FR2780415A1 - Procede enzymatique de glucosylation de derives aromatiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques particuliers. La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue dans les cellules végétales la glucosylation enzymatique de dérivés aromatiques particuliers.

Description

Procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques La présente

invention concerne un nouveau procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques particuliers. La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue dans les cellules végétales la glucosylation enzymatique de

dérivés aromatiques particuliers.

On connaît dans l'état de la technique différentes glycosyl transférases (GST) qui ont la capacité de glucosyler des dérivés phénoliques par la création d'une liaison glucose-phénol, en particulier lorsque le dérivé phénolique est l'acide salicylique

(Yalpani & al., Plant. Physiol., 1992, 100, 457-463; WO 97/45546).

On a maintenant deux nouvelles GST permettant d'effectuer la glucosylation de dérivés aromatiques particuliers, cette glucosilation n'intervenant pas sur une fonction phénolique, mais sur une fonction acide carboxylique, ester ou hydroxyle non aromatique. En outre, cette réaction particulière de glucosylation, lorsqu'effectuée dans des cellules végétales, permet d'améliorer la résistance aux agents pathogènes des

plantes contenant lesdites cellules végétales.

La présente invention concerne donc un procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques de formule générale (I) R6

RI. . R5

(1) R4

R2 R3

dans laquelle R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical alkoxyle, R4 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical

hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-

CO-OH), ou un radical alkoxycarbonule (-CO-O-alkyle), R3 et R4 pouvant former ensemble une liaison ester -O-CO- de manière à former un cycle à 6 éléments, R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical

hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-

CO-OH), ou un radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), à la condition que lorsque l'un de R4 ou R5 représente un radical hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-CO-OH), ou radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), alors l'autre de R4 ou R5 représente un

2 2780415

atome d'hydrogène ou un radical alkyle, et R6 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, dans lequel la réaction de glucosylation est effectuée par une GST dans uin milieu réactionnel approprié en présence d'une source de glucose appropriée, la GST étant choisi parmi les GST définies par les identificateurs de séquence 1 et 2, et leurs

séquences homologues.

Par radical alkyle, on entend de préférence selon l'invention un radical linéaire

ou ramifé en Cl-C6, comprenant les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-

butyle, i-butyle, t-butyle, pentyle et hexyle. De manière avantageuse, les radicaux alkyle ci-dessus sont des radicaux linéaires ou ramifiés en Cl, C2 ou C3, préférentiellement le radical méthyle. Cette définition s'applique également à la partie

alkyle des radicaux alkoxy ou hydroxyalkyle.

De manière préférentielle, RI représente un atome d'hydrogène, un radical

hydroxy ou un radical méthoxy.

De manière préférentielle, R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy. Selon un premier mode de réalisation préférentielle de l'invention, R3 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy et R4 représente un radical hydroxyalkyle ou un groupe acide carboxylique. Dans ce cas, les dérivés aromatiques de formule (générale (I) sont plus préférentiellement choisis parmi les composés suivants: acide cinnamique, acide p-coumarique, acide o-coumarique, acide caféique, acide férulique ou

alcool coniférique.

Selon un deuxième mode préférentiel de réalisation de l'invention, les dérivés aromatiques sont représentés par la formule générale (II) R6

RI R5

R2 0 0

dans laquelle RI, R2 et R6 sont définis précédemment et R5 représente un atome

d'hydrogène ou un radical alkyle.

De manière préférentielle, pour les composés de formule générale (II), Rl représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy. De manière préférentielle, R2 représente un radical hydroxy. De préférence, R5 et R6

représentent un atome d'hydrogène.

Les dérivés aromatiques de formule générale (II) sont plus particulièrement

choisis parmi les composés suivants: scopolétine, exculétine et umbelliferone.

Les enzymes peuvent être introduites dans le milieu réactionnel approprié sous toute tforme acceptable favorisant la réaction de glucosylation du procédé selon l'invention. Elles peuvent être introduites dans le milieu réactionnel approprié sous forme d'extrait protéique, ledit extrait protéique pouvant être brut ou purifié totalement ou en partie, ou encore produites in situ par des organismes biologiques appropriés. Les organismes biologiques appropriés peuvent être des organismes inférieurs, unicellulaires, comme les levures ou les bactéries, ou encore des organismes supérieurs

pluricellulaires comme les plantes.

Le milieu réactionnel approprié est constitué par tout milieu aqueux dont les conditions de température, de pH et de force ionique sont appropriés pour les réactions enzymatiques. Lorsque les enzymes sont produites in situ par un organisme biologique,

le milieu réactionnel est approprié pour la croissance dudit organisme.

Par séquence homologue, on entend selon la présente invention toute séquence protéique équivalente aux protéines représentées par les identificateurs de séquence 1 ou 2, et comprenant une homologie de séquence en acides aminés d'au moins 75 %, préférentiellement d'au moins 85 %, plus préférentiellement d'au moins 90 % les différences entre les séquences protéiques ne venant pas altérer de manière substantielle la fonction et l'activité de ladite séquence homologue aux enzymes représentées par les

identificateurs de séquence 1 ou 3.

Par source de glucose appropriée, on entend selon l'invention toute source de glucose favorisant la réaction enzymatique selon l'invention. De manière avantageuse, la source de glucose est constituée par un nucléotide donneur de sucre,

préférentiellement l'UDP-glucose.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les enzymes sont produits par un organisme hôtes transformé par un gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans ledit organisme hôte, la séquence codante comprenant une séquence d'ADN codant pour les enzymes utiles selon l'invention, y compris leurs homologues. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le procédé est réalisé au sein d'une cellule végétale transformée avec un gène chimère assurant l'expression des enzymes selon l'invention dans le cytoplasme des cellules végétales, le gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour lesdites enzymes, y compris leurs homologues, sous le contrôle d'éléments de régulation en 5' et 3' hétérologues de la

séquence codantes fonctionnels dans les cellules végétales.

Les séquences d'ADN codant pour les enzymes selon l'invention comprenent les séquences d'ADN représentées par les identificateurs de séquence I ou 3, et les

séquences d'ADN homologues de ces séquences.

4 2780415

Par <" séquence d'ADN homologue ", on entend selon l'invention un fragment d'ADN présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n 1 ou 2 et codant pour les enzymes utiles au procédé selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n 1 ou 2 et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire des enzymes utiles selon

l'invention, définies par les identificateurs de séquence 1 ou 2.

Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la

production de GST. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures.

en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacilovirus, ou de préférence des cellules végétales et

des plantes.

Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus

différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc. Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN codant pour les enzymes selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de

régulation sont bien connus de l'homme du métier.

Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries, les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de

transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.

Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21. pp 15-24 et Michaut et al., 1996. FEBS Letters, 395, pp 6-10. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaiïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur

d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV)

décrit par Carrington & Freed.

Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tume/aciens. ou encore d'origine végétale, comme par

exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes. Il est entendu que les techniques de transformation et de régénération des plantes est maintenant bien connue de l'homme du métier. Ces transformations sont effectuées en particulier par l'introduction de particules accélérées enrobées d'ADN dans les cellules végétales, par l'introduction de l'ADN dans les cellules végétales au moyen d'une agitation du milieu contenant les deux en présence d'aiguilles, par les techniques d'électroporation ou encore au moyen de cellules d'Agrobactérium appropriées. Ces techniques sont notamment décrites dans les brevets et demandes de brevet suivants:

US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159,

EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5, 371,014,

US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US

6 2780415

,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5, 405,765,

EP 270 615, EP 442 174. EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO

91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également un procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, dans lequel on effectue la glucosylation enzymatique définie ci-dessus dans les cellules végétales de ladite plante, lesdites

cellules étant transformées par l'introduction d'un gène chimère défini ci-dessus.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention sans toutefois

chercher à en limiter la portée.

METHODES ET RESULTATS

I. Clonage des gènes gtl et gt2 1. Extraction d'4DNgénomique De jeunes feuilles de tabac (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) sont broyées dans de l'azote liquide puis le broyage se poursuit dans 1,5 ml de tampon d'extraction

préchauffé à 65 C (Tris-HCI 0,2 M; EDTA 0,2 M pH 9,0; SDS 1,5%; B13mercapto-

éthanol 10 mM). Un traitement à la RNase A bouillie (1 mg/ml) s'effectue 30 min à 37 C. Puis les échantillons sont incubés 60 min à 65 C en présence de protéinase K (120 mg/ml) de manière à dégrader toute protéine. Après élimination des débris cellulaires par centrifugation, deux extractions successives avec un mélange de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1) suivies de deux extractions avec un mélange de chloroforme / alcool isoamylique (24: 1) permettent de débarrasser l'ADN des protéines. L'ADN est ensuite précipité en présence de NaCI 200 mM et d'éthanol % (2,5 v/v) à 4 C. Après lavage à l'éthanol 70%, les échantillons sont repris dans

l'eau.

2. A.mplification par RPC Des amorces spécifiques permettant d'amplifier par RPC les deux gènes gtl et gt2 sont construites à partir des séquences nucléotidiques de deux clones d'ADNc IS5a et ISO10a isolés à partir de cellules BY-2 de tabac (GenBank numéro d'accession: U 32644 et U 32643) décrits par Horvath et Chua (1996) et codant pour des homologues de glucosyltransférases de plantes. La comparaison des séquences nucléotidiques des clones d'ADNc IS5a et IS10a indique qu'ils possèdent un seul cadre de lecture étendu et plusieurs sites potentiels d'initiation de la traduction. Le site d'inititation de la traduction le plus probable correspond au premier ATG. En effet, la région entourant ce codon d'initiation potentiel est celle qui présente le plus de similarité avec la séquence consensus d'initiation de la traduction chez les plantes (TAAACAATGGCT) (Joshi, 1987). De plus, les clones d'ADNc IS5a et ISlOa ont des tailles similaires et partagent un très fort pourcentage d'identité (95%). Cependant, ils se distinguent par quelques différences nucléotidiques qui créent des sites de restriction spécifiques de chaque gène. Les sites Eco RI et Sal I permettent par la suite de distinguer les deux gènes par

cartographie de restriction.

Deux oligonucléotides correspondant aux sites d'initiation et de terminaison de la traduction et permettant d'amplifier les deux gènes, ont été synthétisés. Les amorces suivantes ont été utilisées

' GTCCCCCGGG TCTAGACATG GGTCAGCTCC ATWTTTTC 3'

' GCCGCTCGAG CTCTTAATGA CCAGTAGAAC TATATG 3'

Ces amorces contiennent également en 5' des sites de restriction qui permettront ultérieurement le sous clonage des fragments amplifiés dans le vecteur d'expression linéarisé avec les mêmes enzymes. Deux sites de restriction reconnus par les enzymes Xba I et Xho I sont choisis. Les deux amorces ci-dessus ont été obtenues

auprès de la société Eurogentech, synthétisées et purifiées selon les méthodes usuelles.

L'ADN qui sert de matrice (de 0,2 à 2 ptg) pour l'amplification est mis en présence d'oligonucléotides de synthèse à une concentration de 0,5 tM, de dNTPs (0,2 15.iM chacun) et de 2,5 unités de Taq polymérase (GibcoBRL). La réaction s'effectue dans un volume final de 50 pIl contenant du Tris-HCl (20 mM, pH 8,4), du KCI (50 pM) et du MgC12 (1,5 jM). Dans un premier temps. le mélange est dénaturé à 94 C durant 5 minutes, il est ensuite soumis à 30 cycles d'amplification dans les conditions suivantes: 1 minute de dénaturation à 94 C. 1 minute d'hybridation à 56 C (température de fusion des amorces diminuée de 4 C) et une minute d'élongation à 72 C. La réaction est achevée par une élongation finale de 5 minutes à 72 C. Les

produits d'amplification sont analysés sur gel d'agarose 1%.

Un fragment de 1,4 kb correspondant à la taille de la région codante des gènes

ciblés est amplifié dans les conditions précitées (Figure 1).

3. Clonage dans le vecteur pGEM-T et sequençage Les ligatures se réalisent dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA). Pour la ligature, le rapport suivant est respecté 3 moles de fragment à insérer pour 1 mole de vecteur. La ligature se réalise avec 1,5 unité de ligase (GibcoBRL) dans 20 p.l de

tampon (Tris-HCl 250 mM pH 7,6, MgC12 50 mM, ATP 5 mM, DTT S mM, PEG-

8006 25% (p/v) durant 12 heures à 4 C. Le matériel de ligature est ensuite précipité durant 1 heure à -20 C en présence de 1,5 pi de NaCI SM, 1 gl de glycogène et 20 p.l d'éthanol 100%. Après centrifugation pendant 10 min à 4 C et à 13000 rpm, le culot d'ADN obtenu est lavé par 100 pil d'éthanol 100%, puis recentrifugé comme

précédemment, séché et repris dans 10 pIl d'eau.

