CN105441445B - miR528的调控位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻OsmiR528编码基因MIR528及OsmiR528调控位点(Os06g06050、Os06g37150、Os08g04310、Os08g42640和Os07g38290)在控制水稻生育期和病毒抗性方面的作用。本发明人通过OsmiR528过量表达和敲除水稻株系的研究，发现OsmiR528能够影响水稻抽穗期和抗水稻条纹叶枯病毒(RSV)能力：即过量表达OsmiR528会导致抽穗期提前和对RSV病毒敏感，而敲除OsmiR528则会导致抽穗期延迟和抗RSV病毒。而且MIR528在水稻不同品种中存在直接影响OsmiR528表达水平的调控序列多态性，以上结果可应用于水稻杂交育种及分子辅助育种。
Description
技术领域：
本发明涉及植物育种，具体涉及水稻miR528编码基因MIR528及miR528调控位点(Os06g06050、Os06g37150、Os08g04310、Os08g42640和Os07g38290)在培育生育期适宜和高抗病毒能力的作物品种中的应用。
技术背景：
开花时间（或谷类作物中的抽穗期）是植物从营养生长到生殖生长转变的过程，为了成功繁衍，植物需要在极端环境（如高温、冷冻等）到来之前开花并完成其生活史。因此，开花时间直接决定着植物能否在其生长地域完成生活史，同时也是决定作物产量的重要农艺性状之一。培育生育期适宜的作物品种，也是作物育种过程中需要考虑的重要因素。以粮食作物水稻为例，水稻是典型的短日照植物，即短日照促进水稻抽穗而长日照延迟其抽穗。现在栽培稻和野生稻（O.rufipogon）被认为起源于共同的祖先，野生稻分布在中国南部到印度东部等低纬度地区，其分布纬度的极限是北纬28°；而与其相对应的是，现在栽培稻的适应范围已经大大扩展，目前在北纬45°附近仍有栽培稻的分布。说明随着人类育种过程中的不断驯化，水稻的适应地域被大大扩展，从而更好地满足人类的粮食需求。由于不同地域的纬度不同，作物开花时间亦会受到影响，为了实现作物产量最大化，选育生育期适宜的品种显得尤为重要。因此，阐明植物尤其是粮食作物开花时间的分子机制，分离控制其开花时间的基因，进而应用于指导分子育种和品种改良具有重要意义。
病虫害是影响植物正常生长和农作物产量的重要因素，因此，病虫害的防治一直是农业生产的重要环节。在病虫害的防治过程中，现代农业面临着巨大的矛盾：一方面，农药使用在保障农作物稳产中功不可没，另一方面，过度使用农药也给环境及食品安全带来极大风险。研究植物自身抗病虫害机制，发掘自然界中植物抗病虫害基因资源，进而指导作物抗病虫害的分子育种，对于保障农作物稳产和食品安全、保护生态环境、维持农业可持续发展有着重要意义。水稻条纹叶枯病毒（RSV）是一种由灰飞虱传播的RNA病毒，由其引起的水稻条纹叶枯病（rice stripe）是一种常见水稻病害，在流行年份能造成水稻的严重减产。水稻条纹叶枯病的发病植物往往表现出矮化，分蘖减少，发病早的心叶卷曲下垂，呈“假枯心”症状；发病晚的虽只在剑叶或叶鞘上有退色斑，但穗发育不良或畸形，形成“假白穗”。水稻条纹叶枯病最早于1931年在日本发现，我国最早于1964年报道，随后发病地区和面积明显扩大，在80-90年代一直是水稻重要病毒病害。自本世纪初以来日趋严重，2004年仅江苏省发病面积就达到133万hm2，随后在全国范围内大面积流行。根据全国农技推广中心的病害测报，该病发病面积连续５年一直在不断扩大，2008年达到200万hm2。
miRNA和siRNA的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一。具有调节功能的非编码小分子RNA是指长度为21-24 nt 左右，大多在进化上具有序列保守性的RNA分子。它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译，参与调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA的发现不仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识，特别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，小分子RNA在2002和2003连续两年被《Science》杂志评为“年度十大科技进展 ”。
大量的实验证据表明miRNA在动植物的生长、发育、环境适应等各个生物学过程中具有重要的调控作用。在植物体内，miRNA通过序列互补的方式识别靶mRNA，进而指导靶mRNA的降解或抑制其蛋白质的翻译，从而负调控靶位点的表达。虽然小分子RNA在理论上的研究已经取得了巨大的进步，但是如何在生产上利用小分子RNA，为现代农业服务，产生经济价值是现代生物领域的一大难题。本发明通过对miR528生物学功能的研究，发现其在水稻抽穗期和抗病毒上具有重要调控作用，并通过调节miR528表达水平影响水稻抽穗期及抗病毒特性，因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抽穗期和抗病毒两个重要农艺性状的改良具有重要的意义。
发明内容：
1、本发明证实miR528能够同时调控多个靶mRNA表达而发挥生物学功能。通过在水稻中过量表达miR528使水稻抽穗时间提前，并且对水稻条纹病毒RSV表现出超敏感；而miR528表达被下调的水稻植株则会表现出抽穗时间延迟和强抗RSV病毒能力。通过系统研究，我们发现miR528在水稻抽穗期和抗病毒方面有着重要调控功能。
