CN111919753B - 一种番茄组培用培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄组培用培养基及其应用，涉及组培技术领域，包括获得无菌苗，选取无菌苗子叶作为外植体切割后以背面向上的姿势放入由MS+1.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L IAA组成的诱导培养基内培养，将分化出不定芽的挑出作为愈伤组织，将愈伤组织转入由MS+2.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L IAA组成的增殖培养基内培养，且转入时将愈伤组织底部按入增殖培养基内培养，将愈伤组织上高度达到3cm的不定芽在其与愈伤组织结合处切割并插入由MS+2mg/L IAA的生根培养基内进行培养，带生根培养基内植株生长高度达8～10cm时，向培养基内加入无菌水并在室温下炼苗2～3d后直接栽种于营养土中，采用贴接法将培养号的接穗与砧木嫁接；本发明建立了适合工厂化育苗手段的番茄快繁技术体系。
Description
技术领域
本发明涉及组培嫁接技术领域，具体为一种番茄组培用培养基及其应用。
背景技术
目前学术界针对番茄组织培养，其激素配方种类多样，类目繁杂，虽有较为成熟的快繁体系，但是对于诱导、增殖、生根等培养基的具体配方，各有其理论依据。目前众多研究人员探索出的方法，多偏向于理论研究，缺少实际工厂化应用发面的探索，且方法各异，使用激素种类多，配方不统一，操作繁琐，对操作者要求较高，不适合工厂实际操作。
因此，提供一种番茄组培用培养基和快繁体系是急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种番茄组培用培养基及其应用，以解决上述背景技术中提出的缺少番茄快繁体系和组培用培养基的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种番茄组培用培养基，所述培养基包括诱导培养基、增殖培养基生根培养基，其中：
诱导培养基具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
增殖培养基具体为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
生根培养基具体为：MS+2mg/L IAA。
本发明还提供一种利用上述培养基进行番茄组培的方法，该方法具体为：
步骤1、选择无粘结、颗粒饱满、大小差异接近的番茄种子，低温4℃无菌水浸种12h，75％乙醇消毒5min后放入15％次氯酸钠中15min，取出冲洗后放入MS培养基内，遮光处理后放入光照培养箱，培养箱光照16h，黑暗8h，光照强度2000LX，温度26℃，待种子发芽至两片子叶完全展开之时，获得无菌苗；
步骤2、选取无菌苗子叶作为外植体切割后以背面向上的姿势放入诱导培养基内培养，将分化出不定芽的挑出作为愈伤组织；
步骤3、将愈伤组织转入增殖培养基内培养，且转入时将愈伤组织底部按入增殖培养基内培养，将愈伤组织上高度达到3cm的不定芽在其与愈伤组织结合处切割并插入生根培养基内进行培养；
步骤4、带生根培养基内植株生长高度达8～10cm时，向培养基内加入无菌水并在室温下炼苗2～3d后直接栽种于营养土中；
步骤5、采用贴接法将培养号的接穗与砧木嫁接。
进一步，步骤2还包括对存在污染的外植体及时清理。
进一步，步骤3中生根培养基的pH值不大于6.5。
进一步，贴接法具体为：将4-6片真叶的砧木离地5cm左右斜切45°，再将2-3片真叶的接穗呈45°斜切，将二者贴合后利用嫁接夹固定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明筛选出了番茄组培用的诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基，并确定IAA与6-BA为三种培养基的添加激素，建立了适合工厂化育苗手段的番茄快繁技术体系；结合嫁接技术，为今后批量化规模化育苗供技术支持和理论依据。
附图说明
图1为愈伤组织诱导过程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例选用品种为‘毛粉812’的番茄种子，砧木品种为‘浙砧一号’，通过组织培养和嫁接实验，较为系统、全面的探讨在番茄组织培养再生体系中的影响因素，获取最优的培养基和嫁接方法，具体操作如下：
1、无菌苗的获取及培养
选择无粘结、颗粒饱满、大小差异接近的番茄种子，分成AB两组，A组用常温无菌水浸泡12h，B组用4℃低温无菌水浸泡12h，在无菌工作台中利用75％乙醇消毒5min，再倒入15％次氯酸钠中15min。将消毒完的种子倒入灭菌后的50ml离心管中，用无菌水进行冲洗，震荡五秒后将水倒出，重复进行三次后更换新的离心管，继续上述步骤，待更换五次离心管后，将种子倒入无菌滤纸上，用镊子夹入MS培养基，每瓶培养基均匀分布50粒种子。将点好种子的培养基分别进行遮光1和不遮光2处理，然后放入光照培养箱，观察种子的发芽天数及发芽势。培养箱光照16h，黑暗8h，光照强度2000LX，温度26℃，5～6d后获得无菌苗。
