WO2000000626A1 - Procede enzymatique de glucosylation de derives aromatiques par udp-glucose: glucosyl transferase - Google Patents

Procede enzymatique de glucosylation de derives aromatiques par udp-glucose: glucosyl transferase Download PDF

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WO2000000626A1
WO2000000626A1 PCT/FR1999/001547 FR9901547W WO0000626A1 WO 2000000626 A1 WO2000000626 A1 WO 2000000626A1 FR 9901547 W FR9901547 W FR 9901547W WO 0000626 A1 WO0000626 A1 WO 0000626A1
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WO
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radical
hydrogen atom
gtase
glucosylation
alkyl
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Application number
PCT/FR1999/001547
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Bernard Fritig
Patrick Saindrenan
Rachel Baltz
Julie Chong
Laurence Fraissinet-Tachet
Marie-Claire Grosjean-Cournoyer
Roland Beffa
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Aventis Cropscience S.A.
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a new enzymatic process for glucosylation of particular aromatic derivatives.
  • the present invention also relates to a process for improving the resistance of plants to pathogens, in which the enzymatic glucosylation of particular aromatic derivatives is carried out in plant cells.
  • the hypersensitivity reaction is one of the most effective induced defense response systems known in plants after aggression by a pathogen.
  • HR hypersensitivity reaction
  • This metabolism is responsible for the formation of secondary phenolic antimicrobial metabolites (phytoalexins), components of mechanical barriers (lignin), but also signaling molecules such as salicylic acid.
  • phenolic compounds exist in free or conjugated forms.
  • the conjugated forms in particular the glucosides produced under the action of glucosyltransferases (Gtases), are less reactive to cellular oxidases than the free forms (aglycones) and more soluble, and consequently, represent potentially forms transportable towards the plant walls (Whetten et al., 1998). Indeed, many hydroxycinnamic and benzoic derivatives are present in the plant walls where they provide bridging with the polysaccharide components.
  • the physical barrier represented by the wall is modified by the infiltration and the deposition in the polysaccharide matrices of these phenolic compounds which can polymerize under the action of peroxidases. This process ensures during an infection what is called parietal strengthening (crosslinking) by increasing the resistance of the walls to bacterial or fungal lysis.
  • glucosyl transferases (Gtase or GST) are known in the prior art which have the capacity to glucosylate phenolic derivatives by the creation of a glucose-phenol bond, in particular when the phenolic derivative is salicylic acid (Yalpani & al., Plant. Physiol, 1992, 100, 457-463; WO 97/45546). It is also described in the literature that enzymatic extracts from cultures of tobacco cell suspensions can catalyze the glucosylation of coumania derivatives, daphnetine or esculetine (RK (2004), 1980).
  • the present invention therefore relates to an enzymatic process for glucosylation of aromatic derivatives of general formula (I)
  • RI, R2 and R3 represent, independently of each other, a hydrogen atom, a hydroxy radical or an alkoxyl radical
  • R4 represents, an aldehyde group (-CO-H), a carboxylic acid group (- CO-OH ), or an alkoxycarbonyl radical (-CO-O-alkyl)
  • R3 and R4 which can together form an ester bond -O-CO- so as to form a 6-element ring
  • R5 represents a hydrogen atom, an alkyl radical, a hydroxyalkyl radical, an aldehyde group (-CO-H), a carboxylic acid group (- CO-OH), or an alkoxycarbonyl radical (-CO-O-alkyl), provided that when one of R4 or R5 represents a hydroxyalkyl radical, an aldehyde group (-CO-H), a carboxylic acid group (- CO-OH), or an alkoxycarbonyl radical (-CO-O-alkyl), then the other of R4 or R5 represents a hydrogen atom or an alkyl radical, and R6 represents a hydrogen atom or an alkyl radical, in which the glucosylation reaction is carried out by a GTase in an appropriate reaction medium in the presence from an appropriate glucose source, the GTase being chosen from the GTAses defined by the sequence identifiers 1 and 2, and their homologous sequences.
  • alkyl radical is preferably meant according to the invention a linear or branched C1-C6 radical, comprising the methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, pentyl radicals and hexyl.
  • the above alkyl radicals are linear or branched radicals in C1, C2 or C3, preferably the methyl radical.
  • RI represents a hydrogen atom, a hydroxy radical or a methoxy radical.
  • R2 represents a hydrogen atom or a hydroxy radical.
  • R3 represents a hydrogen atom or a hydroxy radical and R4 represents a hydroxyalkyl radical or a carboxylic acid group.
  • the aromatic derivatives of general formula (I) are more preferably chosen from the following compounds: cinnamic acid, p-coumaric acid, o-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid or coniferous alcohol.
  • the aromatic derivatives are represented by the general formula (II)
  • RI, R2 and R6 are defined above and R5 represents a hydrogen atom or an alkyl radical.
  • RI represents a hydrogen atom, a hydroxy radical or a methoxy radical.
  • R2 represents a hydroxy radical.
  • R5 and R6 represent a hydrogen atom.
  • aromatic derivatives of general formula (II) are more particularly chosen from the following compounds: scopoletin, esculetin and umbelliferone, preferably scopoletin.
  • the enzymes can be introduced into the appropriate reaction medium in any acceptable form promoting the glucosylation reaction of the process according to the invention. They can be introduced into the appropriate reaction medium in the form of a protein extract, said protein extract possibly being crude or completely or partially purified, or even produced in situ by suitable biological organisms. Suitable biological organisms can be lower, unicellular organisms, such as yeasts or bacteria, or even multicellular higher organisms such as plants.
  • the appropriate reaction medium consists of any aqueous medium whose temperature, pH and ionic strength conditions are suitable for the enzymatic reactions.
  • the reaction medium is suitable for the growth of said organism.
  • homologous sequence is meant according to the present invention any protein sequence equivalent to the proteins represented by the sequence identifiers 1 or 2, and comprising an amino acid sequence homology of at least 75%, preferably at least 85%, more preferably at least 90% of the differences between the protein sequences which do not substantially alter the function and the activity of said sequence homologous to the enzymes represented by the sequence identifiers 1 or 3.
  • glucose source any source of glucose promoting the enzymatic reaction according to the invention.
  • the glucose source consists of a sugar donor nucleotide, preferably UDP-glucose.
  • the enzymes are produced by a host organism transformed by a chimeric gene comprising a coding sequence as well as regulatory elements in the 5 ′ and 3 ′ heterologous position which can function in said host organism, the coding sequence comprising a DNA sequence coding for the enzymes useful according to the invention, including their homologs.
  • the method is carried out within a plant cell transformed with a chimeric gene ensuring the expression of the enzymes according to the invention in the cytoplasm of plant cells, the chimeric gene comprising a sequence of DNA coding for said enzymes, including their homologs, under the control of regulatory elements 5 'and 3' heterologous to the coding sequence functional in plant cells.
  • the DNA sequences coding for the enzymes according to the invention include the DNA sequences represented by the sequence identifiers 1 or 3, and the DNA sequences homologous to these sequences.
  • homologous DNA sequence a DNA fragment having one or more sequence modifications with respect to the nucleotide sequence described by the sequence identifiers No. 1 or 2 and coding for the useful enzymes to the process according to the invention. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques, or alternatively by choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. In view of the multiple combinations of nucleic acids which can lead to the expression of the same amino acid, the differences between the reference sequence described by sequence identifiers No. 1 or 2 and the corresponding homolog can be significant.
  • the degree of homology will be at least 70% relative to the reference sequence, preferably at least 80%, more preferably at least 90%. These modifications are generally neutral, that is to say that they do not affect the primary sequence of the enzymes useful according to the invention, defined by the sequence identifiers 1 or 2.
  • host organism any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of GTase.
  • host organism is meant any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of GTase.
  • bacteria for example E. coli, yeasts, in particular of the genera Saccharomyces or Kluyveromyces, Pichia, fungi, in particular Aspergillus, a bacilovirus, or preferably plant cells and plants.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, l barley, rice, sugar cane, rapeseed, soy, beet, tobacco, sunflower, cotton, etc.
  • the regulatory elements necessary for the expression of the DNA sequence coding for the enzymes according to the invention are well known to those skilled in the art depending on the host organism. They include in particular promoter sequences, transcription activators, terminator sequences, including start and stop codons. The means and methods for identifying and selecting the regulatory elements are well known to those skilled in the art.
  • the regulatory elements are well known to those skilled in the art, and in particular include promoter sequences, trancription activators, transit peptides, terminator sequences and start codons. and stop.
  • any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants can be used, in particular a promoter expressing in particular in the leaves of plants, such as for example so-called promoters of original origin.
  • bacterial, viral or vegetable or also so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit of a plant or any suitable known promoter which can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • the promoters of a plant virus gene there may be mentioned that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the circovirus promoter (AU 689 311).
  • promoter regulatory sequence specific for particular regions or tissues of plants and more particularly seed-specific promoters ([22] Datla, R. & al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269 - 296), in particular the promoters of napine (EP 255 378), of phaseoline, of glutenin, of heliantinin (WO 92/17580), of albumin (WO 98/45460), of oelosin (WO 98/45461), ATSl or 1 ⁇ TS3 (PCT / US98 / 06978, deposited on October 20, 1998, incorporated herein by reference).
