JP2002281851A - 木本性植物のカルスからの再分化方法 - Google Patents
木本性植物のカルスからの再分化方法Info
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- JP2002281851A JP2002281851A JP2001095323A JP2001095323A JP2002281851A JP 2002281851 A JP2002281851 A JP 2002281851A JP 2001095323 A JP2001095323 A JP 2001095323A JP 2001095323 A JP2001095323 A JP 2001095323A JP 2002281851 A JP2002281851 A JP 2002281851A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 木本性植物のカルスから苗条原基を誘導する
際に、再分化効率が高くない樹種でも効率良く再分化で
きる方法、および、形質転換したカルスから効率的に苗
条原基を形成させて、その形質転換植物を再分化させる
方法を提供する。 【解決手段】 ユーカリなどの木本性植物のカルスを竪
型回転培養器により光照射下で培養することにより苗条
原基を誘導するカルスからの再分化方法において、該竪
型回転培養器の一辺から、その辺における受光量が２３
０μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上となるように、強い光を
照射する。
際に、再分化効率が高くない樹種でも効率良く再分化で
きる方法、および、形質転換したカルスから効率的に苗
条原基を形成させて、その形質転換植物を再分化させる
方法を提供する。 【解決手段】 ユーカリなどの木本性植物のカルスを竪
型回転培養器により光照射下で培養することにより苗条
原基を誘導するカルスからの再分化方法において、該竪
型回転培養器の一辺から、その辺における受光量が２３
０μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上となるように、強い光を
照射する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は木本性植物の組織か
ら得られたカルスを竪型回転培養器により光照射下で培
養することにより苗条原基を誘導し再分化して、クロー
ン植物を作出する方法に関する。
ら得られたカルスを竪型回転培養器により光照射下で培
養することにより苗条原基を誘導し再分化して、クロー
ン植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】木本性植物において組織培養は古くから
研究され、主にはクローン増殖技術として利用され、更
に形質転換技術として発展している。木本性植物で利用
されている組織培養技術としては、通常、カルス培養、
成長点培養、器官培養（例えば、腋芽培養）等によって
カルス、不定芽、苗条原基あるいは多芽体等の組織を増
殖させる。次に、これらの増殖組織から苗条を分化させ
た後に、その苗条を発根させることにより植物体を再分
化させている。
研究され、主にはクローン増殖技術として利用され、更
に形質転換技術として発展している。木本性植物で利用
されている組織培養技術としては、通常、カルス培養、
成長点培養、器官培養（例えば、腋芽培養）等によって
カルス、不定芽、苗条原基あるいは多芽体等の組織を増
殖させる。次に、これらの増殖組織から苗条を分化させ
た後に、その苗条を発根させることにより植物体を再分
化させている。
【０００３】これらの組織培養技術で用いられる基本培
地や炭素源および植物ホルモンの種類と濃度、培養温度
等が大きな役割を担っており、更に光が植物の分化や形
態形成と密接な関係にあることが知られるようになって
きた。これまで光は照度という単位を用いて定量化され
てきたが、照度（ルクス）は植物の光合成とは直接的に
は関係ない単位であり、この単位だけを用いて植物の光
環境を評価することには問題があることが指摘されてい
る（稲田 勝美編著、光と植物生育、養賢堂）。つま
り、植物が生育するために光合成を行う上で重要なのは
葉緑素に入射する光量子(光子)の個数とその密度（光合
成光量子束密度）によって左右される。これまでに草本
性植物であるレタス、チンゲンサイ、コマツナ、ハツカ
ダイコン等で光と形態形成との関係が調べられ、これら
の植物においては、それぞれ特定の単色光により葉柄伸
長や節間伸長等が起こることが知られている。
地や炭素源および植物ホルモンの種類と濃度、培養温度
等が大きな役割を担っており、更に光が植物の分化や形
態形成と密接な関係にあることが知られるようになって
きた。これまで光は照度という単位を用いて定量化され
てきたが、照度（ルクス）は植物の光合成とは直接的に
は関係ない単位であり、この単位だけを用いて植物の光
環境を評価することには問題があることが指摘されてい
る（稲田 勝美編著、光と植物生育、養賢堂）。つま
り、植物が生育するために光合成を行う上で重要なのは
葉緑素に入射する光量子(光子)の個数とその密度（光合
成光量子束密度）によって左右される。これまでに草本
性植物であるレタス、チンゲンサイ、コマツナ、ハツカ
ダイコン等で光と形態形成との関係が調べられ、これら
の植物においては、それぞれ特定の単色光により葉柄伸
長や節間伸長等が起こることが知られている。
【０００４】木本性植物においても光の重要性が指摘さ
れており、ユーカリプタス・トレリアーナの組織培養方
法（特開２０００−１３９２５３号公報）において５０
μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上の光強度で多芽体から分化する
苗条の数が増加することが示されている。一方、本発明
者らは特公平６−１１２０９号公報で、ユーカリ属植物
の組織培養による植物体の再生において、２０００〜２
００００ルクスの光照射下で竪型回転培養を行って得た
苗条原基から苗条を得る大量増殖法を提案している。な
お、白色蛍光燈の場合、２００００ルクスは２２７μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）に相当する。
れており、ユーカリプタス・トレリアーナの組織培養方
法（特開２０００−１３９２５３号公報）において５０
μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上の光強度で多芽体から分化する
苗条の数が増加することが示されている。一方、本発明
者らは特公平６−１１２０９号公報で、ユーカリ属植物
の組織培養による植物体の再生において、２０００〜２
００００ルクスの光照射下で竪型回転培養を行って得た
苗条原基から苗条を得る大量増殖法を提案している。な
お、白色蛍光燈の場合、２００００ルクスは２２７μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）に相当する。
【０００５】前記したように、このようなクローン増殖
技術は植物の形質転換技術とも関連し、本出願人は特開
２０００−３１６４０３号公報において、形質転換され
た苗条原基を２００００ルクス以下の光照射下で培養す
るユーカリ属植物の形質転換方法も提案している。
技術は植物の形質転換技術とも関連し、本出願人は特開
２０００−３１６４０３号公報において、形質転換され
た苗条原基を２００００ルクス以下の光照射下で培養す
るユーカリ属植物の形質転換方法も提案している。
【０００６】一般的な植物の形質転換方法では、アグロ
バクテリウム法〔Hooykaas et al.Ann. Rev. Phytopath
ol. (1994) 32:157-179〕、パーティクルガン法〔Klein
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:8502-8
505〕、エレクトロポレーション法〔Fromm et al. (198
5) 82:5824-5828〕、PEG法〔Paszkowski et al.(1984)
EMBO J 3:2717〕等の方法を用いて、生物的、物理的あ
るいは化学的に植物細胞に外来遺伝子を導入し、さらに
その遺伝子が導入された細胞を選抜しつつ、組織培養を
用いて形質転換細胞から形質転換植物を再分化させる過
程を経る。
バクテリウム法〔Hooykaas et al.Ann. Rev. Phytopath
ol. (1994) 32:157-179〕、パーティクルガン法〔Klein
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:8502-8
505〕、エレクトロポレーション法〔Fromm et al. (198
5) 82:5824-5828〕、PEG法〔Paszkowski et al.(1984)
EMBO J 3:2717〕等の方法を用いて、生物的、物理的あ
るいは化学的に植物細胞に外来遺伝子を導入し、さらに
その遺伝子が導入された細胞を選抜しつつ、組織培養を
用いて形質転換細胞から形質転換植物を再分化させる過
程を経る。
【０００７】最近ではin planta法〔Chang et al. Plan
t J.(1994) 5:551-558、Ye et al.Plant J.(1999) 19:2
49-257〕等の組織培養を経由しない形質転換方法が開発
されているが、多くの植物種にin planta法が適応でき
るまでにはいたっておらず、そのため形質転換過程にお
