DD246315A5

DD246315A5 - Verfahren zur Herstellung von embryonalen Calussen und embryonalen Zellsuspensionen

Info

Publication number: DD246315A5
Authority: DD
Publication date: 1987-06-03

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von embryonalen Callussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren Klonen, gekennzeichnet durch die Schritte a) Zuechten von unentwickelten Zygotenembryos der Inzuchtprodukte in einem geeigneten Zuchtmedium; b) Identifizierung der potentiell embryonalen Sektoren durch eine Kombination von morphologischen, anatomischen und biochemischen Merkmalen, einschliesslich Wachstumsrate, Zerreibbarkeit, geringe Zeilengroesse mit einem niedrigen Vakuolationsgrad, Sekretion eines schleimigen Polysaccharids, das kein Wurzelschleim ist, Wachstum auf besonderen Kohlenhydratquellen und Auspressen von spezifischen Isozymen und c) Rueckgewinnung von embryonalen Callussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren Klonen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von embryonalen Calussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren Klonen. Die Zellsuspensionen können als homogene Mischung von keimbildenden und anderen Zellen charakterisiert werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zea Mays L. oder Mais ist eine wichtige Weltgetreidekultur. Allein in den USA wird das jährliche Maisanbaugebiet auf 333400 km² geschätzt. Eine für das Jahr 1979 aufgestellte Übersicht über die Maiskeimplasmabasis der USA, die mit 590 Tonnen Saatmais rechnet, stellte fest, daß Inzucht-Mais B73 zur Erzeugung von etwa 81 Tonnen Mais-Hybridsaatgut diente. Diese Menge stellt etwa 14% der 1980 benötigten Saatgutmenge für die Bestellung von 333400 km² Mais in den USA dar. Inzucht-Mais B73,im folgenden mit B73 bezeichnet, wurde gemäß der Übersicht von 1979 für die Erzeugung von mehr Hybridmais-Saatgut benutzt als jede andere Mais-Inzuchtlinie. Als bedeutendste Mais-Inzuchtlinie für Erzeugung von Hybridmais-Saatgut ist B73 eine kommerziell bedeutende Mais-Inzuchtlinie. Erfolgreiche Schritte zur Verbesserung von B 73 sollten einen erheblichen Einfluß auf das Mais-Saatgutgeschäft haben.

Die gegenwärtigen Methoden zur Verbesserung von Mais-Inzuchtlinien sind zeitaufwendig, arbeitsaufwendig und risikovolf. Methoden, die eines dieser Probleme vermindern, würden daher einen Fortschritt in der Getreidezucht bedeuten. Eine Methode zur Einführung von Veränderungen in eine Mais-Inzuchtlinie besteht darin, daß Inzucht-Mais-Saatgut einem Mutagen, welches in einer ionisierenden Strahlung oder einer mutagenen Chemikalie bestehen kann, ausgesetzt wird, man das Saatgut auswachsen läßt und die Maispflanzen nach einem gewünschten Merkmal, wie verminderte Wuchshöhe oder erhöhte Krankheitsresistenz, aussortiert. Das Saatgut von Pflanzen, die die gewünschten Eigenschaften zeigen, wird dann ausgesät, erneut sortiert und das Saatgut der gewünschten Pflanzen gewonnen. Nach mehreren Jahren und Generationen wird ein ausreichender Inzucht-Saatgutstamm mit den gewünschten Eigenschaften für eine kommerzielle Züchtung erhalten. Die Methode zur Gewinnung einer modifizierten Mais-Inzucht-Saatgutlinie ist von einigen Problemen begleitet. Inzucht-Maislinien sind streng homozygot oder reinrassig. Solche Inzuchtlinien· zeigen oft geringe Vitalität und liefern daher häufig wenig Saatgut. Wenn die Samenerzeugung zu niedrig ist, ist eine erfolgreiche Großproduktion von Saatgut aus einer einzelnen Pflanze einer modifizierten Inzuchtlinie unter Umständen überhaupt nicht möglich. Selbst wenn die modifizierte Inzucht-Linie sehr aktiv ist und ausreichende Mengen fruchtbaren Saatgutes liefert, werden mehrere Jahre und viele Hektar Land benötigt, um genug Saatgut für eine kommerzielle Saatzucht zu erhalten.

Andere Wege zur Fortpflanzung erwünschter modifizierter Inzuchtlinien basieren auf Pflanzengewebekulturtechniken. Bei einigen dieser Methoden werden Zellkulturen einer mutagenen ionisierenden Strahlung unterworfen. Die erwünschte Eigenschaft wird aus der Zellkultur ausgelesen. Zellen mit der gewünschten Eigenschaft werden in Kultur vermehrt und schließlich zu samentragenden Pflanzen regeneriert,wievonP.J.Bottino: „Die Möglichkeiten der genetischen Manipulation von Pflanzenzellkulturen zur Pflanzenzüchtung", Radiation Botany, 15,1-16(1975) beschrieben.

Die Möglichkeit der Anwendung von Auslesetechniken für Kalluskulturen bestimmter nichtkommerzieller Mais-Inzuchtlinien und die Regenerierung von samenbildenden Pflanzen mit den in der Gewebekultur ausgewählten Eigenschaften wurde durch Hibbertetal. dargelegt, siehe „Auswahl und Charakterisierung einer rückkopplungsfreien Mais-Gewebekultur", Planta, 148, 183-187(1980).

Bei keimbildenden Kalluslinien nichtkommerzieller Inzucht-Maise hat C. E. Creon einen zerreibbaren Kallus von Inzucht-Mais A188 beschrieben, der zur Regenerierung von Pflanzen durch somatische Embryogenese befähigt ist, siehe C. E. Creon „Somatische Embryogenese und Pflanzenregenerierung aus dem zerreibbaren Kallus von Zea Mays L." in: Proc. 5th Internat. Cong, on Plant Tissues and Cells, Hrsg. Akio Fujiwara, Japanese Association of Plant Tissue Culture, Tokyo, Japan, 1982. Keimbilender, zerreibbarer Kallus von A188 nach Creon kann aus spontanen Sektoren von organogenem Kallus erhalten werden. Organogener Kallus nach Creon kann folgendermaßen erhalten werden. Unreife zygotische Keime aus den Samen von gleicheltrigen bestäubten A188 werden aus den Samenkörnern entnommen und in ein Murashige-Skoog-Medium (MS-Medium, siehe Murashige und Skoog, Physiologia Plantarium, 15,426 [1962]) mit 0,5mg/l 2,4-D, 1 mMol L-Asparagin und 0,7% Bactoagar gebracht, Die unreifen zygotischen Keime werden bei 28⁰C und 16h täglicher Belichtung inkubiert, wie von W. D. Springer et al.,

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1979, „Histologische Untersuchung von Gewebekulturansätzen aus unreifen Maiskeimen", Protoplasma, 101, 269-281 beschrieben wurde.

