JPH01206931A

JPH01206931A - ニンジンにおける細胞質雄性不稔ラインの作製方法

Info

Publication number: JPH01206931A
Application number: JP63029661A
Authority: JP
Inventors: Saburo Hotta; 堀田　三郎; Yoshiaki Kikuchi; 菊池　美明; Masanori Takatani; 高谷　昌紀; Hiromi Hashimoto; 橋本　浩海; Toshiaki Oridate; 折館　寿朗
Original assignee: YOKOHAMA UEKI KK; Kyodo Shiryo Co Ltd
Current assignee: YOKOHAMA UEKI KK; Kyodo Shiryo Co Ltd
Priority date: 1988-02-10
Filing date: 1988-02-10
Publication date: 1989-08-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】童呈上坐肌■立互本発明は、ニンジンにおける細胞質雄性不稔ラインを得
る方法に関するもので、更に詳しくはプロトプラスト融
合によって雄性不稔ラインを作成する方法に関するもの
である。

皿米東茨査雑種第１代（Ｆ１）ハイブリッドはいずれの親株より形
質が優れており、その卓越性は収量、成長速度、生育の
斉一性、耐病性などの点で現れるため、高価で取引され
る。

この種子を得るための従来方法は、手作業で除ａ（雄蕊
を取り除く）を行い、これを用いて交配を行ふのが一般
的であるが、除誰作業の手間がかかるという問題点があ
った。

この問題点を解決するために、最近　雄性不稔作出の方
法が取り上げられてはいるが、組合わせ能力の高い品種
の発見、及びその交配による雄性不稔ラインまでには最
低５年、通常１０年の年月が必要であり、この点の改良
を求める強い要望があった。

■が′シようとする課本発明は上記問題点に鑑みなされたものであって、戻し
交雑を行うことなく、ニンジンにおける細胞質雄性不稔
ラインを作成する方法、すなわち、ニンジンの育種年月
の短縮を可能とした方法を提供することを課題とするも
ので、また圃場をもちいることなく、数多くの組合わせ
の交配を可能ならしめる方法を提供することを課題とす
る。

以下本発明の詳細な説明する。

課　を”°するための本発明で用いる細胞質雄性不稔ラインのプロトプラスト
の細胞質の調製法は、（１）再生し得るカルスをを誘導し、（２）その細胞か
らプロトプラストを分離し、（３）そのプロトプラスト
の核を不活化しすることにより得ることができる。

カルスの誘導は高塩濃度の培地（例えばＭＳ培地）で外
植片からカルスを誘導し、低塩濃度の培地（例えば−ｔ
＋＋ｔｅＳＢ　５培地等）で継代することにより得られ
るものである。

プロトプラストの分離は上記誘導により得られた生育良
好なカルスをセルラーゼ、ペクチナーゼ等を組合わせて
処理することにより分離できる。

この際浸透圧の離型剤としてマンニトール、ソルビトー
ル、シュクロース等を加えると分離作業が容易となる。

次に上記で得たプロトプラストの核の不活化はＸ線、γ
線、紫外線などの放射線を照射するか、もしくは、パー
コール、ショ糖、ソルビトール等による浸透圧不連続密
度勾配法により行うものである。

上記方法で得られた雄性不稔の細胞質と正常系由来のプ
ロトプラストの核を細胞融合させるには、両者の混合物
に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加し、常法
により処理すると、プロトプラストが凝集し、これがカ
ルシウムの存在下かつ高いｐｌ＋　（１０程度）におい
て融合する。この際のＰＥＧの分子量の範囲は１５４０
〜６０００のものの使用が好ましい。

融合は上記ＰＥＧ法の他に、交流電流、直流電流を用い
て電気的に融合させてもよい。

次いで得られた融合細胞を塩濃度の低い培地（例えばＢ
５培地）で培養する。本培地に用いる生長調整物質はフ
リーかもしくはサイトカイニン！！！（ベンジルアデニ
ン、カイネチン、２１Ｐ等）を単独又は２種以上組合わ
せて用いるものである。

かくして得られた雄性不稔ラインの細胞質は雑種第１代
（Ｆ１）植物として有用であった。

以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例＋１）細胞質雅性不稔ラインへの細胞質の調整法。

■　細胞質雄性不稔ラインのニンジンの種子を７％濃度
の次亜塩素酸ナトリウム液（有効塩素０．５％）で２０
〜３０分間滅菌した。

■　滅菌蒸留水で３回洗浄した。

■　種子を０．２％ゲルライトを含むＭＳ培地に播種し
た。

■　播種１２日口の芽ばえの下肢軸を５ｍｍずつ切り出
し、２．４−　Ｄ　１ｍｇ／　ｊ！、０．２％ゲルライ
トを含むＷｈ　ｉ　ｔｅ培地に移植した。

■　移植１ケ月後にはカルスが形成された。そのカルス
を１ケ月毎に継代し、３〜５代目で生育の安定したカル
スを２．４−　Ｄ　１ｍｇ／　１２を含むＭＳ培地に入
れ、明所、２５℃で振盪培養した。