ける組織培養技術の重要性は高い。多くの植物種で形質
転換方法の開発が望まれているが、その形質転換の成否
を決定する要因は目的とする植物種における組織培養技
術（再分化技術）であると考えられる。
t J.(1994) 5:551-558、Ye et al.Plant J.(1999) 19:2
49-257〕等の組織培養を経由しない形質転換方法が開発
されているが、多くの植物種にin planta法が適応でき
るまでにはいたっておらず、そのため形質転換過程にお
ける組織培養技術の重要性は高い。多くの植物種で形質
転換方法の開発が望まれているが、その形質転換の成否
を決定する要因は目的とする植物種における組織培養技
術（再分化技術）であると考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】前記した特公平６−１
１２０９号公報、特開２０００−１３９２５３号公報な
どに記載される光照射による組織培養方法は有効である
が、カルスから苗条原基を誘導する場合には、木本性植
物の樹種によっては必ずしも高い再分化効率を示さない
という問題があり、特に、形質転換体ではその傾向が強
い。本発明は、カルスから苗条原基を誘導する際に、再
分化効率が高くない樹種でも効率良く再分化できる方法
を提案することを課題とする。また、本発明は木本性植
物の形質転換したカルスから効率的に苗条原基を形成さ
せて、その形質転換植物を再分化させる方法を提供する
ことを課題とする。
１２０９号公報、特開２０００−１３９２５３号公報な
どに記載される光照射による組織培養方法は有効である
が、カルスから苗条原基を誘導する場合には、木本性植
物の樹種によっては必ずしも高い再分化効率を示さない
という問題があり、特に、形質転換体ではその傾向が強
い。本発明は、カルスから苗条原基を誘導する際に、再
分化効率が高くない樹種でも効率良く再分化できる方法
を提案することを課題とする。また、本発明は木本性植
物の形質転換したカルスから効率的に苗条原基を形成さ
せて、その形質転換植物を再分化させる方法を提供する
ことを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１
は、「木本性植物のカルスを竪型回転培養器により光照
射下で培養することにより苗条原基を誘導する、カルス
からの再分化方法において、該竪型回転培養器の一辺か
ら、その辺における受光量が２３０μｍｏｌ／（ｍ2・
ｓ）以上となるように、光を照射することを特徴とする
木本性植物のカルスからの再分化方法」である。
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１
は、「木本性植物のカルスを竪型回転培養器により光照
射下で培養することにより苗条原基を誘導する、カルス
からの再分化方法において、該竪型回転培養器の一辺か
ら、その辺における受光量が２３０μｍｏｌ／（ｍ2・
ｓ）以上となるように、光を照射することを特徴とする
木本性植物のカルスからの再分化方法」である。
【００１０】本発明の第２は、前記第１発明において、
木本性植物がユーカリ属植物であるカルスからの再分化
方法である。
木本性植物がユーカリ属植物であるカルスからの再分化
方法である。
【００１１】本発明の第３は、前記第２発明において、
ユーカリ属植物がユーカリ交雑種あるいはユーカリプタ
ス・ダニアイ（Eucalyptus dunnii）であることを特徴
とするカルスからの再分化方法である。
ユーカリ属植物がユーカリ交雑種あるいはユーカリプタ
ス・ダニアイ（Eucalyptus dunnii）であることを特徴
とするカルスからの再分化方法である。
【００１２】本発明の第４は、前記第３発明において、
ユーカリ交雑種がユーカリプタス・グランディス（Euca
lyptus grandis）とユーカリプタス・ユーロフィラ（Eu
calyptus urophylla）との交雑種であることを特徴とす
る再分化方法である。
ユーカリ交雑種がユーカリプタス・グランディス（Euca
lyptus grandis）とユーカリプタス・ユーロフィラ（Eu
calyptus urophylla）との交雑種であることを特徴とす
る再分化方法である。
【００１３】本発明の第５は、前記第１〜第４発明にお
いて、カルスが形質転換カルスであることを特徴とする
再分化方法である。
いて、カルスが形質転換カルスであることを特徴とする
再分化方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、木本性植物のカルスからの
再分化方法について詳しく説明するが、世界的に植林が
実施され、その技術が検討されているユーカリ属植物を
例として説明する。本発明に使用するユーカリ属植物の
組織は、ユーカリ属植物に由来するならば、いかなる植
物組織を起源としていても良く、また植物組織の一部あ
るいは組織培養物であってもかまわない。
再分化方法について詳しく説明するが、世界的に植林が
実施され、その技術が検討されているユーカリ属植物を
例として説明する。本発明に使用するユーカリ属植物の
組織は、ユーカリ属植物に由来するならば、いかなる植
物組織を起源としていても良く、また植物組織の一部あ
るいは組織培養物であってもかまわない。
【００１５】また、本発明の方法はカルスから苗条原基
を誘導する方法であり、それゆえに、未分化の組織に有
用遺伝子を導入して形質転換体を作出する場合にその効
果を最も発揮する。従って、以下では主として形質転換
カルスを例として説明する。形質転換カルスの作出方法
は特に限定されるものではないが、好ましくは本発明者
らが提案している「木本性植物のクローン増殖法」（特
開平１０−３０４７８５号公報）や「ユーカリ属植物の
成木を形質転換する方法」（特開２０００−３１６４０
３号公報）に従って早生分枝あるいは多芽体を誘導し、
更に得られた早生分枝や多芽体にアグロバクテリウム菌
を感染させる方法が効果的である。以下には、そのよう
な例として、本発明を実施する操作の一例を取り上げて
具体的に説明する。
を誘導する方法であり、それゆえに、未分化の組織に有
用遺伝子を導入して形質転換体を作出する場合にその効
果を最も発揮する。従って、以下では主として形質転換
カルスを例として説明する。形質転換カルスの作出方法
は特に限定されるものではないが、好ましくは本発明者
らが提案している「木本性植物のクローン増殖法」（特
開平１０−３０４７８５号公報）や「ユーカリ属植物の
成木を形質転換する方法」（特開２０００−３１６４０
３号公報）に従って早生分枝あるいは多芽体を誘導し、
更に得られた早生分枝や多芽体にアグロバクテリウム菌
を感染させる方法が効果的である。以下には、そのよう
な例として、本発明を実施する操作の一例を取り上げて
具体的に説明する。
【００１６】＜竪型回転培養器＞本発明で言う竪型回転
培養器とは、図１に模式図を示すように、例えば直径１
ｍ程度の回転する円板を持つ回転培養装置（日本医化機
械製作所）の回転軸方向になるように培地が入った試験
管を回転板に設置したものである。この場合、図１には
示していないが、回転板が回転しても試験管は常に一定
の方向（ナナメ下）を向くようになっており、一辺（最
も通常には上辺）から光を照射する。
培養器とは、図１に模式図を示すように、例えば直径１
ｍ程度の回転する円板を持つ回転培養装置（日本医化機
械製作所）の回転軸方向になるように培地が入った試験
管を回転板に設置したものである。この場合、図１には
示していないが、回転板が回転しても試験管は常に一定
の方向（ナナメ下）を向くようになっており、一辺（最
も通常には上辺）から光を照射する。
【００１７】本発明では光のエネルギーに対応する量と
して、光の粒子である光量子（光子）の個数で表示し、
１ｍｏｌは６．０２×１０23を示す。即ち、単位面積
（ｍ2）単位時間（秒）あたりの光量子の数をμｍｏｌ
／（ｍ2・ｓ）で表わす。一般的にはμｍｏｌ・ｍ-2・
ｓ-1と表示されることが多いが、本明細書では読みやす
さのため、μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）と表示する。
して、光の粒子である光量子（光子）の個数で表示し、
１ｍｏｌは６．０２×１０23を示す。即ち、単位面積
（ｍ2）単位時間（秒）あたりの光量子の数をμｍｏｌ
／（ｍ2・ｓ）で表わす。一般的にはμｍｏｌ・ｍ-2・
ｓ-1と表示されることが多いが、本明細書では読みやす
さのため、μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）と表示する。
【００１８】本発明では光の強さが重要なポイントであ
るが、前記した本発明で使用する光量μｍｏｌ／（ｍ2
・ｓ）は、竪型回転培養器の一辺における受光量であ
る。一辺が上辺の場合、最上部に来た試験管が受ける光
量を意味する。
るが、前記した本発明で使用する光量μｍｏｌ／（ｍ2
・ｓ）は、竪型回転培養器の一辺における受光量であ
る。一辺が上辺の場合、最上部に来た試験管が受ける光
量を意味する。
【００１９】＜アグロバクテリウム菌を感染させるため
の早生分枝の作出＞屋外に生育しているユーカリ属植物
を材料に、当年枝の茎頂あるいは腋芽を含む5〜20mmの
外植体を通常の殺菌方法を用いて殺菌調整の後、例えば
WPM〔Loyd＆ＭcCown Proc.Int.Plant Prop.Soc. 30:42
1-427(1980)〕、B5〔Gamborg et al.Exp. Cell Res. 5
0:151-158(1980)〕、MS〔Murashige ＆ Skoog Physiol.