种子发芽势＝M1/M×100％(M1为发芽势天数内的正常发芽粒数，M为供试种子粒数),实验重复三次，统计结果如下。
不同处理方法对番茄种子萌发外植体的影响
| 方法 | 发芽时间(天) | 发芽势(％) | 发芽总天数 |
| A1 | 6 | 32.7b | 12 |
| A2 | 8 | 15.3b | 14 |
| B1 | 4 | 95.3a | 9 |
| B2 | 7 | 24.0b | 12 |
表1
由表1可知，常温浸种萌芽时间晚于低温浸种2d，遮光处理相较于不遮光，萌芽速度要快2～3d，且经过低温浸种的种子萌发成具有两片完整子叶的无菌苗相较于常温萌芽，早1d。
因此，在本实施例中后继实验中选用低温遮光处理种子。
2、诱导培养基
在无菌工作台中将经过高压灭菌的MS培养基冷却至35℃左右，再加入相应浓度且经过过滤灭菌的IAA和6-BA，并将瓶内pH滴定至6.0。IAA设置3个浓度梯度，分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L；6-BA设置3个浓度梯度，分别为0.8mg/L、1.0mg/L、1.2mg/L。两两组合，获得的九种(如表2)培养基依次倒入培养皿，待凝固后放入外植体进行试验。
其中外植体采用以下方式获得：
在无菌工作台内选取萌发出两片完整子叶的无菌苗，以子叶及下胚轴为外植体，下胚轴选取根部以上，子叶及生长点以下部位进行切割，子叶选取叶柄之前部分进行切割，分别将下胚轴和子叶切割成0.8×5mm、3×5mm小片段。将切割好的子叶外植体分两种放置方式放入诱导培养基，正面向上和背面向上，每个培养基放入20个外植体，均匀分布，进行若干次重复，三十天后观察其愈伤组织诱导率和不定芽诱导率。
每日观察各培养基外植体的生长情况，对存在污染的外植体及时清理，并在适当的条件进行转盘。每隔10d，观察各培养基内外植体诱导愈伤组织情况，统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率，其结果如表3-5。
愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/外植体总数×100％
不定芽诱导率(％)＝诱导出芽的外植体数/外植体总数×100％。
不同激素浓度配比
| 处理 | 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) | 处理 | 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) |
| Ⅰ | 0.8 | 0.1 | Ⅵ | 1.0 | 0.3 |
| Ⅱ | 0.8 | 0.2 | Ⅶ | 1.2 | 0.1 |
| Ⅲ | 0.8 | 0.3 | Ⅷ | 1.2 | 0.2 |
| Ⅳ | 1.0 | 0.1 | Ⅸ | 1.2 | 0.3 |
| Ⅴ | 1.0 | 0.2 |
表2
激素浓度配比对番茄子叶及下胚轴不定芽诱导的影响(30d)
表3
注：下胚轴选取根部以上，子叶及生长点以下部位进行切割，子叶选取叶柄之前部分进行切割
激素浓度配比对番茄子叶愈伤组织诱导的影响(30d)
表4
注：经过30d的诱导培养，各浓度培养基多数愈伤组织已长出适合进行增殖培养的不定芽，故选取30d进行数据统计
激素浓度配比对番茄下胚轴愈伤组织诱导的影响(30d)
表5
注：经过30d的诱导培养，各浓度培养基多数愈伤组织已长出不定芽，故选取30d进行数据统计
由表2-5可得，30d时，九种不同比例的激素浓度进行比较发现，Ⅴ号培养基在愈伤组织诱导率及不定芽诱导率方面效果最好，对子叶愈伤组织诱导率达到99.67％，不定芽诱导率达到93.67％，对下胚轴愈伤组织诱导率达到97.33％，不定芽诱导率达91.67％。而IAA和6-BA浓度较低的Ⅰ号培养基愈伤组织诱导率和不定芽诱导率，在九种培养基中最低。
番茄无菌苗子叶、下胚轴，均可作为外植体，在同样培养条件下，对愈伤组织诱导率及不定芽诱导率进行统计。虽然子叶与下胚轴的愈伤组织诱导率和不定芽诱导率相差不大，但是愈伤组织不定芽的芽高却相差较多，这些对后续不定芽增殖有着直接的影响；表6为愈伤组织生长过程。由图1可以看出，Ⅴ号培养基与Ⅰ号培养基对相同外植体诱导的影响差异，Ⅴ号培养基诱导的愈伤组织明显好于Ⅰ号培养基。
| 时间(d) | 子叶 | 下胚轴 |
| 10 | 白色或黄色愈伤形成 | 开始逐渐膨大 |
| 20 | 出现深绿色针状小点 | 膨大点成瘤状凸起 |
| 30 | 生长点多，分化出不定芽 | 出现少量生长点，分化出不定芽 |
表6