Un litre de milieu LB est ensemencé avec 10 ml d'une préculture d'une nuit de bactéries DH5a. La culture bactérienne est prélevée en phase exponentielle de croissance (DO600nm= 0,6), mise dans la glace 30 min, puis centrifugée à 4 C pendant min à 1000 g. Les bactéries sont lavées deux fois à l'eau (4 C), puis avec 20 ml de

8 2780415

glycérol 10 % et sont resuspendues dans 2 à 3 ml de glycérol 10 %, de telle sorte que la concentration soit de 3.1010 bactéries/ml. Ces bactéries sont stockées à -80 C par jème fractions aliquotées de 40 pl. 1/10ime du matériel de ligature précité est mélangé à 40 Al de bactéries compétentes, décongelées dans la glace. Après 1 min de contact à 4 C, le mélange est placé dans une cuve d'électroporation de 0,2 cm, préalablement refroidie dans la glace. Cette cuve est placée dans un champ électrique de 12,5 kV/cm (résistance de 200 Q) durant 4-5 ms. Immédiatement après l'électro-transformation, 1

ml de milieu LB est ajouté, et la suspension bactérienne est incubée 1 h à 37 C.

Les bactéries ayant intégré le plasmide pGEM-T contenant le fragment de RPC de 1,4 kb sont identifiées par hybridation sur colonies avec une sonde, marquée par amorçage au hasard au [c- 32p] dCTP (a.s. 108 à 109 cpm/mg de matrice), correspondant au fragment de RPC précédemment amplifié. Les clones d'ADN génomique obtenus ont ensuite été analysés. Une digestion différentielle par l'enzyme de restriction Sal I montre l'existence de deux gènes. Une digestion par Sal I clive en un site les plasmides contenant le gène gtl et en deux sites les plasmides contenant le

gène gt2.

Après cette identification par cartographie de restriction, un certain nombre de clones est séquencé. L'extraction et la purification de l'ADN plasmidique se réalise

selon la méthode employée par Sambrook et al. (1989) ou à l'aide du kit Qiagen-

Tip 100 (QIAGEN). Le séquençage est réalisé grâce à la méthode du " Dye Terminator" à l'aide d'un séquenceur automatique (Perkin Elmer). Deux séquences génomrniques correspondant à la région codante de deux glucosyltransférases sont identifiées. Elles sont nommées gtl et gt2 et sont portés respectivement par les plasmides pGEM-GTI et pGEM-GT2 (SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3). Les gènes gtl et gt2 sont homologues aux gènes IS5a et IS1Oa (Horvath et Chua, 1996) à l'exception de trois et un nucléotide(s) respectivement. Ces différences n'affectent pas le cadre de

lecture, mais modifient très légèrement la composition en acides aminés des protéines.

GT1 contient les résidus Phe6, Val343 et Ile363 à la place de Ile6, Ile343 et Val363 rencontrés dans la séquence peptidique de IS5a tandis que GT2 comparée à la séquence

de IS 1 Oa contient un résidu Glu394 à la place de Lys394.

4. Analyse des séquences protéiques déduites des gènes gt] et gt2 Les séquences protéiques déduites des gènes gtl et gt2 montrent que les

protéines codées par les deux gènes possèdent 94% d'identité et 97% de similarité.

Elles comportent 476 acides aminés et la masse moléculaire calculée est de 53 kDa.

La comparaison des séquences protéiques obtenues avec celles d'autres glucosyltransférases, montre que les produits de traduction des gènes gtl et gt2 possèdent des similarités de séquence significatives avec des glucosyltransférases de plantes. Ces enzymes catalysent le transfert d'une molécule de glucose sous la forme d'UDP-glucose sur divers substrats. Parmi ces homologues, deux gènes iaglu et b7l du maïs possèdent des activités glucosyltransférase caractérisées. Ils utilisent respectivement comme substrat l'AIA. une hormone végétale (Szerszen et al, 1994) et un flavonol, qui est un pigment dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (Furtek et al., 1988). Les autres séquences ont été définies comme glucosyltransférases uniquement sur la base de leur homologie de séquence avec les autres gènes caractérisés. L'alignement des séquences peptidiques déduites avec celles d'autres glucosyltransférases de plantes permet de révéler une région consensus de glucosyltransférase (Hughes et Hughes, 1994), localisée dans la partie C-terminale de la protéine. En effet, dans cette région, le pourcentage de similarité entre les différentes glucosyltransférases est de 60 à 70% cette région contient notamment un domaine potentiel de liaison à l'UDP (Hundle et al., 1992). Ce domaine de 49 acides aminés se retrouve également chez des UDP-glucuronosyltransférases de mammifères, avec lesquelles les séquences protéiques GTl et GT2 partagent environ 35% de similarité

dans la région C-terminale.

Il. Expression des gènes gtl et gt2 dans E.coli 1. Sous-clonage de la région codante des gènes gt] et gt2 dans le vecteur d'expression pGEX-KG Le vecteur bactérien pGEX-KG (Pharmacia Biotech) est choisi comme vecteur d'expression pour son haut niveau d'expression et parce qu'il permet la production d'une protéine de fusion, la glutathion S transférase (GST) facilement purifiable sur colonne de glutathion. De plus, il possède le gène de résistance à l'ampicilline permettant l'utilisation d'un milieu sélectif et les sites de restriction Xba I et Xho I. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification des gènes gtl et gt2 dans pGEM-T contiennent également en 5' des sites de restriction reconnus par les enzymes Xba I et Xho I. Après extraction, les ADN plasmidiques pGEX-KG, pGEM-GT1 et pGEM-GT2 sont donc digérés par les endonucléases de restriction Xba I et Xho I. Il

s'agit d'un sous clonage à bords cohésifs: la phosphorylation n'est donc pas nécessaire.

L'efficacité de la digestion des plasmides pGEM-GTI et pGEM-GT2 a été vérifiée par analyse sur gel d'agarose. Après prélèvement des bandes d'ADN sur gel d'agarose et purification, les fragments de restriction Xba I Xho I correspondant à la région codante des gènes gtl et gt2 sont insérés par ligature dans le plasmide d'expression

pGEX-KG digéré afin de générer deux vecteurs d'expression pGEX-GTI et pGEX-

GT2.

Après ligature, des bactéries E. Coli DH5a sont électro-transformées. Après une nuit d'incubation à 37 C sur boîtes de Pétri contenant du milieu LB solide suplémenté par de l'ampicilline, seules les bactéries possédant le gène de résistance à l'ampicilline

contenu uniquement dans le plasmide pGEX-KG se développent.

1 0 2780415

2. Criblage cles bactéries transfirmées Les bactéries ayant intégrées le plasmide pGEX-GTI et le plasmide pGEX-GT2 contenant les fragments de RPC de 1,4 Kb sont identifiées par hybridation homologue avec une sonde marquée au [c-3' 2P] dCTP, correspondant au fragment de RPC précédemment amplifié. Sept clones positifs ont été obtenus pour pGEX- GT1 (nommés

711, 712, 713, 721,722, 723, 73) et trois pour pGEX-GT2 (nommés 141, 142, 143).