Das Scutellum des primären zygotischen Keims entwickelt sich schnell und bildet eine organogene Kalluskultur. Das Epithel des Scutellumswird stark meristematisch. An der Oberfläche der Kultur, die durch eine ausgedehnte Kambiumzone charakterisiert ist, bilden sich spitze Meristeme. Da die Schoßanlagen nicht von Wurzelanlagen begleitet sind, wird der Kallus als organogen angesehen.

Der keimbildende Kallus nach Creon entsteht spontan als Sektoren, die aus dem gebildeten organogenen Kallus herauswachsen, oder kann aus Primärkulturen mit Prolin induziert werden. Der keimbildende Kallus nach Creon erscheint indifferenziert, stark zerreibbar, zeigt bei visueller Kontrolle geringe Organisation und wächst schnell, so daß mindestens alle zwei Wochen eine Nebenkultur erforderlich wird. Die von Creen beschriebene keimbildende Kalluskultur entwickelt sich auf einem MS-oder N6-Medium mit2% Saccharose und 0,5 bis 1,0mg/l 2,4-Dzum Koleoptilarstadium. Eine normale Entwicklung zum reifen .

Keimstadium ist möglich, wenn die Keime auf ein N 6-Medium mit 6% Saccharose und ohne 2,4-D übertragen Werden. Die reifen Keime können dann auf einem MS- oder N 6-Medium mit 2% Saccharose und ohne Hormone zum Keimen gebracht werden.

Creen beschreibt auch Suspensionskulturen der keimbildenden Linie von A188 und beschreibt, daß solche Suspensionskulturen in einem MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 2% Saccharose gehalten werden können. Wenn Anteile der Suspensionskulturen auf Platten mit erstarrtem MS-Medium mit 2% Saccharose gebracht werden, bildet sich aus der aufgestrichenen Suspension ein Kallus, und auf der Oberfläche des Kallus bilden sich Keime. Diese Keime werden zur weiteren Entwicklung auf ein MS- oder N 6-Medium mit 6% Saccharose übertragen. Nach 2 Wochen auf einem Medium" mit 6% Saccharose werden diese auf ein hormonfreies Medium mit niedrigem Saccharosegehalt zur Keimbildung übertragen„Aus diesen Keimen 1<önnen A 188-Pf lanzen routinemäßig regeneriert werden.

Weiterhin ist ejne nicht regenerierende Zellinie von Inzucht-Mais B73 bekannt, siehe Potrykus et al., Theoretical Applied Genetics, 54,209 (1979). Diese Zellinie in Suspensionskultur wurde aus einer Primärkultur von Protoplasten aus Pflanzengeweben de*r B73-Inzuchtlinie gebildet. Diese Zellen sind gekennzeichnet als in Suspensionskultur gut wachsend und auf Agar-Medium leicht handhabbar. Darüber hinaus können die Zellen enzymatisch in Protoplasten umgewandelt werden, die ihrerseits Zellwände regenerieren und wieder zu teilungsfähigen Zellen werden. Die Zellen dieser Linie konnten jedoch niemals zur Regenerierung von Pflanzen gebracht werden und zeigen darüber hinaus ploide Abweichungen, ein bekanntes Merkmal bei anderen nicht regenerierenden diploiden Pflanzenzellinien, wie von M. G. Meadows, in „Charakterisierung von Zellen und Protoplasten der B73-Mais-Zellinie", Plant Science Letters, 28,337-348 (1982/83) beschrieben.

Andere Versuche zur Regenerierung von Pflanzen aus gebildetem B73-Kallus waren ähnlich erfolglos, siehe E. Bartkowiak, „Gewebekultur zur Regenerierung von Maispflänzchen aus Scutella-Kallus", Genetica Polonica, 23, 93-101 (1982). Die Kultivierbarkeit somatischer Zellen von Inzucht-Pflanzen in vitro ermöglicht dem Pflanzenzüchter, die Techniken der mikrobiellen Genetik auf spezielle Zuchtprobleme bei Getreidepflanzen anzuwenden.

Zu den in der Pflanzenzucht angewendeten genetischen Verfahren gehören die Auswahl von Mutationen in Zellkulturen, Untersuchung der Beziehungen zwischen Wirt und pathogenem Keim; Übertragung genetischer Informationen auf Zellen durch Aufnahme exogener heterologer DNS, siehe Szoka et al., in der US-Patentschrift 4.394.448 oder homologer DNS, siehe europäische Patentanmeldung 90033.

Darüber hinaus ermöglichen somatische Zellkulturen dem Pflanzenzüchter, somaclonale Varianten mit neuen und günstigen agronomischen Merkmalen zu entwickeln, auszuwählen und zu vermehren.

Die einzelnen Verwendungsmöglichkeiten einer Getreidezellinie, speziell einer Mais-Zellinie, wie der hier beschriebenen, sind in zahlreichen Artikeln dargelegt, siehe z.B. P. J.Bottino, „Möglichkeiten der genetischen Manipulation in Pflanzenzellkulturen, in Radiation Botany, 15,1-16 (1975); I.E.Vasil, „Pflanzenzellkulturen und Somazellgenetik von Getreiden und Gräsern", in Plant Improvement and Somatic Cell Genetics, Hrsg. Vasil, Academic Press, N. Y., 1 .Aufl., 1983; oder „Gewebekultur bei der Erzeugung neuer krankheitsresistenter Getreidepflanzen", in Biol. Rev., 54,329-345 (1979).

Zu diesen Verwendungsmöglichkeiten gehört die Auswahl von Mutationen bezüglich der Resistenz auf dem Zellniveau gegenüber toxischen Substanzen, wie Herbiziden und von durch Krankheitserregern erzeugten Substanzen.

Es ist z.B. bekannt, daß Maispflanzen von Schwarzem Mexikanischem Zuckermais, einer nichtkommerziellen Kulturrasse, aus Gewebekulturen regeneriert werden können, die auf Resistenz gegen Lysin und Threonin ausgelesen wurden, und daß Gewebe der regenerierten Pflanze ebenfalls Maispflanzengewebe erzeugen, das gegen Lysin und Threonin resistent ist, wie von

K. A. Hibbert et al., in „Auslese und Charakterisierung einer Feedback-unempfindlichen Gewebekultur von Mais.", Planta, 148, 183-187 (1980) beschrieben wurde.