Plant15:473-497(1962)〕基本培地等に、炭素源とし
て、例えばショ糖を１〜３%加えた液体培地の中で竪型
回転培養を行う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型
回転培養器の上辺で120〜320μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の
光量、15〜35℃の温度で竪型回転培養することにより、
20〜50日で苗条の伸長と増殖を同時にできる早生分枝が
得られる。なお、得られた早生分枝の茎頂を含む一部の
組織片を継代することにより増殖を繰り返し行うことが
可能である。
の早生分枝の作出＞屋外に生育しているユーカリ属植物
を材料に、当年枝の茎頂あるいは腋芽を含む5〜20mmの
外植体を通常の殺菌方法を用いて殺菌調整の後、例えば
WPM〔Loyd＆ＭcCown Proc.Int.Plant Prop.Soc. 30:42
1-427(1980)〕、B5〔Gamborg et al.Exp. Cell Res. 5
0:151-158(1980)〕、MS〔Murashige ＆ Skoog Physiol.
Plant15:473-497(1962)〕基本培地等に、炭素源とし
て、例えばショ糖を１〜３%加えた液体培地の中で竪型
回転培養を行う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型
回転培養器の上辺で120〜320μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の
光量、15〜35℃の温度で竪型回転培養することにより、
20〜50日で苗条の伸長と増殖を同時にできる早生分枝が
得られる。なお、得られた早生分枝の茎頂を含む一部の
組織片を継代することにより増殖を繰り返し行うことが
可能である。
【００２０】＜アグロバクテリウム菌を感染させるため
の多芽体の作出＞屋外に生育しているユーカリ属植物を
材料に、当年枝の茎頂あるいは腋芽を含む5〜20mmの外
植体を通常の殺菌方法を用いて殺菌調整の後、例えばWP
M、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであるオーキシン
類としてナフタレン酢酸（NAA)、インドール酢酸（IA
A）等を0.01〜0.02mg/lおよびサイトカイニン類として
ベンジルアデニン（BA)、1-(2-クロロ-4-ピリジル)-3-
フェニル尿素（4-PU)、1-フェニル-3-(1,2,3,-チアジア
ゾル-5-イル)尿素（TDZ）等を0.01〜0.02mg/lを含有
し、更に炭素源として、例えばショ糖1〜3%、支持体材
として寒天0.3〜0.6%あるいはゲランガム0.15〜0.3%を
含有する多芽体誘導培地に植え付ける。培養条件は、光
量16〜160μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、温度15〜35℃の条件
があげられる。以上の条件で20〜50日間培養することに
よって、多芽体を得ることが可能である。なお、得られ
た多芽体は一部の茎頂を含む組織片を継代することによ
り増殖を繰り返し行うことが可能である。
の多芽体の作出＞屋外に生育しているユーカリ属植物を
材料に、当年枝の茎頂あるいは腋芽を含む5〜20mmの外
植体を通常の殺菌方法を用いて殺菌調整の後、例えばWP
M、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであるオーキシン
類としてナフタレン酢酸（NAA)、インドール酢酸（IA
A）等を0.01〜0.02mg/lおよびサイトカイニン類として
ベンジルアデニン（BA)、1-(2-クロロ-4-ピリジル)-3-
フェニル尿素（4-PU)、1-フェニル-3-(1,2,3,-チアジア
ゾル-5-イル)尿素（TDZ）等を0.01〜0.02mg/lを含有
し、更に炭素源として、例えばショ糖1〜3%、支持体材
として寒天0.3〜0.6%あるいはゲランガム0.15〜0.3%を
含有する多芽体誘導培地に植え付ける。培養条件は、光
量16〜160μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、温度15〜35℃の条件
があげられる。以上の条件で20〜50日間培養することに
よって、多芽体を得ることが可能である。なお、得られ
た多芽体は一部の茎頂を含む組織片を継代することによ
り増殖を繰り返し行うことが可能である。
【００２１】＜不定苗条の感染誘導処理＞アグロバクテ
リウム菌を感染させるため、早生分枝あるいは多芽体の
茎頂を含む組織片を20〜50mmの長さにナイフで切り取
り、例えばWPM、B5、MS基本培地等に、オーキシン類と
してNAA、IBA、IAA等を0.01〜0.2mg/l、またサイトカイ
ニン類としてBA、４-PU、TDZ等を0.01〜0.2mg/lの濃度
で含有し、更に炭素源として、例えばショ糖1〜3%、支
持体材として」寒天0.3〜0.6%あるいはゲランガム0.15
〜0.3%を含有する感染誘導培地に植え付ける。培養は遮
光条件下、温度15〜35℃の条件で7〜20日間培養する。
リウム菌を感染させるため、早生分枝あるいは多芽体の
茎頂を含む組織片を20〜50mmの長さにナイフで切り取
り、例えばWPM、B5、MS基本培地等に、オーキシン類と
してNAA、IBA、IAA等を0.01〜0.2mg/l、またサイトカイ
ニン類としてBA、４-PU、TDZ等を0.01〜0.2mg/lの濃度
で含有し、更に炭素源として、例えばショ糖1〜3%、支
持体材として」寒天0.3〜0.6%あるいはゲランガム0.15
〜0.3%を含有する感染誘導培地に植え付ける。培養は遮
光条件下、温度15〜35℃の条件で7〜20日間培養する。
【００２２】＜アグロバクテリウム菌の調整＞アグロバ
クテリウム菌は、そのTiプラシミドを無毒化したもの、
あるいは無毒化してしていない菌株を用意する。導入す
る遺伝子は、植物細胞内で発現するように改良した後
に、Tiプラスミドベクターあるいはバイナリーベクター
に結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用す
る〔Chilton et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4060-4
064 (1980)〕、〔Herrera-Estrella et.al.Nature 303:
209-213(1983)〕。上記の方法で得たアグロバクテリウ
ム菌を、ベクターの保有する抗生物質抵抗性遺伝子が規
定する適正量の選抜抗生物質を添加したL-液体培地〔Mi
ller Experiments in Molecular Genetics(1972)〕10g/
l Bact-tryptone、5g/l Bact-yeast extractおよび5g/N
aClにて、30℃、一晩でO.D.600が0.8以上まで培養す
る。
クテリウム菌は、そのTiプラシミドを無毒化したもの、
あるいは無毒化してしていない菌株を用意する。導入す
る遺伝子は、植物細胞内で発現するように改良した後
に、Tiプラスミドベクターあるいはバイナリーベクター
に結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用す
る〔Chilton et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4060-4
064 (1980)〕、〔Herrera-Estrella et.al.Nature 303:
209-213(1983)〕。上記の方法で得たアグロバクテリウ
ム菌を、ベクターの保有する抗生物質抵抗性遺伝子が規
定する適正量の選抜抗生物質を添加したL-液体培地〔Mi
ller Experiments in Molecular Genetics(1972)〕10g/
l Bact-tryptone、5g/l Bact-yeast extractおよび5g/N
aClにて、30℃、一晩でO.D.600が0.8以上まで培養す
る。
【００２３】＜アグロバクテリウム菌の感染＞感染誘導
処理した早生分枝あるいは多芽体の植物組織を、0.1%の
界面活性剤（Tween-20）で洗浄後、ナイフで2〜10mmの
大きさに切断し、アグロバクテリウム菌の感染培地、例
えばWPM、B5、MS基本培地等に、サイトカイニン類とし
て4-PU、BA、TDZあるいはカイネチン等を、またオーキ
シン類としてNAA、2,4-DあるいはIAA等と、ショ糖、ガ
ラクトース等の糖類、アセトシリンゴンおよびアグロバ
クテリウム菌添加した液体培地に植え付ける。更に好ま
しくは、組織片をアグロバクテリウム菌培養液に浸けた
後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固形培地に
着床する。これを20〜30℃の温度、遮光条件下で1〜2日
間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
処理した早生分枝あるいは多芽体の植物組織を、0.1%の
界面活性剤（Tween-20）で洗浄後、ナイフで2〜10mmの
大きさに切断し、アグロバクテリウム菌の感染培地、例
えばWPM、B5、MS基本培地等に、サイトカイニン類とし
て4-PU、BA、TDZあるいはカイネチン等を、またオーキ
シン類としてNAA、2,4-DあるいはIAA等と、ショ糖、ガ
ラクトース等の糖類、アセトシリンゴンおよびアグロバ
クテリウム菌添加した液体培地に植え付ける。更に好ま
しくは、組織片をアグロバクテリウム菌培養液に浸けた