L'ADN plasmidique des bactéries sélectionnées par hybridation homologue est extrait.

La digestion par Xho I et Xba I a permis de vérifier les tailles des fragments d'ADN et la conservation des sites de restriction. Le séquençage des parties flanquantes des inserts des clones choisis a permis de vérifier qu'aucune erreur ne s'est introduite lors de la ligature dans le vecteur d'expression, en particulier qu'il n'y a pas eu de

changement de trame de lecture.

3. Purification des protéines fusion Une préculture de bactéries DH5a est incubée pendant une nuit à 37 C sous forte agitation dans 20 ml de milieu LB supplémenté d'ampicilline à 100 ag/ml. Dix ml de cette préculture sont prélevés et inoculés dans 100 ml de milieu LB supplémentée d'ampicilline à 100 gtg/ml. Après une heure d'incubation à 37 C sous forte agitation, la DO est mesurée. Lorsque la DO est comprise entre 0,6 et 0,8, la culture est induite par de l'IPTG (0,1 mM) et incubée pendant 10-12 heures à 18 C. Après centrifugation pendant 20 min à 5000 rpm, le culot est repris dans 20 ml de tampon PBS (NaCI mM, Na2HPO4 16 mM, NaH2PO4 4 mM) supplémenté de PMSF 0,1 mM et de DTT 10 mM. Les bactéries sont lysées à la presse de French et 5% de glycérol sont ajoutés au lysat. Après lh d'agitation à température ambiante, le lysat est centrifugé à 10000 rpm pendant 20 min. Le surnageant est additionné de GST Sépharose (50% v/v) (Pharmacia Biotech) et mis en agitation pendant 30 min à température ambiante. Après centrifugation à 500 rpm pendant 30 secondes, la matrice GST Sépharose est lavée 5 fois avec 20 volumes de tampon PBS. Un deuxième traitement du surnageant par la GST Sépharose est effectué dans les même conditions précitées. Les deux phases de matrices dans le tampon PBS sont traitées par une endopeptidase, la thrombine (1 U/ml) pendant 16h à températureambiante. Le surnageant est récupéré et la matrice

lavée 5 fois par le tampon PBS.

Les surnageants sont récupérés et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Laemmli, 1970) et par immunodétection. Des anticorps dirigés contre un peptide de synthèse correspondant à l'extrémité Cterminale de la protéine (CTLLEDISTYSSTGH) et couplé à un porteur préactivé (Keyhole Limpet

Hemocyanin, Pierce) sont préalablement élaborés.

Les résultats obtenus montrent qu'au moins deux clones (clones 711 et 141) sur les quatre testés produisent une protéine d'environ 79 kDa. La protéine de fusion est induite très fortement par l'IPTG (Figure 2A). Après clivage par la thrombine et purification sur GST Sépharose, deux bandes majeures sont observées en SDS-PAGE (Figure 2B). L'une correspond à la GST (26 kDa) et l'autre à la protéine GT (53 kDa)

immunodétectée par l'antisérum précité.

III. Analyses de l'activité catalytique et de la spécificité de substrat des protéines GT1 et GT2 L'activité catalytique UDP-glucose: glucosyltransférase (GT) des protéines recombinantes est testée à l'encontre des substrats suivants: la scopolétine, l'esculétine, l'ombelliférone, l'acide benzoïque, l'acide salicylique, l'acide métahydroxybenzoïque, l'acide para-hydroxybenzoïque, l'acide cinnamique, l'acide para-coumarique, l'acide caféique, l'acide férulique, l'acide ortho-coumarique, l'alcool coniférylique, l'acide chlorogénique, la tyramine et l'auxine. Pour tous ces substrats, à l'exception de l'acide salicylique, l'activité GTase est testée dans 50 ml de milieu réactionnel contenant: - 200 piM de substrat, - 110 jtM UDP-glucose (5,6 KBq UDP-D-[U14C]-glucose, 10.6 Gbq/mmole)? - 10 ig de protéine,

- dans un tampon tampon KPi 0,1M (KH2PO4 0, l M, K2HPO4 0, 1M pH 6,0).

En revanche, vis-à-vis de l'acide salicylique, l'activité GTase est testée dans 1tl de milieu réactionnel contenant: - 180 ptM d'acide salicylique (18,4KBq [7-14C]-AS, 20,5 Gbq/mmole), - 200pM UDP-glucose, - 10 mg de protéine,

- dans le tampon KPi 0,lM (KH2PO4 0,1M, K2HPO4 0,1M pH 6,0).

La réaction s'effectue à 30 C et est arrêtée par l'addition de 50 ptl de méthanol.

Après centrifugation à 13000 rpm pendant 5min, le surnageant est déposé sur plaque chromatographique en couche mince de gel de silice avec indicateur de fluorescence (X=254nm). Les systèmes de solvants suivants sont utilisés: (I) n-butanol: acide acétique: eau (4: 1: 1; v/v/v); (II) chloroforme: méthanol (50: 50; v/v); (III) chloroforme: méthanol: acide acétique (75: 20: 5; v/v/). Après migration,

l'incorporation dans les différents substrats de la radioactivité liée à l'UDP-D-[U14C]-

glucose ou à 1'[7-14C]-AS est analysée et mesurée au Bio-Imager Analyser (Fuji X100 BAS 1000). Les résultats concernant l'activité GTase (formation des esters de glucose et des glucosides) de la protéine GT1 sont indiqués par rapport à la glucosylation de la scopolétine (100%). Les produits de la réaction sont identifiés par co-chromatographie avec les produits de références et selon leur disponibilité, ou par spectométie de masse

opérant en modes d'impact électronique et de ionisation chimique.

1 2 2780415

L'activité GTase est très importante sur les hydroxycoumnarines et les dérivés cinnamiques, dont l'acide cinnamique, les acides para et orthocoumarique, les acides caféique et férulique et l'alcool conitférylique, tfaible sur les dérivés benzoïques (dont l'acide salicylique). L'auxine, la tyramine et l'acide chlorogénique ne sont pas des substrats pour la protéine GTI. Ces résultats indiquent que la protéine GT1 catalyse essentiellement les hydroxycoumarines et les acides (hydroxy)cinnamiques. Les mêmes valeurs relatives d'activité GTase vis-à-vis de la scopolétine et de l'acide salicylique sont obtenues avec la protéine GT2. De plus, GTI introduit le résidu glucose de l'UDP-glucose sur la partie carboxylique ou hydroxylique des aglycones

ayant deux groupements réactifs, comme les acides salicylique, pcoumarique et o-

coumarique (Figure 3; SA: acide salicylique; SOG, p-COG, o-COG: acides p-

coumarique, o-coumariques et leurs glucosides correspondants; SEG, p-CEG, o-CEG: esters de glucose). Les esters de glucose semblent être les formes prédominantes des glucosides. Références Furtek D., Schiefelbein J.W., Johnston F. et Nelson O.E. (1988): Sequence comparisons of three wild-type Bronze-i alleles from Zea mays. Plant Mol. Biol. 11,

473-481.