  • an inducible promoter advantageously chosen from the promoters of phenylalanine ammonia lyase (PAL), of HMG-CoA reductase (HMG), of chitinases, of glucanases, of proteinase inhibitors (PI), of genes of the family.
  • PR1, nopaline synthase (nos) or the vspB gene (US 5,670,349, Table 3)
  • the HMG2 promoter US 5,670,349, Table 3
  • the HMG2 promoter US 5,670,349)
  • the apple beta-galactosidase (ABG1) promoter or the l apple cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) from apple WO 98/45445.
  • promoter regulatory sequence other regulatory sequences which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators (“enhancer”), such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington & Freed.
  • transcription activators such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington & Freed.
  • any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, of viral origin, such as for example the terminator of CaMV 35S, or of origin, may be used.
  • vegetable such as for example a histone terminator as described in application EP 0 633 317.
  • the chimeric gene can also be associated with a selection marker adapted to the transformed host organism.
  • a selection marker adapted to the transformed host organism.
  • antibiotic resistance genes there may be mentioned antibiotic resistance genes, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells.
  • herbicide tolerance genes biashos, glyphosate or isoxazoles
  • genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS
  • genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells are notably described in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • transformations are carried out in particular by the introduction of accelerated particles coated with DNA into plant cells, by the introduction of DNA into plant cells by means of agitation of the medium containing the two in the presence of needles. , by electroporation techniques or by means of appropriate Agrobacterium cells.
  • the present invention also relates to a method for improving the resistance of plants to pathogenic agents, in which the enzymatic glucosylation defined above is carried out in the plant cells of said plant, the genome of said plant cells comprising a chimeric gene defined above.
  • the chimeric gene is integrated in a stable manner into the genome of said plant cells and transmissible by sexual reproduction, in particular in a breeding and selection program for the development of commercial plants, in particular field crops.
  • Young tobacco leaves are crushed in liquid nitrogen and then the crushing continues in 1.5 ml of extraction buffer preheated to 65 ° C (0.2 M Tris-HCl; 0.2 M EDTA pH 9.0; 1.5% SDS; 10 mM ⁇ -mercaptoethanol).
  • a treatment with boiled RNase A (1 mg / ml) is carried out for 30 min at 37 ° C.
  • the samples are then incubated for 60 min at 65 ° C. in the presence of proteinase K (120 mg / ml) so as to degrade any protein.
  • the two genes gt ⁇ and gtl are constructed from the nucleotide sequences of two cDNA clones IS5a and ISlOa isolated from tobacco BY-2 cells (GenBank accession number: U 32644 and U 32643) described by Horvath and Chua (1996) and coding for homologs of plant glucosyltransferases. Comparison of the nucleotide sequences of the IS5a and IS10a cDNA clones indicates that they have a single extended reading frame and several potential translation initiation sites. The most likely translation initiation site is the first ATG.
  • the region surrounding this potential initiation codon is that which presents the most similarity with the consensus sequence of initiation of translation in plants (TAAACAAJGGCT) (Joshi, 1987).
  • the IS5a and IS10a cDNA clones have similar sizes and share a very high percentage of identity (95%). However, they are distinguished by a few nucleotide differences which create specific restriction sites for each gene. The Eco RI and Sal I sites subsequently make it possible to distinguish the two genes by restriction mapping.
  • primers also contain restriction sites at 5 'which will subsequently allow the cloning of the amplified fragments in the expression vector linearized with the same enzymes.
  • Two restriction sites recognized by the enzymes Xba I and Xho I are chosen.
  • the two primers above were obtained from the company Eurogentech, synthesized and purified according to the usual methods.
  • the DNA which serves as a matrix (from 0.2 to 2 ⁇ g) for the amplification is placed in the presence of synthetic oligonucleotides at a concentration of 0.5 ⁇ M, of dNTPs (0.2 ⁇ M each) and of 2 , 5 units of Taq polymerase (GibcoBRL).
  • the reaction is carried out in a final volume of 50 ⁇ l containing Tris-HCl (20 mM, pH 8.4), KC1 (50 ⁇ M) and MgCl2 (1.5 ⁇ M).
  • the mixture is denatured at 94 ° C for 5 minutes, it is then subjected to 30 amplification cycles under the following conditions: 1 minute of denaturation at 94 ° C, 1 minute of hybridization at 56 ° C (melting temperature of the primers reduced by 4 ° C) and one minute extension at 72 ° C.
  • the reaction is completed by a final elongation of 5 minutes at 72 ° C.
  • the amplification products are analyzed on 1% agarose gel.
  • the ligations are carried out in the vector pGEM-T (PROMEGA).
  • the following ratio is respected: 3 moles of fragment to be inserted for 1 mole of vector.
  • Ligation is carried out with 1.5 ligase units (GibcoBRL) in 20 ⁇ l of buffer (250 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25% PEG- 8006 (w / v) for 12 hours at 4 ° C.
  • the ligation material is then precipitated for 1 hour at -20 ° C. in the presence of 1.5 ⁇ l of 5M NaCl, 1 ⁇ l of glycogen and 20 ⁇ l of 100% ethanol. centrifugation for 10 min at 4 ° C. and at 13,000 rpm, the DNA pellet obtained is washed with 100 ⁇ l of 100% ethanol, " then recentrifuged as above, dried and taken up in 10 ⁇ l of water.
  • LB medium is inoculated with 10 ml of an overnight preculture of DH5a bacteria.
  • the bacteria are washed twice with water (4 ° C.), then with 20 ml of 10% glycerol and are resuspended in 2 to 3 ml of 10% glycerol, so that the concentration is 3.1 ⁇ lO bacteria / ml .
  • These bacteria are stored at - îèr ⁇ G 80 ° C in aliquoted fractions of 40 ⁇ l.
  • 1/10 of the above ligating material is mixed with 40 ⁇ l of competent bacteria, thawed in ice. After 1 min of contact at 4 ° C., the mixture is placed in a 0.2 cm electroporation tank, previously cooled in ice. This tank is placed in an electric field of 12.5 kV / cm (resistance of 200 ⁇ ) for 4-5 ms. Immediately after electrotransformation, 1 ml of LB medium is added, and the bacterial suspension is incubated for 1 h at 37 ° C.
  • the bacteria having integrated the plasmid pGEM-T containing the fragment of
  • RPCs of 1.4 kb are identified by hybridization on colonies with a probe, labeled by random priming with [ ⁇ - P] dCTP (a.s. 10 ⁇ to 10 ⁇ cpm / mg of matrix), corresponding to the RPC fragment previously amplified.
  • the genomic DNA clones obtained were then analyzed.
  • Differential digestion with the restriction enzyme Sal I shows the existence of two genes. Sal i digestion cleaves the plasmids containing the gt1 gene at one site and the plasmids containing the gt2 gene at two sites.
  • the gtl and gt2 genes are homologous to the IS5a and IS10a genes (Horvath and Chua, 1996) with the exception of three and one nucleotide (s) respectively. These differences do not affect the reading frame, but very slightly modify the amino acid composition of proteins.
  • GT1 contains the residues Phe6, Val343 and Ile363 in place of Ile6, Ile343 and Val363 encountered in the peptide sequence of IS5a while GT2 compared to the sequence of IS10a contains a residue Glu394 in place of Lys394. 4. Analysis of the protein sequences deduced from the gtl and gt2 genes
  • the protein sequences deduced from the gtl and gt2 genes show that the proteins encoded by the two genes have 94% identity and 97% similarity. They contain 476 amino acids and their calculated molecular mass is 53 kDa.
  • the other sequences have been defined as glucosyltransferases only on the basis of their sequence homology with the other genes characterized. Alignment of the deduced peptide sequences with those of other plant glucosyltransferases makes it possible to reveal a consensus region of glucosyltransferase (Hughes and Hughes, 1994), located in the C-terminal part of the protein. In fact, in this region, the percentage of similarity between the different glucosyltransferases is 60 to 70%; this region notably contains a potential domain for binding to the UDP (Hundle et al, 1992). This 49 amino acid domain is also found in mammalian UDP-glucuronosyltransferases, with which the protein sequences GT1 and GT2 share about 35% similarity in the C-terminal region.
  • the bacterial vector pGEX-KG (Pharmacia Biotech) is chosen as an expression vector for its high level of expression and because it allows the production of a fusion protein, glutathione S transferase (GTase), which can be easily purified on a column. glutathione. In addition, it has the ampicillin resistance gene allowing the use of a selective medium and the restriction sites Xba l eXXho l.
  • the oligonucleotides used for the amplification of the gtl and gt2 genes in pGEM-T also contain, at 5 ′, restriction sites recognized by the enzymes Xba I and Xho I.
  • the plasmid DNAs pGEX-KG, pGEM-GT1 and pGEM -GT2 are therefore digested by restriction endonucleases Xba I and Xho I. It is a subcloning with cohesive edges: phosphorylation is therefore not necessary.
  • the digestion efficiency of plasmids pGEM-GT1 and pGEM-GT2 was verified by analysis on agarose gel.
  • restriction fragments Xba I -Xho I corresponding to the coding region of the gtl and gt2 genes are inserted by ligation into the digested expression plasmid pGEX-KG in order to generate two expression vectors pGEX-GT1 and pGEX-GT2.