2、本发明分析了MIR528基因位点在不同水稻品种中的多态性，发现MIR528上游启动子调控区域存在两段明显的插入（或缺失）序列，而且这种多态性对于成熟miR528的表达量有重要调控作用。因此MIR528基因位点在不同水稻品种中的多态性可以在遗传育种过程中作为分子标记，应用于水稻抽穗期和抗病毒两个重要农艺形状的筛选。
3、本发明在玉米、高粱、甘蔗等重要禾本科作物中检测到miR528保守存在，说明miR528对禾本科植物开花时间和抗病毒能力的调控广泛存在。因此，MIR528基因可以作为分子标记应用于上述几种农作物的遗传育种过程中。
本发明所提供的水稻MIR528基因及其上游调控序列具有以下特性：
1、序列表中的SEQ ID NO:1
序列表中的SEQ ID NO:1由水稻MIR528基因及其上下游调控序列共3154个脱氧核糖核苷酸组成。序列1中自2149位至2800位脱氧核糖核苷酸为MIR528基因转录序列，其余部分为上下游调控序列。
2、本发明涉及的MIR528基因序列以及受到成熟miR528调控的靶位点序列在分子育种标记、转基因株系、转基因新品种中的应用均属于保护内容。
附图说明
图1所示是miR528在水稻中的调控位点。miR528在水稻有5个靶mRNA，分别由基因Os06g06050、Os06g37150、Os08g04310、Os08g46240、Os07g38290转录而成。miR528的识别位点是长度约为21nt的核苷酸序列，图中显示了miR528与靶mRNA在对应的识别位点存在序列的反向互补。
图2所示的是miR528过量表达载体图谱。MIR528基因序列在组成型启动子ACTIN1启动子的驱动下，连入到双元表达载体pCAMBIA2300。利用该载体转化野生型水稻，进而在水稻中过量表达miR528。
图3所示的是miR528过量表达和敲除水稻株系中成熟miR528表达量鉴定。A所示的是小RNA Northern杂交显示mir528突变体及其野生型对照Dongjin中miR528的表达水平，U6和5s RNA作为内参。B所示的是小RNA Northern杂交显示3个独立的miR528过表达转基因系和其野生型对照中miR528的表达水平。
图4所示的是北京田间miR528过量表达和敲除水稻株系抽穗期表型。结果显示相对也其野生型对照，mir528突变体表现出晚花，而miR528过表达转基因植株则表现出早花。
图5所示是miR528过量表达水稻株系接种RSV病毒后的表型。Mock为未接种病毒的对照植株，相对于野生型对照，miR528过量表达水稻株系对RSV表现出强敏感表型。
图6所示的是MIR528基因上游调控区在不同品种中存在的序列插入（或缺失）。通过对来自不同水稻品种的MIR528基因及其顺式调控序列分析，我们发现来自不同品种的MIR528上游调控区域序列存在两种不同的等位形式（MIR528-A1和MIR528-A2）。其中相对于MIR528-A1来说，MIR528-A2转录起始位点上游-590bp和-837bp位点分别存在30bp和38bp的序列缺失。
图7 miR528表达水平在不同水稻品种中存在差异。含有MIR528-A1等位基因的水稻品种中miR528的表达水平整体高于含有MIR528-A2等位基因的水稻品种。其中miR156、miR172、U6和5s RNA作为内参
图8 水稻MIR528基因在单子叶植物中的保守性。利用水稻miR528前体序列(形成miR528前体茎-环结构的序列)通过序列比对的方式搜索了植物转录组装数据库（http://plantta.jcvi.org/）。比对结果显示，miR528前体在玉米、高粱、甘蔗等禾本科作物中保守存在，尤其是在成熟miR528及其星号链（miR528*）区域高度保守，说明miR528在这些物种保守存在。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。
具体实施实例
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell, David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）或相关产品。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1、miR528识别位点的获得
利用植物miRNA与靶mRNA存在序列互补的原理，通过水稻全基因组扫描，我们获得了水稻中miR528的识别位点。在水稻中miR528的靶mRNA有5个，分别由Os06g06050、Os06g37150、Os08g04310、Os08g46240、Os07g38290基因转录而成。miR528的识别位点是长度约为21nt的核苷酸序列，miR528与靶mRNA在对应的识别位点存在很好的序列匹配，见附图1。
实施例 2、MIR528基因过量表达载体的构建
本实施例是关于pCAMBIA2300-pACTIN1-MIR528载体构建一个通用说明。
首先以日本晴水稻DNA为模板，设计引物与之匹配，并在正反向引物的5’端分别加上PstI酶切位点序列，利用高保真DNA聚合酶PCR扩增MIR528基因序列。电泳回收PCR产物，并连接到克隆载体P-EASY blunt上，转化大肠杆菌DH5α，涂板获取单克隆。选择测序正确的克隆提取质粒，用PstI酶切，回收MIR528片段；同时，将载体pCAMBIA2300用PstI酶切过夜，末端脱磷并回收。将回收的MIR528片段与载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接（T4Ligase (NEB®)）过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，验证正确的克隆提取质粒，并进一步测序验证，从而获得用做植物转化的载体。图谱见附图2。
实施例 3、miR528敲除和过量表达水稻株系的鉴定