後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固形培地に
着床する。これを20〜30℃の温度、遮光条件下で1〜2日
間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
【００２４】＜アグロバクテリウム菌の除菌＞アグロバ
クテリウム菌を感染させた組織片を除菌培地、例えばWP
M、B5、MS基本培地等に、サイトカイニン類として4-P
U、BA、TDZあるいはカイネチン等を、またオーキシン類
としてNAA、2,4-DあるいはIAA等と、アグロバクテリウ
ム菌を殺菌するために抗生物質、例えばカルベニシリ
ン、バンコマイシン、クラフォラン等とショ糖を添加し
た液体培地に植え付ける。これを15〜35℃の温度、0〜2
0μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量下で3〜14日間静置培養
し、アグロバクテリウム菌の除菌を行う。
クテリウム菌を感染させた組織片を除菌培地、例えばWP
M、B5、MS基本培地等に、サイトカイニン類として4-P
U、BA、TDZあるいはカイネチン等を、またオーキシン類
としてNAA、2,4-DあるいはIAA等と、アグロバクテリウ
ム菌を殺菌するために抗生物質、例えばカルベニシリ
ン、バンコマイシン、クラフォラン等とショ糖を添加し
た液体培地に植え付ける。これを15〜35℃の温度、0〜2
0μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量下で3〜14日間静置培養
し、アグロバクテリウム菌の除菌を行う。
【００２５】＜形質転換カルスの形成＞アグロバクテリ
ウム菌を完全に除菌した組織片を、基本培地として、例
えばWPM、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであるサイ
トカイニン類として4-PU、BA、TDZあるいはカイネチン
等を、またオーキシン類としてNAA、2,4-DあるいはIAA
等と炭素源、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗
生物質、更に形質転換された細胞集塊を選抜するための
抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行
う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型回転培養の上
辺が0〜230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量、15〜35℃の
温度とする。14〜40日間隔で新鮮培地へ継代して培養を
継続すると、形質転換カルスの選抜を始めてから20〜50
日で、組織片中に黄白色の形質転換カルス形成が認めら
れる。
ウム菌を完全に除菌した組織片を、基本培地として、例
えばWPM、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであるサイ
トカイニン類として4-PU、BA、TDZあるいはカイネチン
等を、またオーキシン類としてNAA、2,4-DあるいはIAA
等と炭素源、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗
生物質、更に形質転換された細胞集塊を選抜するための
抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行
う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型回転培養の上
辺が0〜230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量、15〜35℃の
温度とする。14〜40日間隔で新鮮培地へ継代して培養を
継続すると、形質転換カルスの選抜を始めてから20〜50
日で、組織片中に黄白色の形質転換カルス形成が認めら
れる。
【００２６】＜形質転換カルスから苗条原基の形成＞本
願における形質転換カルスとは、アグロバクテリウム
法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、
PEG法等のいずれかの方法で形質転換した結果得られる
外来遺伝子が導入されたカルスであり、カルスの大きさ
は問題にはならない。形質転換によって得られたカルス
を組織片からナイフによって切り離し、基本培地とし
て、例えばWPM、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであ
るサイトカイニン類として4-PU、BA、TDZあるいはカイ
ネチン等を、またオーキシン類としてNAA、2,4-Dあるい
はIAA等と炭素源、更に形質転換された苗条原基を選抜
するための抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転
培養を行う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型回転
培養器の一辺が230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の光照射
下、15〜35℃の温度で竪型回転培養し、選抜開始から40
〜120日で形質転換された苗条原基が誘導される。
願における形質転換カルスとは、アグロバクテリウム
法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、
PEG法等のいずれかの方法で形質転換した結果得られる
外来遺伝子が導入されたカルスであり、カルスの大きさ
は問題にはならない。形質転換によって得られたカルス
を組織片からナイフによって切り離し、基本培地とし
て、例えばWPM、B5、MS基本培地に、植物ホルモンであ
るサイトカイニン類として4-PU、BA、TDZあるいはカイ
ネチン等を、またオーキシン類としてNAA、2,4-Dあるい
はIAA等と炭素源、更に形質転換された苗条原基を選抜
するための抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転
培養を行う。培養条件は1〜10rpmの回転速度、竪型回転
培養器の一辺が230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の光照射
下、15〜35℃の温度で竪型回転培養し、選抜開始から40
〜120日で形質転換された苗条原基が誘導される。
【００２７】なお、ここにおける光の強さは340μｍｏ
ｌ／（ｍ2・ｓ）以上がより好ましく、最も好ましくは4
00〜500μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）である。500μｍｏｌ／
（ｍ2・ｓ）を越えた場合、温度が上がり過ぎる危険性
がある。光源としては、蛍光燈、ナトリウムランプ、メ
タルハライドランプ、キセノンランプなどが例示される
が、植物成長に影響する光変換効率が高く、光質バラン
スが良いメタルハライドランプが最も適切である。ま
た、光をもっとも強く受ける辺において、一本の試験管
全体があまりむらなく230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の
光を受けるよう、ランプの大きさ、反射板構造などを選
択すれば良い。
ｌ／（ｍ2・ｓ）以上がより好ましく、最も好ましくは4
00〜500μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）である。500μｍｏｌ／
（ｍ2・ｓ）を越えた場合、温度が上がり過ぎる危険性
がある。光源としては、蛍光燈、ナトリウムランプ、メ
タルハライドランプ、キセノンランプなどが例示される
が、植物成長に影響する光変換効率が高く、光質バラン
スが良いメタルハライドランプが最も適切である。ま
た、光をもっとも強く受ける辺において、一本の試験管
全体があまりむらなく230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の
光を受けるよう、ランプの大きさ、反射板構造などを選
択すれば良い。
【００２８】また、光は竪型回転培養器の一辺からのみ
当てることが重要で、一辺とは、例えば図１に記載する
ような上辺、下辺、側辺あるいはその間のいずれか一辺
であれば良いが、上辺が植物体にとってもっとも自然な
位置である。光を当てる辺に対向する辺では光量が光を
当てる辺の半分以下となっていることが好ましく、より
好ましくは１／３以下、最も好ましくは１／４以下であ
る。対向する辺の光量を制御する方法としては、竪型回
転培養器の回転直径、ランプの位置、ランプカバー、培
養器ケースの反射などの条件を調整することにより可能
である。
当てることが重要で、一辺とは、例えば図１に記載する
ような上辺、下辺、側辺あるいはその間のいずれか一辺
であれば良いが、上辺が植物体にとってもっとも自然な
位置である。光を当てる辺に対向する辺では光量が光を
当てる辺の半分以下となっていることが好ましく、より
好ましくは１／３以下、最も好ましくは１／４以下であ
る。対向する辺の光量を制御する方法としては、竪型回
転培養器の回転直径、ランプの位置、ランプカバー、培
養器ケースの反射などの条件を調整することにより可能
である。
【００２９】カルスから苗条原基を形成する前記過程に
おいて、一辺から230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の光を