  • E. Coli DH5a bacteria After ligation, E. Coli DH5a bacteria are electro-transformed. After an overnight incubation at 37 ° C. on petri dishes containing solid LB medium supplemented with ampicillin, only the bacteria possessing the gene for resistance to ampicillin contained only in the plasmid pGEX-KG develop.
  • the bacteria having integrated the plasmid pGEX-GT1 and the plasmid pGEX-
  • GT2 containing the 1.4 Kb RPC fragments are identified by homologous hybridization with a probe labeled with [ ⁇ - 32 P] dCTP, corresponding to the fragment of
  • the plasmid DNA of the bacteria selected by homologous hybridization is extracted. Digestion with Xho I and Xba I made it possible to verify the sizes of the DNA fragments and the conservation of the restriction sites. The sequencing of the flanking parts of the inserts of the chosen clones made it possible to verify that no error was introduced during ligation in the expression vector, in particular that there was no change of frame from reading.
  • a preculture of DH5a bacteria is incubated overnight at 37 ° C. with vigorous shaking in 20 ml of LB medium supplemented with ampicillin at 100 ⁇ g / ml. Ten ml of this preculture are taken and inoculated in 100 ml of LB medium supplemented with ampicillin at 100 ⁇ g / ml. After one hour of incubation at 37 ° C under strong agitation, the OD is measured. When the OD is between 0.6 and 0.8, the culture is induced by IPTG (0.1 mM) and incubated for 10-12 hours at 18 ° C.
  • the pellet is taken up in 20 ml of PBS buffer (150 mM NaCl, 16 mM Na2HP ⁇ 4, 4 mM N ⁇ 1H2PO4) supplemented with PMSF 0.1 lmM and 10 mM DTT.
  • PBS buffer 150 mM NaCl, 16 mM Na2HP ⁇ 4, 4 mM N ⁇ 1H2PO4
  • PMSF 0.1 lmM and 10 mM DTT The bacteria are lysed with the French press and 5% glycerol are added to the lysate.
  • the lysate is centrifuged at 10,000 rpm for 20 min.
  • GTase Sepharose (50% v / v) (Pharmacia Biotech) is added to the supernatant and stirred for 30 min at room temperature.
  • the GTase Sepharose matrix is washed 5 times with 20 volumes of PBS buffer.
  • a second treatment of the supernatant with GTase Sepharose is carried out under the same conditions mentioned above.
  • the two matrix phases in the PBS buffer are treated with an endopeptidase, thrombin (1 U / ml) for 16 h at room temperature.
  • the supernatant is recovered and the matrix washed 5 times with PBS buffer.
  • the supernatants are recovered and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel (Laemmli, 1970) and by immunodetection.
  • Antibodies directed against a synthetic peptide corresponding to the C-terminal end of the protein (CTLLEDISTYSSTGH) and coupled to a pre-activated carrier (Keyhole Limpet Hemocyanin, Pierce) are previously developed.
  • the catalytic activity UDP-glucose: glucosyltransferase (GTase) of the recombinant proteins is tested against the following substrates: scopoletin, esculetin, umbelliferone, benzoic acid, salicylic acid, meta acid - hydroxybenzoic acid, para-hydroxybenzoic acid, cinnamic acid, para-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, ortho-coumaric acid, coniferyl alcohol, chlorogenic acid, tyramine and auxin.
  • substrates scopoletin, esculetin, umbelliferone, benzoic acid, salicylic acid, meta acid - hydroxybenzoic acid, para-hydroxybenzoic acid, cinnamic acid, para-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, ortho-coumaric acid, coniferyl alcohol, chlorogenic acid, tyramine and auxin.
  • the GTase activity is tested in 50 ml of reaction medium containing: - 200 ⁇ M of substrate, - 110 ⁇ M UDP-glucose (5.6 KBq UDP-D- [Ul4c] -glucose, 10.6 Gbq / mmol), - 10 ⁇ g of protein,
  • the following solvent systems are used: (I) n-butanol: acetic acid: water (4: 1: 1; v / v / v); (II) chloroform: methanol (50:50; v / v); (III) chloroform: methanol: acetic acid (75: 20: 5; v / v /).
  • the incorporation into the various substrates of radioactivity linked to UDP-D- or at [7-14c] -AS is analyzed and measured with the Bio-Imager Analyzer (Fuji XI 00 BAS 1000).
  • the results concerning the GTase activity (formation of glucose esters and glucosides) of the GT1 protein are indicated relative to the glucosylation of scopoletin (100%).
  • the reaction products are identified by co-chromatography with the reference products and according to their availability, or by mass spectrometry operating in electronic impact and chemical ionization modes.
  • GTase activity is very important on hydroxycoumarins and cinnamic derivatives, including cinnamic acid, para and ortho-coumaric acids, caffeic and ferulic acids and coniferyl alcohol, weak on benzoic derivatives (including salicylic acid).
  • Auxin, tyramine and chlorogenic acid are not substrates for the GT1 protein.
  • GT1 introduces the glucose residue of UDP-glucose onto the carboxylic or hydroxylic part of aglycones having two reactive groups, such as salicylic, p-coumaric and o-coumaric acids ( Figure 3; SA: salicylic acid; SOG, p-COG, o-COG: glucosides of p-coumaric and o-coumaric acids; SEG, p- CEG, o-CEG: glucose esters).
  • Glucose esters appear to be the predominant forms of glucosides.
  • IV Glucosyltransferases GTs and induced resistance
  • the GTs proteins according to the invention i) glucosylate very efficiently, as demonstrated above, hydroxycoumarins, such as scopoletin considered as a tobacco phytoalexin, and therefore can provide transportable forms of antimicrobial compounds to infection sites, ii) also act on hydroxycinnamic acids, which are most often found incorporated into the plant walls after infection.
  • hydroxycoumarins such as scopoletin considered as a tobacco phytoalexin
  • the complete gtl cDNA clone was integrated in sense and antisense orientation into the vector pFB8 (Atanassova et al., 1995) downstream of the CaMV 35S promoter. Constructs are sequenced to confirm their structure and the junction boundaries.
  • the different constructs, CaMV 35S promoter and gtl cDNA in sense and antisense orientation obtained previously in the plasmid pFB8, are introduced into a strain of Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM 6000) (Rossi et al., 1993) by electroporation (Nagel et al., 1990).
  • Tobacco plants (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) are transformed by the infiltration of Agrobacterium on 10-day plants (Rossi et al., 1993).
  • the plants are regenerated on the medium of Murashige and Skoog (MS) (GibcoBRL) supplemented with sucrose (15g / l), 6-benzylaminopurine (2mg / ml, Serva) and naphthalene acetic acid (0.05g / ml, Serva).
  • Kanamycin 150 mg / ml
  • Control plants were prepared by transformation with the empty vector pFB8. Twenty to 40 transformants are regenerated for each construct.
  • the transgenic tobacco plants are then transferred to the greenhouse and cultivated in the soil under a photoperiod of 16 h at 22 ° C ⁇ 2 ° C.
  • the expression of the gt1 gene was analyzed by Western blot from leaf tissues of transgenic plants having the gt1 cDNA in sense or antisense orientation under the control of the 35S promoter, under conditions of induction or not. 3.1. Leaf treatments
  • Leaf discs with a diameter of 3.5 cm are removed using a cookie cutter and the mesophyll is infiltrated with a syringe with 1 ml i) salicylic acid, inducer of the gtl gene, ii) by a solution of ⁇ -megaspermine (50 nM), a purified protein elicitor from a culture medium of Phytophthora megasperma (Kauffmann et al., 1993).
  • the discs are then placed in Petri dishes in continuous light for 10 or 16h depending on the treatments, and harvested for analysis.
  • the plants are conditioned before treatment, a few days in an air-conditioned cubicle at 22 ° C ⁇ 1 ° C, under a brightness of 5000 lux and a photoperiod of 16h.
  • the leaf tissues are then directly infiltrated on the foot with 50 nM of ⁇ -megaspermine or with water.
  • the samples (300 mg) previously frozen are ground in a mortar in 0.1M KPi buffer (0.1M KH2PO4, 0.1M K2HPO4 pH 6.0) supplemented with 0.2 mM PMSF and 10 mM DTT.
  • the ground material is centrifuged at 13000 g for 20 min.
  • the supernatant constituting the crude extract is then analyzed.
  • the protein concentration is determined by the method of Bradford (1976) using the Biorad reagent.
  • the proteins are separated by electrophoresis on polyacrylamide gel (Laemmli, 1970). After migration, the proteins are transferred in liquid medium to the transfer buffer (0.16 M Tris-Hcl-1.20 M glycine), on a PVDF nylon membrane (Immobilon, Millipore).
  • Immunodetection is carried out using antibodies directed against the GT1 protein (dilution 1/5000). The revelation is carried out by chemiluminescence using the Biorad kit. The signals are quantified by densitometry with the Mac Bas program and the values obtained are corrected by the amount of protein actually loaded on the gel.
  • the effect of the transgene is analyzed after induction of the endogenous gene by salicylic acid.
  • the expression levels of the GT1 protein are variable depending on the transformants considered and oscillate, after correction of the amount of protein deposited on the gel, between 5 and 87% compared to the control plants (transformed with the vector pFB8) ( Figure 4 ).
