CN101622960A

CN101622960A - 一种快速获得辣椒花药培养再生植株的方法

Info

Publication number: CN101622960A
Application number: CN200910183646A
Authority: CN
Inventors: 王述彬; 刘金兵; 潘宝贵; 戈伟; 刁卫平
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2010-01-13

Abstract

一种快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，制备方法为：选取小孢子处于单核靠边期的花药，置于3～5℃低温下预处理24～72小时；低温预处理后的花蕾用75％酒精和0.1％升汞消毒，最后用无菌水冲洗干净；无菌条件下从花蕾中剥取花药，将花药接种在MS基本培养基+0.5－1.0mg/LNAA+1.0－2.0mg/L KT+2wt％麦芽糖+0.8wt％琼脂+0.5wt％活性炭的培养基上，33～37℃下热激处理6～10天，后在光照度2000lx、光照时间12h、室温25℃下继续培养，直至形成根芽叶俱全的完整植株。本发明可在一种培养基上完成花药膨大、不同类型胚状体的形成以及再生植株的获得，从花药开始培养到再生植株的形成一般需要7周时间。此项发明的目的是提供一种通过辣椒花药培养快速获得再生植株的方法。该方法可用于辣椒通过花药培养快速获得单倍体、双单倍体等材料。

Description

一种快速获得辣椒花药培养再生植株的方法

技术领域

本发明属于生物技术科学领域，特别涉及一种通过辣椒花药培养快速获得再生植株的方法。

背景技术

单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，仅由一个染色体组所构成的个体称为单倍体(D.F.I.Langlet，1927)，相当于二倍体的半数体。在作物基础理论研究和实际育种实践中均具有重要意义。在遗传研究中，单倍体是良好的实验材料，尤其在作物数量遗传和转基因研究中。如：经单倍体加倍后获得的双单倍体是分子标记和遗传图谱绘制研究的良好材料；利用单倍体细胞作为受体，获得的转基因材料经加倍后从理论上讲就是一个稳定的群体。而在育种实践中，利用单倍体获得双单倍体(DH)群体不仅可以快速获得纯系，缩短育种周期，提高选择效率，还可以进行突变体和新型自交系的筛选。

单倍体材料的获得途径包括自然产生和诱发产生。前者发生频率极低，难以应用。目前，诱发植物产生单倍体主要有以下几种方法：1)种间和属间杂交、2)物理照射和化学诱变、3)双生苗的筛选、4)未授粉子房和胚珠培养和5)花药培养和花粉培养等。其中，前3种方法需要种植较大的植株群体进行人工诱导，工作量巨大，周期长，耗时耗力，成本较高且诱导率低，难以利用。而利用后两种方法诱导单倍体或双单倍体已在很多作物上有成功的报道，同时利用获得的新种质资源已进行了新品种的选育和推广，并取得了良好的社会效益和经济效益。

辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物，是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。目前。关于辣椒单倍体诱导工作的研究主要集中花药培养和花粉培养上，但诱导过程仍存在一些主要问题限制了辣椒花(粉)药培养在实际育种中的应用，如：培养过程中外植体易愈伤化、培养周期长和胚状体发生率和植株再生频率低等。

通常，通过花药(粉)培养获得再生植株，其形态发生方式主要有两种途径，即胚状体发育途径(直接发生途径)和愈伤组织发育途径(间接发生途径)。第一种途径中小孢子的行为与合子的一样，经历了如同活体条件下诱导胚发生的各个阶段。而第二种途径与第一种相比，小孢子没有经历胚发生阶段，而是分裂数次形成愈伤，从花药壁上形成。这种发育方式很普遍，通常是由复杂的培养基打破了小孢子的极性造成的。这种愈伤组织要么在同一培养基上只能分化形成胚、根、芽，要么必须转到另一培养基中分化。一般来说这种途径是不希望出现的，因为此种途径产生的植株会出现遗传变异且倍性复杂。目前，在辣椒的单倍体诱导过程中，再生植株主要以第二种途径产生，必须经过多次转接和更换培养基类型，这无疑延长了培养时间、增加了培养难度，导致再生植株获得率很低。因此，如何通过对影响辣椒花药培养胚状体和植株再生因素的研究，以期利用第一种途径直接获得花粉植株已是辣椒单倍体诱导工作中急需解决的一个难题。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种通过辣椒花药培养快速获得再生植株的方法。该方法可用于辣椒通过花药培养快速获得单倍体、双单倍体等材料，也为其他作物的花药培养提供参考。