Horvath D.M. et Chua N.H. (1996): Identification of an immediate-early salicylic

acid-inducible tobacco gene and characterization of induction by other compounds.

Plant Mol. Biol. 31, 1061-1072.

Hugues J. et Hugues M.A. (1994): Multiple secondary plant product UDPglucose

glucosyltransferase genes expressed in cassava (llanihot esculenta Crantz) cotyledons.

DNA Sequence-The Journal of Sequencing and Mapping 5, 41-49.

Hundles B.S., O'Brien D.A., Alberti M., Beyer P. et Hearst J.E. (1992): Functional expression of zeaxanthin glucosyltransferase from Erwinia herbicola and a proposed

uridine diphosphate binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 93219325.

Joshi C. (1987): An inspection of the domain between putative TATA box and

translation start site in 79 plant genes. Nucl. Ac. Res. 15, 6643-6652.

Laemmli U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriphage T4. Nature 227, 680-685.

Sambrook J., Fritsch E.F. et Maniatis T. (1989): Molecular cloning: a laboratory

manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY.

Szerszen J.B., Szczyglowski K. et Bandurski R.B. (1994): iaglu, a gene from Zea mays involved in conjugation of growth hormone Indole-3-Acetic Acid. Science 265,

1699-1702.

13 2780415

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1428 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:l..1428

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

ATG GGT CAG CTC CAT TTT TTC TTC TTT CCT GTG ATG GCT CAT GGC CAC 48

Met Gly Gln Leu His Phe Phe Phe Phe Pro Val Met Ala His Gly His

1 5 10 15

ATG ATT CCT ACA CTA GAC ATG GCG AAG CTC TTT GCT TCA CGT GGT GTT 96

Met Ile Pro Thr Leu Asp Met Ala Lys Leu Phe Ala Ser Arg Gly Val

25 30

AAG GCC ACT ATA ATC ACA ACC CCA CTC AAT GAA TTC GTT TTC TCC AAA 144

Lys Ala Thr Ile Ile Thr Thr Pro Leu Asn Glu Phe Val Phe Ser Lys

40 45

GCT ATT CAA AGA AAC AAG CAT TTG GGT ATC GAA ATC GAA ATC CGT TTG 192

Ala Ile Gln Arg Asn Lys His Leu Gly Ile Glu Ile Glu Ile Arg Leu

55 60

ATC AAA TTC CCA GCT GTT GAA AAC GGC TTA CCT GAA GAA TGC GAA CGC 240

Ile Lys Phe Pro Ala Val Glu Asn Gly Leu Pro Glu Glu Cys Glu Arg

70 75 80

CTC GAT CAA ATC CCT TCA GAT GAG AAG CTC CCA AAC TTT TTC AAA GCT 288

Leu Asp Gln Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro Asn Phe Phe Lys Ala

90 95

GTA GCT ATG ATG CAA GAA CCA CTA GAA CAG CTT ATT GAA GAA TGT CGC 336

Val Ala Met Met Gln Glu Pro Leu Glu Gln Leu Ile Glu Glu Cys Arg

105 110

CCC GAT TGT CTT ATT TCA GAT ATG TTC CTT CCT TGG ACT ACT GAT ACT 384

Pro Asp Cys Leu Ile Ser Asp Met Phe Leu Pro Trp Thr Thr Asp Thr

120 125

GCA GCA AAA TTT AAC ATT CCA AGA ATA GTC TTT CAT GGC ACA AGC TTC 432

Ala Ala Lys Phe Asn Ile Pro Arg Ile Val Phe His Gly Thr Ser Phe

135 140

TTT GCT CTT TGT GTT GAG AAT AGC GTC AGG CTA AAT AAG CCT TTC AAG 480

Phe Ala Leu Cys Val Glu Asn Ser Val Arg Leu Asn Lys Pro Phe Lys

150 155 160

AAT GTG TCC TCA GAT TCT GAA ACT TTT GTT GTA CCG GAT TTG CCT CAC 528

Asn Val Ser Ser Asp Ser Glu Thr Phe Val Val Pro Asp Leu Pro His

170 175

GAA ATT AAG CTG ACC AGA ACC CAG GTG TCT CCG TTT GAG CGA TCT GGG 576

Glu Ile Lys Leu Thr Arg Thr Gln Val Ser Pro Phe Glu Arg Ser Gly

185 190

GAA GAG ACG GCT ATG ACC CGG ATG ATA AAA ACA GTC AGG GAA TCA GAT 624

Glu Glu Thr Ala Met Thr Arg Met Ile Lys Thr Vai Arg Glu Ser Asp

200 205

TCA AAG AGC TAT GGA GTT GTT TTC AAC AGT TTC TAT GAG CTT GAA ACA 672

Ser Lys Ser Tyr Gly Val Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Leu Glu Thr

210 215 220

GAT TAT GTT GAG CAT TAT ACT AAG GTG CTG GGT AGA AGA GCT TGG GCT 720

Asp Tyr Val Glu His Tyr Thr Lys Val Leu Gly Arg Arg Ala Trp Ala

225 230 235 240

ATT GGC CCT CTA TCG ATG TGC AAC AGG GAC ATT GAA GAT AAA GCT GAA 768

Ile Gly Pro Leu Ser Met Cys Asn Arg Asp Ile Glu Asp Lys Ala Glu

245 250 255

AGA GGA AAG AAA TCC TCT ATT GAT AAA CAC GAG TGC TTG AAA TGG CTT 816

Arg Gly Lys Lys Ser Ser Ile Asp Lys His Glu Cys Leu Lys Trp Leu

260 265 270

GAT TCG AAG AAA CCA AGT TCC GTC GTT TAC GTT TGT TTT GGA AGC GTA 864

Asp Ser Lys Lys Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Cys Phe Gly Ser Val

275 280 285

GCG AAT TTC ACT GCA TCA CAA CTG CAC GAA CTT GCT ATG GGA ATT GAA 912

Ala Asn Phe Thr Ala Ser Gln Leu His Glu Leu Ala Met Gly Ile Glu

290 295 300

GCT TCC GGA CAA GAA TTC ATT TGG GTT GTT AGA ACA GAA CTA GAC AAC 960

Ala Ser Gly Gln Glu Phe Ile Trp Val Val Arg Thr Glu Leu Asp Asn

305 310 315 320

GAA GAT TGG TTG CCT GAA GGA TTC GAG GAA AGA ACG AAA GAG AAA GGT 1008

Glu Asp Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg Thr Lys Glu Lys Gly

325 330 335

TTA ATA ATA AGA GGA TGG GCA CCC CAA GTA CTA ATT CTT GAT CAC GAA 1056

* Leu Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Asp His Glu

340 345 350

TCT GTG GGA GCT TTT GTT ACA CAT TGT GGT TGG AAT TCA ACA CTA GAA 1104

Ser Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu

355 360 365

GGA GTT TCA GGA GGG GTT CCA ATG GTA ACA TGG CCT GTA TTT GCT GAG 1152

Gly Val Ser Gly Gly Val Pro Met Val Thr Trp Pro Val Phe Ala Glu

370 375 380

CAA TTT TTC AAT GAG AAG TTA GTG ACT GAG GTT TTG AAA ACT GGA GCT 1200

Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Thr Glu Val Leu Lys Thr Gly Ala

385 390 395 400

GGT GTT GGT TCG ATA CAA TGG AAG AGA TCA GCT AGT GAA GGA GTG AAA 1248

Gly Val Gly Ser Ile Gln Trp Lys Arg Ser Ala Ser Glu Gly Val Lys

405 410 415

AGA GAA GCA ATA GCT AAG GCA ATA AAG AGA GTA ATG GTG AGT GAA GAA 1296

Arg Glu Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Arg Val Met Val Ser Glu Glu

420 425 430

GCA GAT GGA TTC AGA AAC AGA GCT AAA GCG TAT AAG GAG ATG GCA AGA 1344

Ala Asp Gly Phe Arg Asn Arg Ala Lys Ala Tyr Lys Glu Met Ala Arg

435 440 445

2780415

AAG GCT ATT GAA GAA GGA GGG TCA TCT TAC ACT GGA TTG ACT ACT TTG 1392

Lys Ala Ile Glu Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Gly Leu Thr Thr Leu

450 455 460

TTG GAA GAT ATA AGT ACA TAT AGT TCC ACT GGT CAT 1428

Leu Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Gly His

465 470 475

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 476 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: liné,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Gly Gln Leu His Phe Phe Phe Phe Pro Val Met Ala His Gly His

1 5 10 15

Met Ile Pro Thr Leu Asp Met Ala Lys Leu Phe Ala Ser Arg Gly Val

25 30

Lys Ala Thr Ile Ile Thr Thr Pro Leu Asn Glu Phe Val Phe Ser Lys

40 45

Ala Ile Gln Arg Asn Lys His Leu Gly Ile Glu Ile Glu Ile Arg Leu

55 60

Ile Lys Phe Pro Ala Val Glu Asn Gly Leu Pro Glu Glu Cys Glu Arg

70 75 80

Leu Asp Gln Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro Asn Phe Phe Lys Ala

90 95

Val Ala Met Met Gln Glu Pro Leu Glu Gln Leu Ile Glu Glu Cys Arg

105 110

Pro Asp Cys Leu Ile Ser Asp Met Phe Leu Pro Trp Thr Thr Asp Thr

120 125

Ala Ala Lys Phe Asn Ile Pro Arg Ile Val Phe His Gly Thr Ser Phe

135 140

Phe Ala Leu Cys Val Glu Asn Ser Val Arg Leu Asn Lys Pro Phe Lys

150 155 160

Asn Val Ser Ser Asp Ser Glu Thr Phe Val Val Pro Asp Leu Pro His

170 175

Glu Ile Lys Leu Thr Arg Thr Gln Val Ser Pro Phe Glu Arg Ser Gly

185 190

Glu Glu Thr Ala Met Thr Arg Met Ile Lys Thr Val Arg Glu Ser Asp

200 205

Ser Lys Ser Tyr Gly Val Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Leu Glu Thr

210 215 220

Asp Tyr Val Glu His Tyr Thr Lys Val Leu Gly Arg Arg Ala Trp Ala

225 230 235 240

Ile Gly Pro Leu Ser Met Cys Asn Arg Asp Ile Glu Asp Lys Ala Glu

245 250 255

16 2780415

Arg Gly Lys Lys Ser Ser Ile Asp Lys His Glu Cys Leu Lys Trp Leu

260 265 270

Asp Ser Lys Lys Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Cys Phe Gly Ser Val

275 280 285

Ala Asn Phe Thr Ala Ser Gln Leu His Glu Leu Ala Met Gly Ile Glu

290 295 300

Ala Ser Gly Gln Glu Phe Ile Trp Val Val Arg Thr Glu Leu Asp Asn

305 310 315 320

Glu Asp Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg Thr Lys Glu Lys Gly

325 330 335

Leu Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Asp His Glu

340 345 350

Ser Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu

355 360 365

Gly Val Ser Gly Gly Val Pro Met Val Thr Trp Pro Val Phe Ala Glu

370 375 380

Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Thr Glu Val Leu Lys Thr Gly Ala

385 390 395 400

Gly Val Gly Ser Ile Gln Trp Lys Arg Ser Ala Ser Glu Gly Val Lys

405 410 415

Arg Glu Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Arg Val Met Val Ser Glu Glu

420 425 430

Ala Asp Gly Phe Arg Asn Arg Ala Lys Ala Tyr Lys Glu Met Ala Arg

435 440 445

Lys Ala Ile Glu Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Gly Leu Thr Thr Leu

450 455 460

Leu Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Gly His

465 470 475

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1428 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:l..1428

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

ATG GGT CAG CTC CAT TTT TTC TTC TTT CCT GTG ATG GCT CAT GGC CAC 48

Met Gly Gln Leu His Phe Phe Phe Phe Pro Val Met Ala His Gly His

1 5 10 15

ATG ATT CCT ACG CTA GAC ATG GCC AAG CTC GTT GCT TCA CGT GGA GTT 96

Met Ile Pro Thr Leu Asp Met Ala Lys Leu Val Ala Ser Arg Gly Val

25 30

AAG GCC ACT ATA ATC ACA ACC CCA CTC AAT GAA TCC GTT TTC TCC AAA 144

Lys Ala Thr Ile Ile Thr Thr Pro Leu Asn Glu Ser Val Phe Ser Lys

40 45

OZ8EC SIE OIE S0E

usV dsW nel nID C lL Bav ieA ITA dal @II atd nhid uIc AIC aS lIV 096 DVV DVC VJD VfúD VDV VEN LIC ICS SDL LIV DLi VffC VD VDD LDL IDD

00ú 96Z 06Z

niC @II ÀIC qaN IV ner nhId STH naq ulT 3aS eV e aqIL qd usl IV Z16 Vlf 1iV VCC DIJV JDS DLD WED DVD SID VVD VDL VDD IDV DiL LVV SDD

58Z Z08Z SLZ

IeA;S AID Gqd SAD ILA XI leIA ILA aGS IGS Oad sA' sAr aS dsV t,98 VI DCV ODD LLL IDI LIS DVI LLS DLi DDI LCv VDD twV Dv DDI IVE

OLZ S9Z 09Z

nM dL SAir nrI sAD nIC STH sA' dsV GîI ass aS uIr sk AID IV5 918 IID SSI VVV SLL DSL CV) D)D VVV IVC IIV IDL DDI fVVD CWff CCD VDE sSSZ OSZ, StIF nID Me sArI dsv nhiC TI dsV B6V usV sAD qgW TaS nar oad AITD II 89L VfC iDD VV IVC V'C 1IV DVD CVD DVV DSL Div DDL LID VDD DSS jIV

O0PZ SúZ 0ú7 SZE

-ep daI piV Siv BLV LIC n5 ITeA sAl Xqi AjI STH nl I TA XiL dsV OZL LIDS Ci IDS LDS VCV ICC CiLD DIE VV ' iLDV LVL LVD VVE iLL IVL IVC sTH nhI naq nhi us- 94d aS usv aqd GII eA AID AL aS srI xaS ZL9 IVD VVC LLID CLV 'vV DiLi lV DVV D.LL DLV 11 VDC DIL DCE CVV VDI

S0 00 561

dsV.azs nie L1 leA a GS sAr alI DaN Eau al4I 1N aMLi aili nlC nlC

I7E9 IVC VDL 1VV CCV D.LC VDI VVE VIV DV CCSD DDV CLV LDV VDV CVE VVC

061 s8T 081 AID eS UID niD eiqd oad aS nar ulD a-q LIv xqI nar sr aII nhI 9L9 CSCC SS DL VVD CEV Iii CDD IDI DII DVD DDV VCV DDV i Vv iSiL V VC

SLI OLI S9I

STH odi n@q usV od TeA ieA eqd aLi nie aS dsV aS iaS TeA usV 8z DVD IDD CLD iVLf DD VIEC LID III IDV VfC IDI IVD LDiL DDI DiL LVf

091 S1 01ST S9T

sArjq qd oad sAri usV naq aV elI aS usV nId TleA sAD naq eiV aqd 08o CVV Dii LDD CVV iLtf VLD DCV DLV DDV L'W CVD DI LiL IID ID LLiI OtI SET OEI GtQd IS qLi AIT STH aMd TiA @TI EV oad qaN usV aqd sArI elV eV E E DLi DCV VDV DSC IVD LLII VIV VCV E VDD DLV DVV LiL VVfV DDC VDC SZI OZI Sll aqi, dsV xqI ail dal oad naq eqd qeW ds aS TleA naq SAD usV oQd t8E ILDV LVD IDY IDV SSL IDD IID DlI SLV IVC LDL ILD LLD IDI LVV DDD

011 501 001

6I SAD hic nid alI nq uID niD Enaq old nId UIC 2W aW IVel IeA

9EE VCD LCI WCS VVE LV LLID CVD VVC VLD VDD VVC VVD CLV CIV LDS VLD

56 06 S8

eIV sr asqd aqd usv oid naq sAr dsV dsV.aS od sI na dsV nrI 88Z LD VVDD V DLi DII Dvl VDD DID Dfv LVC IVC VDL IDD DIV DID IVE DLD

08 SL OL S9

BLV niD SAD nID nli oid na AIC usV nI leA eIV o0d aqd sArI 1I O. DCD CVC DCL VVC VVfC IDD ViI DCCS IV ff VVD lI IDC VDD DIL VVVi DIV

09 SS 0S

nal LIv eI nlid II niC GII AID nar STH sAl US usID;I I 1aS Z6I iDI ICD DiV VVD DIV fVE DIV LCD DCI IVD CVV Duv VCV)VD 11V IDI 9IbO8LZ9 LI

18 2780415

GAA GAT TGG TTG CCT GAA GGA TTA GAG GAA AGA ACA AAA GAG GAA GGT 1008

Glu Asp Trp Leu Pro Glu Gly Leu Glu Glu Arg Thr Lys Glu Glu Gly

325 330 335

TTA ATC ATA AGA GGA TGG GCA CCT CAA GTA CTA ATT CTT GAT CAC GAA 1056

Leu Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Asp His Glu

340 345 350

TCT GTG GGA GCT TTT GTT ACA CAT TGT GGT TGG AAT TCA ACA CTA GAA 1104

Ser Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu

355 360 365

GGA GTT TCA GGA GGT GTT CCA ATG GTA ACA TGG CCT GTG TTT GCG GAG 1152

Gly Val Ser Gly Gly Val Pro Met Val Thr Trp Pro Val Phe Ala Glu

370 375 380

CAA TTT TTC AAT GAA AAG TTG GTG ACT GAG GTT TTG AAA ACT GGG GCT 1200

Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Thr Glu Val Leu Lys Thr Gly Ala

385 390 395 400

GGT GTT GGT TCG ATT CAG TGG AAG AGA TCA GCT AGC GAA GGA GTG AAA 1248

Gly Val Gly Ser Ile Gln Trp Lys Arg Ser Ala Ser Glu Gly Val Lys

405 410 415

AGA GAA GCA ATA GCT AAG GCA ATA AAG AGA GTA ATG GTG AGT GAA GAA 1296

Arg Glu Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Arg Val Met Val Ser Glu Glu

420 425 430

GCA GAG GGA TTC AGA AAC AGA GCT AAA GCG TAT AAG GAG ATG GCA AGA 1344

Ala Glu Gly Phe Arg Asn Arg Ala Lys Ala Tyr Lys Glu Met Ala Arg

435 440 445

AAA GCT ATT GAA GGA GGA GGA TCA TCT TAC ACT GGA TTG ACT ACT TTG 1392

Lys Ala Ile Glu Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Gly Leu Thr Thr Leu

450 455 460

TTG GAA GAT ATT AGT ACA TAT AGT TCT ACT GGT CAT 1428

Leu Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Gly His

465 470 475

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 476 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Met Gly Gln Leu His Phe Phe Phe Phe Pro Val Met Ala His Gly His

1 5 10 15

Met Ile Pro Thr Leu Asp Met Ala Lys Leu Val Ala Ser Arg Gly Val

25 30

Lys Ala Thr Ile Ile Thr Thr Pro Leu Asn Glu Ser Val Phe Ser Lys

40 45

Ser Ile Gln Arg Asn Lys His Leu Gly Ile Glu Ile Glu Ile Arg Leu

55 60

Ile Lys Phe Pro Ala Val Glu Asn Gly Leu Pro Glu Glu Cys Glu Arg

70 75 80

Leu Asp Leu Ile Pro Ser Asp Asp Lys Leu Pro Asn Phe Phe Lys Ala

90 95

Val Ala Met Met Gln Glu Pro Leu Glu Gln Leu Ile Glu Glu Cys Arg

105 110

Pro Asn Cys Leu Val Ser Asp Met Phe Leu Pro Trp Thr Thr Asp Thr

120 125

Ala Ala Lys Phe Asn Met Pro Arg Ile Val Phe His Gly Thr Ser Phe

135 140

Phe Ala Leu Cys Val Glu Asn Ser Ile Arg Leu Asn Lys Pro Phe Lys

150 155 160

Asn Val Ser Ser Asp Ser Glu Thr Phe Val Val Pro Asn Leu Pro His

170 175

Glu Ile Lys Leu Thr Arg Thr Gln Leu Ser Pro Phe Glu Gln Ser Gly

185 190

Glu Glu Thr Thr Met Thr Arg Met Ile Lys Ser Val Arg Glu Ser Asp

200 205

Ser Lys Ser Tyr Gly Val Ile Phe Asn Ser Phe Asn Glu Leu Glu His

210 215 220

Asp Tyr Val Glu His Tyr Thr Lys Val Leu Gly Arg Arg Ala Trp Ala

225 230 235 240

Ile Gly Pro Leu Ser Met Cys Asn Arg Asp Ile Glu Asp Lys Ala Glu

245 250 255

Arg Gly Lys Gln Ser Ser Ile Asp Lys His Glu Cys Leu Lys Trp Leu

260 265 270

Asp Ser Lys Lys Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Cys Phe Gly Ser Val

275 280 285

Ala Asn Phe Thr Ala Ser Gln Leu His Glu Leu Ala Met Gly Ile Glu

290 295 300

Ala Ser Gly Gln Glu Phe Ile Trp Val Val Arg Thr Glu Leu Asp Asn

305 310 315 320

Glu Asp Trp Leu Pro Glu Gly Leu Glu Glu Arg Thr Lys Glu Glu Gly

325 330 335

Leu Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Asp His Glu

340 345 350

Ser Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu

355 360 365

Gly Val Ser Gly Gly Val Pro Met Val Thr Trp Pro Val Phe Ala Glu

370 375 380

Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Thr Glu Val Leu Lys Thr Gly Ala

385 390 395 400

Gly Val Gly Ser Ile Gln Trp Lys Arg Ser Ala Ser Glu Gly Val Lys

405 410 415

Arg Glu Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Arg Val Met Val Ser Glu Glu

420 425 430

Ala Glu Gly Phe Arg Asn Arg Ala Lys Ala Tyr Lys Glu Met Ala Arg

435 440 445

Lys Ala Ile Glu Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Gly Leu Thr Thr Leu

450 455 460

2780415

Leu Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Gly His

465 470 475

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 38 paires de bases (B) TYPE: oligonucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

GTCCCCCGGG TCTAGACATG GGTCAGCTCC ATWTTTTC 38

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: paires de bases (B) TYPE: oligonucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

GCCGCTCGAG CTCTTAATGA CCAGTAGAAC TATATG 36

2 1 2780415

Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   l. Procédé enzymatique de glucosylation de dérivés aromatiques de formule générale () R6

   R I R5 ()

   R2 R3

   dans laquelle RI, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical alkoxyle, R4 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical

   hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-

   CO-OH), ou un radical alkoxycarbonule (-CO-O-alkyle), R3 et R4 pouvant former ensemble une liaison ester -O-CO- de manière à former un cycle à 6 éléments, R5 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical

   hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-

   CO-OH), ou un radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), à la condition que lorsque l'un de R4 ou R5 représente un radical

   hydroxyalkyle, un groupe aldéhyde (-CO-H), un groupe acide carboxylique (-

   CO-OH), ou radical alkoxycarbonyle (-CO-O-alkyle), alors l'autre de R4 ou R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, et R6 represente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, dans lequel la réaction de glucosylation est effectuée par une GST dans un milieu réactionnel approprié en présence d'une source de glucose appropriée, la GST étant choisi parmi les GST définies par les identificateurs de séquence 1 et 3, et leurs

   séquences homologues.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Ri représente un

   atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy.
3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que R2

   représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R3

   représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy et R4 représente un radical

   hydroxyalkyle ou un groupe acide carboxylique.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les dérivés aromatiques de formule générale (I) sont choisis parmi les composés suivants: acide cinnamique, acide p-coumarique, acide o- coumarique, acide caféique, acide férulique

   22 2780415

   ou alcool coniférique.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les

   dérivés aromatiques sont représentés par la formule générale (II) R6

   RI R5 (II)

   R2 0 O0

   dans laquelle Ri, R2 et R6 sont définis précédemment et R5 représente un

   atome d'hydrogène ou un radical alkyle.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que Ri représente un

   atome d'hydrogène, un radical hydroxy ou un radical méthoxy.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que R2

   représente un radical hydroxy.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que R5

   et R6 représentent un atome d'hydrogène.
10. 10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que les

    dérivés aromatiques de formule générale (II) sont choisis parmi les composés

    suivants: scopolétine, exculétine et umbelliferone.
11. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la

    GST est introduite dans le milieu réactionnel approprié sous forme d'extrait protéique, ledit extrait protéique pouvant être brut ou purifié totalement ou en partie, ou encore

    produites in situ par des organismes biologiques appropriés.
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le

    milieu réactionnel approprié est constitué par tout milieu aqueux dont les conditions de température, de pH et de force ionique sont appropriés pour les réactions enzymatiques.
13. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la

    source de glucose est constituée par un nucléotide donneur de sucre,

    préférentiellement l'UDP-glucose.
14. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la

    GST est produite par un organisme hôtes transformé par un gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans ledit organisme hôte, la séquence codante

    comprenant une séquence d'ADN codant pour la GST.
15. 15. Procédé pour améliorer la résistance des plantes aux agents pathogènes, caractérisé en ce que l'on effectue la glucosylation enzymatique selon l'une des

    23 2780415

    revendications I à 14 dans les cellules végétales de ladite plante, lesdites cellules étant

    transformées par l'introduction d'un gène chimère selon la revendication 14.