  • transformants carrying the constructs in direction orientation are variable depending on the transformants considered and oscillate, after correction of the amount of protein deposited on the gel, between 5 and 87% compared to the control plants (transformed with the vector pFB8) ( Figure 4 ).
  • the effect of the transgene is analyzed directly on the transformants, without prior induction.
  • the expression levels of the transgene directed by the CaMV 35S promoter are also variable depending on the transformants considered (FIG. 5A).
  • the constitutive expression of GT1 results in an accumulation of the protein 8 to 55 times greater than that observed in the control plants (transformed with the vector pFB8).
  • Scopoline is obtained enzymatically by incubating 10 ⁇ g of recombinant GTl protein in 100 mM of 0.1M KPi buffer (0.1 M KH2PO4, 0.1 M K2HPO4 pH 6.0) with 800 ⁇ M of scopoletin (Sigma) and 400 ⁇ M d 'UDP-glucose. Five hundred mg of plant material is extracted with 1 ml of 90% methanol (2X). The extract is evaporated to dryness and taken up in 200 ⁇ l of MeOH.

Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques particuliers. La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue dans les cellules végétales la glucosylation enzymatique de dérivés aromatiques particuliers.

Description

PROCEDE ENZYMATIQUE DE GLUCOSYLATION DE DERIVES AROMATIQUES PAR UDP-GLUCOSE: GLUCOSYL TRANSFERASE
La présente invention concerne un nouveau procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques particuliers. La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue dans les cellules végétales la glucosylation enzymatique de dérivés aromatiques particuliers.
La réaction d'hypersensibilité (HR) constitue l'un des systèmes de réponses de défense induites les plus efficaces connus chez les plantes, après une agression par un agent pathogène. Parmi les événements qui caractérisent l'induction de la HR, on assiste notamment à la production rapide de formes activées de l'oxygène, en particulier de peroxyde d'hydrogène, ainsi qu'à l'induction du métabolisme des phénylpropanoïdes. Ce métabolisme est à l'origine de Ta formation de métabolites secondaires phénoliques antimicrobiens (phytoalexines), de composants des barrières mécaniques (lignine), mais également de molécule de signalisation comme l'acide salicylique.
Au niveau cellulaire, les composés phénoliques existent sous formes libre ou conjuguée. Les formes conjuguées, en particulier les glucosides produits sous l'action de glucosyltransferases (Gtases), sont moins réactives aux oxydases cellulaires que les formes libres (aglycones) et plus solubles, et partant, représentent potentiellement des formes transportables vers les parois végétales (Whetten et al., 1998). En effet, de nombreux dérivés hydroxycinnamiques et benzoïques sont présents dans les parois végétales où ils assurent des pontages avec les composants polysaccharidiques. Au cours de la HR, la barrière physique que représente la paroi est modifiée par l' infiltration et le dépôt dans les matrices polysaccharidiques de ces composés phénoliques qui peuvent se polymériser sous l'action de peroxydases. Ce processus assure au cours d'une infection ce que l'on appelle le renforcement pariétal (réticulation) en augmentant la résistance des parois aux lyses bactérienne ou fongique.
On connaît dans l'état de la technique différentes glucosyl transférases (Gtase ou GST) qui ont la capacité de glucosyler des dérivés phénoliques par la création d'une liaison glucose-phénol, en particulier lorsque le dérivé phénolique est l'acide salicylique (Yalpani & al., Plant. Physiol, 1992, 100, 457-463 ; WO 97/45546). Il est également décrit dans la littérature que des extraits enzymatiques de cultures de suspensions cellulaires de tabac peuvent catalyser la glucosylation de dérivés de coumanie, daphnetine ou esculetine (R.K. Ibrahim, 1980). La possibilité de moduler la résistance des plantes aux pathogènes en surexprimant ou réprimant l'expression d'une GTase particulière de manière à moduler la glucosylation de l'acide salicylique est notamment décrite dans WO 97/45546. On a maintenant deux nouvelles GTases permettant d'effectuer la glucosylation de dérivés aromatiques particuliers, cette glucosylation intervenant sur une fonction phénolique et sur une fonction acide carboxylique ou ester. En outre, cette réaction particulière de glucosylation, lorsqu'effectuée dans des cellules végétales, permet d'améliorer la résistance aux agents pathogènes des plantes contenant lesdites cellules végétales.
La présente invention concerne donc un procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques de formule générale (I)
Figure imgf000004_0001
dans laquelle
RI, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical alkoxyle, R4 représente, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou un radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), R3 et R4 pouvant former ensemble une liaison ester -O-CO- de manière à former un cycle à 6 éléments,
R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou un radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), à la condition que lorsque l'un de R4 ou R5 représente un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), alors l'autre de R4 ou R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, et R6 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, dans lequel la réaction de glucosylation est effectuée par une GTase dans un milieu réactionnel approprié en présence d'une source de glucose appropriée, la GTase étant choisi parmi les GTAses définies par les identificateurs de séquence 1 et 2, et leurs séquences homologues.
Par radical alkyle, on entend de préférence selon l'invention un radical linéaire ou ramifé en C1-C6, comprenant les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n- butyle, i-butyle, t-butyle, pentyle et hexyle. De manière avantageuse, les radicaux alkyle ci-dessus sont des radicaux linéaires ou ramifiés en Cl, C2 ou C3, préférentiellement le radical méthyle. Cette définition s'applique également à la partie alkyle des radicaux alkoxy ou hydroxyalkyle. De manière préférentielle, RI représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy.
De manière préférentielle, R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
Selon un premier mode de réalisation préférentielle de l'invention, R3 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy et R4 représente un radical hydroxyalkyle ou un groupe acide carboxylique. Dans ce cas, les dérivés aromatiques de formule générale (I) sont plus préférentiellement choisis parmi les composés suivants : acide cinnamique, acide p-coumarique, acide o-coumarique, acide caféique, acide férulique ou alcool coniférique.
Selon un deuxième mode préférentiel de réalisation de l'invention, les dérivés aromatiques sont représentés par la formule générale (II)
Figure imgf000005_0001
dans laquelle RI, R2 et R6 sont définis précédemment et R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle.
De manière préférentielle, pour les composés de formule générale (II), RI représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy. De manière préférentielle, R2 représente un radical hydroxy. De préférence, R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène.
Les dérivés aromatiques de formule générale (II) sont plus particulièrement choisis parmi les composés suivants : scopolétine, esculetine et umbelliferone, de préférence la scopolétine.
Les enzymes peuvent être introduites dans le milieu réactionnel approprié sous toute forme acceptable favorisant la réaction de glucosylation du procédé selon l'invention. Elles peuvent être introduites dans le milieu réactionnel approprié sous forme d'extrait protéique, ledit extrait protéique pouvant être brut ou purifié totalement ou en partie, ou encore produites in situ par des organismes biologiques appropriés. Les organismes biologiques appropriés peuvent être des organismes inférieurs, unicellulaires, comme les levures ou les bactéries, ou encore des organismes supérieurs pluricellulaires comme les plantes.
Le milieu réactionnel approprié est constitué par tout milieu aqueux dont les conditions de température, de pH et de force ionique sont appropriés pour les réactions enzymatiques. Lorsque les enzymes sont produites in situ par un organisme biologique, le milieu réactionnel est approprié pour la croissance dudit organisme.
Par séquence homologue, on entend selon la présente invention toute séquence protéique équivalente aux protéines représentées par les identificateurs de séquence 1 ou 2, et comprenant une homologie de séquence en acides aminés d'au moins 75 % , préférentiellement d'au moins 85 %, plus préférentiellement d'au moins 90 % les différences entre les séquences protéiques ne venant pas altérer de manière substantielle la fonction et l'activité de ladite séquence homologue aux enzymes représentées par les identificateurs de séquence 1 ou 3.
Par source de glucose appropriée, on entend selon l'invention toute source de glucose favorisant la réaction enzymatique selon l'invention. De manière avantageuse, la source de glucose est constituée par un nucléotide donneur de sucre, préférentiellement l'UDP-glucose.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les enzymes sont produits par un organisme hôtes transformé par un gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans ledit organisme hôte, la séquence codante comprenant une séquence d'ADN codant pour les enzymes utiles selon l'invention, y compris leurs homologues.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le procédé est réalisé au sein d'une cellule végétale transformée avec un gène chimère assurant l'expression des enzymes selon l'invention dans le cytoplasme des cellules végétales, le gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour lesdites enzymes, y compris leurs homologues, sous le contrôle d'éléments de régulation en 5' et 3' hétérologues de la séquence codantes fonctionnels dans les cellules végétales.
Les séquences d'ADN codant pour les enzymes selon l'invention comprennent les séquences d'ADN représentées par les identificateurs de séquence 1 ou 3, et les séquences d'ADN homologues de ces séquences.
Par « séquence d'ADN homologue », on entend selon l'invention un fragment d'ADN présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n° 1 ou 2 et codant pour les enzymes utiles au procédé selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n° 1 ou 2 et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire des enzymes utiles selon l'invention, définies par les identificateurs de séquence 1 ou 2.
Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production de GTase. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacilovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le riz, la canne à sucre, e colza, le soja, la betterave, le tabac, le tournesol, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN codant pour les enzymes selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries, les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.
Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al, 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al, 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10 .
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).
On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ([22] Datla, R.& al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269- 296), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATSl ou de 1ΑTS3 (PCT/US98/06978, déposée le 20 octobre 1998, incorporée ici par référence).
On peut également employer un promoteur inductible avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349, Tableau 3), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la beta- galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445).
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMV 35S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Il est entendu que les techniques de transformation et de régénération des plantes est maintenant bien connue de l'homme du métier. Ces transformations sont effectuées en particulier par l'introduction de particules accélérées enrobées d'ADN dans les cellules végétales, par l'introduction de l'ADN dans les cellules végétales au moyen d'une agitation du milieu contenant les deux en présence d'aiguilles, par les techniques d' électroporation ou encore au moyen de cellules d'Agrobactérium appropriées. Ces techniques sont notamment décrites dans les brevets et demandes de brevet suivants : US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 270 615, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue la glucosylation enzymatique définie ci-dessus dans les cellules végétales de ladite plante, le génome desdites cellules végétales comprenant un gène chimère défini ci-dessus.
De manière préférentielle, le gène chimère est intégré de manière stable au génome des dites cellules végétales et transmissible par reproduction sexuée, notamment dans un programme de croisement et de sélection pour le développement de plantes commerciales, en particulier de grandes cultures..
Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention sans toutefois chercher à en limiter la portée.
METHODES ET RESULTATS I. Clonage des gènes gtl et gfl
1. Extraction d'ADN génomique
De jeunes feuilles de tabac (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont broyées dans de l'azote liquide puis le broyage se poursuit dans 1,5 ml de tampon d'extraction préchauffé à 65°C (Tris-HCl 0,2 M ; EDTA 0,2 M pH 9,0 ; SDS 1,5% ; β-mercapto- éthanol 10 mM). Un traitement à la RNase A bouillie (1 mg/ml) s'effectue 30 min à 37°C. Puis les échantillons sont incubés 60 min à 65°C en présence de protéinase K (120 mg/ml) de manière à dégrader toute protéine. Après élimination des débris cellulaires par centrifugation, deux extractions successives avec un mélange de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25 : 24 : 1) suivies de deux extractions avec un mélange de chloroforme / alcool isoamylique (24 : 1) permettent de débarrasser l'ADN des protéines. L'ADN est ensuite précipité en présence de NaCl 200 mM et d'éthanol 100% (2,5 v/v) à 4°C. Après lavage à l'éthanol 70%, les échantillons sont repris dans l'eau. 2. Amplification par RPC
Des amorces spécifiques permettant d'amplifier par RPC les deux gènes gt\ et gtl sont construites à partir des séquences nucléotidiques de deux clones d'ADNc IS5a et ISlOa isolés à partir de cellules BY-2 de tabac (GenBank numéro d'accession : U 32644 et U 32643) décrits par Horvath et Chua (1996) et codant pour des homologues de glucosyltransférases de plantes. La comparaison des séquences nucléotidiques des clones d'ADNc IS5a et ISlOa indique qu'ils possèdent un seul cadre de lecture étendu et plusieurs sites potentiels d'initiation de la traduction. Le site d'inititation de la traduction le plus probable correspond au premier ATG. En effet, la région entourant ce codon d'initiation potentiel est celle qui présente le plus de similarité avec la séquence consensus d'initiation de la traduction chez les plantes (TAAACAAJGGCT) (Joshi, 1987). De plus, les clones d'ADNc IS5a et ISlOa ont des tailles similaires et partagent un très fort pourcentage d'identité (95%). Cependant, ils se distinguent par quelques différences nucléotidiques qui créent des sites de restriction spécifiques de chaque gène. Les sites Eco RI et Sal I permettent par la suite de distinguer les deux gènes par cartographie de restriction.
Deux oligonucléotides correspondant aux sites d'initiation et de terminaison de la traduction et permettant d'amplifier les deux gènes, ont été synthétisés. Les amorces suivantes ont été utilisées :
5 ' GTCCCCCGGG TCTAGACATG GGTCAGCTCC AT TTTTC 3 ' 5 ' GCCGCTCGAG CTCTTAATGA CCAGTAGAAC TATATG 3 '
Ces amorces contiennent également en 5' des sites de restriction qui permettront ultérieurement le sous clonage des fragments amplifiés dans le vecteur d'expression linéarisé avec les mêmes enzymes. Deux sites de restriction reconnus par les enzymes Xba I et Xho I sont choisis. Les deux amorces ci-dessus ont été obtenues auprès de la société Eurogentech, synthétisées et purifiées selon les méthodes usuelles.
L'ADN qui sert de matrice (de 0,2 à 2 μg) pour l'amplification est mis en présence d'oligonucléotides de synthèse à une concentration de 0,5 μM, de dNTPs (0,2 μM chacun) et de 2,5 unités de Taq polymérase (GibcoBRL). La réaction s'effectue dans un volume final de 50 μl contenant du Tris-HCl (20 mM, pH 8,4), du KC1 (50 μM) et du MgCl2 (1,5 μM). Dans un premier temps, le mélange est dénaturé à 94°C durant 5 minutes, il est ensuite soumis à 30 cycles d'amplification dans les conditions suivantes : 1 minute de dénaturation à 94°C, 1 minute d'hybridation à 56°C (température de fusion des amorces diminuée de 4°C) et une minute d'élongation à 72°C. La réaction est achevée par une élongation finale de 5 minutes à 72°C. Les produits d'amplification sont analysés sur gel d'agarose 1%.
Un fragment de 1 ,4 kb correspondant à la taille de la région codante des gènes ciblés est amplifié dans les conditions précitées (Figure 1). 3. Clonage dans le vecteur pGEM-T et sequençage
Les ligatures se réalisent dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA). Pour la ligature, le rapport suivant est respecté : 3 moles de fragment à insérer pour 1 mole de vecteur. La ligature se réalise avec 1,5 unité de ligase (GibcoBRL) dans 20 μl de tampon (Tris-HCl 250 mM pH 7,6, MgCl2 50 mM, ATP 5 mM, DTT 5 mM, PEG- 8006 25% (p/v) durant 12 heures à 4°C. Le matériel de ligature est ensuite précipité durant 1 heure à -20°C en présence de 1,5 μl de NaCl 5M, 1 μl de glycogène et 20 μl d'éthanol 100%. Après centrifugation pendant 10 min à 4 °C et à 13000 rpm, le culot d'ADN obtenu est lavé par 100 μl d'éthanol 100%, "puis recentrifugé comme précédemment, séché et repris dans 10 μl d'eau.
Un litre de milieu LB est ensemencé avec 10 ml d'une préculture d'une nuit de bactéries DH5a. La culture bactérienne est prélevée en phase exponentielle de croissance (Dθ600nm= 0>6), mise dans la glace 30 min, puis centrifugée à 4°C pendant 15 min à 1000 g. Les bactéries sont lavées deux fois à l'eau (4°C), puis avec 20 ml de glycérol 10 % et sont resuspendues dans 2 à 3 ml de glycérol 10 %, de telle sorte que la concentration soit de 3.1θlO bactéries/ml. Ces bactéries sont stockées à - îèrπG 80°C par fractions aliquotées de 40 μl. 1/10 du matériel de ligature précité est mélangé à 40 μl de bactéries compétentes, décongelées dans la glace. Après 1 min de contact à 4°C, le mélange est placé dans une cuve d'électroporation de 0,2 cm, préalablement refroidie dans la glace. Cette cuve est placée dans un champ électrique de 12,5 kV/cm (résistance de 200 Ω) durant 4-5 ms. Immédiatement après l'électro- transformation, 1 ml de milieu LB est ajouté, et la suspension bactérienne est incubée l h à 37°C.
Les bactéries ayant intégré le plasmide pGEM-T contenant le fragment de
RPC de 1,4 kb sont identifiées par hybridation sur colonies avec une sonde, marquée par amorçage au hasard au [α- P] dCTP (a.s. 10^ à 10^ cpm/mg de matrice), correspondant au fragment de RPC précédemment amplifié. Les clones d'ADN génomique obtenus ont ensuite été analysés. Une digestion différentielle par l'enzyme de restriction Sal I montre l'existence de deux gènes. Une digestion par Sal i clive en un site les plasmides contenant le gène gtl et en deux sites les plasmides contenant le gène gt2.
Après cette identification par cartographie de restriction, un certain nombre de clones est séquence. L'extraction et la purification de l'ADN plasmidique se réalise selon la méthode employée par Sambrook et al. (1989) ou à l'aide du kit Qiagen- Tip 100 (QIAGEN). Le séquençage est réalisé grâce à la méthode du « Dye Terminator » à l'aide d'un séquenceur automatique (Perkin Elmer). Deux séquences génomiques correspondant à la région codante de deux glucosyltransférases sont identifiées. Elles sont nommées g/1 et gt2 et sont portés respectivement par les plasmides pGEM-GTl et pGEM-GT2 (SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3). Les gènes gtl et gt2 sont homologues aux gènes IS5a et ISlOa (Horvath et Chua, 1996) à l'exception de trois et un nucléotide(s) respectivement. Ces différences n'affectent pas le cadre de lecture, mais modifient très légèrement la composition en acides aminés des protéines. GT1 contient les résidus Phe6, Val343 et Ile363 à la place de Ile6, Ile343 et Val363 rencontrés dans la séquence peptidique de IS5a tandis que GT2 comparée à la séquence de ISlOa contient un résidu Glu394 à la place de Lys394. 4. Analyse des séquences protéiques déduites des gènes gtl et gt2
Les séquences protéiques déduites des gènes gtl et gt2 montrent que les protéines codées par les deux gènes possèdent 94% d'identité et 97%» de similarité. Elles comportent 476 acides aminés et leur masse moléculaire calculée est de 53 kDa.
