JP4075081B2 - 形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アグロバクテリウム菌を用いて形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法に関し、さらに詳しくは、従来のアグロバクテリウム菌による形質転換方法によっては形質転換植物が得られなかったユーカリ属植物に対して、有効な形質転換植物の作出方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物育種技術として、従来より選抜あるいは交雑といった方法が広く利用されている。これらの方法は植物の遺伝子を大きな単位として扱う広義の遺伝子導入であると考えることができる。一方、遺伝子操作技術の進歩によって、特定の遺伝子の単離、その遺伝子の改変、及び植物への導入がいくつかの植物種で可能になってきている。これらの遺伝子操作技術を応用することによって、タバコ、イネ、トマト等の草本性植物において、実用性の高い育種が達成されつつある。しかしながら、一方では多くの植物において、遺伝子操作による植物育種が困難であり、その大きな理由として形質転換技術が未完成であることが考えられる。
【０００３】
植物の形質転換技術は、（１）アグロバクテリウム菌を介して遺伝子を導入する生物的方法、（２）植物細胞に対して物理的あるいは化学的処理を行い、遺伝子を直接的に導入する方法に大別される。両方法は、対象とする植物の再分化系によって、使い分ける必要がある。すなわち、生物的方法を用いる場合は、組織からの形質転換植物の再分化を行う必要があり、また直接的方法の場合は、プロトプラストから再分化を行う必要がある。このような状況において、再分化系の確立されていない植物の場合、組織からの再分化系を確立することは、プロトプラストから再分化系を確立することより容易であることを考え合わせると、生物的方法によって形質転換する方が適用範囲が広いために、産業上有益であると考えられる。
【０００４】
これまで、組織培養が困難であると考えられてきた木本性植物でも、アグロバクテリウム菌を用いる生物学的方法によって、ロブロリーパイン（Sederoff et al. Bio/Technology 4 : 647-649(1986)）、ポプラ（Fillatti et al. Mol.Gen.Genet. 206 : 192-199(1987)）、ウォールナット（McGranahan et al. Bio/Technology 6 : 800-804(1988)）、リンゴ（James et al. Plant Cell Rep. 7 : 658-661(1989)）、プラム（Mante et al. Bio/Technology 9 : 853-857(1991) ）等で形質転換植物の作製に成功したことが報告されている。これらの木本性植物で形質転換植物の作製に成功した要因は、組織からの再分化系が確立されていることに起因していると考えられるが、これら以外の新たな植物種で再分化系を確立することは依然として困難である。
【０００５】
一方、本発明者らは、ユーカリ属植物のプロトプラストからコロニーを経て植物体を再生する方法を既に提案している（特開平２−１２８６３１号公報）。さらに、そのプロトプラストに対して、エレクトロポレーション法によって遺伝子を導入した形質転換植物の作出法も提案している（特開平４−５３４２９号公報）。しかしながら、これらの新規で有効な方法であっても、植物種が異なれば、新たにプロトプラストからの再分化系を確立しなければならない。さらに形質転換植物を得るまでに長期間を要するばかりでなく、形質転換植物が得られる頻度が低い等の点で改良の余地が残されていた。
【０００６】
本発明者らは、苗条原基にアグロバクテリウム菌を感染させる形質転換法についても提案している（特開平２−１３８９６６号公報）。しかしながら、ユーカリ属植物ではアグロバクテリウム菌の苗条原基に対する感染性が低いため、アグロバクテリウム菌の感染材料として優れた組織の検討、あるいは感染性を向上させる要因を発見する必要が生じた。さらに固体培地上ではユーカリ属植物カルスからの再分化が困難である等の点で改良の余地が残されていた。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ユーカリ属植物の様々な組織に対してアグロバクテリウム菌の感染を行い、組織間での形質転換率を調べるとともに、最適組織における形質転換率を向上させる要因について検討した。さらに、アグロバクテリウム菌の感染によって形質転換された組織片を、感染処理後に抗生物質を含む培地で竪型回転培養することで、非形質転換細胞から区別するとともに、効率的に形質転換苗条原基を形成する本方法を完成した。このようにして得られた形質転換苗条原基からは容易に形質転換植物が再生される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アグロバクテリウム菌の感染性が低いユーカリ属植物を効率よく形質転換し、その形質転換細胞から効率よく形質転換植物を作出する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ユーカリ属植物の子葉あるいは胚軸からなる組織片をガラクトース及びアセトシリンゴンを添加した感染培地中で液体静置培養又は固体培養により感染培養してアグロバクテリウム菌に感染させた後、感染した組織片を抗生物質を添加した液体除菌培地中で竪型回転培養することによって除菌し、次に感染した組織片を抗生物質を添加した選抜培地中で竪型回転培養することによって形質転換細胞集塊を選抜し、選抜によって得られた細胞集塊をさらに光照射下で竪型回転培養することによって形質転換された苗条原基を作出し、得られた苗条原基を介して形質転換されたユーカリ属植物を作出することを特徴とする形質転換されたユーカリ属植物の作出方法に存する。
【００１０】
また、本発明は、ユーカリ属植物の組織片として子葉或いは胚軸を使用することを特徴とする方法、その感染培地中にガラクトース及びアセトシリンゴンを添加することを特徴とする方法、感染培養が液体静置培養、又は固体培養であることを特徴とする方法及び除菌培養が液体回転培養であることを特徴とする方法にも存する。 以下、本発明の形質転換されたユーカリ属植物の作出方法について詳しく説明する。
【００１１】
（アグロバクテリウム菌を感染させるための子葉、胚軸）：
形質転換することを目的とするユーカリ属植物の子葉及び胚軸は種子を殺菌した後、植物の組織培養培地、例えばＢ５培地あるいはＭＳ培地等の寒天培地上に置床して発芽させ、ピンセットとナイフを用いて無菌的に摘出したものを用いる。
【００１２】