注：选择九组处理中愈伤组织诱导率及诱芽率最高的培养基进行持续观察，且每隔10d材料会发生较为显著的变化，故每隔10d进行数据观测
放置方式对不定芽诱导的影响
| 放置方式 | 接种数 | 诱愈率 | 诱芽率 |
| 正面向上 | 20 | 66.55±0.63b | 57.67±0.48b |
| 背面向上 | 20 | 99.67±1.53a | 93.67±0.58a |
表7
由表7可以得出，经过10d左右，正面向上放置的子叶外植体诱愈率和诱芽率均低于背面向上的放置方式，可得背面向上的放置方式优于正面向上的放置方式。
基于上述，本实施例后继实验用诱导培养基具体为：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA。
3、增殖培养基
在无菌工作台中将经过高压灭菌的MS培养基冷却至35℃左右，再加入相应浓度的且经过过滤灭菌的IAA和6-BA，pH值滴定至6.0。IAA设置3个浓度梯度，分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L；6-BA设置3个浓度梯度，分别为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L。两两组合，将获得的九种(如表8)培养基依次倒入培养瓶，每个瓶中倒入大概40ml培养基。将分化出不定芽的愈伤组织转入培养瓶，转入时将愈伤组织底部微微按入培养基防止愈伤组织四处晃动影响不定芽的增殖。每个培养瓶放入三个愈伤组织。
| 处理 | 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) | 处理 | 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) |
| a | 1.0 | 0.1 | f | 2.0 | 0.3 |
| b | 1.0 | 0.2 | g | 3.0 | 0.1 |
| c | 1.0 | 0.3 | h | 3.0 | 0.2 |
| d | 2.0 | 0.1 | i | 3.0 | 0.3 |
| e | 2.0 | 0.2 |
表8
每日观察各培养愈伤组织的生长情况，对存在污染的愈伤组织及时清理，并在适当的条件进行转盘。观察各培养基内外植体诱导愈伤组织情况，统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率，其结果如下表。
不定芽伸长率(％)＝伸长的不定芽数/接种不定芽数×100％不定芽平均高度＝不定芽高度之和/不定芽总数不定芽平均茎粗＝不定芽茎粗之和/不定芽总数。
不同激素比例对番茄分化芽增殖的影响(10d子叶)
表9
注：增殖培养10d后，多数培养基的芽已增殖至适合生根培养的芽高，考虑到时间成本及统计一致，故选择10d作为统计日期。
增殖培养10d后，多数培养基的芽已增殖至适合生根培养的芽高，考虑到时间成本及统计一致，故选择10d作为统计日期在诱导不定芽增值的阶段，选择诱导培养基中利用子叶进行诱导的e号培养基与导出的愈伤组织，进行不定芽增殖。表9中显示，在两种激素，三个浓度梯度的九种培养基中不定芽的不定芽伸长率、不定芽平均高度、不定芽平均茎粗，e号培养基的指标最好，分别为98.3％、28.87mm、1.97mm。e号培养基的单个外植体增殖倍数为4.0。
基于上述，本实施例后继实验用增殖培养基具体为：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA。
4、生根培养基
在无菌工作台中将经过高压灭菌的MS培养基冷却至35℃左右，再加入相应浓度的且经过过滤灭菌的IAA。IAA设置3个浓度梯度，分别为1mg/L、2mg/L、3mg/L。将所得的培养基依次倒入培养瓶，每个瓶中倒入大概80ml培养基。将增殖后高度达到3cm的不定芽在与愈伤组织结合处切割，所选芽连带主茎从愈伤组织切下，插入生根培养基，培养基pH值不宜超过6.5，否则不利于生根。每个培养瓶中插入三个分化芽。
待其中一种培养基中的植株生根数量及长度达到炼苗标准后，统计各生根培养基中植株的根数、根长、生根率。
平均根数＝生根总数/不定芽个数平均根长＝根总长/不定芽个数生根率＝已生根不定芽个数/不定芽总数
生根指标
| 处理 | IAA(1mg/L) | IAA(2mg/L) | IAA(3mg/L) |
| 平均根数 | 4.3b | 7.3a | 6.7a |
| 生根率(％) | 100 | 100 | 100 |
| 平均根长(cm) | 4.67b | 7.17a | 5.30b |
表9
由表9根据根数、生根率、平均根长比较的出，IAA(2mg/L)对应培养基最适合生根培养，分别是7.3根、100％、7.17cm，虽三种培养基的生根率都达到了100％，但是根长和根数却决定着移栽后植株的成活率。
基于上述，本实施例后继实验用生根培养基具体为：MS+2mg/LIAA。
5、炼苗与移栽