■　２週間毎に継代した。

■　継代後１０日口の培養細胞約０．５ｇを下記の酵素
混合物を含む６０ｍｍ　Ｘ　１５ｍｎ＋のシャーレに移
した。

■　プロトプラストが遊離するまでに暗所において、１
６〜２０時間インキュベートした。

■　得られた溶液をナイロンメツシュで濾過し、１０ｍ
　１２容の遠心管に入れ、１）００Ｘの遠心をかけ上清
を滅菌したピペットで捨てた。新たに０．５Ｍマンニト
ールを加えて再懸濁させ、遠心をかけ上清を捨てた。こ
の操作を３回行い、プロトプラストを洗浄した。

［相］　プロトプラスト懸濁液の一部をとり、血球計算
盤上でプロトプラスト数を計数し、濃度が５×ｌＯ４〜
１×１０Ｓ個／ｍｌｌになる様に０．５Ｍマンニトール
で調整した。

■　プロトプラストにＸ線を照射し、核を不活化した。

（２）花粉稔性を持つ優良系統プロトプラストからの核
の３１）整方法 ■　花粉稔性を持つ優良系統ニンジンの種子を７％濃度
の次亜塩素酸ナトリウム液（有効濃度０．５％）で２０
〜３０分間滅菌した。

■　以下前述のｉｌＪの細胞質雄性不稔ラインのプロト
プラス）　ｆＪ’ｌ整法と同様に■〜［相］の操作を行
った。

０３日目の遠心のあと、上清を捨てた後、１０ｍＭヨー
ドアセトアミド（ＩＯＡ）を加えて５ＩＩＩｌのプロト
プラスト液とし１０分間インキュベートした。

■　その後、１）００Ｘの遠心をかけプロトプラストか
らＩＯＡを洗浄した。

０　沈澱したプロトプラストに０．５Ｍマンニトールを
加えて５ｍｆに定容し、再度遠心をかけて上清をすてＩ
ＯＡを洗浄した。

■　プロトプラストＱ濁液の一部をとり赤血球計算盤上
で、プロトプラスト数を計数し、濃度が５×１０４〜１
×ｌＯｓ個／ｌｌ１ｌニナル様４．１ｍ０．５Ｍマンニ
トールで調整した。

（３）細胞質雄性不稔ラインの細胞質と正常系プロトプ
ラストの核の融合方法 ■　ｆｌ）と（２）で調整したプロトプラストを１：１
の割合で静かに遠心管に入れよく混ぜた。

■　２００μｌのプロドプラストンックシャーレ（６０　Ｘ　１５ｍｍ）の底に静かに置き
、約１０分間放置した。

■　５０μｌの３０％ＰＥＧをプロトプラスト混合液４
ケ所に滴下した。

■　パスツールピペットの先端で、糸をひく様な形でＰ
ＥＧ液で移動させ、プロトプラスト懸濁液に接触させた
。

■゛２０２０分後５Ｍマンニトールを含むＢ５培地を静
かに注入してＰＥＧを希釈した。

■　１５分後、ＰＥＧとプロトプラストの混合液の上部
からパスツールピペットで希釈された液を吸い上げた。

■　プロトプラスト混合液が乾かないうちにＢ’　５培
地を再び加え洗浄した。この操作を３回くり返した。

■　３回目の洗浄の後には、プロトプラストは３ｍｌの
８５培地に懸濁した。

■　シャーレをパラフィルムでシールし、２５℃で暗黒
下で培養した。

［相］　融合細胞は不定胚形成をへて、１ケ月後には魚
らい型不定胚となり、さらに１ケ月後に幼植物体となっ
た。

■　得られた植物体を’Ａ？Ｈ度のＭＳ培地に移植し、
発根を促し十分に肥育させた後、バーミキュライト、赤
玉土等を混合した用土に移植した。

■　得られた植物体を開花させたところ、花粉稔性は無
かった。

■　得られた植物体と優良正常系とを常法により交配さ
せることにより、優良な雑種第一代（Ｆ，）が得られた
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞質雄性不稔ラインの細胞質と正常系由来プロ
トプラストからの核をプロトプラスト融合条件下で結合
させて雄性不稔サイブリッドを形成させる方法。
（２）細胞質雄性不稔ラインの核を不活化し、正常系の
核と置換させることにより新規雄性不稔ラインを作成す
る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）植物の細胞質雄性不稔ラインの細胞質と正常系由
来のプロトプラストの核を融合させ形成した雄性不稔サ
イブリッドを再生条件下で培養し雄性不稔成熟植物を調
製する方法。
（４）植物の細胞質雄性不稔ラインの細胞質と正常系由
来のプロトプラストの核を融合させ形成した雄性不稔サ
イブリッドを再生条件下で培養して得られた雄性不稔成
熟植物を優良正常系と交雑させることを特徴とする雑種
第１代（Ｆ＿１）植物を得る方法。