（アグロバクテリウム菌の調整）：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無毒化したもの、あるいは無毒化していない菌株を用意する。導入する遺伝子は、植物細胞内で発現するように改良した後に、Ｔｉプラスミドベクターあるいはバイナリーベクターに結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用する（Ｍ−Ｄ，Chilton et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 : 4060-4064(1980)）、（L.Herrera-Estrella et al. Nature 303 : 209-213(1983)）。上記の方法で得たアグロバクテリウム菌を、ベクターの適正量の選抜抗生物質を添加したＬ−液体培地（Miller Experiments in Molecular Genetics (1972) 10g/1 Bact-tryptone, 5g/1 Bact-yeast extract,5g/1 NaCl) にて、３０℃、一晩でＯ．Ｄ．600 が０．８以上まで培養する。
【００１３】
（アグロバクテリウム菌の感染）：
子葉、胚軸の植物組織を、０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断し、アグロバクテリウム菌感染培地、例えばＷＰＭ（Loyd & McCown Proc.Int.Plant Prop.Soc. 30 : 421-427(1980))、Ｂ５（Gamborg et al. Exp.Cell Res. 50 : 151-158(1968))、ＭＳ（Murashige & Skoog Physiol.Plant 15 : 473-497(1962)) 培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿素（４−ＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）あるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）あるいはインドール酢酸（ＩＡＡ）等と、ショ糖、ガラクトース、アセトシリンゴン及びアグロバクテリウム菌を添加した液体培地に植え付ける。さらに好ましくは、植物組織片をアグロバクテリウム菌培養液に漬けた後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固体培地に着床する。これを２０〜３０℃の温度、遮光条件下で１〜２日間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
【００１４】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させた植物組織片を除菌培地、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４−ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、例えばカルベニシリン、バンコマイシン、クラフォラン等とショ糖を添加した液体培地に植え付ける。これを２５℃の温度、０〜２０００ルクスの照度下で３〜１４日間竪型回転培養し、アグロバクテリウム菌の除菌を行う。
【００１５】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した植物組織片を、基本培地として、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するために、目的導入遺伝子と同時に導入される選抜遺伝子に対応する抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は１〜１０ｒｐｍの回転速度、最高２，０００〜２０，０００ルクスの照度、２０〜３０℃の温度とする。１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続すると、形質転換された細胞の選抜を始めてから１ケ月程度で、植物組織片中に黄白色の形質転換したカルス形成が認められる。得られたカルスを植物組織片からナイフによって切り離し、さらに竪型回転培養を継続することによって、光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られる。
【００１６】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基を、苗条を再生するための培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＡＡ等のオーキシン類、ＢＡ、４−ＰＵ、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン類及び炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した培地で培養する。培養は２０〜３０℃の温度、２，０００〜３，０００ルクスの照度で約６０日間行って苗条を再生させ、さらに、発根させて完全な形質転換植物を得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
供試植物
ユーカリ属植物としてユーカリ・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis) を使用した。
（子葉、胚軸の作出）：
ユーカリ・カマルドレンシスの種子を、１０倍に希釈したアンチホルミンで１時間殺菌し、さらに、無菌的に７０％の濃度のエタノールに１５秒間、及び５倍に希釈したアンチホルミンに２０分間浸漬して殺菌した。これを植物の組織培養培地であるＢ５寒天培地上で無菌的に発芽させた。発芽した植物から子葉及び胚軸をピンセットとナイフを用いて無菌的に摘出し実験材料とした。
【００１８】
（アグロバクテリウム菌の調整）：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無毒化したＬＢＡ４４０４株（M.W.Bevan et al.Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721(1984) ) を使用した。導入遺伝子としてはいかなる遺伝子であろうとも、そのプロモーターを植物用のプロモーターに置換することによって発現させ得る。ここでは、市販品として入手可能なβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をバイナリーベクターｐＢＩ１２１に結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用した（R.A.Jefferson et al.EMBO J. 6 : 3901-3907(1987) ) 。上記のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１を、抗生物質であるカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬ−液体培地にて、一晩３０℃で培養した。
