JPH02265419A - 苗条原基集塊の作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 苗条原基は、優れた、かつ有用な形質を持った植物を、
その形質を変異させることなく大量増殖させることが可
能な細胞集塊であるが、本発明は、このような苗条原基
の集合体である苗条原基集塊を効率的に作用する方法に
関するものである。

〔従来の技術及びその問題点〕

苗条原基は、田中隆荘等（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎａｔ
、。

５８　：　６５〜Ｔ０．１９８３　）がキク科の一年生
植物であるハブ口）でラプスについて、その生長点を含
む茎頂部を摘出して一定の温度と照度そして回転数の下
で回転培養して細胞集塊として得たのが最初である。

この苗条原基は、分裂細胞の集塊である−次苗条原基を
経て二層化した二次苗条原基に到り、再びこれから一次
苗条原基を生ずるというサイクルを繰り返す。したがっ
て、苗条原基は単独ではなく、苗条原基の集塊として増
殖する。

苗条原基集塊から植物体を再生させる場合には、苗条原
基を切り出して苗化培地に移して培養する。

特開昭５９−１３２８２２号公報には一年生植物ハブロ
パッブス、特開昭５９−１３２８２３号公報には有用−
手生植物、特開昭６１−９６９９４号公報にはステビア
への応用例が開示されている。

また、本発明者は苗条原基を用いる方法が木本性植物の
大量増殖にも有効であることを見出した（特開昭６２−
５５０２０号公報）。この方法は、木本性植物、特にポ
プラ、ユーカリの場合、人工液体培地であるガンボーグ
のＢ５培地（第１表参照）に、植物ホルモンであるオー
キシン類としてナフタレン酢酸（ＮＡ＾）を、サイトカ
イニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）　、カイネチ
ン右よびゼアチン等を、さらにショ糖を添加した培地に
茎頂を移植し、３０〜５０日間一定の条件下で回転培養
して苗条原基を作用し、さらにこれを苗化培地に移植し
て静置培養し、植物体を再生させる方法に関するもので
ある。

第１表　ガンボーグのＢ５培地の組成 〔発明が解決しようとする課題〕 従来行われてきた苗条原基の作用方法についてはまだ解
決しなければならない点がいくつか残っていた。すなわ
ち屋外で採取した植物の茎頂を用いる場合、これが殺菌
処理に対して非常に敏感で、茎頂が植付後すぐに褐変し
てしまう場合がある。また、茎頂の摘出操作は通常ろ紙
上で行うが、特に木本性植物の場合、摘出の際の物理的
な障害によって誘導されるポリフェノール等の二次代謝
産物により褐変する場合が多い。

さらにまた、特にユーカリにおいて、従来使用されてき
た植物ホルモンでは濃度の許容範囲が狭く厳密に調整し
なければ、苗条原基を安定的に作用することができない
等いくつかの問題点があった。

このため、本発明者等はさらに安定的に苗条原基を作用
する方法につい°て鋭意研究した。この結果、無菌的に
生育させた植物を材料に使って、ポリビニルピロリドン
（以下、ｒＰＶＰＪと略記する）を含む液体中で茎頂を
摘出し、さらに植物ホルモンとしてサイトカニン類であ
るノー會＜２−９０ルー４−ピリジル）−３−フェニル
尿素（協和醗酵株式会社、以下、ｒ　４ＰＵＪと略記す
る）　（別名にＴ−３０＞を用いることによって、より
安定的に苗条原基を作用することが可能であることを見
出して本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明者等は、（１）無菌的に生育させた植物（
無菌苗）の茎頂を摘出して通常の方法で苗条原基を作用
する場合、苗条原基を形成することなく褐変することが
ないこと、（２）苗条原基を作用するために植物の茎頂
を摘出する場合、ＰＶＰを含む水溶液中で摘出すれば、
ポリフェノール等の二次代謝物により摘出された茎頂部
が褐変するのを防止しうること、並びに（３）摘出した
茎頂部から苗条原基を作用する場合、４ＰＵを添加した
人工液体培地中で培養することにより効果的に苗条原基
を得ることができること、更に、上記（１）、（２）及
び〔３〕の方法を組み合わせて行うことにより安定的に
効率よく苗条原基を得ることができることを見いだした
。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明は、無菌的に生育させた木本性植物の生長点を含
む茎頂部分をＰｖＰを含む液体中で摘出し、次いで苗条
原基誘導用人工液体培地である、例えばガンボークの８
５培地に、植物ホルモンとしてサイトカニン類である４
ＰＵを用いることによってより安定的に苗条原基を作用
する方法である。

本発明の対象である木本性植物としては、特に限定され
るものではないが例えばユーカリ、アカシア、バラゴム
ツキ、コーヒー等の常緑広葉樹類、ポプラ、コナラ、ク
ヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹類、ミカン、レモン、サク
シ、モモ、リンゴ、ナシ、アボガド、キウィフルーツ、
カキ、クルミ、ブドウ、イチヂク、アーモンド、マンゴ
ウ等の果樹類、さらにバラ、ツバキ、ウメ、サクシ等の
花木類等をあげることができる。