Der Nutzen solcher Auslesen an Kalluskulturen wurde auch bei der Regenerierung von gegen Südlichen Maisblattbrand resistenten Maispflanzen aus Kalluskulturen gezeigt. Dieses ist eine Pflanzenkrankheit, die durch ein vom Krankheitserreger Helminthosporium maydis var. T. erzeugten Pathotoxin hervorgerufen wird. Durch Einwirkung des vom Krankheitserreger erzeugten Pathotoxins auf Maiskallus wurde resistenter Kallus ausgelesen. Die Nachkommen resistenter Pflanzen waren ebenfalls gegen das Toxin und den Krankheitserreger deutlich resistent. So sind Kalluskulturen einer Mais-Zellinie sichtlich wirksam bei der Entwicklung krankheitsresistenter Maissaat, siehe Gengenbach et al., in „Vererbung von ausgelesener Pathotoxinresistenzbei aus Zellkulturen regenerierten Maispflanzen", Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 5113-5117 (1977).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die im Stand der Technik genannten Methoden auf die Vermehrung der Mais-Inzuchtlinie B73 anwendbar zu machen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Gewebekultur oder eine Zellsuspension zu erhalten, die ganze Pflanzen regenerieren kann.

a) Züchten von unentwickelten Zygotenembryos der Inzuchtprodukte in einem geeigneten Zuchtmedium;

b) Identifizierung der potentiell embryonalen Sektoren durch eine Kombination von morphologischen, anatomischen und biochemischen Merkmalen, einschließlich Wachstumsrate, Zerreibbarkeit, geringe Zellengröße mit einem niedrigen Vakuolationsgrad, Sekretion eines schleimigen Polysaccharids, das kein Wurzelschleim ist, Wachstum auf besonderen Kohlenhydratquellen und Auspressen von spezifischen Isozymen und

c) Rückgewinnung von embryonalen Callussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren Klonen. ·

Die Aufgabe wird gelöst, indem unter den im folgenden beschriebenen Kulturbedingungen die Zellsuspensionen unerwarteterweise Keime von Inzucht-Mais B73 liefern.

Die Erfindung betrifft ferner lebensfähige samenerzeugende Pflanzen von Inzucht-Mais B 73, die gemäß der Erfindung aus ' keimbildendem Callus oder keimbildenden Zellsuspensionen regeneriert werden. Schließlich betrifft die Erfindung mutierte und/oder rekombinierte Nachkommenschaft von keimbildendem Callus oder keimbildenden Zellsuspensionen und daraus regenierten Maispflanzen. Spezielle Beispiele des keimbildenden Callus von Inzucht-Mais B73_aus dem keimbildende Zellsuspensionen gewonnen werden können, sind in der American Type Culture Collection unter der ATCC-Eingangsnummer 40116vom 14.April 1984 niedergelegt. .

Die vorliegende Erfindung umfaßt Gewebekulturen der Mais-Inzuchtlinie B73. Diese Gewebekulturen sind gekennzeichnet als keimbildende Kalluskulturen von Inzuchtmais B73 und Zeilsuspensionskulturen, die aus der keimbildenden Kalluskultur von Inzuchtmais B73 gewonnen wurden. Unter dem im folgenden gebrauchten Begriff „keimbildender Kallus" soll ein als zerreibbarer Kallus, der im Erhaltungsmedium keine sichtbare Ordnung zeigt, sich jedoch im Regenerationsmedium zu diskreten globularen Strukturen ordnet, von denen ein Teil keimt und Pflanzen bildet, verstanden werden.

Unter dem im folgenden gebrachten Begriff „Variation" sollen Phänotypveränderungen, die stabil sind, d.h. bei Abwesenheit des Ereignisses, welches die Veränderung hervorrief, bestehen bleiben, und vererblich sind, verstanden werden, d. h., der neue Phänotyp wird bei der Zellteilung auf die Tochterzellen übertragen.

Veränderungen im Phänotyp, die nur so lange existieren, wie die Zellen oder Gewebe in einer neuen Umgebung gehalten werden, werden als physiologische Reaktion bezeichnet. Der Begriff „Genetische Variation" wird hier zur Beschreibung vererblicher Variationen verwendet, die geschlechtlich auf die Nachkommenschaft von Pflanzen übertragen werden, die aus kultivierten Zellen oder Geweben regeneriert wurden. Der Begriff „Mutante" ist dem Sonderfall vorbehalten, bei dem eine Eigenschaft meiotisch nach bekannten Vererbungsgesetzen übertragen wird. Wenn die Natur der erblichen Veränderung nicht bekannt ist, wird der Begriff „Variante" verwendet.

Der im folgenden gebrauchte Begriff „regeneriert", auf Pflanzen bezogen, bezeichnet Pflanzen, die aus Zeil- und Gewebekulturen erhalten wurden. Der Begriff „Nachkommenschaft" bezeichnet Pflanzen, die durch Selbstbefruchtung, Geschwisterbefruchtung, Rückkreuzung oder Auskreuzung der regenerierten Pflanzen erhalten wurden.

Der im folgenden gebrauchte Begriff „Klon" bezeichnet Kallus oder Zellsuspensionen, die aus einer stabilen Zellsuspension oder Kalluslinie vermehrt wurden. . .

Die keimbildende Kalluskultur von Inzuchtmais B73 ist charakterisierbar als eine Ansammlung von Zellen mit nahezu gleichem Durchmesser, die in Klumpen oder Zellaggregaten auf einem festen Erhaltungsmedium, wie MS-Medium oder N6-Medium, welches zusätzlich mit 0,25 bis 1,0mg/l 2,4-D und 2% (Gew./Vol.) Saccharose versetzt wurde, wachsen. Auf Erhaltungsmedium ist der keimbildende Kallus zerreibbar, d.h., er kann leicht in kleinere Klumpen oder einzelne Zellen zerteilt werden. Unter dem Lichtmikroskop ist in dem keimbildenden Kallus keine durchgängige Epidermisschicht sichtbar. Im allgemeinen hat der keimbildende Kallus eine gelbbraune Farbe. Das Wachstum des keimbildenden Kallus ist, gemessen als Gewichtszunahme, rasche; der keimbildende Kallus wächst etwa dreimal so schnei I wie die organogene Kalluskultur, aus der er gebildet wurde. Als Folge dieser Wachstumsgeschwindigkeit muß der keimbildende Kallus alle 1 bis 2 Wochen auf ein neues Medium übertragen werden. Der keimbildende Kallus ist weiter durch das Fehlen differenzierter Pflanzenstrukturen, wie kleine Schosse oder ihre Anlagen, Wurzeln oder ihre Anlagen und Meristeme, gekennzeichnet. Ein Merkmal der aus dem Kallus erhaltenen Zellsuspensionen ist die Produktion eines schleimigen Polysaccharids in Medien, die Saccharose und 2,4-D enthalten. Dieses Polysaccharid wurde als Galactose-Mannose-Polymer identifiziert.