【００１９】
（アグロバクテリウム菌のユーカリ属植物組織への感染）：
Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ
ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらに１０ｍＭ ガラクトースと１μＭアセトシリンゴンを添加し、さらに１％の濃度になるように前記の方法で調整したアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１の培養液を添加した感染培地を作製した。この培地に、ユーカリ属植物の子葉、胚軸の各組織片を０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断して移植し、２６℃の温度、遮光条件下で２日間静置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００２０】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させた組織片より、アグロバクテリウム菌を除くために、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらにアグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質として、２５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン、１００μｇ／ｍｌ バンコマイシンを添加した除菌培地に移植した。これを２５℃の温度、遮光条件下、２ｒｐｍの回転速度で７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００２１】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵ、３％ショ糖、および抗生物質ジェネチィシン（Ｇ４１８）を３０μｇ／ｍｌで添加した液体培地に、１本の試験管に対し３片の割合で植え付けた。２５℃の温度、遮光条件下で７日間、さらに下辺が２００ルクス上辺が２００００ルクスの光照射下、２ｒｐｍの回転速度で１か月間竪型回転培養することによって、組織片中に黄白色で２〜３ｍｍの形質転換したカルス形成が認められた。得られたカルスを１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られた。
【００２２】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基より、形質転換された苗条を再生させるためにＢ５培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ＢＡ、１％ ショ糖、０．２％ ゲランガム（和光純薬）及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した固形培地に５ｍｍ程度の大きさに調整した苗条原基を移植した。そして、２５℃の温度、照度４０００ルクス、１６時間光照射下で培養した結果、移植後１か月後には苗条の再生が認められた。得られた苗条はＢ５培地に０．０１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、１％ ショ糖、０．１５％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した発根培地に移植することによって、１か月後には発根が認められ完全な植物体となった。すなわち、本方法の場合、植物組織片への感染から形質転換植物の作出まで５〜１２か月を要した。
【００２３】
（形質転換植物における導入遺伝子の存在確認）：
抗生物質による選抜によって得られていた４個体について、サザンハイブリダイゼーション法を用いて導入遺伝子の存在を確認したところ、全個体において少なくとも１個以上、多い場合は数個の遺伝子が導入されていることが確認された。このことより本方法によるユーカリ属植物の形質転換が有効であることが証明された。
【００２４】
（形質転換植物における導入遺伝子の発現確認）：
サザンハイブリダイゼーションによって導入遺伝子の存在が確認された個体について、ＧＵＳ遺伝子の発現を組織染色（S.Kosugi et al. Plant Science 70 : 133-140(1990)) によって調べたところ、葉の周囲、根端及び根毛において強いＧＵＳ遺伝子の発現が確認された。
【００２５】
実施例２
ユーカリ・カマルドレンシスを無菌播種後、子葉、胚軸、根、及び成葉、野外植物の成葉に対して、実施例１と同様の感染培地を用いてアグロバクテリウム菌を感染させた後、実施例１と同様の方法によって形質転換カルスの作出を行った。そして、材料の違いによるアグロバクテリウム菌の感染率を形質転換カルス形成率で比較した。その結果、実験に用いた子葉断片の９．９％、胚軸断片の１１．３％に形質転換カルスの形成がみられたのに対し、根断片では０％であった。またアグロバクテリウム菌による形質転換で一般的に使用される成葉を感染材料に用いた場合、アグロバクテリウム菌との共存培養によって葉色の褐変、あるいは、非形質転換細胞が生育する傾向にあり、形質転換カルスを得るのは困難であることが明らかになった。
【００２６】
実施例３
ユーカリ・カマルドレンシスの子葉片とアグロバクテリウム菌との感染培養を行う時、感染培地中にガラクトースとアセトシリンゴンを添加しないこと以外は、実施例１と同じ方法で形質転換を行い、形質転換カルスの形成率でガラクトースとアセトシリンゴンの添加が形質転換率に与える影響を調べた。その結果、無添加の場合供試した２０子葉片のうち１片に形質転換カルスが得られた。一方、添加した場合２０子葉のうち３片に形質転換カルスが得られ、ガラクトースとアセトシリンゴンの添加がユーカリ属植物の形質転換率の向上に効果があることが明らかになった。
【００２７】
実施例４
アグロバクテリウム菌の感染培養方法と除菌培養方法が形質転換率に与える影響を検討した。具体的には、実施例１と同様の方法によって調整したユーカリ・カマルドレンシスの子葉片をアグロバクテリウム菌に感染させる際、その感染培養と除菌培養において、寒天の有無以外実施例１と同じ成分を有する固体培地あるいは液体培地の静置培養又は回転培養を行うことによって、形質転換したカルスの数を調べた。その結果、表１に示したようにアグロバクテリウム菌の感染培養は液体静置培養、さらに好ましくは、固体培養で行い、除菌培養については液体回転培養で行うことで効率よく形質転換できることが明らかになった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実施例５