通过搜索水稻数据库RiceGE (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，我们从中找到一个T-DNA插入位点位于miR528前体（pre-miR528）内的水稻株系,我们将其命名为mir528。小RNA Northern杂交结果显示，mir528株系中miR528被完全敲除，见附图3。另外，们将含有水稻內源强启动子ACTIN1驱动MIR528序列的pCAMBIA2300载体（pCAMBIA2300- pACTIN1-MIR528）转入水稻，鉴定获得了多个独立的转基因株系，成熟结果显示转基因株系中miR528表达水平被上调，见附图3。
实施例 4、miR528敲除和过量表达水稻株系抽穗期表型分析
北京秋季田间实验结果显示，miR528敲除和过量表达水稻株系在整个苗期和营养生长期内，与野生型相比没有明显差异。抽穗期的统计分析发现，miR528敲除突变体mir528株系表现出抽穗时间稍有延迟（约3.5天）。而与野生型对照相比，miR528过量表达的水稻株系（miR528-OE）抽穗期会有所提前，见附图4。以上结果表明，miR528对于水稻抽穗具有正调控作用。
实施例 5、miR528敲除和过量表达水稻株系抗水稻条纹叶枯病毒（RSV）功能分析
为了验证miR528在抗水稻条纹叶枯病毒中的功能，我们对分蘖期的miR528敲除和过量表达水稻株系做了RSV接病毒实验，结果显示，miR528敲除突变体mir528株系具有更强的抗病毒能力；而与野生型对照相比，miR528过量表达的水稻株系则对病毒表现出更加敏感，表现出更高的发病率，见附图5。这一结果表明，miR528对于水稻抗水稻条纹叶枯病毒（RSV）具有负调控作用。
实施例 6、水稻MIR528基因在不同品种中的差异
通过对来自不同水稻品种的MIR528基因及其顺式调控序列分析，我们发现来自不同品种的MIR528上游调控区域序列存在两种不同的等位形式（MIR528-A1和MIR528-A2）。其中相对于MIR528-A1来说，MIR528-A2转录起始位点上游-590bp和-837bp位点分别存在30bp和38bp的序列缺失。为了研究这种序列缺失对于成熟miR528表达水平的影响，我们进一步对不同品种叶片中成熟miR528的表达水平做了鉴定，结果显示，含有MIR528-A1等位基因的水稻品种中miR528的表达水平整体高于含有MIR528-A2等位基因的水稻品种，见附图7。以上结果表明，来自不同水稻品种的MIR528上游调控序列可以直接影响成熟miR528的表达水平，因此可以作为育种中的分子标记，通过杂交的方式优化水稻体内成熟miR528的表达水平。
实施例 6、MIR528在禾本科植物中保守存在
本发明研究了MIR528在植物中的保守性。首先，我们分析了miR528前体在植物中的保守性，利用水稻miR528前体序列(形成miR528前体茎-环结构的序列)通过序列比对的方式搜索了植物转录组装数据库（http://plantta.jcvi.org/）。比对结果显示，miR528前体在玉米、高粱、甘蔗等禾本科作物中保守存在，尤其是在成熟miR528及其星号链（miR528*）区域高度保守，见附图8。进一步对这些转录本的二级结构分析结果发现，它们都能形成典型的miRNA前体的茎-环结构，说明miR528在这些物种保守存在。
Claims (12)
1.一种延后植物的抽穗期和/或增强植物对水稻条纹叶枯病毒的抗性的方法，包括在该植物中下调miR528的表达，所述植物为水稻，miR528的序列为UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，miR528的表达下调通过MIR528基因敲除而实现。
3.一种提前植物的抽穗期的方法，包括在该植物中上调miR528的表达，所述植物为水稻，miR528的序列为UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，miR528的表达上调通过向该植物导入过表达miR528的载体而实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述过表达miR528的载体中，MIR528基因序列可操作地连接至能够指导该基因序列在植物中表达的组成型启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述组成型启动子为ACTIN1启动子。
7.miR528在增强植物对水稻条纹叶枯病毒的抗性中的用途，其中，miR528的表达在植物中下调，所述植物为水稻，miR528的序列为UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG。
8.miR528在调节植物的抽穗期中的用途，其中miR528的表达在植物中下调或上调，从而使得该植物的抽穗期延后或提前，所述植物为水稻，miR528的序列为UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，miR528的表达下调通过MIR528基因敲除而实现。
10.根据权利要求7或8所述的用途，其中，miR528的表达上调通过向该植物导入过表达miR528的载体而实现。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，在所述过表达miR528的载体中，MIR528基因序列可操作地连接至能够指导该基因序列在植物中表达的组成型启动子。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述组成型启动子为ACTIN1启动子。
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