La comparaison des séquences protéiques obtenues avec celles d'autres glucosyltransférases, montre que les produits de traduction des gènes gtl et gt2 possèdent des similarités de séquence significatives avec des glucosyltransférases de plantes. Ces enzymes catalysent le transfert d'une molécule de glucose sous la forme d'UDP-glucose sur divers substrats. Parmi ces homologues, deux gènes iaglu et bzl du maïs possèdent des activités glucosyltransférase caractérisées. Ils utilisent respectivement comme substrat l'AIA, une hormone végétale (Szerszen et al, 1994) et un flavonol, qui est un pigment dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (Furtek et al, 1988). Les autres séquences ont été définies comme glucosyltransférases uniquement sur la base de leur homologie de séquence avec les autres gènes caractérisés. L'alignement des séquences peptidiques déduites avec celles d'autres glucosyltransférases de plantes permet de révéler une région consensus de glucosyltransférase (Hughes et Hughes, 1994), localisée dans la partie C-terminale de la protéine. En effet, dans cette région, le pourcentage de similarité entre les différentes glucosyltransférases est de 60 à 70% ; cette région contient notamment un domaine potentiel de liaison à l'UDP (Hundle et al, 1992). Ce domaine de 49 acides aminés se retrouve également chez des UDP-glucuronosyltransférases de mammifères, avec lesquelles les séquences protéiques GT1 et GT2 partagent environ 35% de similarité dans la région C-terminale.
II. Expression des gènes gtl etgt2 dans E.coli
1. Sous-clonage de la région codante des gènes gtl et gt2 dans le vecteur d'expression pGEX-KG Le vecteur bactérien pGEX-KG (Pharmacia Biotech) est choisi comme vecteur d'expression pour son haut niveau d'expression et parce qu'il permet la production d'une protéine de fusion, la glutathion S transférase (GTase) facilement purifiable sur colonne de glutathion. De plus, il possède le gène de résistance à l'ampicilline permettant l'utilisation d'un milieu sélectif et les sites de restriction Xba l eXXho l.
Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification des gènes gtl et gt2 dans pGEM-T contiennent également en 5' des sites de restriction reconnus par les enzymes Xba I et Xho I. Après extraction, les ADN plasmidiques pGEX-KG, pGEM- GT1 et pGEM-GT2 sont donc digérés par les endonucléases de restriction Xba I et Xho I. Il s'agit d'un sous clonage à bords cohésifs : la phosphorylation n'est donc pas nécessaire. L'efficacité de la digestion des plasmides pGEM-GTl et pGEM-GT2 a été vérifiée par analyse sur gel d'agarose. Après prélèvement des bandes d'ADN sur gel d'agarose et purification, les fragments de restriction Xba I -Xho I correspondant à la région codante des gènes gtl et gt2 sont insérés par ligature dans le plasmide d'expression pGEX-KG digéré afin de générer deux vecteurs d'expression pGEX- GTl et pGEX-GT2.
Après ligature, des bactéries E. Coli DH5a sont électro-transformées. Après une nuit d'incubation à 37°C sur boîtes de Pétri contenant du milieu LB solide suplémenté par de l'ampicilline, seules les bactéries possédant le gène de résistance à l'ampicilline contenu uniquement dans le plasmide pGEX-KG se développent.
2. Criblage des bactéries transformées
Les bactéries ayant intégrées le plasmide pGEX-GTl et le plasmide pGEX-
GT2 contenant les fragments de RPC de 1,4 Kb sont identifiées par hybridation homologue avec une sonde marquée au [α- 32 P] dCTP, correspondant au fragment de
RPC précédemment amplifié. Sept clones positifs ont été obtenus pour pGEX-GTl
(nommés 711, 712, 713, 721,722, 723, 73) et trois pour pGEX-GT2 (nommés 141,
142, 143). L'ADN plasmidique des bactéries sélectionnées par hybridation homologue est extrait. La digestion par Xho I et Xba I a permis de vérifier les tailles des fragments d'ADN et la conservation des sites de restriction. Le séquençage des parties flanquantes des inserts des clones choisis a permis de vérifier qu'aucune erreur ne s'est introduite lors de la ligature dans le vecteur d'expression, en particulier qu'il n'y a pas eu de changement de trame de lecture.
3. Purification des protéines fusion
Une préculture de bactéries DH5a est incubée pendant une nuit à 37°C sous forte agitation dans 20 ml de milieu LB supplémenté d'ampicilline à 100 μg/ml. Dix ml de cette préculture sont prélevés et inoculés dans 100 ml de milieu LB supplémentée d'ampicilline à 100 μg/ml. Après une heure d'incubation à 37°C sous forte agitation, la DO est mesurée. Lorsque la DO est comprise entre 0,6 et 0,8, la culture est induite par de l'IPTG (0,1 mM) et incubée pendant 10-12 heures à 18°C. Après centrifugation pendant 20 min à 5000 rpm, le culot est repris dans 20 ml de tampon PBS (NaCl 150 mM, Na2HPθ4 16 mM, NΣ1H2PO4 4 mM) supplémenté de PMSF 0,lmM et de DTT 10 mM. Les bactéries sont lysées à la presse de French et 5% de glycérol sont ajoutés au lysat. Après lh d'agitation à température ambiante, le lysat est centrifugé à 10000 rpm pendant 20 min. Le surnageant est additionné de GTase Sépharose (50% v/v) (Pharmacia Biotech) et mis en agitation pendant 30 min à température ambiante. Après centrifugation à 500 rpm pendant 30 secondes, la matrice GTase Sépharose est lavée 5 fois avec 20 volumes de tampon PBS. Un deuxième traitement du surnageant par la GTase Sépharose est effectué dans les même conditions précitées. Les deux phases de matrices dans le tampon PBS sont traitées par une endopeptidase, la thrombine (1 U/ml) pendant 16h à température ambiante. Le surnageant est récupéré et la matrice lavée 5 fois par le tampon PBS.
Les surnageants sont récupérés et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Laemmli, 1970) et par immunodétection. Des anticorps dirigés contre un peptide de synthèse correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéine (CTLLEDISTYSSTGH) et couplé à un porteur préactivé (Keyhole Limpet Hemocyanin, Pierce) sont préalablement élaborés.
Les résultats obtenus montrent qu'au moins deux clones (clones 711 et 141) sur les quatre testés produisent une protéine d'environ 79 kDa. La protéine de fusion est induite très fortement par l'IPTG (Figure 2A). Après clivage par la thrombine et purification sur GTase Sépharose, deux bandes majeures sont observées en SDS- PAGE (Figure 2B). L'une correspond à la GTase (26 kDa) et l'autre à la protéine GT (53 kDa) immunodétectée par l'antisérum précité. Des anticorps dirigés contre la protéine GT1 sont ainsi élaborés.
III. Analyses de l'activité catalytique et de la spécificité de substrat des protéines GT1 et GT2
L'activité catalytique UDP-glucose : glucosyltransférase (GTase) des protéines recombinantes est testée à l'encontre des substrats suivants : la scopolétine, l'esculétine, l'ombelliférone, l'acide benzoïque, l'acide salicylique, l'acide méta- hydroxybenzoïque, l'acide para-hydroxybenzoïque, l'acide cinnamique, l'acide para- coumarique, l'acide caféique, l'acide férulique, l'acide ortho-coumarique, l'alcool coniférylique, l'acide chlorogénique, la tyramine et l'auxine. Pour tous ces substrats, à l'exception de l'acide salicylique, l'activité GTase est testée dans 50 ml de milieu réactionnel contenant : - 200 μM de substrat, - 110 μM UDP-glucose (5,6 KBq UDP-D-[Ul4c]-glucose, 10,6 Gbq/mmole), - 10 μg de protéine,
- dans un tampon tampon KPi 0,1 M (KH2PO4 0,1 M, K2HPO4 0,1 M pH 6,0).
En revanche, vis-à-vis de l'acide salicylique, l'activité GTase est testée dans 50 μl de milieu réactionnel contenant :
- 180 μM d'acide salicylique (18,4KBq [7-14C]-AS, 20,5 Gbq/mmole),
- 200μM UDP-glucose, - 10 mg de protéine,
- dans le tampon KPi 0,1M (KH2PO4 0,1M, K2HPO4 0,1M pH 6,0).