実施例１と同様の方法でアグロバクテリウム菌感染を行ったユーカリ・カマルドレンシスの子葉片を除菌期間以外は実施例１と同じ方法で形質転換し、その除菌期間による形質転換率に与える影響を調べた。アグロバクテリウム菌感染直後に除菌を行った場合、形質転換カルスの形成率は０％であったのに対して、２日間では３０％、７日間では４３％に向上し、さらに１４日間では４０％の子葉片にカルスの形成が観察された。このことから、アグロバクテリウム菌の除菌に要する期間は７日間が好ましいことが明らかになった。
【００３０】
比較例１
太田らが提案した方法（特開平４−５３４２９号公報）に従い、ユーカリ・カマルドレンシスのプロトプラストに実施例１と同様に調整した遺伝子をエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物を作出したが、これには約２年間を要した。
一方、アグロバクテリウム法による形質転換植物の作出は、感染から約５〜１２か月で形質転換植物の作出ができる。このことからアグロバクテリウム法はエレクトロポレーション法よりも短期間で形質転換植物を作出することができることが明らかになった。
【００３１】
比較例２
ユーカリ属植物の苗条原基に対して、実施例１と同様の感染培地を用いてアグロバクテリウム菌を感染させた後、実施例１と同様の方法によって形質転換カルスの作出を行った。その結果、形質転換したカルスの形成はなかった。
【００３２】
比較例３
実施例１と同様の方法でアグロバクテリウム菌の感染を行ったユーカリ・カマルドレンシスの子葉を、除菌以降の過程で静置培養する以外は実施例１と同じ方法によって形質転換を行った。その結果、実施例１と同様に形質転換したカルスは得られたが、苗化培地に置床しても苗条は得られずカルスのまま増殖し、やがて枯死した。
【００３３】
実施例６
（供試植物）：
ユーカリ属植物としてユーカリ・グロブラス（Eucalyptus globulus)を使用した。
（子葉、胚軸の作出及びアグロバクテリウム菌の調整）：
ユーカリ・グロブラスについても、実施例１と同様の方法によって行った。
（アグロバクテリウム菌のユーカリ属植物組織への感染）：
実施例１と同様の方法によって、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらに１０ｍＭ ガラクトースと１μＭ アセトシリンゴンを添加し、さらに１％になるようにアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１の培養液を添加したアグロバクテリウム菌の感染培地を作製した。この培地に、ユーカリ属植物の子葉、胚軸のそれぞれの組織片を、０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断した組織片を移植し、２６℃の温度、遮光条件下で２日間静置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００３４】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させたユーカリ属植物組織より、アグロバクテリウム菌を除くために、植物組織片を除菌培地、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらにアグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、２５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、１００μｇ／ｍｌ バンコマイシンを添加した除菌培地に移植した。これを２５℃の温度、遮光条件下、２ｒｐｍの回転速度で７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００３５】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵ、３％ ショ糖、及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した選抜培地に、１本の試験管に対し３片の割合で植え付けた。２５℃の温度、遮光条件下で７日間、さらに下辺が２０００ルクス上辺が２００００ルクスの光照射下、２ｒｐｍの回転速度で１か月間竪型回転培養することによって、組織中に黄白色で２〜３ｍｍのカルス形成が認められた。得られたカルスを１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られた。
【００３６】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基より、形質転換された苗条を再生させるためにＢ５培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ＢＡ、１％ ショ糖、０．２％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した固形培地に５ｍｍ程度の大きさに調整した苗条原基を移植した。そして、２５℃の温度、照度４０００ルクス、１６時間光照射下で培養した結果、移植後１か月後には苗条の再生が認められた。得られた苗条はＢ５培地に０．０１ｍｇ／ｌＮＡＡ、１％ ショ糖、０．１５％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した発根培地に移植することによって、１か月後には発根が認められ完全な植物体となった。
【００３７】
（形質転換植物における導入遺伝子の存在確認と発現確認）：
形質転換によって得られた個体について、実施例１と同様にサザンハイブリダイゼーション法によって、導入遺伝子の存在確認を行ったところ、全個体において少なくとも１個以上、多い場合は数個の遺伝子が導入されていることが確認された。さらに、ＧＵＳ遺伝子の発現を組織染色によって確認した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって、これまで形質転換植物の作出が困難であったユーカリ属植物においても、効率よく安定的にしかも短期間に形質転換植物の作出が可能になった。さらに、有用遺伝子導入によって、ユーカリ属植物の優良新品種を作出し、その新品種を形質転換過程で得られる苗条原基を用いることによって、短期間にしかもより安価に有用遺伝形質をもつ苗木を供給することが可能になった。
【産業上の利用分野】