照射する期間は少なくとも5日以上、好ましくは10日以
上最も好ましくは14〜40日である。この期間の前に、そ
れより弱い光を照射する期間を設けても良い。
おいて、一辺から230μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）以上の光を
照射する期間は少なくとも5日以上、好ましくは10日以
上最も好ましくは14〜40日である。この期間の前に、そ
れより弱い光を照射する期間を設けても良い。
【００３０】＜形質転換植物の再生＞竪型回転培養して
得られた形質転換苗条原基を、苗条を再生するための培
地、例えばB5あるいはMS基本培地等に植物ホルモン類と
して、例えばNAA、2,4-D、IAA等のオーキシン類、BA、4
-PU、カイネチン、ゼアチン、TDZ等のサイトカイニン類
および炭素源、寒天あるいはゲランガム、更に形質転換
された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した苗
化培地で培養する。培養は15〜35℃の温度、20〜35μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量で40〜80日間行うことにより
苗条を再生させ、更に、発根させて完全な形質転換植物
を得ることができる。
得られた形質転換苗条原基を、苗条を再生するための培
地、例えばB5あるいはMS基本培地等に植物ホルモン類と
して、例えばNAA、2,4-D、IAA等のオーキシン類、BA、4
-PU、カイネチン、ゼアチン、TDZ等のサイトカイニン類
および炭素源、寒天あるいはゲランガム、更に形質転換
された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した苗
化培地で培養する。培養は15〜35℃の温度、20〜35μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量で40〜80日間行うことにより
苗条を再生させ、更に、発根させて完全な形質転換植物
を得ることができる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 ＜実施例１＞ （１）供試植物 ユーカリ交雑種のユーカリプタス・グランディス×ユー
カリプタス・ユーロフィラ（Eucalyptus grandis×E.ur
ophylla）を使用した。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 ＜実施例１＞ （１）供試植物 ユーカリ交雑種のユーカリプタス・グランディス×ユー
カリプタス・ユーロフィラ（Eucalyptus grandis×E.ur
ophylla）を使用した。
【００３２】（２）早生分枝の作出 屋外に生育している3年生のユーカリプタス・グランデ
ィス×ユーカリ・ユーロフィラの茎頂を含む組織を70%
アルコールで30秒、10倍に希釈したアンチホルミンで１
分間殺菌した後、更に滅菌水による洗浄を３回行い、ピ
ンセットとナイフを用いて無菌的に茎頂を含む組織を切
り出した。得られた茎頂を含む組織をB5基本培地に対し
て1%ショ糖を含有する液体培地に移植し、上辺で160μ
ｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量、24〜28℃の温度で、竪型
回転培養することにより30日で早生分枝を誘導した。
ィス×ユーカリ・ユーロフィラの茎頂を含む組織を70%
アルコールで30秒、10倍に希釈したアンチホルミンで１
分間殺菌した後、更に滅菌水による洗浄を３回行い、ピ
ンセットとナイフを用いて無菌的に茎頂を含む組織を切
り出した。得られた茎頂を含む組織をB5基本培地に対し
て1%ショ糖を含有する液体培地に移植し、上辺で160μ
ｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光量、24〜28℃の温度で、竪型
回転培養することにより30日で早生分枝を誘導した。
【００３３】（３）早生分枝の感染誘導処理 安定的に増殖する早生分枝の茎頂を含む組織片を20〜50
mmの長さにナイフで切り取り、B5基本培地に対して0.02
mg/l NAA、1%ショ糖と0.2%ゲランガムを含有する感染誘
導培地に植え付ける。培養は遮光条件下、温度26〜28℃
の条件で14日間培養した。
mmの長さにナイフで切り取り、B5基本培地に対して0.02
mg/l NAA、1%ショ糖と0.2%ゲランガムを含有する感染誘
導培地に植え付ける。培養は遮光条件下、温度26〜28℃
の条件で14日間培養した。
【００３４】（４）アグロバクテリウム菌の調整 アグロバクテリウム菌は、そのTiプラスミドを無毒化し
たEHA101株〔Hood etal .J.Bacteriology 168:1291-131
(1986) 〕を使用した。遺伝子導入としてはいかなる遺
伝子であろうとも、そのプロモーターを植物用のプロモ
ーターに置換することによって発現させ得る。ここでは
選抜マーカー遺伝子となるハイグロマイシン抵抗性遺伝
子とカナマイシン抵抗性遺伝子を有し、更にレポーター
遺伝子としてヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イントロン
を含むβ―グルクロニダーゼ(イントロンGUS)遺伝子をT
-DNA領域に有するバイナリーベクターpIG121-Hm〔中村
ら、植物バイオテクノロジーII、pp.123-132、現代化学
増刊、(1991)〕をアグロバクテリウム菌に形質転換して
使用した。上記のイントロンGUS遺伝子を保有するアグ
ロバクテリウム菌EHA101/pIG121-Hmをカナマイシンを50
mg/l、ハイグロマイシンを50mg/lの濃度で含有するL液
体培地にて、一晩30℃で培養して調整した。
たEHA101株〔Hood etal .J.Bacteriology 168:1291-131
(1986) 〕を使用した。遺伝子導入としてはいかなる遺
伝子であろうとも、そのプロモーターを植物用のプロモ
ーターに置換することによって発現させ得る。ここでは
選抜マーカー遺伝子となるハイグロマイシン抵抗性遺伝
子とカナマイシン抵抗性遺伝子を有し、更にレポーター
遺伝子としてヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イントロン
を含むβ―グルクロニダーゼ(イントロンGUS)遺伝子をT
-DNA領域に有するバイナリーベクターpIG121-Hm〔中村
ら、植物バイオテクノロジーII、pp.123-132、現代化学
増刊、(1991)〕をアグロバクテリウム菌に形質転換して
使用した。上記のイントロンGUS遺伝子を保有するアグ
ロバクテリウム菌EHA101/pIG121-Hmをカナマイシンを50
mg/l、ハイグロマイシンを50mg/lの濃度で含有するL液
体培地にて、一晩30℃で培養して調整した。
【００３５】（５）アグロバクテリウム菌のユーカリ属
植物組織への感染 感染誘導処理した早生分枝をナイフで2〜10mmの大きさ
に切断した後、前記の方法で調整したアグロバクテリウ
ム菌EHA101/pIG121-Hmの培養液に浸けた。早生分枝に付
着した培養液を濾紙で拭き取った後、早生分枝をB5基本
培地に2mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、1mMガラクトース、10
μMアセトシリンゴン、3%ショ糖と0.2%ゲランガムを含
有する感染培地に置床し、26℃の温度、遮光条件下で2
日間静置培養して、アグロバクテリウムを感染させた。
植物組織への感染 感染誘導処理した早生分枝をナイフで2〜10mmの大きさ
に切断した後、前記の方法で調整したアグロバクテリウ
ム菌EHA101/pIG121-Hmの培養液に浸けた。早生分枝に付
着した培養液を濾紙で拭き取った後、早生分枝をB5基本
培地に2mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、1mMガラクトース、10
μMアセトシリンゴン、3%ショ糖と0.2%ゲランガムを含
有する感染培地に置床し、26℃の温度、遮光条件下で2
日間静置培養して、アグロバクテリウムを感染させた。
【００３６】（６）アグロバクテリウム菌の除菌 アグロバクテリウム菌を感染させた組織片のアグロバク
テリウム菌を殺菌するために、B5基本培地に対して2mg/
l NAA、0.2mg/l の4-PU、3%ショ糖、更にアグロバクテ
リウム菌を殺菌するための抗生物質である500mg/lカル
ベニシリンを含有する除菌培地に移植した。これを26℃
の温度、遮光条件下、2rpmの回転速度で7日間竪型回転
培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
テリウム菌を殺菌するために、B5基本培地に対して2mg/
l NAA、0.2mg/l の4-PU、3%ショ糖、更にアグロバクテ
リウム菌を殺菌するための抗生物質である500mg/lカル
ベニシリンを含有する除菌培地に移植した。これを26℃
の温度、遮光条件下、2rpmの回転速度で7日間竪型回転
培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００３７】（７）形質転換カルスの形成 アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、B5基
本培地に0.02mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、3%ショ糖、およ
び抗生物質ハイグロマイシンを10mg/lで含有する液体培