La réaction s'effectue à 30°C et est arrêtée par l'addition de 50 μl de méthanol. Après centrifugation à 13000 rpm pendant 5min, le surnageant est déposé sur plaque chromatographique en couche mince de gel de silice avec indicateur de fluorescence (λ=254nm). Les systèmes de solvants suivants sont utilisés : (I) n-butanol : acide acétique : eau (4 : 1 : 1 ; v/v/v); (II) chloroforme : méthanol (50 : 50 ; v/v); (III) chloroforme : méthanol : acide acétique (75 : 20 : 5 ; v/v/). Après migration, l'incorporation dans les différents substrats de la radioactivité liée à l'UDP-D-
Figure imgf000015_0001
ou à l'[7-14c]-AS est analysée et mesurée au Bio-Imager Analyser (Fuji XI 00 BAS 1000). Les résultats concernant l'activité GTase (formation des esters de glucose et des glucosides) de la protéine GTl sont indiqués par rapport à la glucosylation de la scopolétine (100%). Les produits de la réaction sont identifiés par co-chromatographie avec les produits de références et selon leur disponibilité, ou par spectométie de masse opérant en modes d'impact électronique et de ionisation chimique.
L'activité GTase est très importante sur les hydroxycoumarines et les dérivés cinnamiques, dont l'acide ci namique, les acides para et ortho-coumarique, les acides caféique et férulique et l'alcool coniférylique, faible sur les dérivés benzoïques (dont l'acide salicylique). L'auxine, la tyramine et l'acide chlorogénique ne sont pas des substrats pour la protéine GTl. Ces résultats indiquent que la protéine GTl catalyse essentiellement le transfert d'une molécule de glucose sur les hydroxycoumarines et les acides (hydroxy)cinnamiques. Les mêmes valeurs relatives d'activité GTase vis-à- vis de la scopolétine et de l'acide salicylique sont obtenues avec la protéine GT2. De plus, GTl introduit le résidu glucose de l'UDP-glucose sur la partie carboxylique ou hydroxylique des aglycones ayant deux groupements réactifs, comme les acides salicylique, p-coumarique et o-coumarique (Figure 3 ; SA : acide salicylique ; SOG, p-COG, o-COG : glucosides des acides p-coumarique et o-coumariques; SEG, p- CEG, o-CEG : esters de glucose). Les esters de glucose semblent être les formes prédominantes des glucosides. IV. Les glucosyltransférases GTs et la résistance induite
Les protéines GTs selon l'invention i) glucosylent très efficacement, comme démontré ci-dessus, des hydroxycoumarines, comme la scopolétine considérée comme une phytoalexine du tabac, et donc peuvent fournir des formes transportables de composés antimicrobiens aux sites d'infection, ii) agissent également sur les acides hydroxycinnamiques, que l'on retrouve le plus souvent incorporés aux parois végétales après infection. L'implication des gènes gts selon l'invention dans les modifications métaboliques associées à la résistance est ci-après précisé par une approche de transgenèse sur le tabac en introduisant le gène gtl en orientation sens et antisens sous la dépendance du promoteur 35S du CaMV.
1. Construction du vecteur binaire
Le clone complet d'ADNc de gtl a été intégré en orientation sens et antisens dans le vecteur pFB8 (Atanassova et al., 1995) en aval dû promoteur 35S du CaMV. Les construits sont séquences pour confirmer leur structure et les frontières de jonction.
2. Transformation des plantes et régénération
Les différents construits, promoteur 35S du CaMV et ADNc de gtl en orientation sens et antisens obtenus précédemment dans le plasmide pFB8, sont introduits dans une souche d'Agrobactérium tumefaciens GV3101 (pPM 6000) (Rossi et al., 1993) par électroporation (Nagel et al., 1990). Les plants de tabac (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont transformés par l'infiltration d'Agrobactérium sur des plants de 10 jours (Rossi et al., 1993). Les plantes sont régénérées sur le milieu de Murashige et Skoog (MS) (GibcoBRL) supplémenté avec du saccharose (15g/l), de la 6-benzylaminopurine (2mg/ml, Serva) et de l'acide naphthalène acétique (0,05g/ml, Serva). La kanamycine (150 mg/ml) est employée comme agent de sélection durant les étapes de régénération in vitro et de propagation. Des plantes témoins ont été préparées par transformation avec le vecteur vide pFB8. Vingt à 40 transformants sont régénérés pour chaque construit. Les plants de tabac transgéniques sont ensuite transférés en serre et cultivés en sol sous une photopériode de 16h à 22°C±2°C.
3. Analyse de l 'expression du gène gtl dans les tabacs transgéniques
L'expression du gène gtl a été analysée par Western-blot à partir de tissus foliaires des plantes transgéniques possédant l'ADNc de gtl en orientation sens ou antisens sous le contrôle du promoteur 35S, en conditions d'induction ou non. 3.1. Traitements des feuilles
Des disques foliaires d'un diamètre de 3,5 cm sont prélevés à l'aide d'un emporte-pièce et le mésophylle est infiltré avec une seringue par 1 ml i) d'acide salicylique, inducteur du gène gtl, ii) par une solution de β-mégaspermine (50 nM), un éliciteur protéique purifié d'un milieu de culture de Phytophthora megasperma (Kauffmann et al., 1993). Les disques sont ensuite placés dans des boîte de Pétri en lumière continue pendant 10 ou 16h selon les traitements, et récoltés pour être analysés. Dans certains cas, les plantes sont conditionnées avant le traitement, quelques jours dans une logette climatisée à 22°C±1°C, sous une luminosité de 5000 lux et une photopériode de 16h. Les tissus foliaires sont alors directement infiltrés sur pied par 50 nM de β-mégaspermine ou par de l'eau.
3.2. Extraction, séparation sur gel de polyacrylamide dénaturé, transfert et immunodétection des protéines
Les échantillons (300 mg) préalablement congelés sont broyés dans un mortier dans du tampon KPi 0,1M (KH2PO4 0,1M, K2HPO4 0,1M pH 6,0) supplémenté de PMSF 0,2 mM et de DTT 10 mM. Le broyât est centrifugé à 13000 g pendant 20 min. Le surnageant constituant l'extait brut est alors analysé. La concentration des protéines est déterminée par la méthode de Bradford (1976) à l'aide du réactif Biorad. La séparation des protéines est effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Laemmli, 1970). Après migration, les protéines sont transférées en milieu liquide dans le tampon de transfert (0,16 M Tris-Hcl-1,20 M glycine), sur membrane nylon PVDF (Immobilon, Millipore). L'immunodétection est réalisée grâce à des anticorps dirigés contre la protéine GTl (dilution 1/5000). La révélation est effectuée par chimioluminescence à l'aide du kit Biorad. Les signaux sont quantifiés par densitométrie avec le programme Mac Bas et les valeurs obtenues sont corrigées de la quantité de protéines réellement chargée sur le gel.
3.3. Niveau d'expression de GTl dans les transformants a) transformants portant les construits en orientation antisens
L'effet du transgène est analysé après induction du gène endogène par l'acide salicylique. Les niveaux d'expression de la protéine GTl sont variables selon les transformants considérés et oscillent, après correction de la quantité de protéines déposée sur le gel, entre 5 et 87 % par rapport aux plantes témoins (transformées avec le vecteur pFB8) (Figure 4). b) transformants portant les construits en orientation sens
L'effet du transgène est analysé directement sur les transformants, sans induction préalable. Les niveau d'expression du transgène dirigé par le promoteur 35S du CaMV sont également variables selon les transformants considérés (Figure 5A). Afin de quantifier les modifications des niveaux d'expression de GTl, ont été représentés les facteurs d'expression qui correspondent aux rapports des niveaux observés dans les plantes transformées et dans les plantes témoins (facteur d'expression relatif = 1) (Figure 5B). L'expression constitutive de GTl entraîne une accumulation de la protéine de 8 à 55 fois supérieure à celle observée dans les plantes témoins (transformées avec le vecteur pFB8). V. Effet des transgènes
Les variations du pool des composés phénoliques solubles, en particulier celui de la scopolétine (une phytoalexine et l'un des meilleurs substrats de GTl) et de la scopoline (le glucoside, produit de la réaction), ont été analysées à partir de tissus foliaires des plantes transgéniques possédant l'ADNc de gtl en orientation sens ou antisens sous le contrôle du promoteur 35S, après lOh ou 16h d'induction par la β- mégaspermine (50 nM). 4.1 Analyse de la scopolétine et de la scopoline par CLHP
La scopoline est obtenue enzymatiquement en incubant 10 μg de protéine recombinante GTl dans 100 mM de tampon KPi 0,1M (KH2PO4 0,1M, K2HPO4 0,1 M pH 6,0) avec 800 μM de scopolétine (Sigma) et 400 μM d'UDP-glucose. Cinq cent mg de matériel végétal sont extraits avec 1ml de méthanol 90% (2X). L'extrait est évaporé à sec et repris par 200 μl de MeOH. L'analyse par CLHP est réalisée sur une colonne Cl 8 Nova Pak (Waters) en utilisant un gradient de CH3CN (A) dans du tampon NaH2PO4 25mM pH 3 (B), avec un débit de 1 ml/min. Le gradient varie de 5% à 22% (A) pendant 35 min et ensuite de 22% à 80% (A) pendant 1 min. La scopolétine et la scopoline sont détectées by fluorescence (lex 290 nm, 1 em 402 nm). 4.2. Niveaux de scopolétine et de scopoline dans les transformants
Bien que les niveaux de scopolétine soient relativement élevés chez les plantes témoins (ce qui se traduit par une non élicitabilité apparente de certaines plantes témoins par la β-mégaspermine), ceux observés chez les transformants possédant le construit en orientation antisens sont globalement plus faibles (Figure 6A). La diminution de la quantité de scopolétine reflète peut-être le fait que ce composé, lorsqu'il n'est pas protégé des oxydases cellulaires par la glucosylation, est rapidemment dégradé.