本発明は、アグロバクテリウム菌を用いて形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法に関し、さらに詳しくは、従来のアグロバクテリウム菌による形質転換方法によっては形質転換植物が得られなかったユーカリ属植物に対して、有効な形質転換植物の作出方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物育種技術として、従来より選抜あるいは交雑といった方法が広く利用されている。これらの方法は植物の遺伝子を大きな単位として扱う広義の遺伝子導入であると考えることができる。一方、遺伝子操作技術の進歩によって、特定の遺伝子の単離、その遺伝子の改変、及び植物への導入がいくつかの植物種で可能になってきている。これらの遺伝子操作技術を応用することによって、タバコ、イネ、トマト等の草本性植物において、実用性の高い育種が達成されつつある。しかしながら、一方では多くの植物において、遺伝子操作による植物育種が困難であり、その大きな理由として形質転換技術が未完成であることが考えられる。
【０００３】
植物の形質転換技術は、（１）アグロバクテリウム菌を介して遺伝子を導入する生物的方法、（２）植物細胞に対して物理的あるいは化学的処理を行い、遺伝子を直接的に導入する方法に大別される。両方法は、対象とする植物の再分化系によって、使い分ける必要がある。すなわち、生物的方法を用いる場合は、組織からの形質転換植物の再分化を行う必要があり、また直接的方法の場合は、プロトプラストから再分化を行う必要がある。このような状況において、再分化系の確立されていない植物の場合、組織からの再分化系を確立することは、プロトプラストから再分化系を確立することより容易であることを考え合わせると、生物的方法によって形質転換する方が適用範囲が広いために、産業上有益であると考えられる。
【０００４】
これまで、組織培養が困難であると考えられてきた木本性植物でも、アグロバクテリウム菌を用いる生物学的方法によって、ロブロリーパイン（Sederoff et al. Bio/Technology 4 : 647-649(1986)）、ポプラ（Fillatti et al. Mol.Gen.Genet. 206 : 192-199(1987)）、ウォールナット（McGranahan et al. Bio/Technology 6 : 800-804(1988)）、リンゴ（James et al. Plant Cell Rep. 7 : 658-661(1989)）、プラム（Mante et al. Bio/Technology 9 : 853-857(1991) ）等で形質転換植物の作製に成功したことが報告されている。これらの木本性植物で形質転換植物の作製に成功した要因は、組織からの再分化系が確立されていることに起因していると考えられるが、これら以外の新たな植物種で再分化系を確立することは依然として困難である。
【０００５】
一方、本発明者らは、ユーカリ属植物のプロトプラストからコロニーを経て植物体を再生する方法を既に提案している（特開平２−１２８６３１号公報）。さらに、そのプロトプラストに対して、エレクトロポレーション法によって遺伝子を導入した形質転換植物の作出法も提案している（特開平４−５３４２９号公報）。しかしながら、これらの新規で有効な方法であっても、植物種が異なれば、新たにプロトプラストからの再分化系を確立しなければならない。さらに形質転換植物を得るまでに長期間を要するばかりでなく、形質転換植物が得られる頻度が低い等の点で改良の余地が残されていた。
【０００６】
本発明者らは、苗条原基にアグロバクテリウム菌を感染させる形質転換法についても提案している（特開平２−１３８９６６号公報）。しかしながら、ユーカリ属植物ではアグロバクテリウム菌の苗条原基に対する感染性が低いため、アグロバクテリウム菌の感染材料として優れた組織の検討、あるいは感染性を向上させる要因を発見する必要が生じた。さらに固体培地上ではユーカリ属植物カルスからの再分化が困難である等の点で改良の余地が残されていた。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ユーカリ属植物の様々な組織に対してアグロバクテリウム菌の感染を行い、組織間での形質転換率を調べるとともに、最適組織における形質転換率を向上させる要因について検討した。さらに、アグロバクテリウム菌の感染によって形質転換された組織片を、感染処理後に抗生物質を含む培地で竪型回転培養することで、非形質転換細胞から区別するとともに、効率的に形質転換苗条原基を形成する本方法を完成した。このようにして得られた形質転換苗条原基からは容易に形質転換植物が再生される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アグロバクテリウム菌の感染性が低いユーカリ属植物を効率よく形質転換し、その形質転換細胞から効率よく形質転換植物を作出する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ユーカリ属植物の子葉あるいは胚軸からなる組織片をガラクトース及びアセトシリンゴンを添加した感染培地中で液体静置培養又は固体培養により感染培養してアグロバクテリウム菌に感染させた後、感染した組織片を抗生物質を添加した液体除菌培地中で竪型回転培養することによって除菌し、次に感染した組織片を抗生物質を添加した選抜培地中で竪型回転培養することによって形質転換細胞集塊を選抜し、選抜によって得られた細胞集塊をさらに光照射下で竪型回転培養することによって形質転換された苗条原基を作出し、得られた苗条原基を介して形質転換されたユーカリ属植物を作出することを特徴とする形質転換されたユーカリ属植物の作出方法に存する。
【００１０】
また、本発明は、ユーカリ属植物の組織片として子葉或いは胚軸を使用することを特徴とする方法、その感染培地中にガラクトース及びアセトシリンゴンを添加することを特徴とする方法、感染培養が液体静置培養、又は固体培養であることを特徴とする方法及び除菌培養が液体回転培養であることを特徴とする方法にも存する。 以下、本発明の形質転換されたユーカリ属植物の作出方法について詳しく説明する。
【００１１】
（アグロバクテリウム菌を感染させるための子葉、胚軸）：
形質転換することを目的とするユーカリ属植物の子葉及び胚軸は種子を殺菌した後、植物の組織培養培地、例えばＢ５培地あるいはＭＳ培地等の寒天培地上に置床して発芽させ、ピンセットとナイフを用いて無菌的に摘出したものを用いる。
【００１２】
（アグロバクテリウム菌の調整）：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無毒化したもの、あるいは無毒化していない菌株を用意する。導入する遺伝子は、植物細胞内で発現するように改良した後に、Ｔｉプラスミドベクターあるいはバイナリーベクターに結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用する（Ｍ−Ｄ，Chilton et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 : 4060-4064(1980)）、（L.Herrera-Estrella et al. Nature 303 : 209-213(1983)）。上記の方法で得たアグロバクテリウム菌を、ベクターの適正量の選抜抗生物質を添加したＬ−液体培地（Miller Experiments in Molecular Genetics (1972) 10g/1 Bact-tryptone, 5g/1 Bact-yeast extract,5g/1 NaCl) にて、３０℃、一晩でＯ．Ｄ．600 が０．８以上まで培養する。