Das wichtigste Merkmal der keimbildenden Kallus ist die Bildung keimartiger Strukturen. Die keimartigen Strukturen sind kompakt und kugelförmig. Nach Übertragung der kugelförmigen Strukturen auf ein hormonfreies Medium, wie MS- oder N6-Medium, können einige dieser kugelförmigen Strukturen zur Bildung von Pflanzen gebracht werden. Die Pflanzen können in den Boden gepflanzt werden, und es entstehen fruchtbare B73-Maispflanzen. Die Nachkommen dieser regenerierten Pflanzen sind im wesentlichen mit den aus Samen gezogenen B73-Pflanzen identisch. Somit umfaßt die Erfindung die aus einem keimbildenden Kallus von Inzuchtmais B73 regenierten Maispflanzen und die Nachkommen der regenerierten Maispflanzen. Die Erfindung umfaßt ferner keimbildende Zeilsuspensionskulturen von keimbildenden Kalluskulturen von Inzuchtmais B73. Unerwarteterweise behalten diese Zellkulturen die Fähigkeit, sich zu lebensfähigen B73-Maispflanzen zu regenerieren. Zur Regenerierung ganzer Pflanzen fähige B73-Zellsuspensionen werden aus in einem MS-Medium gehaltenen zerreibbaren B73-Kallus gestartet. Der zerreibbare Kallus wird in ein zur Erhaltung von Suspensionskulturen geeignetes Medium gebracht, z.B. MS-Medium mit 2mg/l 2,4-D, und in einen Drehschüttler mit 130UpM bei 28⁰C gebracht. Die Zellsuspensionen werden zur Bildung von kugelförmigen Keimen veranlaßt, wenn sie auf Platten mit festem MS-oder N6-Medium ohne Hormone und mit 2 bis 6% Saccharose aufgebracht werden. Die kugelförmigen Keime werden auf festes MS-oder N6-Medium gebracht, welches hormonfrei ist und 2% Saccharose enthält und zu dem wahlweise Aktivkohle zur Absorption von möglicherweise vorhandenen Resthormonen zugegeben wird. Auf diesem Medium entwickeln sich Jungpflanzen. Somit umfaßt die Erfindung Maispflanzen, die aus einer keimbildenden Zellsuspension von Inzuchtmais B73 regeneriert wurden, sowie die Nachkommen der regenerierten Maispflanzen.

Aus dem bisher Gesagten, aber insbesondere die aus den Beispielen zu ersehenden Ergebnisse, die auch keine einschränkende Bedeutung haben sollen, machen es dem Fachmann offenbar, daß keimbildende Gewebe und Zellsuspensionen von Inzuchtmais B73 Pflanzenzüchtern, Fachleuten für Methoden von Pflanzengewebe- und Zellkulturen und Pflanzenmolekularbiologen die Möglichkeit gibt, wesentliche Verbesserungen bei dieser wertvollen und weitverbreiteten Inzucht-Maislinie einzuführen. Die durch die vorliegende Erfindung eingeführten keimbildenden Kulturen von Inzuchtmais B73 ermöglichen es z.B., diese Kulturen einer Mutagenese in vitro zu unterwerfen, um Varianten in daraus regenerierten Maispflanzen zu erzeugen. Methoden der chemischen und physikalischen Mutagenese sowie Zellkulturtechniken für die Gewinnung erwünschter Mutanten sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe z.B. B.J.Popova: „Möglichkeiten der Einführung ökonomisch günstiger Mutationen an Maissamen durch Behandlung mit Methansulfonsäureethylester", Genetic Plant Breeding, 8 [1975], S.282-290; Balint et al.: „Untersuchung von WF9-Mutanten-Unterlinien auf Lodging und Fusarium-Resistenz", Induced Mutations Against Plant Diseases, S. 489-494, IAEA, Wien; Weber und Lark, „Effektives Plattenkultursystem· zur raschen Isolierung von Mutanten aus Pflanzenzellsuspensionen" Theor. Appl. Genetics, 55 [1979], S. 81-86; J.A.Thomas et al., „Verbesserung von Getreidepflanzen durch Einzelzellen in vitro — eine Bewertung", Z. Pflanzenzucht., 82 [1979], S. 1-3). So soll die Erfindung mutagenisierte B73-Gewebekulturen und Zellsuspensionen und daraus regenerierte Maispflanzen und die Mutanten- oder Varianten Nachkommenschaft der regenerierten Maispflanzen umfassen.