地に、1本の試験管に対し5片の割合で植え付けた。26℃
の温度、遮光条件下で7日間竪型回転培養した。更に竪
型回転培養器の下辺が20μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺
が150μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射下、2rpmの竪型回
転培養で１カ月間竪型回転培養することによって、組織
片中に黄白色で2〜3mmの形質転換したカルス形成が認め
られた。
本培地に0.02mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、3%ショ糖、およ
び抗生物質ハイグロマイシンを10mg/lで含有する液体培
地に、1本の試験管に対し5片の割合で植え付けた。26℃
の温度、遮光条件下で7日間竪型回転培養した。更に竪
型回転培養器の下辺が20μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺
が150μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射下、2rpmの竪型回
転培養で１カ月間竪型回転培養することによって、組織
片中に黄白色で2〜3mmの形質転換したカルス形成が認め
られた。
【００３８】（８）形質転換カルスから苗条原基の形成 得られたカルス65個を、竪型回転培養器の下辺が80μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が420μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）
の光照射条件において、30日目で新鮮培地へ継代して回
転培養を継続し60日目で取り出して苗条原基の形成を確
認した。その結果、40個のカルスが苗条原基を形成した
ことが判明し、苗条原基形成率は61.5％であった。な
お、本明細書の実施例における光照射は三菱電気製メタ
ルハライドランプＢＯＣランプを使用した。
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が420μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）
の光照射条件において、30日目で新鮮培地へ継代して回
転培養を継続し60日目で取り出して苗条原基の形成を確
認した。その結果、40個のカルスが苗条原基を形成した
ことが判明し、苗条原基形成率は61.5％であった。な
お、本明細書の実施例における光照射は三菱電気製メタ
ルハライドランプＢＯＣランプを使用した。
【００３９】（９）形質転換植物の再生 以上により得られた形質転換された苗条原基より、形質
転換された苗条を再生させるためにB5基本培地に0.02mg
/l NAA、0.2mg/l BA、1%ショ糖、0.2%ゲランガムおよび
10mg/lハイグロマイシンを含有する苗化培地に5mm角程
度の大きさにした苗条原基を移植した。そして、25℃の
温度、光量40μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間光照射下
で培養した結果、移植後１カ月後に苗条の再生が認めら
れた。得られた苗条はB5基本培地に0.01mg NAA、1%ショ
糖、0.35%寒天および10mg/lハイグロマイシンを含有す
る発根培地に移植することによって、１カ月後には発根
が認められ完全な植物体となった。すなわち、本方法の
場合、組織片への感染から形質転換植物の作出まで６カ
月を要した。
転換された苗条を再生させるためにB5基本培地に0.02mg
/l NAA、0.2mg/l BA、1%ショ糖、0.2%ゲランガムおよび
10mg/lハイグロマイシンを含有する苗化培地に5mm角程
度の大きさにした苗条原基を移植した。そして、25℃の
温度、光量40μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間光照射下
で培養した結果、移植後１カ月後に苗条の再生が認めら
れた。得られた苗条はB5基本培地に0.01mg NAA、1%ショ
糖、0.35%寒天および10mg/lハイグロマイシンを含有す
る発根培地に移植することによって、１カ月後には発根
が認められ完全な植物体となった。すなわち、本方法の
場合、組織片への感染から形質転換植物の作出まで６カ
月を要した。
【００４０】（１０）形質転換植物における導入遺伝子
の存在確認 抗生物質による選抜によって得られた個体について、PC
R法を用いて導入遺伝子の存在を確認したところ、全個
体において導入遺伝子が確認された。このことにより本
方法によるユーカリ属植物の形質転換が有効であること
証明された。
の存在確認 抗生物質による選抜によって得られた個体について、PC
R法を用いて導入遺伝子の存在を確認したところ、全個
体において導入遺伝子が確認された。このことにより本
方法によるユーカリ属植物の形質転換が有効であること
証明された。
【００４１】（１１）形質転換植物における導入遺伝子
の発現確認 PCR法によって導入遺伝子の存在が確認された個体に付
いて、イントロンGUS遺伝子の発現を組織染色〔Kosugi
et al. Plant Sciene 70:133-140(1990)〕によって調べ
たところ、葉の周囲、根端および根毛において強いイン
トロンGUS遺伝子の発現が確認された。
の発現確認 PCR法によって導入遺伝子の存在が確認された個体に付
いて、イントロンGUS遺伝子の発現を組織染色〔Kosugi
et al. Plant Sciene 70:133-140(1990)〕によって調べ
たところ、葉の周囲、根端および根毛において強いイン
トロンGUS遺伝子の発現が確認された。
【００４２】＜実施例２＞実施例１の（１）〜（７）ま
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス65個を、竪型回転培
養器の下辺が66μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が344μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、25個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、苗条原基形成率は3
8.5％であった。
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス65個を、竪型回転培
養器の下辺が66μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が344μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、25個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、苗条原基形成率は3
8.5％であった。
【００４３】＜比較例１＞実施例１の（１）〜（７）ま
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス65個を、竪型回転培
養器の下辺が30μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が160μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、4個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、形成率は6.2％であ
った。以上の実施例・比較例をまとめて表１記載した。
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス65個を、竪型回転培
養器の下辺が30μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が160μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、4個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、形成率は6.2％であ
った。以上の実施例・比較例をまとめて表１記載した。
【００４４】
【表１】 但し、照度と光合成光量子束密度は竪型回転培養器の上
辺での値のみ記載してある。
辺での値のみ記載してある。
【００４５】＜実施例３＞ （１）供試植物 ユーカリ属植物としてユーカリプタス・ダニアイ（Euca
lyptus dunnii）を使用した。
lyptus dunnii）を使用した。
【００４６】（２）多芽体の作出 (a) 無菌播種 ユーカリプタス・ダニアイ（Eucalyptus dunnii）種子
を７倍に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液に、Tween2
0を0.1％加えた液に40分間浸漬し、70％アルコールで2
分間、さらに5倍に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液
にTween-20を0.1％加えた液に30分間浸漬して殺菌後、
滅菌水で3回洗浄した。次いで1％ ショ糖および0.6％の
寒天を含むB5培地上に種子を置床した。培養条件は温度
26℃、照度46μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間日長で行
った。播種後、約2週間生育させて苗条を得た。