【００１３】
（アグロバクテリウム菌の感染）：
子葉、胚軸の植物組織を、０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断し、アグロバクテリウム菌感染培地、例えばＷＰＭ（Loyd & McCown Proc.Int.Plant Prop.Soc. 30 : 421-427(1980))、Ｂ５（Gamborg et al. Exp.Cell Res. 50 : 151-158(1968))、ＭＳ（Murashige & Skoog Physiol.Plant 15 : 473-497(1962)) 培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿素（４−ＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）あるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）あるいはインドール酢酸（ＩＡＡ）等と、ショ糖、ガラクトース、アセトシリンゴン及びアグロバクテリウム菌を添加した液体培地に植え付ける。さらに好ましくは、植物組織片をアグロバクテリウム菌培養液に漬けた後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固体培地に着床する。これを２０〜３０℃の温度、遮光条件下で１〜２日間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
【００１４】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させた植物組織片を除菌培地、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４−ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、例えばカルベニシリン、バンコマイシン、クラフォラン等とショ糖を添加した液体培地に植え付ける。これを２５℃の温度、０〜２０００ルクスの照度下で３〜１４日間竪型回転培養し、アグロバクテリウム菌の除菌を行う。
【００１５】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した植物組織片を、基本培地として、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するために、目的導入遺伝子と同時に導入される選抜遺伝子に対応する抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は１〜１０ｒｐｍの回転速度、最高２，０００〜２０，０００ルクスの照度、２０〜３０℃の温度とする。１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続すると、形質転換された細胞の選抜を始めてから１ケ月程度で、植物組織片中に黄白色の形質転換したカルス形成が認められる。得られたカルスを植物組織片からナイフによって切り離し、さらに竪型回転培養を継続することによって、光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られる。
【００１６】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基を、苗条を再生するための培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＡＡ等のオーキシン類、ＢＡ、４−ＰＵ、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン類及び炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した培地で培養する。培養は２０〜３０℃の温度、２，０００〜３，０００ルクスの照度で約６０日間行って苗条を再生させ、さらに、発根させて完全な形質転換植物を得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
供試植物
ユーカリ属植物としてユーカリ・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis) を使用した。
（子葉、胚軸の作出）：
ユーカリ・カマルドレンシスの種子を、１０倍に希釈したアンチホルミンで１時間殺菌し、さらに、無菌的に７０％の濃度のエタノールに１５秒間、及び５倍に希釈したアンチホルミンに２０分間浸漬して殺菌した。これを植物の組織培養培地であるＢ５寒天培地上で無菌的に発芽させた。発芽した植物から子葉及び胚軸をピンセットとナイフを用いて無菌的に摘出し実験材料とした。
【００１８】
（アグロバクテリウム菌の調整）：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無毒化したＬＢＡ４４０４株（M.W.Bevan et al.Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721(1984) ) を使用した。導入遺伝子としてはいかなる遺伝子であろうとも、そのプロモーターを植物用のプロモーターに置換することによって発現させ得る。ここでは、市販品として入手可能なβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をバイナリーベクターｐＢＩ１２１に結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用した（R.A.Jefferson et al.EMBO J. 6 : 3901-3907(1987) ) 。上記のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１を、抗生物質であるカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬ−液体培地にて、一晩３０℃で培養した。
【００１９】
（アグロバクテリウム菌のユーカリ属植物組織への感染）：
Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ
ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらに１０ｍＭ ガラクトースと１μＭアセトシリンゴンを添加し、さらに１％の濃度になるように前記の方法で調整したアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１の培養液を添加した感染培地を作製した。この培地に、ユーカリ属植物の子葉、胚軸の各組織片を０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断して移植し、２６℃の温度、遮光条件下で２日間静置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００２０】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させた組織片より、アグロバクテリウム菌を除くために、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらにアグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質として、２５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン、１００μｇ／ｍｌ バンコマイシンを添加した除菌培地に移植した。これを２５℃の温度、遮光条件下、２ｒｐｍの回転速度で７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００２１】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵ、３％ショ糖、および抗生物質ジェネチィシン（Ｇ４１８）を３０μｇ／ｍｌで添加した液体培地に、１本の試験管に対し３片の割合で植え付けた。２５℃の温度、遮光条件下で７日間、さらに下辺が２００ルクス上辺が２００００ルクスの光照射下、２ｒｐｍの回転速度で１か月間竪型回転培養することによって、組織片中に黄白色で２〜３ｍｍの形質転換したカルス形成が認められた。得られたカルスを１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られた。
【００２２】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基より、形質転換された苗条を再生させるためにＢ５培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ＢＡ、１％ ショ糖、０．２％ ゲランガム（和光純薬）及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した固形培地に５ｍｍ程度の大きさに調整した苗条原基を移植した。そして、２５℃の温度、照度４０００ルクス、１６時間光照射下で培養した結果、移植後１か月後には苗条の再生が認められた。得られた苗条はＢ５培地に０．０１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、１％ ショ糖、０．１５％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した発根培地に移植することによって、１か月後には発根が認められ完全な植物体となった。すなわち、本方法の場合、植物組織片への感染から形質転換植物の作出まで５〜１２か月を要した。
【００２３】
（形質転換植物における導入遺伝子の存在確認）：
抗生物質による選抜によって得られていた４個体について、サザンハイブリダイゼーション法を用いて導入遺伝子の存在を確認したところ、全個体において少なくとも１個以上、多い場合は数個の遺伝子が導入されていることが確認された。このことより本方法によるユーカリ属植物の形質転換が有効であることが証明された。
【００２４】
（形質転換植物における導入遺伝子の発現確認）：
サザンハイブリダイゼーションによって導入遺伝子の存在が確認された個体について、ＧＵＳ遺伝子の発現を組織染色（S.Kosugi et al. Plant Science 70 : 133-140(1990)) によって調べたところ、葉の周囲、根端及び根毛において強いＧＵＳ遺伝子の発現が確認された。
【００２５】
実施例２
ユーカリ・カマルドレンシスを無菌播種後、子葉、胚軸、根、及び成葉、野外植物の成葉に対して、実施例１と同様の感染培地を用いてアグロバクテリウム菌を感染させた後、実施例１と同様の方法によって形質転換カルスの作出を行った。そして、材料の違いによるアグロバクテリウム菌の感染率を形質転換カルス形成率で比較した。その結果、実験に用いた子葉断片の９．９％、胚軸断片の１１．３％に形質転換カルスの形成がみられたのに対し、根断片では０％であった。またアグロバクテリウム菌による形質転換で一般的に使用される成葉を感染材料に用いた場合、アグロバクテリウム菌との共存培養によって葉色の褐変、あるいは、非形質転換細胞が生育する傾向にあり、形質転換カルスを得るのは困難であることが明らかになった。
【００２６】
実施例３
ユーカリ・カマルドレンシスの子葉片とアグロバクテリウム菌との感染培養を行う時、感染培地中にガラクトースとアセトシリンゴンを添加しないこと以外は、実施例１と同じ方法で形質転換を行い、形質転換カルスの形成率でガラクトースとアセトシリンゴンの添加が形質転換率に与える影響を調べた。その結果、無添加の場合供試した２０子葉片のうち１片に形質転換カルスが得られた。一方、添加した場合２０子葉のうち３片に形質転換カルスが得られ、ガラクトースとアセトシリンゴンの添加がユーカリ属植物の形質転換率の向上に効果があることが明らかになった。
【００２７】
実施例４
アグロバクテリウム菌の感染培養方法と除菌培養方法が形質転換率に与える影響を検討した。具体的には、実施例１と同様の方法によって調整したユーカリ・カマルドレンシスの子葉片をアグロバクテリウム菌に感染させる際、その感染培養と除菌培養において、寒天の有無以外実施例１と同じ成分を有する固体培地あるいは液体培地の静置培養又は回転培養を行うことによって、形質転換したカルスの数を調べた。その結果、表１に示したようにアグロバクテリウム菌の感染培養は液体静置培養、さらに好ましくは、固体培養で行い、除菌培養については液体回転培養で行うことで効率よく形質転換できることが明らかになった。
【００２８】
【表１】
実施例５
実施例１と同様の方法でアグロバクテリウム菌感染を行ったユーカリ・カマルドレンシスの子葉片を除菌期間以外は実施例１と同じ方法で形質転換し、その除菌期間による形質転換率に与える影響を調べた。アグロバクテリウム菌感染直後に除菌を行った場合、形質転換カルスの形成率は０％であったのに対して、２日間では３０％、７日間では４３％に向上し、さらに１４日間では４０％の子葉片にカルスの形成が観察された。このことから、アグロバクテリウム菌の除菌に要する期間は７日間が好ましいことが明らかになった。
【００３０】
比較例１
太田らが提案した方法（特開平４−５３４２９号公報）に従い、ユーカリ・カマルドレンシスのプロトプラストに実施例１と同様に調整した遺伝子をエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物を作出したが、これには約２年間を要した。
一方、アグロバクテリウム法による形質転換植物の作出は、感染から約５〜１２か月で形質転換植物の作出ができる。このことからアグロバクテリウム法はエレクトロポレーション法よりも短期間で形質転換植物を作出することができることが明らかになった。
【００３１】
比較例２
ユーカリ属植物の苗条原基に対して、実施例１と同様の感染培地を用いてアグロバクテリウム菌を感染させた後、実施例１と同様の方法によって形質転換カルスの作出を行った。その結果、形質転換したカルスの形成はなかった。
【００３２】
比較例３
実施例１と同様の方法でアグロバクテリウム菌の感染を行ったユーカリ・カマルドレンシスの子葉を、除菌以降の過程で静置培養する以外は実施例１と同じ方法によって形質転換を行った。その結果、実施例１と同様に形質転換したカルスは得られたが、苗化培地に置床しても苗条は得られずカルスのまま増殖し、やがて枯死した。
【００３３】
実施例６
（供試植物）：
ユーカリ属植物としてユーカリ・グロブラス（Eucalyptus globulus)を使用した。
（子葉、胚軸の作出及びアグロバクテリウム菌の調整）：
ユーカリ・グロブラスについても、実施例１と同様の方法によって行った。
（アグロバクテリウム菌のユーカリ属植物組織への感染）：
実施例１と同様の方法によって、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらに１０ｍＭ ガラクトースと１μＭ アセトシリンゴンを添加し、さらに１％になるようにアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１の培養液を添加したアグロバクテリウム菌の感染培地を作製した。この培地に、ユーカリ属植物の子葉、胚軸のそれぞれの組織片を、０．１％の界面活性剤（Tween-20) で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断した組織片を移植し、２６℃の温度、遮光条件下で２日間静置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００３４】
（アグロバクテリウム菌の除菌）：
アグロバクテリウム菌を感染させたユーカリ属植物組織より、アグロバクテリウム菌を除くために、植物組織片を除菌培地、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵを、さらにアグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、２５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、１００μｇ／ｍｌ バンコマイシンを添加した除菌培地に移植した。これを２５℃の温度、遮光条件下、２ｒｐｍの回転速度で７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００３５】
（形質転換された苗条原基の形成）：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ４−ＰＵ、３％ ショ糖、及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した選抜培地に、１本の試験管に対し３片の割合で植え付けた。２５℃の温度、遮光条件下で７日間、さらに下辺が２０００ルクス上辺が２００００ルクスの光照射下、２ｒｐｍの回転速度で１か月間竪型回転培養することによって、組織中に黄白色で２〜３ｍｍのカルス形成が認められた。得られたカルスを１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られた。
【００３６】
（形質転換植物の再生）：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基より、形質転換された苗条を再生させるためにＢ５培地に０．０２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ ＢＡ、１％ ショ糖、０．２％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した固形培地に５ｍｍ程度の大きさに調整した苗条原基を移植した。そして、２５℃の温度、照度４０００ルクス、１６時間光照射下で培養した結果、移植後１か月後には苗条の再生が認められた。得られた苗条はＢ５培地に０．０１ｍｇ／ｌＮＡＡ、１％ ショ糖、０．１５％ ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加した発根培地に移植することによって、１か月後には発根が認められ完全な植物体となった。
【００３７】
（形質転換植物における導入遺伝子の存在確認と発現確認）：
形質転換によって得られた個体について、実施例１と同様にサザンハイブリダイゼーション法によって、導入遺伝子の存在確認を行ったところ、全個体において少なくとも１個以上、多い場合は数個の遺伝子が導入されていることが確認された。さらに、ＧＵＳ遺伝子の発現を組織染色によって確認した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって、これまで形質転換植物の作出が困難であったユーカリ属植物においても、効率よく安定的にしかも短期間に形質転換植物の作出が可能になった。さらに、有用遺伝子導入によって、ユーカリ属植物の優良新品種を作出し、その新品種を形質転換過程で得られる苗条原基を用いることによって、短期間にしかもより安価に有用遺伝形質をもつ苗木を供給することが可能になった。
Claims (1)
- ユーカリ属植物の子葉あるいは胚軸からなる組織片をガラクトース及びアセトシリンゴンを添加した感染培地中で液体静置培養又は固体培養により感染培養してアグロバクテリウム菌に感染させた後、感染した組織片を抗生物質を添加した液体除菌培地中で竪型回転培養することによって除菌し、次に感染した組織片を抗生物質を添加した選抜培地中で竪型回転培養することによって形質転換細胞集塊を選抜し、選抜によって得られた細胞集塊をさらに光照射下で竪型回転培養することによって形質転換された苗条原基を作出し、得られた苗条原基を介して形質転換されたユーカリ属植物を作出することを特徴とする形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法。
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