以下、本発明の苗条原基の作用法ならびに植物体の再生
等について詳しく説明する。

無菌苗の養成 植物の種子を５〜７倍に希釈したアンチホルミンならび
に７０％アルコールで殺菌したあと、滅菌水で３回程度
洗浄する。次いで、ろ紙で水分を取り除きこれを植物の
組織培養培地、例えばガンボークの０５培地あるいはム
ラシゲ・スクーグのＭＳ培地にショ糖および寒天を添加
した培地で２０〜３０℃の温度、また１２〜１６時間の
明条件で発芽させる。

発芽した植物の根を切り取ったあと上記の組織培養培地
に植物ホルモンのオーキシン頚として例えばナフタレン
酢酸（以下、ｒ　ＮＡＡＪと略記する）、そしてサイト
カニン類としてベンジルアデニン（以下、ｒＢＡＪと略
記する）等を添加した固体培地に植え付け、発芽させた
のと同じ条件下で培養することよって無菌苗が得られる
。

なお、得られた無菌苗は継代的に培養を繰り返すことが
可能で、季節に関係なくいつでも苗条原基を作用するた
めの材料を提供することができる。

苗条原基作用方法 木本性植物の苗条原基作用法はすでに特開昭６２−５５
０２０号公報に記載されほぼ確立されているが、今回発
明者らは、さらに安定的に効率良く苗条原基を作用する
ために、次の点を改良した。

■無菌苗を用いること。

■液体中で茎頂を摘出すること。

■植物ホルモンとして４ＰＵを使用すること。

すなわち、前記の無菌的に養成した植物の生長点を含む
茎頂部分を、０．１−１％の濃度のＰＶＩ’を含む液体
の中で０．５ｍｍ程度の大きさで切り出し、これを植物
の組織培養培地、例えばガンボークの０５培地あるいは
ムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等に、植物ホルモンのサ
イトカニン類として４Ｐ口を、オーキシン頚としてＮＡ
Ａ　、　２．４ジクロロフエノキシ酢酸（２，４−Ｄ）
あるいはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を添加した液体培
地に植え付ける。

これを２０〜３０℃の温度、２．０００〜２０．０００
１０Ｘの照度、そして１〜！Ｏｒｐｍの回転数で３０〜
５０間回転培養する。

苗条原基の苗化法 苗条原基作用法によって得られた苗条原基は、苗化用の
固定培地に移植することによって苗条が得られる。すな
わち、ガンボーグの口５培地あるいはムラシゲ・スクー
グのＭＳ培地にオーキシン類としてＮへ＾を、サイトカ
イニン類としてＢ八等を添加し、さらに１％のショ糖と
０．４〜０．６％の寒天を添加した苗化用培地に苗条原
基を移植して１５〜３０℃の温度、１，０００〜４，０
００１　ｕｘで１２〜１６時間の照明下で静置培養する
と多数の微少な苗条を生じる。

次にこれを発根培地に移植して発根させると、完全な植
物体となる。なお、植物体が再生されるまでの期間は静
置培養開始後約３か月であり、得られた植物の遺伝子型
、染色体型および表現型は親植物と全く同一である。

以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明する。

〔実施例１〕 供試植物 ユーカリ　（［！ｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃａｍａｌｄｕ
ｌｅｎｓｉｓ　）無菌苗の作用 無菌苗を作用するために、まず成熟した種子を選んで７
倍に希釈したアンチホルミンに１時間、７０％アルコー
ルに２分間、さらに５倍に希釈したアンチホルミンに２
０分間浸漬して殺菌後、滅菌水で３回洗浄した。次に、
水分をろ紙で吸い取ってから、ガンボーグのＢ５培地に
、３％のショ糖および０．６％の寒天を含む無菌播種用
の培地に植え付けた。培養は２７℃の温度、４．０００
Ｉ！ｕｘの照度、１６時間の明条件下で行った。植え付
けてから約１週間後に発芽が認められたが、これをさら
に培養してその地上部がｌ　ｃｍ程度に伸びたところで
、苗を培地より取り出しナイフを用いて根の部分を切除
した。そして、地上部だけをガンボーグの８５培地に植
物ホルモンとしてＮへへ０．０５　ｍｇ／ｊ！　、口＾
０．１ｍｇ＃！及び３％のショ糖と０．６％の寒天を加
えた培地に植え付け、前述と同じ培養条件下で培養して
無菌苗を得た。

苗条原基の作用法 無菌苗の作用法によって得られた植物を、蒸留水に０．
１％のＰＶｒ’　（ポリビニルピロリドン、Ｋ−３０和
光純薬工業株式会社製）を加えた液体中で約０．５ｍｍ
の大きさの生長点を含む茎頂部を切り出し、これを植物
の組織培養培地であるガンボーグの０５培地に３％、の
ショ糖を加え、植物ホルモンとしてＮＡΔと４　ＰＵを
添加してｐＨ５，６に調整した液体培地に植え付けた。