技术方案：一种快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，制备方法为：选取小孢子处于单核靠边期的花药，置于3～5℃低温下预处理24～72小时；低温预处理后的花蕾用75％酒精和0.1％升汞消毒，最后用无菌水冲洗干净；无菌条件下从花蕾中剥取花药，将花药接种在MS基本培养基+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/LKT+2wt％麦芽糖+0.8wt％琼脂+0.5wt％活性炭的培养基上，33～37℃下热激处理6～10天，后在光照度2000lx、光照时间12h、室温25℃下继续培养，直至形成根芽叶俱全的完整植株。

所述花药接种前预处理温度为4℃。

所述花药接种前预处理时间为48小时。

所述花药接种后热激处理温度为35℃。

所述花药接种后热激处理时间为8天。

有益效果：

1)首次在辣椒花药培养中利用胚状体发生途径快速地获得再生植株。该发明缩短了培养时间，提高了培养效率，获得的胚状体和再生植株可用于研究辣椒离体雄核发育机制。同时，获得的再生植株确定为单倍体后可作为新的种质资源，用于遗传分析、遗传图谱绘制等理论研究。

2)辣椒(Capsicum annuum L.)属茄科辣椒属，是一种被广泛种植的重要蔬菜作物。然而，由于辣椒遗传基础狭窄，种质资源有限，仅采用常规育种手段选育新品种不仅耗时耗力、效率低，且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。而利用本发明方法可快速获得纯系和突变体，不仅可以缩短育种年限，提高育种效率，而且可以提供新的种质资源，使新品种在抗性和品质等方面得到显著提高。应用本发明获得的双单倍体中性状优良的个体当代即可作为育种材料直接用于新品种的培育。

3)双单倍体在遗传上是纯合的，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在DNA碱基序列的细微差异，从而大大提高基因定位标图的准确性，所以是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究，以及物种进化研究、遗传分析和植物基因克隆筛选等的理想材料。

4)本发明是建立在对辣椒花药培养影响因素包括基因型、取蕾时期、温度处理和培养基成分等系统研究工作基础上的。通过胚状体发生途径获得花药培养再生植株可以缩短培养时间、提高培养效果。而花药具有取材方面、结构简单、基因型丰富等优点，对花药进行离体培养可以准确地控制雄核发育条件和研究雄核发育机制，以及可以快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料。同时，通过花药培养可以进行优良辣椒无性系变异材料的筛选，创制新的种质资源，扩大辣椒基因池。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法简便，易于操作和实际应用。

附图说明

图1辣椒花药培养的流程图

图2单核靠边期小孢子(200×)

图3辣椒花药培养胚状体发生和植株再生。A.刚接种的辣椒花药；B膨大的辣椒花药；C.胚状体萌发；D.子叶形胚；E.根芽叶俱全的再生植株

具体实施方式

单倍体和双单倍体在作物遗传理论研究和实际育种实践中具有重要意义和良好的应用前景。单倍体材料的起源可以自发产生，也可诱发产生。前者发生频率极低；后者以花药(粉)培养应用最为广泛。花粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发生途径和愈伤组织发育途径。第一种发育途径中小孢子的行为与合子一样，经历了如同活体条件下诱导胚发生的各个阶段，可以在花药上见到花粉植株，是花药(粉)培养中植株再生的理想发育途径。同时，由于花药培养是把完整花药从花蕾中取出，作为外植体进行离体培养的一种方法，使其取材方便、基因型丰富、群体数量大等优点，因此对花药进行离体培养可以更好地控制雄核发育条件，快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料，以及容易获得体细胞无性系变异材料。