Die mit der vorliegenden Erfindung vorgelegte Möglichkeit zur Regenerierung ganzer Pflanzen aus keimbildenden Gewebe- und Zeilsuspensionskulturen von Inzuchtmais B73 gibt den Fachleuten auch die Möglichkeit, in-vitro-Selektionen nach gewünschten Eigenschaften oder gegen ungewünschte Eigenschaften durchzuführen (siehe Hibbert et al. und Gengenbach et al., beide oben genannt). So ist es durch Benutzung der keimbildenden Gewebe-und Zellsuspensionskulturen der vorliegenden Erfindung jetzt möglich, Kulturen von B73-Inzuchtmais selektiven Mitteln, z.B. Herbiziden und Pathotoxinen auszusetzen, um Gewebe und Zellen auszulesen, die gegen die selektiven Mittel resistent sind, und dann Pflanzen zu regenerieren, die gegen solche selektiven Mittel resistent sind. So umfaßt die vorliegende Erfindung keimbildende Gewebe und Zellen von Inzuchtmais B73, die in vitro ausgelesen sind, deren daraus regenerierte Pflanzen und Samen und die Nachkommen der regenerierten Maispflanzen. Für die Fachleute ist es auch leicht verständlich, daß keimbildende Gewebe- und Zellsuspensionskulturen von Inzuchtmais B73 die Möglichkeit zur Erzeugung somaklonaler Varianten von Inzuchtmais B73 durch Regenerierung von Pflanzen aus nach der vorliegenden Erfindung erzeugten keimbildenden Gewebekulturen und Zellsuspensionskulturen von Inzuchtmais B73 bieten. Solche stabilen somaklonalen Varianten sind in der Literatur wohl bekannt, wie z. B. in Edallo et al., „Chromosomenvariation und Häufigkeit spontaner Mutationen bei derin-vitro-Kultur und Pflanzenregenerierung von Mais", Maydica,26, (1981), S.39-56; Beckert et al., „Etude de la Variabilite Genetique Obtenue Chez Ie Mais Apres Callogenese et Regeneration de Plants in vitro", Agronomie, 3 (1983), S. 9-18; Larkin et al., „Somaklonale Variation — eine neue Quelle der Variabilität aus Zellkulturen zur Pflanzenverbesserung", Theor. Appl. Genet, 60 (1981), S. 197-214. Tatsächlich sagt eine große Menge von Literaturstellen aus, daß Pflanzen, die aus Kulturen regeneriert werden, durch einen unerwartet hohen Anteil stabiler fortpflanzungsfähiger Phänotyp-Variationen charakterisiert sind. Siehe Rice, „Genetische Variation von Inzucht-Gewebekulturen bei regeneriertem Inzuchtmais", 37th. Ann. Com & Sorghum Research Conference (1983). So ist es jetzt möglich, Nachkommen mit genetischen Variationen aus somaklonalen Varianten, die aus Inzuchtmais B73 regeneriert wurden, zu erhalten. Solche Merkmale können stabil in der Nachkommenschaft der zweiten Generation der regenerierten Pflanzen gehalten werden und zeigen entweder Mendelsche Aufspaltung (z. B. 3:1-Verhältnis für einzelne Genmerkmale) oder gleichmäßige Ausformung, weil die somaklonale Variation in diploiden Zellen erscheint und homozygotische Varianten erzeugen kann. Sie soll die Erfindung somaklonale Varianten des keimbildenden Kallus und von Zellsuspensionen von Inzuchtmais B73, Maispflanzen und deren daraus regenerierte Samen und die Nachkommen der regenerierten Maispflanzen umfassen.

Da die Selektion auf dem Zellniveau erfolgt, ist zu erwarten, daß die ganzen Pflanzen, die aus den Zellen regeneriert werden, das ausgewählte Merkmal zeigen. Es ist bedeutsam, daß ein solches System dem Pflanzenzüchter erlaubt, unter Tausenden von Zellen in einer einzelnen Kulturschale oder -flasche nach dem gewünschten Merkmal auszulesen, während zur Auslese einer entsprechenden Anzahl von aus Samen gezogenen Pflanzen nach traditionellen Pflanzenzuchtmethoden eine Großanpflanzung erforderlich wäre.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen unter Einbeziehung der Figuren näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1: die Darstellung eines Isozymmusters für Esterase, erhalten durch Stärkegelelektrophorese, wie im einzelnen in Beispiel 7

beschrieben; Fig. 2: die Darstellung eines Isozymmusters für Alkoholdehydrogenase, erhalten durch Stärkegelelektrophorese, wie im

einzelnen in Beispiel 7 beschrieben; Fig. 3: die Darstellung eines Isozymmusters für Glutamatdehydrogenase, erhalten durch Stärkegelelektrophorese, wie im

einzelnen in Beispiel 7 beschrieben; Fig.4: die Darstellung eines Isozymmusters für /3-Glucosidase, erhalten durch Stärkegelelektrophorese, wie im einzelnen in Beispiel 7 beschrieben.

Beispiel 1 Starten der organogenen Kultur

In einem Gewächshaus mit zusätzlichen Metallhalogenidlampen (15h/d) bei 30⁰C am Tag und 21⁰C bei Nacht wurden Pflanzen der Mais-Inzuchtlinie B73 zur Reife gebracht. Diese Pflanzen wurden selbstbestäubt oder geschwisterbestäubt. Unreife zygotische Keime von 1,0 bis 2,0 mm Länge (12 bis 14Tage nach der Bestäubung) wurden aseptisch aus oberflächensterilisierten Samenkörnern entfernt und mit der flachen Seite nach unten auf das Startmedium gebracht, welches MS-Salze und MS-Vitamine, 150 mg/l Asparagin, 0,6% Agar, 0,5 mg/l 2,4-Dund 12% Saccharose enthielt. Das gesamte Kulturmedium wurde vor dem Autoklavieren auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt. Die Kulturen wurden 2 bis 3 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C inkubiert, nach welchem Zeitraum sich ein kompaktes weißes Gewebe vom Coleorrhizalende des Scutellums entwickelte. Die zygotische

Keimschoßachse war kein Teil des sich entwickelnden Gewebes. Das weiße kompakte Gewebe bestand aus kleinen parenchymartigen Zellen mit meristematischen Regionen und war von einer Epidermisschicht bedeckt. Zahlreiche Wurzelmeristeme, einzelne Schosse und Stärkekörner waren in diesem Gewebe zu erkennen. Das weiße kompakte Gewebe wurde von den Keimen entfernt, auf ein Erhaltungsmedium übertragen, welches dieselbe Zusammensetzung hatte wie das Startmedium, jedoch 0,5 bis 1,0mg/l 2,4-D und 2% Saccharose enthielt, und unter Agrolite (1 500 lux) bei 28°C kultiviert. Die Kulturen wurden alle 10 bis 20 Tage auf frisches Medium übertragen.

Das auf dem Startmedium gebildete kompakte Gewebe wurde nach der Übertragung auf das Erhaltungsmedium extrem heterogen. Zahlreiche Schosse, Wurzeln sowie zerreibbare und kompakte grüne Gewebe wurden sichtbar. Blatt- und Wurzelgewebe wurden bei jeder Übertragung sorgfältig abgetrennt und von dem kompakten organogenen Gewebe verworfen. Nach einem Jahr ständiger Auslese gegen nichtregenerierende Regionen und Wurzeln war das entstandene organogene Gewebe dunkelgrün, kompakt, zusammengerollt und mit einer wohldefinierten Epidermis bedeckt. Diese Epidermisschicht blieb selbst in Zonen, die Schoßmeristeme bildeten, geschlossen. Unter der Epidermisschicht waren meristematische Zentren häufig. Dieses Gewebe war durch eine extrem niedrige Wachstumsrate charakterisiert, die durch Zusatz von 9 mg/l Zeatin beschleunigt werden konnte. Die Zugabe von Zeatin verminderte auch die Menge der normalerweise ausgelesenen Gewebe.

Beispiel 2

Starten und Auslese des keimbildenden Kallus ...