なお、これと比較するために、植物ホルモンである４Ｐ
Ｕに代えて口＾を用いた液体培地にも植え付けた。

さらに、無菌苗の使用による効果を検討するために、従
来法によって苗条原基を作用する方法についても行った
。すなわち、屋外で生育した４年生の苗の枝条を先端部
分から約１０ｍｍを切り取って７０％の濃度のアルコー
ルで３０秒間と１０倍希釈したアンチホルミンで２０分
間殺菌した。

これを滅閑水で３回洗浄後、前記の方法にしたがって茎
頂部を組織培養培地に植え付けた。これを２８℃の温度
、２，０００−２０，０ＯＯ１ｕｘの照度モして２ｒｐ
ｍの回転数で３０日間回転培養した。この結果を第２表
に示す。

第２表に示す結果によれば本発明の無菌苗を使用する場
合には、植物ホルモンとしてＢＡおよび４ＰＵを使った
いずれの場合にも従来法で滅菌したものに比較して褐変
するものの数が少なく、無菌苗を使用することが有効で
あることが明らかである。また、植物ホルモンとして口
Ａを使った場合には早生分枝までは形成されるが、苗条
原基の形成には至らない。しかしながら、４ＰＩＩを使
った場合には苗条原基が形成された。

苗条原基の苗化法 回転培養して得た苗条原基を、ガンボーグの０５培地に
植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／　ｌのＮＡＡと０．
２ｍｇ／　ｌの８八、さらにショ糖を１％と寒天を０．
６％添加し、次いでｐｔ１５．６に調整した苗化培地に
置床した。そして、２７℃の温度、照度４．０００１　
ｕｘ”′Ｑ１６時間の明条件下で培養を継続した結果、
６０日日目は苗化が認められた。次にこれを発根させる
ためにガンボーグの８５培地に０、０１ｍｇ／　ｌのＮ
ＡＡおよび１％のショ糖さらに０．４％の寒天を添加し
、ｐＨ５，６に調整した発根用培地に移植し、同一条件
下で培養を行った。

その結果３０日１には発根して完全な植物体となった。

〔実施例２〕 供試植物 ユーカリ　（Ｌｌｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ
および［！ｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓａｌｉｇｎａ　）無
菌苗の作用 無菌苗を作用するために実施例１記載の方法と同様にし
て、無菌植物を調整した。ただし、実施例１に示したＢ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓの場
合とは異なってガンボーグの０５培地に植物ホルモンと
してＮＡＡを０．５ｍｇ／Ｉ！、ＢＡを０．０１ｍｇ／
ｌ、またショ糖を３％と寒天を０．６％加えた培地を使
用した。

苗条原基の作用法 無菌苗の作用法によって得られた植物の茎頂部を実施例
１と同様にして切り出して液体培地に植え付けて回転培
養した。その結果第３表に示すように植物ホルモンとし
てＢＡを使用した場合には苗条原基の形成は認められず
、早生分枝の形成までにとどまったが、４ＰＵを用いる
ことによって苗条原基が作用された。

苗条原基の苗化法 得られた苗条原基を、ガンボーグの口５培地に植物ホル
モンとして０．２ｍｇ／　１のＮＡＡと　０．２ｍｇ／
ｉの０八、さらにショ糖を１％、寒天を０．６％添加し
てｐＨ５，６に調整した苗化培地に置床した。

これを２７℃の温度、照度４．０００１　ｕｘで１６時
間の明条件で培養を継続した結果、６０日１には苗化が
認められた。

次にそれらを発根させるためにガンボーグの８５培地に
０．０１ｍｇ／　１のＮＡＡおよび１％のショ糖、０．
４％の寒天を添加し、さらにｐＨを５．６に調整した発
根培地に移植し同一条件下で培養を行った。

その結果３０日１には発根し完全な植物体が再生された
。得られた植物の遺伝型、染色体型および表現型は親植
物と全く同一である。

発明の効果 本発明によって有用でかつ優れた遺伝子をもった植物を
その形質を変異させることなく、また季節に左右される
ことなく、効率よく安定的に作用することが可能になっ
た。すなわち、無菌苗の茎頂を用いることによって褐変
率を４５％程度低下させ、さらに植物ホルモンとして４
ＰＵを用いることによって効率良く苗条原基を得ること
が可能になった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、無菌的に生育させた木本性植物の生長点を含む茎頂
   部をポリビニルピロリドンを含む液体中で摘出して無機
   塩類および植物ホルモンを添加した人工液体培地に移植
   し、光照射下に回転培養することを特徴とする苗条原基
   集塊を作用する方法。 ２、無菌的に生育させた木本性植物の生長点を含む茎頂
   部を摘出して無機塩類組成物および１−（２−クロル−
   ４−ピリジル）−３−フェニル尿素を添加した人工液体
   培地に移植し、光照射下に回転培養することを特徴とす
   る苗条原基集塊を作用する方法。 ３、人工液体培地に加える植物ホルモンである１−（２
   −クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿素を０．０
   ２〜０．５ｍｇ／ｌの範囲の濃度となるように添加する
   請求項１記載の方法。 ４、木本性植物の生長点を含む茎頂部を摘出する際にポ
   リビニルピロリドンを０．１〜１％の濃度で含む液体を
   使用する請求項１又は２記載の方法。