过深以免埋心。边定植后边喷水，定植后要及时浇透定根水，然后覆盖非常薄的塑料薄膜封好，上覆盖遮荫网。5、病虫害防治：驯化炼苗过程中病虫害的防治，以防为主，可定期随喷施叶面肥时，加入多菌灵/百菌清和氯氰菊酯/灭幼脲进行预防，并注意观察，一旦发现病虫害及时对症下药；除常规病虫害外，需特别注意根蛆和蝇虫的防治，注意挂黄板进行物理预防。

Claims (6)

1.一种获得工业大麻全雌性或全雄性种苗的方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)单性外植体的培养、获取

大麻开花季节，从健壮的雌性植株上选取顶端茎段，用消毒后的剪刀把顶部8-12cm的茎段剪切下来消毒；

(2)外植体材料灭菌

先用流水冲洗，再用新洁尔灭浸泡，洗净后剪成茎段后进行消毒处理：无菌水震荡冲洗，75％的酒精震荡冲洗，无菌水震荡冲洗2～5min，0.1％的氯化汞溶液，滴入2～5滴吐温80，震荡冲洗，无菌水震荡；

(3)灭菌后材料的培养

将消毒后的茎段用剪去伤口，将茎段剪成带有1-2个芽的茎段，接种于空白MS培养基中，接种完的外植体放置于培养间，进行培养；

(4)分化培养

将步骤3培养后带有幼芽的茎段，用手术剪剪去下端，然后插入到分化培养基中，分化培养基配方如下：MS+0.5～1.2mg·L^-16-BA+0.2～0.5mg·L^-1ZT+0.1～0.5mg·L^-1KT+25g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)；将接种后的幼苗放置于培养间培养；优选的：培养条件：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度2500lx-4000lx，光照时间14h-16h，培养周期25-30d。

(5)继代扩繁培养

分化培养结束后，幼苗转接到继代培养基中进行继代扩繁培养；继代扩繁培养基为：

MS+0.2～1.0mg·L^-16-BA+0.3～1.5mg·L^-1IAA+0.1～0.5mg·L^-1ZT+0.1～0.2mg·L^{- 1}KT+25g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉；

(6)生根培养

将4cm以上健壮的幼苗分成单棵，接到生根培养基中；生根培养基如下：WH+0.1～1.0mg·L^-1IAA+0.05～0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5g·L^-1琼脂粉(琼脂粉凝胶强度为1300g/cm²)+0.2g·L^-1活性炭；

(7)温室驯化

当80％幼苗根长度大于3cm时，进行洗苗并定植到50孔的穴盘内，基质配比为草炭：珍珠岩：蛭石＝5-7：1-2：0.5-1，35天左右就可获得能定植到大田全雌或全雄工业大麻种苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(4)培养条件如下：温度25℃±1℃，湿度30％-50％，光照强度2500lx-4000lx，光照时间14h-16h；20-25d转瓶继续培养，直至分化出新芽。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(5)培养条件如下：培养条件：温度25℃±2℃，湿度30％-60％，光照强度2500lx-5000lx，光照时间14h-17h，培养周期25-35d。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(6)培养条件如下：温度25℃±2℃，湿度35％-60％，光照强度2500-4500lx，光照时间14-16h。培养25-35d，便可有根生出。

5.权利要求1-4任一所述的方法培育得到的工业大麻全雌性或全雄性种苗。

6.权利要求5所述的种苗在制备二氢大麻酚中的应用。

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