Nach über einem Jahr Kultur des organogenen Gewebes wurde daraus ein zerreibbarer, schneliwachsender Kallus in der folgenden Weise ausgelesen. Der organogene Kallus, aus dem der keimbildende Kallus isoliert wurde, wurde auf ein · '

Erhaltungsmedium übertragen, welches MS-Salze und MS-Vitamine, 150mg/l Asparagin, 1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l 3,5-Dichlorphenoxyessigsäure (3,5-D), 2% Saccharose und 0,6% gewaschenen Agar enthielt. Der organogene Kallus wurde nach 3 Wochen auf ein frisches Medium mit der gleichen Zusammensetzung übertragen.

Nach insgesamt 5 Wochen auf dem Medium erschien der keimbildende Kallus als kleine Zellen mit gleichem Durchmesser, die unter dem Mikroskop ein dichtes Zytoplasma und große Kerne hatten. Die Sektoren wurden in eine schleimige Matrix und von dem umgebenden kompakten organogenen Kallus entfernt, wozu eine sterile Pinzette oder ein steriles Skalpell benutzt wurde. Die Sektoren und die schleimige Matrix wurden auf ein Erhaltungsmedium gebracht, das wie oben beschrieben zusammengesetzt war, jedoch keine 3,5-D enthielt. Der zerreibbare keimbildende Kallus wurde etwa dreimal so schnell wie das organogene Gewebe auf Erhaltungsmedium mit 3,5-D. Anfänglich wurde der keimbildende Kallus aus einem organogenen Kallus isoliert, der auf Erhaltungsmedium mit 3,5-D gezogen wurde. Später wurden keimbildende Sektoren aus organogenem Kallus isoliert, welcher ohne 3,5-D gezüchtet wurde. Die so isolierten Produkte neigen jedoch dazu, sich rasch zu organisieren und können nicht erhalten werden.

Beispiel 3 Starten der Suspensionskulturen

1,77g zerreibbares Kallusgewebe aus Inzuchtmais B73 wurde in 25ml MS-Medium derfolgenden Zusammensetzung eingebracht:

Magnesiumsulfat-heptahydrat (MgSO₄ · 7 H₂O), ^

Calciumchlorid-dihydrat (CaCI₂ · 2H₂O),

Kaliumnitrat (KNO₃),

Ammoniumnitrat (NH₄NO₃),

Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄),

Mangan(ll)-sulfat-tetrahydrat (MnSO₄ · 4H₂O), ,

Zinksulfat-heptahydrat (ZnSO₄ · 7 H₂O),

Kupfer(ll)-sulfat-pentahydrat (CuSO₄ · 5 H₂O),

CobaltOO-chlorid-hexahydrat (CoCI₂ 6H₂O),

Kaliumiodid (Kl),

Borsäure (H₃BO₃),

Natriummolybdat-dihydrat (Na₂MoO₄ · 2 H₂O),

Eisen(ll)-sulfat-heptahydrat (FeSO₄ · 7H₂O) und

Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz (Na₂EDTA).

Die genaue Konzentration der Salze, wie sie in der Erfindung angewendet wurde, kann im allgemeinen innerhalb bestimmter Grenzen variiert werden, ohne von der Erfindung abzuweichen. Zur Standardisierung der Herstellung der Medien wurden jedoch die Konzentrationen der oben aufgezählten Salze als Mindestbestandteil folgendermaßen gewählt:

MgSO₄-7 H₂O 370 mg/l

CaCI₂-2 H₂O 440 mg/l

KNO₃ 1900 mg/l

NH₄NO₃ 1650 mg/l

KH₂PO₄ ' 170 mg/l

MuSO₄-4 H₂O 22,3 mg/l

ZnSO₄-7 H₂O 8,6 mg/l

CuSO₄-5 H₂O 0,025 mg/l

CoCI₂-6 H₂O 0,025 mg/l

Kl 0,83 mg/l

H₃BO₃ 6,2 mg/l

Na₂MoO₄-2 H₂O 0,25 mg/l

FeSO₄-7 H₂O 28,75 mg/l

Na₂EDTA 37,25 mg/l

Das Medium enthält ferner die folgenden Vitamine, Hormone und Kohlenhydratquellen: Thiamin-HCI .. 0,2 mg/1

Pyridoxin · HCI 0,25 mg/1

Nicotinsäure 1,3 mg/1

Calciumpantothenat 0,25mg/l

L-Asparagin 132 mg/1 .

2,4-D 2 mg/1

"Saccharose 2%(Gew./Vol.)

pH-Wert 6,0

Der zerreibbare keimbildende Kallus und das Medium werden in einen 100ml Delong-Kolben gegeben und bei27°Cin einem Rotationsschüttler mit 130UpM unter täglich 16stündiger Beleuchtung mitAgrolite7Tage lang inkubiert. Die Kulturen wurden alle 7 Tage in einer 2:5-Kultur in 50 ml des gleichen Mediums in 250 ml Delong-Kolben übertragen. Aus den Suspensionskulturen wurden Keime gewonnen, indem ein Aliquot von 1 m! aus einer 7 Tage alten Übertragungskultur entnommen wurde und auf ein festes Pflanzenwuchsmedium, wie MS-Medium ©d-sr N6-Medium ohne Hormone oder mit 0,01 mg/l 2,4-D und mit 2 bis 6% Saccharose gegeben wurde. Die Platten werden etwa eine Woche unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen gehalten. Durch Übertragung der Keime auf MS-oder N 6-Medium ohne Hormone und mit 2 bis 6% Saccharose, wie in Beispiel 6 beschrieben, können aus den Keimen Pflanzen regeneriert werden.

Beispiel 4 · -.-.·,.

Bildung von Keimen und Pflänzchen

Eine 15 Tage alte Suspensionskultur mit einem Volumen von etwa 25ml wurde in ein steriles Zentrifugenglas gegeben, und die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1000UpM abgesetzt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, und die Zellen wurden erneut in 25ml hormonfreiem N6-Medium mit 6% Saccharose suspendiert. 1 mldieser Suspension wurde auf festem N 6-Medium mit 6% Saccharose, ohne Hormone und mit 0,6% gewaschenem Agar (der Firma K. C. Biologicals, Renex, Kansas) ausgestrichen. Die Platten wurden abgedeckt und bei 27°C unter täglich 16stündiger Beleuchtung mit Agrolite bei 1000 bis 3000 lux gehalten. Nach 23 Tagen wuchsen auf dem hormonfreien N 6-Medium mit 6% Saccharose zahlreiche globulare Strukturen. Die globularen Strukturen wurden abgenommen und auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose und 0,1 % Aktivkohle übertragen. Nach 6 Tagen wurden 4 Pflänzchen von etwa 1 bis 2cm Länge mit Schossen und Wurzeln beobachtet.