を７倍に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液に、Tween2
0を0.1％加えた液に40分間浸漬し、70％アルコールで2
分間、さらに5倍に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液
にTween-20を0.1％加えた液に30分間浸漬して殺菌後、
滅菌水で3回洗浄した。次いで1％ ショ糖および0.6％の
寒天を含むB5培地上に種子を置床した。培養条件は温度
26℃、照度46μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間日長で行
った。播種後、約2週間生育させて苗条を得た。
【００４７】(b) 多芽体の作出 無菌発芽させた苗条の茎頂を含む組織片を切り出し、B5
基本培地に対して0.02mg/l NAA、0.02mg/l BA、１％ シ
ョ糖と0.2％ ゲランガムを含有する固体培地に植え付
け、温度26℃、光量46μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間
光照射下で行い、約４週間毎に新鮮培地に継代した。
基本培地に対して0.02mg/l NAA、0.02mg/l BA、１％ シ
ョ糖と0.2％ ゲランガムを含有する固体培地に植え付
け、温度26℃、光量46μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間
光照射下で行い、約４週間毎に新鮮培地に継代した。
【００４８】（３）感染誘導処理 前記で得られた多芽体の感染誘導処理を実施例１と同様
に行った。 （４）アグロバクテリウム菌の調整 アグロバクテリウム菌の調整は実施例１と同様に行っ
た。
に行った。 （４）アグロバクテリウム菌の調整 アグロバクテリウム菌の調整は実施例１と同様に行っ
た。
【００４９】（５）アグロバクテリウム菌のユーカリプ
タス・ダニアイへの感染 前記感染誘導した多芽体を取り出しナイフで2〜10mmの
大きさで切断した。更にB5基本培地に2mg/l NAA、0.2mg
/l 4-PU、1mMガラクトース、10μMアセトシリンゴンと3
%ショ糖を含有する培地を調整し、更に前記の方法で調
整したアグロバクテリウム菌EHA101/pIG121-Hmの培養液
に浸けた。ついで実施例１と同様の方法で前記組織片を
感染培地に移植し、26℃の温度、遮光条件下で2日間静
置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
タス・ダニアイへの感染 前記感染誘導した多芽体を取り出しナイフで2〜10mmの
大きさで切断した。更にB5基本培地に2mg/l NAA、0.2mg
/l 4-PU、1mMガラクトース、10μMアセトシリンゴンと3
%ショ糖を含有する培地を調整し、更に前記の方法で調
整したアグロバクテリウム菌EHA101/pIG121-Hmの培養液
に浸けた。ついで実施例１と同様の方法で前記組織片を
感染培地に移植し、26℃の温度、遮光条件下で2日間静
置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００５０】（６）アグロバクテリウムの除菌 アグロバクテリウム菌を感染させたユーカリ属植物組織
より、アグロバクテリウム菌を除くために、組織片をB5
基本培地に2mg/l NAA、0.2mg/l 4-PUと3%ショ糖、更に
アグロバクテリウム菌を殺菌するために抗生物質として
500mg/lのカルベニシリンを含有する除菌培地に移植し
た。これを26℃の温度、遮光条件下、2rpmの回転速度で
７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌
を行った。
より、アグロバクテリウム菌を除くために、組織片をB5
基本培地に2mg/l NAA、0.2mg/l 4-PUと3%ショ糖、更に
アグロバクテリウム菌を殺菌するために抗生物質として
500mg/lのカルベニシリンを含有する除菌培地に移植し
た。これを26℃の温度、遮光条件下、2rpmの回転速度で
７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌
を行った。
【００５１】（７）形質転換カルスの形成 アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、B5基
本培地に0.02mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、3%ショ糖および
10mg/lハイグロマシンを含有する選抜培地に、１本の試
験管に対し5片の割合で植え付けた。26℃の温度、遮光
条件下で7日間、更に下辺20μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上
辺が150μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射下、2rpmの竪型
回転培養で１カ月間竪型回転培養することによって、組
織片中に黄白色で2〜3mmの形質転換したカルス形成が認
められた。
本培地に0.02mg/l NAA、0.2mg/l 4-PU、3%ショ糖および
10mg/lハイグロマシンを含有する選抜培地に、１本の試
験管に対し5片の割合で植え付けた。26℃の温度、遮光
条件下で7日間、更に下辺20μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上
辺が150μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射下、2rpmの竪型
回転培養で１カ月間竪型回転培養することによって、組
織片中に黄白色で2〜3mmの形質転換したカルス形成が認
められた。
【００５２】（８）カルスから苗条原基の形成 得られたカルス40個を、竪型回転培養器の下辺が20μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が420μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）
の光照射条件において、30日目で新鮮培地へ継代して培
養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから
60日目で取り出して苗条原基の形成を確認した。その結
果、25個のカルスが苗条原基を形成したことが判明し、
形成率は62.5％であった。
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が420μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）
の光照射条件において、30日目で新鮮培地へ継代して培
養を継続した。光照射下で竪型回転培養をはじめてから
60日目で取り出して苗条原基の形成を確認した。その結
果、25個のカルスが苗条原基を形成したことが判明し、
形成率は62.5％であった。
【００５３】（９）形質転換植物の再生 竪型回転培養して得られた形質転換された苗条原基から
苗条を再生させるために、B5基本培地に0.01mg/l NAA、
0.5mg/l BA、1%ショ糖、0.2%ゲランガムおよび10mg/lハ
イグロマイシンを含有する苗化培地に5mm角程度の大き
さにした苗条原基を移植した。そして、26℃の温度、光
量40μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間光照射下で培養し
た結果、移植後１カ月後に苗条の再生が認められた。得
られた苗条は1／4B5基本培地に0.1mg/l IBA、1%ショ
糖、0.4%寒天および10mg/lハイグロマイシンを含有する
発根培地に移植することによって、1カ月後には発根が
認められ完全な植物体になった。
苗条を再生させるために、B5基本培地に0.01mg/l NAA、
0.5mg/l BA、1%ショ糖、0.2%ゲランガムおよび10mg/lハ
イグロマイシンを含有する苗化培地に5mm角程度の大き
さにした苗条原基を移植した。そして、26℃の温度、光
量40μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、16時間光照射下で培養し
た結果、移植後１カ月後に苗条の再生が認められた。得
られた苗条は1／4B5基本培地に0.1mg/l IBA、1%ショ
糖、0.4%寒天および10mg/lハイグロマイシンを含有する
発根培地に移植することによって、1カ月後には発根が
認められ完全な植物体になった。
【００５４】（１０）形質転換植物における導入遺伝子
の存在確認と発現確認 形質転換によって得られた固体について、実施例１と同
様にPCR法によって、導入遺伝子の存在確認を行った。
またGUS遺伝子の発現を組織染色によって確認した。
の存在確認と発現確認 形質転換によって得られた固体について、実施例１と同
様にPCR法によって、導入遺伝子の存在確認を行った。
またGUS遺伝子の発現を組織染色によって確認した。
【００５５】＜実施例４＞実施例３の（１）〜（７）ま
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス40個を、竪型回転培
養器の下辺が66μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が344μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、14個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、形成率は35.0％であ