待植株生长高度达到8～10cm左右时，且根部较发达时，加入无菌水，在室温下炼苗2～3d后，直接栽种于营养土中。
6、嫁接方式的筛选
将培养好的接穗与砧木进行嫁接，利用劈接、贴接、套管嫁接三种嫁接方法，对嫁接后及原生植株的成活率、生长指标、根系活力等进行比较。
劈接法：将4-6片真叶的砧木离地面5cm横切，将主茎从中间劈开,深度约1cm左右。接穗苗保留2-3片真叶,上部切成双面楔形,下部用刀片切掉,然后将接穗插入砧木劈口,接牢,再夹上嫁接夹。
贴接法：将4-6片真叶的砧木离地5cm左右斜切约45°，再将2-3片真叶的接穗呈45°斜切，尽量使两植株接口大小一致，将二者贴合后，利用嫁接夹固定。套接法：将4-6片真叶的砧木离地5cm左右斜切约45°，再将2-3片真叶的接穗呈45°斜切，尽量使两植株接口大小一致，将二者贴合后，套上套管，最后将接穗与砧木对齐。
成活率＝成活苗数/嫁接苗数×100％
(嫁接后15d，待接口完全愈合后统计)
嫁接速率：同一人使用每种嫁接方法完成指定数量嫁接苗的时间
嫁接工效＝嫁接速率×嫁接成活率
不同嫁接方法对番茄嫁接功效的影响
| 嫁接方法 | 嫁接速率(株/h) | 嫁接成活率(％) | 嫁接功效 |
| 劈接 | 200.6b | 65.6b | 131.6b |
| 贴接 | 451.3a | 89.4a | 403.5a |
| 套管嫁接 | 234.6b | 44.8b | 105.1b |
表10
由上可知，贴接法为最适嫁接方法。
基于前述，本实施例得出最适番茄组培用的方法，具体为：
步骤1、选择无粘结、颗粒饱满、大小差异接近的番茄种子，低温4℃无菌水浸种12h，75％乙醇消毒5min后放入15％次氯酸钠中15min，取出冲洗后放入MS培养基内，遮光处理后放入光照培养箱，培养箱光照16h，黑暗8h，光照强度2000LX，温度26℃，待种子发芽至两片子叶完全展开之时，获得无菌苗；
步骤2、选取无菌苗子叶作为外植体切割后以背面向上的姿势放入诱导培养基内培养，将分化出不定芽的挑出作为愈伤组织；
步骤3、将愈伤组织转入增殖培养基内培养，且转入时将愈伤组织底部按入增殖培养基内培养，将愈伤组织上高度达到3cm的不定芽在其与愈伤组织结合处切割并插入生根培养基内进行培养；
步骤4、带生根培养基内植株生长高度达8～10cm时，向培养基内加入无菌水并在室温下炼苗2～3d后直接栽种于营养土中；
步骤5、采用贴接法将培养号的接穗与砧木嫁接。
其中：诱导培养基具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
增殖培养基具体为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
生根培养基具体为：MS+2mg/L IAA。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种番茄组培的方法，其特征在于，该方法具体为：
步骤1、选择无粘结、颗粒饱满、大小差异接近的番茄种子，低温4℃无菌水浸种12h，75％乙醇消毒5min后放入15％次氯酸钠中15min，取出冲洗后放入MS培养基内，遮光处理后放入光照培养箱，培养箱光照16h，黑暗8h，光照强度2000LX，温度26℃，待种子发芽至两片子叶完全展开之时，获得无菌苗，其中番茄种子型号为“毛粉812”；
步骤2、选取无菌苗子叶作为外植体切割后以背面向上的姿势放入诱导培养基内培养，将分化出不定芽的挑出作为愈伤组织；
步骤3、将愈伤组织转入增殖培养基内培养，且转入时将愈伤组织底部按入增殖培养基内培养，将愈伤组织上高度达到3cm的不定芽在其与愈伤组织结合处切割并插入生根培养基内进行培养；
步骤4、带生根培养基内植株生长高度达8～10cm时，向培养基内加入无菌水并在室温下炼苗2～3d后直接栽种于营养土中；
步骤5、采用贴接法将培养好 的接穗与砧木嫁接，其中砧木型号为“浙砧一号”；
其中：诱导培养基具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
增殖培养基具体为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA；
生根培养基具体为：MS+2mg/L IAA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2还包括对存在污染的外植体及时清理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3中生根培养基的pH值不大于6.5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，贴接法具体为：将4-6片真叶的砧木离地5cm左右斜切45°，再将2-3片真叶的接穗呈45°斜切，将二者贴合后利用嫁接夹固定。
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