Beispiel 5 Regenerierung von B73-Pflänzchen aus Suspensionskulturen

Eine etwa 4 Monate alte B73-Suspension wurde bei 1000UpM 5 min zentrifugiert, um die Zellen abzusetzen. Diese Zellen wurden dann gewogen und mit hormonfreiem MS-Medium auf eine Konzentration von 100 mg suspendierten Zellen je ml hormonfreies Medium verdünnt. 1 ml Medium (100 mg Zellen) wurde auf ein hormonfreies N 6-Medium" mit 2% Saccharose, 0,1% Aktivkohle und pH-Wert = 5,8 ausgestrichen.

Diese Platten wurden bei 28⁰C im Dunkeln inkubiert. Nach einem Monat bilden sich globulare Strukturen, die dann auf frisches Medium übertragen wurden und mit Agrolite bestrahlt wurden. Nach etwa 3 Wochen hatten sich viele dieser Strukturen zu Pflänzchen entwickelt.

Beispiel 6 Regenerierung von B73-Pf lanzen aus keimbildender Kalluskultur

100 mg zerreibbarer B 73-Kallus je Petrischale wurden auf hormonfreies N 6-Medium mit 4% Saccharose gebracht. Diese Schalen wurden bei 28⁰C im Dunkeln ink'ubiert. Nach 27 Tagen wurden zahlreiche Pflänzchen abgenommen und in Plast-Gewebekulturbpxen (etwa 3" χ 3" χ 4") mit 50ml hormonfreiem MS-Medium mit 2% Saccharose gebracht. Nach etwa einem Monat wurden ,6 dieser Pflanzen in Blumentöpfe in das Gewächshaus gebracht. Alle Pflanzen wurden bis zur Reife gebracht.

Beispiel 7 Isozymvergleich von keimbildender B73-Kalluskultur mit nichtkeimbildendem B73-Gewebe

0,5 bis 5g des unten angegebenen B73-Inzuchtmais-Gewebes wurden mit dem gleichen Gewicht Homogenisierungspuffer versetzt, welcher 16,7% (Gew./Vol.) Saccharose, 8,3% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure bei pH-Wert 7,4 enthielt, und mit einem Porter-Gewebehomogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde der Stärkegel-Elektrophorese unterworfen, und die erhaltenen Gele wurden gefärbt auf Esterase (Fig. 1), Alkoholdehydrogenase (Fig. 2), Glutamat-Dehydrogenase (Fig. 3) und /3-Glucosidase (Fig:4), wie bei Goodman et al. in Genetics, 96,697-70 beschrieben, aufgebracht. In den Fig. 1 bis 4 wurden die folgenden Gewebe untersucht:

Blätter: direkt von 6 Wochen alten im Gewächshaus gezogenen B73-Pflanzen entnommen, Coleoptilen: von Schossen 6 Tage nach der Keimung aus Samen entnommen.

Schosse: aus reifen B73-Samen einen Tag nach Quellung in destilliertem Wasser entnommen.

Scutellum: aus reifen B73-Keimen einen Tag nach Quellung in destilliertem Wasser entnommen.

Zygotische Keime: 19 Tage nach Bestäubung entnommen.

Unreife stabilisierte zygotische Keime: 12 Tagenach Bestäubung entnommen und dann auf dem Medium von Beispiel 3 7 Tage lang gehalten.

Keimbildendes-2,4-D: zerreibbares keimbildendes Kallusgewebe von B73, das 19 Tage lang auf dem Medium von Beispiel 3 ohne 2,4-D gehalten wurde.

Keimbildendes + 2,4-D: zerreibbare keimbildende Gewebe von B73, die auf dem Medium von Beispiel 3 gehalten wurden.

Organogenes: organogenes B73-Gewebe, das auf dem Medium von Beispiel 2 gehalten wurde.

Die Fig. 1 bis 4 stellen Stärkegelmuster für die angegebenen Enzyme dar. Die Gelmuster zeigen die folgenden Ergebnisse:

Esterase (Fig. 1): Keimbildende Kulturen gaben das gleiche Isozymmuster wie stabilisierte zygotische Keime. Organogene Kulturen gaben das gleiche Isozymmuster wie reife Blätter. Alkoholdehydrogenase (Fig. 2): Organogene Kulturen und keimbildende Kulturen ohne 2,4-D gaben das gleiche Isozymmuster wie zygotische Keime, jedoch nicht keimbildende Kulturen auf flsm nlflirhpm Medium mit 2.4-D.

Glutamat-Dehydrogenase (Fig. 3): Keimbildende Kulturen auf Medium ohne 2,4-D gaben das gleiche Muster wie zygotische Keime, jedoch nicht keimbildende Kulturen auf Erhaltungsmedium mit 2,4-D.

/3-Glucosidase (Fig.4): Keimbildende und organogene Kulturen gaben dasgleiche Muster wie Coleoptilen, jedoch ein anderes Muster wie zygotische Keime.

Diese Ergebnisse bestätigen die Darstellung, daß die Regenerierung auskeimbildenden Kulturen nach einem Typ von somatischer Keimbildung verläuft. Das Vorhandensein von Isozymen, die gewöhnlich bei Coleoptilen vorhanden sind, weist darauf hin, daß der Zeitablauf der Keimentwicklungsphasen ein anderer ist als der zygotischer Keime.

Beispiel 8 Charakterisierung des Polysaccharid-Sekretionsprodukts von keimbildenden B73-Geweben

10ml einer 7 Tage alten keimbildenden Zellsuspension von Inzuchtmais B73 wurden auf 50ml frisches Medium nach Beispiel 3 übertragen. Die Kulturen wurden im Licht bei 27⁰C in einem Schüttler bei 130UpM gehalten. Nach 7 Tagen wurden Zellen und Bruchstücke durch Zentrifugieren oder Filtration aus dem Medium abgetrennt. Das verbleibende klare Kulturmedium wurde dann mit defrfdreifächen Volumen 95VoT.-%igem Ethanol bei Raumtemperatur unter Rühren verdünnt. Es bildete sich ein weißer faseriger Niederschlag, der an einem Glasstab gesammelt wurde, mit absolutem Ethanol gewaschen und in einem Vakuumtrockenofen getrocknet wurde. Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 N Salzsäure 6 h bei 100⁰C hydrolysiert und die Zuckerkomponenten auf einem Varian XL-200NMR-Spektrometer durch ¹³C-kemmagnetische Resonanz (¹³C-NMR) analysiert. Das Polysaccharid wurde als Polymer identifiziert, das Galactose und Mannose im Verhältnis von etwa 4:1 enthielt. Die Zusammensetzung des Polymers unterscheidet sich von der von Maiswurzelschleim, der ein glucosereiches, Fucose und Galacturonsäure enthaltendes Polymer enthält', und-von der von Maishüllengummi, der Xylose, Arabinose und Galactose im Verhältnis 7:5:1 enthält (siehe F.Smith et al., The Chemistry of Plant Gums and Mucilages and Some Related Polysaccharides, Reinhold Publishing Corp., New York).