った。
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス40個を、竪型回転培
養器の下辺が66μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が344μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、14個のカルスが
苗条原基を形成したことが判明し、形成率は35.0％であ
った。
【００５６】＜比較例２＞実施例３の（１）〜（７）ま
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス27個を、竪型回転培
養器の下辺が30μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が160μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、苗条原基を形成
したものが無いことが判明し、形成率は0％であった。
以上の実施例・比較例の結果をまとめて表２に記載し
た。
での工程で選られたカルスを、（８）の光強度条件のみ
を変更した。即ち、得られたカルス27個を、竪型回転培
養器の下辺が30μｍｏｌ／（ｍ2・ｓ）、上辺が160μｍ
ｏｌ／（ｍ2・ｓ）の光照射条件において、30日目で新
鮮培地へ継代して回転培養を継続し60日目で取り出して
苗条原基の形成を確認した。その結果、苗条原基を形成
したものが無いことが判明し、形成率は0％であった。
以上の実施例・比較例の結果をまとめて表２に記載し
た。
【００５７】
【表２】 但し、照度と光合成光量子束密度は竪型回転培養器の上
辺での値のみ記載してある。
辺での値のみ記載してある。
【００５８】
【発明の効果】本発明によって、これまで形質転換植物
の作出が困難であったユーカリ属植物の形質転換におい
ても、強度の光照射下で形質転換カルスを竪型回転培養
することにより苗化能力に優れた苗条原基を高頻度に誘
導できるようになった。その結果、効率的よく安定的に
形質転換苗条原基形成を行うことで形質転換植物体の作
出が可能になった。従って、従来育種法である選抜や交
雑によって作出されたプラス木に対して有用遺伝子の導
入ができることから、従来よりも安価で更に生物種を越
えた有用遺伝子形質を保有する新品種を供給することが
可能になった。
の作出が困難であったユーカリ属植物の形質転換におい
ても、強度の光照射下で形質転換カルスを竪型回転培養
することにより苗化能力に優れた苗条原基を高頻度に誘
導できるようになった。その結果、効率的よく安定的に
形質転換苗条原基形成を行うことで形質転換植物体の作
出が可能になった。従って、従来育種法である選抜や交
雑によって作出されたプラス木に対して有用遺伝子の導
入ができることから、従来よりも安価で更に生物種を越
えた有用遺伝子形質を保有する新品種を供給することが
可能になった。
【図１】 本発明に使用する竪型回転培養器及び光照射
装置の模式図。
装置の模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 河津 哲 三重県亀山市能褒野町24−９ 王子製紙株 式会社森林資源研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD06 CD09 CD13 CD16 CD17
Claims (5)
- 【請求項１】 木本性植物のカルスを竪型回転培養器に
より光照射下で培養することにより苗条原基を誘導す
る、カルスからの再分化方法において、該竪型回転培養
器の一辺から、その辺における受光量が２３０μｍｏｌ
／（ｍ2・ｓ）以上となるように、光を照射することを
特徴とする木本性植物のカルスからの再分化方法。 - 【請求項２】 木本性植物がユーカリ属植物である請求
項１に記載の再分化方法。 - 【請求項３】 ユーカリ属植物がユーカリ交雑種あるい
はユーカリプタス・ダニアイ（Eucalyptus dunnii）で
あることを特徴とする請求項２に記載の再分化方法。 - 【請求項４】 ユーカリ交雑種がユーカリプタス・グラ
ンディス（Eucalyptus grandis）とユーカリプタス・ユ
ーロフィラ（Eucalyptus urophylla）との交雑種である
ことを特徴とする請求項３に記載の再分化方法。 - 【請求項５】 カルスが形質転換カルスである請求項１
〜請求項４に記載の再分化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001095323A JP2002281851A (ja) | 2001-03-29 | 2001-03-29 | 木本性植物のカルスからの再分化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001095323A JP2002281851A (ja) | 2001-03-29 | 2001-03-29 | 木本性植物のカルスからの再分化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002281851A true JP2002281851A (ja) | 2002-10-02 |
Family
ID=18949389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001095323A Pending JP2002281851A (ja) | 2001-03-29 | 2001-03-29 | 木本性植物のカルスからの再分化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002281851A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102577945A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-18 | 玉林市林业科学研究所 | 防止桉树继代培养玻璃化的方法 |
| CN115997684A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-04-25 | 广州市林业和园林科学研究院 | 一种宫粉紫荆组织培养育苗的培养基及培养方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0611209B2 (ja) * | 1985-09-04 | 1994-02-16 | 王子製紙株式会社 | 木本性植物の大量増殖法 |
| JPH07184492A (ja) * | 1993-12-27 | 1995-07-25 | Sapporo Breweries Ltd | 形質転換オオムギ植物並びに該植物の作出方法 |
| JPH07203790A (ja) * | 1994-01-25 | 1995-08-08 | New Oji Paper Co Ltd | 形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法 |
| JPH07213183A (ja) * | 1994-02-04 | 1995-08-15 | Sapporo Breweries Ltd | オオムギ植物体の再生方法 |
| JPH0889113A (ja) * | 1994-09-22 | 1996-04-09 | New Oji Paper Co Ltd | 形質転換されたユーカリ属植物の作出方法 |
| JPH08172955A (ja) * | 1994-12-26 | 1996-07-09 | Sapporo Breweries Ltd | オオムギ植物体の再生方法 |
| JPH09107831A (ja) * | 1995-10-24 | 1997-04-28 | Hokko Chem Ind Co Ltd | 花卉植物の種苗の製造方法 |
| JP2000139253A (ja) * | 1998-11-16 | 2000-05-23 | Nippon Paper Industries Co Ltd | ユーカリプタス・トレリアーナの組織培養方法 |
| JP2000316403A (ja) * | 1999-05-07 | 2000-11-21 | Oji Paper Co Ltd | ユーカリ属植物の成木を形質転換する方法 |
-
2001
- 2001-03-29 JP JP2001095323A patent/JP2002281851A/ja active Pending
Patent Citations (9)
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102577945A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-18 | 玉林市林业科学研究所 | 防止桉树继代培养玻璃化的方法 |
| CN115997684A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-04-25 | 广州市林业和园林科学研究院 | 一种宫粉紫荆组织培养育苗的培养基及培养方法 |
| CN115997684B (zh) * | 2022-12-30 | 2023-10-13 | 广州市林业和园林科学研究院 | 一种宫粉紫荆组织培养育苗的培养基及培养方法 |
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