Chez les transformants possédant le construit en orientation sens, ainsi que chez les plantes témoins, les quantité de scopolétine sont faibles et les différences observées ne semblent pas significatives (Figure 6B). En revanche et paradoxalement, les quantités de scopoline détectées chez ces transformants sont diminuées par rapport aux plantes témoins (Figure 6C). Cette apparente contradiction est explicable par le fait que la surexpression de la protéine GTl entraîne transitoirement une production accrue de scopoline (forme transportable) qui est rapidemment dirigée vers la paroi végétale où elle subit une hydrolyse sous l'action de β-glucosidases. L'aglycone formé, la scopolétine, est alors lui-même transformé (oxydation, polymérisation).
Ces résultats montrent que le produit du gène gtl a un impact direct sur les événements métaboliques associés à la résistance induite en intervenant dans la voie des phénylpropanoïdes, métabolisme majeur associé à la résistance des plantes aux microorganismes pathogènes. Références
Atanassova R., Favet N., Martz F., Chabbert B., Thollier M.-T., Monties B., Fritig. et
Legrand M. (1995) : Altered lignin composition in transgenic tobacco expressing O- methyltransferase séquences in sensé and antisense orientation. Plant J. 8, 465-477.
Bradford M.M. (1976) : A rapide and sensitive method for the quantification of microgram quantifies of protein utilising the principle of protein-dye binding, Anal.
Biochem. 72, 248-254.
Furtek D., Schiefelbein J.W., Johnston F. et Nelson O.E. (1988) : Séquence comparisons of three wild-type Bronze-1 alleles from Zea mays. Plant Mol. Biol. 11,
473-481.
Horvath D.M. et Chua N.H. (1996) : Identification of an immediate-early salicylic acid-inducible tobacco gène and characterization of induction by other compounds.
Plant Mol. Biol. 31, 1061-1072.
Hugues J. et Hugues M. A. (1994) : Multiple secondary plant product UDP-glucose glucosyltransférase gènes expressed in cassava (Manihot esculenta Crantz) cotylédons. DNA Sequence-The Journal of Sequencing and Mapping 5, 41-49.
Hundles B.S., O'Brien D.A., Alberti M., Beyer P. et Hearst J.E. (1992) : Functional expression of zeaxanthin glucosyltransférase from Erwinia herbicola and a proposed uridine diphosphate binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9321-9325.
Ibrahim R.K. (1980) : Position specificity of an o-dihydrocoumarin glucosyltrasferase from tobacco cell suspenssion culture. Phytochemistry 19, 2459-
2460.
Joshi C. (1987) : An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant gènes. Nucl. Ac. Res. 15, 6643-6652.
Laemmli U.K. (1970) : Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriphage T4. Nature 227, 680-685.
Kauffmann S., Baillieul F., Genetet I., Kopp M. and Fritig B. (1993) : Two proteins secreted by Phytophthora megasperma elicit defense-related responses in tobacco. In:
Mechanism of plant défense responses (B.Fritig and M. Legrand Eds), Kluwer
Académie Publishers, Dordrecht, 140-143.
Nagel R., Eliott A., Masel A., Birch R.G. et Manners J.M. (1990) : Electroporation of binary Ti plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FEMS Microbiol. Lett. 67, 325-328.
Rossi L., Escudero J., Hohn B. et Tinland B. (1993) : Efficient and sensitive assay for
T-DNA dépendant transient gène expression. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 220-229.
Sambrook J., Fritsch E.F. et Maniatis T. (1989) : Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. Szerszen J.B., Szczyglowski K. et Bandurski R.B. (1994) : iaglu, a gène from Zea mays involved in conjugation of growth hormone Indole-3-Acetic Acid. Science 265,
1699-1702.
Whetten, R.W., MacKay, J.J. et Seseroff, R.R. (1998) : Récent advances in understanding Iignin biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 585-
609.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques de formule générale (I)
Figure imgf000021_0001
dans laquelle
RI, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical alkoxyle, R4 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou un radical alkoxycarbonule (-CO-O-alkyle), R3 et R4 pouvant former ensemble une liaison ester -O-CO- de manière à former un cycle à 6 éléments,
R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou un radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), à la condition que lorsque l'un de R4 ou R5 représente un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (- CO-OH), ou radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), alors l'autre de R4 ou R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, et R6 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, dans lequel la réaction de glucosylation est effectuée par une GTase dans un milieu réactionnel approprié en présence d'une source de glucose appropriée, la GTase étant choisi parmi les GTase définies par les identificateurs de séquence 1 et 3, et leurs séquences homologues.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que RI représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R3 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy et R4 représente un radical hydroxyalkyle ou un groupe acide carboxylique.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les dérivés aromatiques de formule générale (I) sont choisis parmi les composés suivants : acide cinnamique, acide p-coumarique, acide o-coumarique, acide caféique, acide férulique ou alcool coniférique.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les dérivés aromatiques sont représentés par la formule générale (II)
Figure imgf000022_0001
dans laquelle RI, R2 et R6 sont définis précédemment et R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que RI représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que R2 représente un radical hydroxy.
9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène.
10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que les dérivés aromatiques de formule générale (II) sont choisis parmi les composés suivants : scopolétine, exculétine et umbelliferone.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la GTase est introduite dans le milieu réactionnel approprié sous forme d'extrait protéique, ledit extrait protéique pouvant être brut ou purifié totalement ou en partie, ou encore produites in situ par des organismes biologiques appropriés.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le milieu réactionnel approprié est constitué par tout milieu aqueux dont les conditions de température, de pH et de force ionique sont appropriés pour les réactions enzymatiques.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la source de glucose est constituée par un nucléotide donneur de sucre, préférentiellement l'UDP-glucose.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la GTase est produite par un organisme hôtes transformé par un gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans ledit organisme hôte, la séquence codante comprenant une séquence d'ADN codant pour la GTase.
15. Procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, caractérisé en ce que l'on effectue la glucosylation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 14 dans les cellules végétales de ladite plante, le génome desdites cellules végétales comprenant ungène chimère selon la revendication 14.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le gène chimère est intégré de manière stable au génome des dites cellules végétales et transmissible par reproduction sexuée, notamment dans un programme de croisement et de sélection pour le développement de plantes commerciales, en particulier de grandes cultures.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi le maïs, le blé, l'orge, le riz, la canne à sucre, le colza, le soja, le riz, la betterave, le tabac, le tournesol et le coton.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1072684A1 (fr) * 1999-02-16 2001-01-31 Suntory Limited Genes codant des proteines ayant une activite de transfert de sucre sur l'aurone
WO2001059140A1 (fr) * 2000-02-09 2001-08-16 The University Of York Cellules transgeniques exprimant des acides nucleiques de glucosyltransferase
EP1510573A1 (fr) * 2003-09-01 2005-03-02 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Méthode pour la détoxification de mycotoxines
CN113073112A (zh) * 2021-04-30 2021-07-06 华中农业大学 一种用植物介导crispr技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045546A1 (fr) * 1996-05-31 1997-12-04 The University Of York Utilisation d'une nouvelle glycosyltransferase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045546A1 (fr) * 1996-05-31 1997-12-04 The University Of York Utilisation d'une nouvelle glycosyltransferase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HORVATH D M ET AL: "IDENTIFICATION OF AN IMMEDIATE-EARLY SALICYLIC ACID-INDUCIBLE TOBACCO GENE AND CHARACTERIZATION OF INDUCTION BY OTHER COMPUNDS", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 31, August 1996 (1996-08-01), pages 1061 - 1072, XP002043265 *
IBRAHIM R K: "Position specificity of an o-dihydroxycoumarin glucosyltransferase from tobacco cell suspension culture", PHYTOCHEMISTRY, vol. 19, 10 November 1980 (1980-11-10), pages 2459 - 2460, XP002098093 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1072684A1 (fr) * 1999-02-16 2001-01-31 Suntory Limited Genes codant des proteines ayant une activite de transfert de sucre sur l'aurone
EP1072684A4 (fr) * 1999-02-16 2004-11-17 Suntory Ltd Genes codant des proteines ayant une activite de transfert de sucre sur l'aurone
WO2001059140A1 (fr) * 2000-02-09 2001-08-16 The University Of York Cellules transgeniques exprimant des acides nucleiques de glucosyltransferase
US7335814B2 (en) 2000-02-09 2008-02-26 The University Of York Transgenic cells expressing glucosyltransferase nucleic acids
EP1510573A1 (fr) * 2003-09-01 2005-03-02 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Méthode pour la détoxification de mycotoxines
WO2005021740A1 (fr) * 2003-09-01 2005-03-10 Universität Für Bodenkultur Wien Methode de detoxication de mycotoxines
CN113073112A (zh) * 2021-04-30 2021-07-06 华中农业大学 一种用植物介导crispr技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法

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