Beispiel 9 Verwendung von Kohlenstoffquellen

Keimbildende Suspensionskulturen von Inzuchtmais B73 wurden in kohlenhydratfreiem Medium gewaschen und auf das Medium von Beispiel 3 verstrichen, welches mit 0,6% gewaschenem Agar verfestigt wurde und 1 % (Gew./Vol.) der in der nachfolgenden Tabelle 1 genannten filtersterilisierten Testverbindungen enthielt. Das Wachstum der Kolonien wurde visuell nach 2 Wochen und 9 Wochen Wachstum im Dunkeln bei 27⁰C eingeschätzt.

Die Toxizität von Galactose in Gegenwart von Saccharose wurde an keimbildenden Suspensionskulturen von Inzuchtmais B73 getestet, indem Galactose (0,1 bis 6% Gew./Vol.) zu dem Medium von Beispiel 3 mit 2% (Gew./Vol.) Saccharose zugesetzt wurde. Das Wachstum wurde nach 7 Tagen Inkubation in einem Schüttler bei 27°C im Licht als Kompaktzellvolumen (PCV) gemessen.

Tabelle 1

Wachstum keimbildender Zellen von Inzuchtmais B73 auf verschiedenen Kohlenstoffquellen (1 % Gew./Vol.)

Kohlhenstoffquelle Wachstum von B 73-Zellen im Vergleich mit kohlenhydratfreien Kulturen; 2 Wochen

Saccharose

D-Glucose

Lösliche Stärke

D(+)-Galactose +

-Lactose¹ 0

D-Sorbitol +

L-Prolin 0

0 (Vergleichskultur) 0 '

L-(+)-Arabinose 0 ^J

myo-lnositol 0

-D(+)-Fucose¹ 0

L-Glycin 0

L-Arginin 0

L(-)-Xylose 0

D(+)-Mannose 0

DL-Äpfelsäure 0

D-Mannitol 0

L(- !-Sorbose O

-L-Rhamnose¹ 0

L-Glutaminsäure 0

+ = Sichtbares Wachstum

Die meisten Kohlenstoffquellen förderten das Wachstum der Zellen nicht. Die besten Ergebnisse wurden mit Saccharose und Glucose erreicht. Lösliche Stärke förderte ein gutes Wachstum der Zellinie nach einer anfänglichen Verzögerungsphase. Auf Sorbitol zeigte die Zellinie ein begrenztes Wachstum, jedoch nicht auf Prolin und Lactose. Die keimbildende B73-Maiszellinie zeigte gegen Galactose eine begrenzte Wachstumsreaktion.

Der keimbildende Kallus von Inzuchtmais B73, der auf stärkehaltigen Platten wuchs, schien im Gegensatz zu den Platten mit Saccharose oder Glucose keine Galactomanan-Sekretion zu zeigen. Suspensionskulturen desselben Gewebes, die auf Stärke wuchsen, zeigten keine nachweisbaren Mengen von Galaktomanan.

Beispiel 10

Die in Beispiel 6 erhaltenen Pflanzen wurden im Gewächshaus aufgezogen und entweder selbstbestäubt, mit der Elternlinie B73 rückgekreuzt oder mit regenerierten Geschwisterpflanzen bestäubt (für selbstbestäubte Pflanzen mit RiS₁,für rückgekreuzte mit R1BC1 und für geschwisterbestäubte mit RiSib-i bezeichnet).

Die Nachkommenschaft wurde aus 4 regenerierten Pflanzen erzeugt. Zwei regenerierte Pflanzen wurden mit der Hauptstengelähre und einer Sproßquaste selbstbestäubt. Wegen des ungleichzeitigen Erscheinens der Rispen und der.Seide und des häufigen Vorkommens von männlichen Rispen konnten die verbleibenden regenerierten Maispflanzen oft nicht selbstbestäubt werden, sondern wurden stattdessen als weibliche Eltern für Kreuzungen mit aus Samen gezogenen B73 verwendet. Die erhaltenen Samen wurden zwischen Dezember 1983 und März 1984 im Feld ausgesät. Die Pflanzen wurden Anfang Februar bewertet, d.h. etwa 2 Wochen nach der Bestäubung. Insgesamt 10 Reihen regenerierter Nachkommen wurden in Ährenreihen ausgepflanzt.

Zusätzlich wurden zwei aus Samen gezogene Pflanzen, die als männliche Eltern bei Kreuzungen mit den regenerierten Pflanzen dienten, selbstbefruchtet, und dienten als Vergleichsreihen. Folgende Eigenschaften wurden bewertet: Pflanzenhöhe, Kolbenlänge, Stengeldurchmesser, Blattzahl und alle Anzeichen von Mutationen einzelner Gene, die das Erscheinungsbild der Pflanze beeinflussen. Während einige Reihen Anzeichen von Salzstreß zeigten, konnten keine Unterschiede zwischen.R-iSi,,, . R1BC1, RTSibrNachkommen und den aus Samen gezogenen Vergleichsreihen festgestellt werden.

Claims

- 1 - 4.¹VO ύ IO

Erfindungsanspruch:

Verfahren zur Herstellung von embryonalen Calussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren'KIonen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) Züchten von unentwickelten Zygotenembryos der Inzuchtprodukte in einem geeigneten Zuchtmedium;

b) Identifizierung der potentiell embryonalen Sektoren durch eine Kombination von morphologischen, anatomischen und biochemischen Merkmalen, einschließlich Wachstumsrate, Zerreibbarkeit, geringe Zellengröße mit einem niedrigen Vakuolationsgrad, Sekretion eines schleimigen fdysaccharids, das kein Wurzelschleim ist, Wachstum auf besonderen Kohlenhydratquellen und Auspressen von spezifischen Isozymen und

c) Rückgewinnung von embryonalen Callussen und embryonalen Zellsuspensionen von durch Inzucht erzeugtem Getreide B73 und deren Klonen , - · . .

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen