CN116217683A - 一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用 - Google Patents

一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用，涉及植物基因工程技术领域。本发明提供了与棉花纤维品质相关的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。超表达GhMYB4基因能促进棉花纤维次生壁的积累，棉纤维变短；敲除GhMYB4基因能使细胞壁变薄，促进纤维伸长，可以为培育“又长又细”的棉花新品种提供理想的途径。

Description

一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用。
背景技术
棉花纤维由棉花胚珠外珠被单个细胞分化而来，是高等植物中伸长最快，合成纤维素最多的单细胞。棉花纤维发育过程可分为起始、伸长、次生壁加厚、脱水成熟4个部分重叠的时期。其中纤维伸长和次生壁合成两个时期与纤维的发育与品质形成关系最为密切。棉花纤维细的分化发育是一个复杂的动态过程，在不同的发育时期均有大量的基因参与调控，其中最重要的一类是转录因子。转录因子在高等植物的生长发育、形态建成、次生代谢和抗逆反应等方面起重要的调节作用。在棉花纤维细胞分化发育过程及其调控的研究中，对MYB转录因子的研究最为广泛和深入。MYB转录因子以含有保守的MYB结构域为共同特征。植物中的MYB转录因子大都含有两个不完全重复区域(R2R3MYB)。Loguerico等于1999年最早从陆地棉胚珠cDNA文库中分离出6个棉花R2R3MYB转录因子。Suo等从棉花纤维起始早期胚珠中分离到了55个包含不同MYB保守域的DNA序列，预示在起始期有大量的MYB类转录因子参与了对纤维细胞分化起始的调节。GaMYB2与拟南芥GL1高度相似，在拟南芥中表达棉花的GaMYB2可恢复gl1突变体无毛的表型。GhMYB25和GhMYB25-like基因编码MIXTA类R2R3MYB转录因子，金鱼草中的MIXTA基因和矮牵牛中的PhMYB1基因的主要功能是调节花瓣乳突细胞的形成，在金鱼草中过量表达MIXTA基因可导致叶片产生异位的多细胞表皮毛。GhMYB25和GhMYB25-like基因皆在纤维起始阶段高量表达，在棉花中过表达GhMYB25可使叶柄表皮毛数量增加，纤维起始数量也明显增加；抑制GhMYB25可使棉花纤维分化起始延迟、纤维细胞数量减少、长度变短。GhMYB25-like基因对棉花纤维发育具有更重要的调节功能，通过抑制GhMYB25-like基因的表达，棉花纤维发育被完全抑制，种子呈现无纤维表型，然而植株其他部位的表皮毛发育未受到影响。以上研究大都集中于MYB转录因子对纤维起始及伸长的调控研究，MYB转录因子对次生壁的调控研究鲜有报道。维管植物中NAC/MYB介导的次生壁合成的级联调控网络十分保守。NAC转录因子GhFSN1是纤维次生壁合成的正调控因子，而棉花中次生壁合成阶段MYB转录因子的功能有待研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用，所述基因对棉花纤维如棉花次生壁积累和/或棉花纤维伸长进行调控，可以为培育“又长又细”的棉花新品种提供理想的途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与棉花纤维品质相关的基因GhMYB4，所述基因GhMYB4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因GhMYB4编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述基因GhMYB4的超表达载体。
优选的，包括将所述基因GhMYB4重组到pK2GW7.0表达载体上。
本发明还提供了上述基因GhMYB4的敲除载体。
优选的，所述敲除载体的基本载体包括pRGEB32-7。
本发明还提供了上述基因GhMYB4或上述超表达载体或上述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
本发明还提供了上述基因GhMYB4或上述超表达载体或上述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
本发明还提供了上述超表达载体在促进棉花次生壁积累和/或抑制棉花纤维伸长中的应用。
本发明还提供了上述敲除载体在抑制棉花次生壁积累和/或促进棉花纤维伸长中的应用。
有益效果：本发明提供了一种与棉花纤维品质相关的基因GhMYB4，可以改良作纤维品质，具有广泛的应用价值。如在本发明实施例中，超表达GhMYB4基因能促进棉花纤维次生壁的积累，棉纤维变短；敲除GhMYB4基因能使细胞壁变薄，促进纤维伸长，可以为培育“又长又细”的棉花新品种提供理想的途径。
附图说明
图1为本发明提供的候选基因GhMYB4的表达模式图；
图2为本发明提供的pK2GW7-GhMYB4超表达质粒载体的图谱；
图3为本发明提供的pRGEB32-7-GhMYB4突变体质粒载体的图谱；
图4为本发明提供的超表达转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，阴性表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；超表达材料阳检PCR扩增正向引物为35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC，反向引物MYB4-R:TCATTTCATTTCCAAACTTCTGTA；
图5为本发明提供的突变体转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，阴性表示野生型受体材料，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带；突变体材料阳检PCR扩增正向引物为U6-7-F:TGTGCCACTCCAAAGACATCAG，反向引物CRISPR-INFT2-2R:TTCTAGCTCTAAAACGACCTCAAACGTGGCAACTT；
图6为本发明提供的超表达转基因材料Southern杂交结果胶图；
图7为本发明提供的超表达转基因材料qRT-PCR检测结果胶图；
图8为本发明提供的突变体转基因材料Hi-TOM检测结果图；
图9为本发明提供的转基因材料成熟纤维手梳结果图；
图10为本发明提供的转基因材料细胞壁石蜡切片图。
具体实施方式
本发明提供了一种与棉花纤维品质相关的基因GhMYB4，所述基因GhMYB4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，优选提取陆地棉品系的RNA经反转录成cDNA，作为模板，利用MYB4-F(SEQ ID NO.3：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGGAAGGTCTCCTTGCTG)和MYB4-R(SEQID NO.4：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTCATTTCCAAACT)进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸5min。本发明优选将上述PCR扩增得到的产物经BP反应连接至pDONRTM221载体上后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10～12h后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了上述基因GhMYB4的超表达载体。
本发明在构建所述超表达载体时，优选包括将所述基因GhMYB4重组到pK2GW7.0表达载体上。本发明对所述重组的方法并没有特殊限定，优选包括LR反应。
本发明还提供了上述基因GhMYB4的敲除载体。
本发明所述敲除载体的基本载体优选包括pRGEB32-7。本发明在构建所述敲除载体时，利用引物pRGEB32-7F和CRISPR-T2-1R，以及CRISPR-T2-2F和CRISPR-T2-2R分别进行第一PCR扩增，再将第一PCR的扩增产物利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增，得到插入基本载体的目标序列。
在本发明中，构建所述敲除载体所涉及到的引物，优选如下所示：
CRISPR-T2-1R(SEQ ID NO.7):AACTTCTGTAATCCAAGAAATGCACCAGCCGGGAAT；
CRISPR-T2-2F(SEQ ID NO.8):TTTCTTGGATTACAGAAGTTGTTTTAGAGCTAGAAATA；
CRISPR-T2-2R(SEQ ID NO.9):GACCTCAAACGTGGCAACTTTGCACCAGCCGGGAAT；
CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.10):TTCTAGCTCTAAAACGACCTCAAACGTGGCAACTT；
pRGEB32-7F(SEQ ID NO.11):AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG；
infpRGEB32-7F(SEQ ID NO.12):AAGCATCAGATGGGCAAACAAA。
本发明所述第一PCR扩增的程序和体系相同，且体系以20μl计，优选包括：ddH2O16.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板1μl。本发明所述第一PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，27个循环，72℃延伸5min。
本发明以第一PCR的扩增产物为模板，利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增，所述重叠延伸PCR扩增的体系以20μl计，优选包括：ddH2O 15.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板各1μl。本发明所述重叠延伸PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，28个循环，72℃延伸5min。
本发明在构建所述敲除载体前，优选还包括利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体37℃酶切6h，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将上述目标序列和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhMYB4。
本发明还提供了上述基因GhMYB4或上述超表达载体或上述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
本发明可将上述超表达载体或敲除载体，利用遗传转化的方法转入棉花基因组内，使得所述基因GhMYB4进行超表达或不再表达。本发明对所述遗传转化的方法并没有特殊限定，优选包括农杆菌介导的遗传转化方法。在本发明中，经实施例验证，超表达GhMYB4基因能促进棉花纤维次生壁的积累，棉纤维变短；敲除GhMYB4基因能使细胞壁变薄，促进纤维伸长，从而可基于需要对棉花进行对应基因的超表达或抑制表达，产生新的棉花种质材料。
本发明还提供了上述基因GhMYB4或上述超表达载体或上述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述超表达载体在促进棉花次生壁积累和/或抑制棉花纤维伸长中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述敲除载体在抑制棉花次生壁积累和/或促进棉花纤维伸长中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
GhMYB4基因的克隆及表达模式分析及转基因植株表达量检测
A.RNA的提取及cDNA的获得
取陆地棉品系(JIN668，由河南省农业科学院培育成功的Y668，后经我校金双侠教授通过杂交等方法选育，已在文章中公开：陆地棉GhABF1基因在棉花抗旱中的功能研究)纤维样品，采用异硫氰酸胍的方法提取总RNA，cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RT buffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl
Figure BDA0003837762580000061
Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μlSuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。
B.GhMYB4基因全长序列的获得
从陆地棉基因组数据库中提取该基因序列(Gh_D12G0316)，设计扩增该基因的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。PCR产物经BP反应连接至pDONRTM221载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，pDONRTM221载体来源于CSIROPlantIndustry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10～12h后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
C.GhMYB4基因表达模式分析及转基因植株表达量检测
按上述方法提取纤维cDNA，以上述反转录合成的cDNA为模板，用实施例1中的引物进行特异PCR扩增，棉花GhUb7(GenBank登陆号：DQ116441)基因作为内参对照进行相对定量分析，测定开花后0天(0D)、5天(5D)、10天(10D)、15天(15D)、20天(20D)的纤维内的GhMYB4基因表达量。
结果如图1所示，GhMYB4基因在次生壁增厚期(花后15～45d)优势表达。
实施例2
GhMYB4基因转基因载体的构建
A.超量表达载体的构建
将克隆到pDONRTM221上的GhMYB4用LR反应(Invitrogen)将其重组至植物表达载体pK2GW7.0(其中：LR酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，载体构建图谱见图2：该载体骨架为pK2GW7，在细菌中的抗性为壮观霉素，转基因植株抗性为卡那霉素，目标基因GhMYB4由组成型启动子35S驱动；表达载体pK2GW7.0来自比利时根特大学)，用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10～12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用35S-F(SEQ ID NO.5)：GACGCACAATCCCACTATCC，反向引物MYB4-R(SEQ ID NO.6):TCATTTCATTTCCAAACTTCTGTA；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pK2GW7.0-GhMYB4。
B.CRISPR载体的构建
参考CRISPR-P网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行搜索靶标，设计载体构建所用到的引物：CRISPR-T2-1R(SEQ ID NO.7)、CRISPR-T2-2F(SEQ ID NO.8)、CRISPR-T2-2R(SEQ ID NO.9)、CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.10)、pRGEB32-7F(SEQ ID NO.11)和infpRGEB32-7F(SEQ ID NO.12)。
利用引物pRGEB32-7F和CRISPR-T2-1R，以及CRISPR-T2-2F和CRISPR-T2-2R分别进行第一PCR扩增。PCR体系为：ddH2O 16.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板1μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，27个循环，72℃延伸5min。
再将第一PCR的扩增产物利用引物infpRGEB32-7F和CRISPR-INFT2-2R进行重叠延伸PCR扩增。PCR体系为：ddH2O 15.1μl，Buffer 2μl，dNTP0.3μl，正反向引物各0.2μl，酶0.2μl，模板各1μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，28个循环，72℃延伸5min。
利用BSAⅠ对pRGEB32-7空载体37℃酶切6小时，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将重叠延伸PCR扩增的目的片段和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhMYB4(载体图谱见图3，该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因植株抗性为卡那霉素)。用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用：
U6-7-F(SEQ ID NO.13)：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG；
CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.10)：TTCTAGCTCTAAAACGACCTCAAACGTGGCAACTT；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的突变体质粒pRGEB32-7-GhMYB4。
C.利用载体转化农杆菌
将构建的pK2GW7.0-GhMYB4载体和pRGEB32-7-GhMYB4载体分别转化农杆菌菌株EHA105，分别挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基和含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用特异引物对菌液进行阳性检测(所述的引物序列见实施例2中A和B)，阳性菌液用20％甘油于-70℃下保存。
实施例3
GhMYB4基因的遗传转化及筛选鉴定
A.农杆菌介导的遗传转化
供试材料为陆地棉品系(JIN668)，选择饱满一致JIN668种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4～5天。
从超低温冰箱内取出保存的实施例2制备的含有GhMYB4基因的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，分别接10μl于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体和含100mg/L卡那霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20μL于15～20ml含100mg/L壮观霉素的新鲜液体LB和含100mg/L卡那霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000～10000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30～40min，用于侵染下胚轴。
农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：
(1)在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.5～0.8cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pK2GW7.0-GhMYB4和含有目标载体pRGEB32-7-GhMYB4的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；
(2)倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10～15min后接入不含抗生素的2,4-D诱导培养基(以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L，调pH至5.9)上，在19℃黑暗条件下共培养48-60h；
(3)共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2,4-D诱导培养基，在28℃弱光下培养，连续继代至出现胚性愈伤组织；
(4)将胚性愈伤组织陆续接入胚分化培养基(以MS为基础培养基，添加1.9g/LKNO3，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L，调pH至5.9)继代至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L，调pH为5.9)上萌发，直至获得完整植株。
B.转基因植株的鉴定
(1)转基因植株阳性检测及纯系检测
提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，以35s启动子正向引物35S-F(SEQ ID NO.14)：GACGCACAATCCCACTATCC和目的基因反向引物MYB4-R(SEQ IDNO.4)，及U6-7-F(SEQ ID NO.13)和CRISPR-INFT2-2R(SEQ ID NO.10)，两对引物进行PCR分别检测是否有相应T-DNA插入。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
转基因植株阳性检测结果如图4和图5，成功构建得到超表达转基因材料和敲除基因的突变体转基因材料。
将收取的T1代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10～12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1天后扶苗，转移至光照室(光照强度为3000Lux，15h光照/9h黑暗)培养，5～6天观察是否有抗性分离(若有长侧根的转基因植株鉴定为阳性转基因植株)。之后每一代单株保留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。
(2)转基因植株的拷贝数检测：
DNA酶切及电泳分离DNA
1)在200μl微量离心管中加入15～20μg DNA样品(根据DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)的说明书，提取棉花基因组DNA)，80U限制性内切酶(HindIII-HF)，8μl相应的CutSmart Buffer，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃酶切72h。
2)于DYY-Ⅲ34A型电泳槽中制备0.8％的0.5×TBE琼脂糖凝胶；向每个样品中加入2μl上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样；在0.5×TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟，再在40V电泳12～14h。
DNA变性及转膜
1)切胶：停止电泳，拿出胶板，上端切去点样孔，两边距点样孔0.5cm左右，下端沿溴酚蓝处边缘切开，切左上角以示方位。
2)变性：酸变性15min，碱变性20min，变性期间不时的温和晃动胶块。
3)搭盐桥：一块洗净的20×30cm瓷盘，倒入碱转液，把干净玻璃板横放于盘上，调平衡后用碱转液湿润玻璃板，把搭盐桥的滤纸平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后，再按同样的方法铺上第二层滤纸，将胶的正面朝上放于滤纸中央，赶尽气泡，用X光片条将胶的四周约0.5cm宽处与滤纸隔开，使碱转液必须经过凝胶进入吸水纸，以保证胶中的DNA充分转移到尼龙膜上。取与胶块等大的尼龙膜准确放于胶上，赶尽气泡，在尼龙膜上放两张等大的滤纸，再放约10cm厚的吸水纸，再放一个玻璃板及约500g的重物，调水平，印记18～24h。
4)将转好的尼龙膜用2×SSC浸泡15min，重复一次，捞出后用滤纸吸干水分，再用干净的滤纸包好，于80℃烘干2h后用保鲜膜包好放在-20℃保存。
Southern杂交
1)预杂交：将预杂交的尼龙膜用2×SSC浸泡15～30min，取出尼龙膜装入杂交管中，赶尽气泡，在杂交管中加入25ml预杂交液，并于42℃预杂交，保持低速转动，几分钟后检查是否漏液。若不漏加入320μL/403μL鲑鱼精。
2)杂交：吸取500μL杂交管中的杂交液于一新离心管中，加入探针，在98℃变性5分钟后，立即置于冰上3min。将变性好的探针加入杂交管中，充分混匀，42℃杂交10～12h。
3)洗膜：2×SSC+0.1％SDS于室温洗2次，每次15min；0.1×SSC+0.1％SDS于68℃洗3次，前2次15min，第3次10min；Washing Buffer洗1次，2～3min；马来酸缓冲液洗1次，2～3min；用马来酸缓冲液将10×Blocking Solution稀释成1×Blocking Solution，取其中80ml用来封阻背景，常温轻摇1h后弃掉溶液；试剂盒中4号管(Anti-AP)，用前12000rmp，离心5min，取2μL加入20ml的1×Blocking Solution，将配好的Blocking Solution加入杂交管中，37℃杂交炉轻摇40min，之后取出尼龙膜，在瓷盘中用500ml的Washing Buffer清洗3次，每次15min。
压膜及显影
1)将尼龙膜用检测缓冲液漂洗，室温3～5分钟。
2)压膜：将足够大的自封袋剪开，平铺于桌面，吸取800μL的CSPD均匀地滴在塑料袋上，取出尼龙膜将DNA面朝下，置于自封袋上，压好膜，用封口机封口，防止气泡的产生。室温孵育10min后将膜置于37℃孵育5-10min，以增强化学发光反应。
3)压磷屏：将膜的DNA面朝上放置于磷屏中，放入1张X光片，盖好磷屏，曝光10～20min。
4)显影：将X光片浸入显影液中，反复几次后，用水冲洗干净X光片，浸入定影液中5min，冲洗干净即可。
转基因株系拷贝数鉴定结果如图6所示，转基因OE15-12、OE15-28株系均为单拷贝。
实施例4
GhMYB4基因CRISPR转基因株系编辑效率检测
棉花叶片DNA的提取方法见实施例3。由于CRISPR-Cas9技术会造成一个单株上有多种编辑类型的现象以及sanger测序无法鉴定多种突变类型，因此使用高通量Hi-TOM测序技术。结合Barcode标记的方法，针对敲除材料被编辑的每一个单株，以接头的方式在检测靶点的正反引物5’端标记上Barcode，因此不同单株获得一对特异的Barcode标记。利用这些含有Barcode的引物扩增独立单株的靶位点序列，构建混合的DNA文库并进行高通量测序。测序结果根据Barcode标记的引物进行分选，获得独立单株对应的测序结果。测序结果经过去掉重复和低质量的序列，再和参考基因序列进行比对分析，从而完成单株靶基因位点突变检测的过程。检测时使用的Barcode引物为：
2P-F-1(SEQ ID NO.15)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTTCAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT，
2P-R-1(SEQ ID NO.16)：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACGAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTT。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。等量吸取PCR产物，纯化后送测序。编辑效率检测结果如图8所示：CR15-2株系在MYB4的At亚族产生了大片段缺失，在Dt亚族产生了1碱基缺失；CR15-3株系在MYB4的At亚族、Dt亚族各产生了1碱基缺失。
实施例5
利用转基因棉花对GhMYB4基因进行功能验证
具体步骤如下：
GhMYB4转基因株系成熟纤维长度测定
将转基因纯系材料OE15-12、OE15-28、CR15-2、CR15-3及阴性对照(Nμll)和野生型材料(WT)六个株系的材料种植于转基因试验田，每个株系各20株，待棉纤维成熟，同一时间点摘取转基因及对照株系相同部位的棉桃进行纤维长度测量，每个株系3个生物学重复，采用棉籽分梳法进行测量。先顺棉籽中间腹沟将纤维理直，用梳子进行梳绒。之后，将棉籽腹沟向下贴在黑绒板上，用钢尺进行测量。所得数据用prism软件进行多重比较分析，结果见图9，与野生型及Null比较，超表达GhMYB4可以显著抑制棉纤维伸长，敲除GhMYB4可以显著促进棉纤维伸长；与野生型比较，超表达株系促进了棉纤维次生壁增厚，超表达株系中阴性分离株系Null与野生型植株比较没有显著差异。
GhMYB4转基因株系细胞壁厚度测定
取同一天收获的、棉花植株相同部位的、位于成熟棉铃中部的籽棉(转基因和对照)，用分梳法对其进行梳绒后，再用细线将中部的纤维捆成一束(长约1cm)，对这部分纤维进行石蜡切片观察。石蜡切片的具体步骤：
1.将样品置于2mL的离心管中，加入1.5mL的FAA固定液，抽真空30min，室温固定至少24h(纤维是干燥的，跳过脱水和透明两步)。
2.弃去固定液，依次在70％、85％、95％乙醇(含1％伊红)和无水乙醇中逐级脱水，每级约1h。
3.依次在1/5、2/5、3/5、4/5及纯氯仿中透明，每级1～2h。
4.在材料中加入与氯仿等体积的碎蜡，37℃温育2天。
5.50％石蜡(48℃，2h)、75％石蜡(53℃，2h)逐级浸蜡；纯蜡A(56℃，1h)，纯蜡B(56℃，1h)，纯蜡C(56℃，1h)逐级浸蜡。
6.将石蜡和样品置于折好的纸盒中，再加入适量熔好的石蜡(温度不能太高)，室温冷却凝固。
7.将材料进行修整后，用Thermo MICPOM HM340E型切片机切片(8μm)。切好的薄片放在加有蒸馏水和涂有蛋清甘油(1:1，V/V)的玻片上展片(37℃)。晾干后，放入37℃烘箱中烘片3天以上。
9.脱蜡：二甲苯脱蜡0.5h，二甲苯透明0.5h，无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、蒸馏水，每级10秒钟左右。
10.染色：番红5min。蒸馏水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、固绿、95％乙醇、无水乙醇、1/2乙醇+1/2二甲苯逐级脱水，每级10秒钟左右。再置于二甲苯中。
11.加拿大树胶封片后，晾干，置于37℃烘箱中烘片3天以上。
突变体转基因材料石蜡切片结果如图10所示，与野生型比较，本发明的超表达株系细胞壁厚度与野生型比较明显增厚，但是株系细胞壁厚度与野生型比较明显变薄。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种与棉花纤维品质相关的基因GhMYB4，其特征在于，所述基因GhMYB4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述基因GhMYB4，其特征在于，所述基因GhMYB4编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述基因GhMYB4的超表达载体。
4.根据权利要求3所述超表达载体，其特征在于，包括将所述基因GhMYB4重组到pK2GW7.0表达载体上。
5.权利要求1或2所述基因GhMYB4的敲除载体。
6.根据权利要求5所述敲除载体，其特征在于，所述敲除载体的基本载体包括pRGEB32-7。
7.权利要求1或2所述基因GhMYB4或权利要求3或4所述超表达载体或权利要求5或6所述敲除载体在培育棉花新种质中的应用。
8.权利要求1或2所述基因GhMYB4或权利要求3或4所述超表达载体或权利要求5或6所述敲除载体在改良棉花纤维品质中的应用。
9.权利要求3或4所述超表达载体在促进棉花次生壁积累和/或抑制棉花纤维伸长中的应用。
10.权利要求5或6所述敲除载体在抑制棉花次生壁积累和/或促进棉花纤维伸长中的应用。
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