大量研究表明，一套单倍体诱导技术体系的建立受多种因素的影响，尤其是培养基配方、温度处理、碳源和激素。对于有些物种，培养前或培养后对花药进行处理，能显著提高培养效果。如大麦花药，在4℃处理28天能收到最好效果，且认为4℃是其最适的处理温度。而对洋葱花蕾进行热激处理后发现，15℃热激处理后的胚状体获得率相对10℃处理的提高了10倍。另一方面，离体植物细胞难于合成足够的营养物质，它们必须依赖于外界碳源才能生存。在单倍体诱导过程中，添加一种合适的碳源对胚状体的发生和植株再生是十分必要的。目前，最常用的碳源有蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖等，而不同作物不同器官培养最适的碳源来源又是不同的。同时，在单倍体诱导培养基中，除了营养物种之外，为了促进组织和器官的生长，在培养基中添加一种或一种以上的生长调节物质(激素)是必要。植物组织培养常用的激素有生长素和细胞分裂素两类。不过，对这些物质的要求因组织的不同而有很大变化，主要取决于组织自身的内源激素水平。此外，研究结果表明，生长素和细胞分裂素之间的比例决定着植株再生途径的类型。我们应用本发明的方法，在研究温度处理、碳源来源和激素配比的基础上，通过胚状体发生途径在短时间内直接获得了再生植株。

本实例就以辣椒‘003’作为材料，采用本发明方法通过胚状体发育途径在40天内获得了胚状体和再生植株。实施过程如下：

1.在盛花期(第一朵雄花盛开后2周)于晴天上午8:00～9:00从健壮植株上取花蕾。采用显微镜镜检的方法鉴定小孢子发育时期，即将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴少许去离子水浸没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在OLYMPUS显微镜下鉴定小孢子发育时期。选取小孢子发育处于单核靠边期(图2)的花蕾用于花药培养。

2.将小孢子发育处于单核靠边期的花蕾置于4℃下低温预处理2天。

3.将花蕾先在医用酒精(75％体积分数)溶液里浸30秒，然后用0.1％升汞(配制时取升汞1克加1000毫升蒸馏水即可得到0.1％的升汞溶液)消毒8分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次3分钟。

4.在无菌滤纸上用无菌的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净，随后接种在MS基本培养基+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+1.0mg/L激动素(KT)+2wt％麦芽糖+0.8wt％琼脂+0.5wt％活性炭的培养基上(图3-A)。花药接种后，在35℃下热激处理8天，后在光照度2000lx、光照时间12h、室温25℃下继续培养。

5.培养一周后，离体花药明显膨大(图3-B)。大约三周后，可陆续观察到心形胚(图3-C)、子叶形胚(图3-D)的出现，随后胚状体进一步发育，直至形成根芽叶俱全的完整植株(图3-E)。

Claims

1.一种快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，其特征在于制备方法为：

a.选取小孢子处于单核靠边期的花药，置于3～5℃低温下预处理24～72小时；

b.低温预处理后的花蕾用75％酒精和0.1％升汞消毒，最后用无菌水冲洗干净；

c.无菌条件下从花蕾中剥取花药，将花药接种在MS基本培养基+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/L KT+2wt％麦芽糖+0.8wt％琼脂+0.5wt％活性炭的培养基上，33～37℃下热激处理6～10天，后在光照度2000lx、光照时间12h、室温25℃下继续培养，直至形成根芽叶俱全的完整植株。

2.根据权利要求1所述的快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，其特征在于花药接种前预处理温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，其特征在于花药接种前预处理时间为48小时。

4.根据权利要求1所述的快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，其特征在于花药接种后热激处理温度为35℃。

5.根据权利要求1所述的快速获得辣椒花药培养再生植株的方法，其特征在于花药接种后热激处理时间为8天。