JP2022544084A - 染色体再編成のための組成物および方法 - Google Patents

染色体再編成のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

染色体再編成の効率を評価するための方法および組成物が提供される。いくつかの例では、第１のイントロンを介して第２の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第１の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む第１のＤＮＡ分子と、第２のイントロンを介して上記第１の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、上記第２の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む第２のＤＮＡ分子とを含む系。イントロンは、組換えがイントロンのスプライシング後に第１または第２のレポーターコード配列の発現をもたらすように、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼなどのゲノム編集試薬によって認識される少なくとも１つの標的部位を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月５日に出願された米国仮出願第６２／８８２，８５４号の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に関し、さらに具体的には、植物細胞における染色体再編成を評価するための構築物および方法に関する。
配列表の組込み
「ＭＯＮＳ４４９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名され、３６．７キロバイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、２０２０年８月４日に作成されたファイルに含まれる配列表は、４８個のヌクレオチド配列を含み、本明細書とともに電子的に出願され、参照によりその全体が組み込まれる。
所望の遺伝子座での組換えは、有益な遺伝子座を含むＤＮＡが商業的生殖系列に移動するのを可能にする可能性を有し、これは、作物の改良にとって非常に価値がある可能性がある。シス染色体再編成またはトランス染色体再編成を使用して植物ゲノムを改変する方法が存在するが、これらの以前に知られている方法は、植物ゲノムに対する改変を同定するために遺伝的選択に主に依存している。そのため、既存の方法は、所望のゲノム改変を含む植物を作製および同定するためにかなりの労力が必要であるため、非効率的であり、費用がかかる。したがって、シス染色体再編成またはトランス染色体再編成の効率を評価し、有利なゲノム改変を同定するための改良された方法が必要である。
第１の態様では、ａ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子であって、上記第１のイントロンが、第１のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第１の標的部位を含む第１のＤＮＡ分子、およびｂ）上記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、上記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子であって、上記第２のイントロンが、第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第２の標的部位を含む第２のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子対が提供される。上記標的部位での上記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換え後、上記第１のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分は、上記第１のレポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成し、上記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分は、上記第２のレポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成する。上記第１または上記第２のレポーターコード配列は、蛍光マーカー、酵素マーカーまたは除草剤耐性選択マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはＣＰ４をコードし得る。上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）からなる群から選択され得る。例えば、上記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであってよく、上記標的部位はＬｏｘ部位であってよい。上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。例えば、上記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。上記第１のＤＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含み得、上記第２のＤＮＡ分子は、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み得る。あるいは、上記第１のＤＮＡ分子は、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み得、上記第２のＤＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含み得る。リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする上記配列の発現は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは減数分裂プロモーター（ｍｅｉｏｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって駆動され得る。例えば、上記プロモーターは、Ａｔ ＥＡＳＥプロモーター、Ａｔ ＤＭＣ１プロモーター、ユビキタスプロモーター１、コメアクチンプロモーターまたはダイズＢＵＲＰ０９プロモーターからなる群から選択され得る。
別の態様では、本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子対を含む植物細胞が提供される。本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子対を含むトランスジェニック植物、植物種子または植物部分がさらに提供される。
さらなる態様では、シス染色体再編成系またはトランス染色体再編成系における組換えを検出するための方法であって、ａ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子によって形質転換されたトランスジェニック植物を得ること、ｂ）上記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、上記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子によって形質転換されたトランスジェニック植物を得ること、ｃ）上記第１のトランスジェニック植物を上記第２のトランスジェニック植物と交配して、上記第１のＤＮＡ分子と上記第２のＤＮＡ分子とを含む子孫植物を作製すること、ｄ）上記第１のＤＮＡ分子と上記第２のＤＮＡ分子とを含む上記子孫植物またはその子孫の少なくとも第１の細胞に、上記第１のイントロン内の標的部位または上記第２のイントロン内の標的部位を認識するリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを提供すること、ならびにｅ）上記第１および第２のレポーターコード配列の発現に基づいて、上記標的部位での上記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換えを検出することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、上記第１のＤＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含み、上記第２のＤＮＡ分子は、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含む。あるいは、上記第１のＤＮＡ分子は、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み、上記第２のＤＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含む。上記第１または上記第２のレポーターコード配列は、蛍光マーカー、酵素マーカーまたは除草剤耐性選択マーカーをコードし得る。上記第１または上記第２のレポーターコード配列は、ＧＦＰ、ＧＵＳまたはＣＰ４をコードし得る。上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）からなる群から選択され得る。上記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼまたはＣｆｐ１エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
別の態様では、シス染色体再編成系またはトランス染色体再編成系における組換えを検出するための方法であって、ａ）ｉ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子であって、上記第１のイントロンが、第１のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第１の標的部位を含む第１のＤＮＡ分子、およびｉｉ）上記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、上記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子であって、上記第２のイントロンが、第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第２の標的部位を含む第２のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を得ること、ならびに、ここで、上記第１のＤＮＡ分子または上記第２のＤＮＡ分子が、上記第１または上記第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする配列をさらに含み、ｂ）上記第１および第２のレポーターコード配列の発現に基づいて、上記標的部位での上記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換えを検出することを含む方法が提供される。上記第１または上記第２のレポーターコード配列は、蛍光マーカー、酵素マーカーまたは除草剤耐性選択マーカーをコードし得る。上記第１または上記第２のレポーターコード配列は、ＧＦＰ、ＧＵＳまたはＣＰ４をコードし得る。上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥＲからなる群から選択され得る。上記エンドヌクレアーゼは、ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはＣｆｐ１エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
細胞内の組換えの効率を試験するために有用な構築物の概略図を示す。この構築物は、ＣａＭＶプロモーターと、ＧＦＰコード配列のＮ末端部分と、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位を含むイントロンと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のための標的部位と、ＣＰ４コード配列のＣ末端部分とを含む。 図１に示す構築物と組み合わせて使用するための構築物の概略図を示す。第２の構築物は、ユビキタスプロモーター１と、ＣＰ４コード配列のＮ末端部分と、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位を含むイントロンと、ｇＲＮＡ標的部位と、ＧＦＰコード配列のＣ末端部分とを含む。 本明細書に記載のシス染色体再編成系またはトランス染色体再編成系における組換えを検出および最適化するために設計された一組の構築物（ベクターＡおよびベクターＢ）の概略図を示す。ベクターＡは、ＣａＭＶプロモーターと、ＧＦＰコード配列のＮ末端部分と、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼなどのゲノム編集試薬によって認識される標的部位を含むイントロンと、ＣＰ４コード配列のＣ末端部分とを含む。ベクターＢは、ユビキタスプロモーター１と、ＣＰ４コード配列のＮ末端部分と、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼなどのゲノム編集試薬によって認識される標的部位を含むイントロンと、ｇＲＮＡ標的部位と、ＧＦＰコード配列のＣ末端部分とを含む。これらの構築物のいずれかまたは両方は、標準的な植物形質転換法を使用して植物内に形質転換され得る。 開示された方法による、編集試薬（ＣｒｅまたはＣａｓ９）の発現によって誘導されたプラスミド組換えの概略図を示す。 開示された系を使用した、トウモロコシプロトプラスト内のＧＦＰ発現細胞の割合として測定された組換え効率を示す。 ダイズ子葉プロトプラストにおける組換え効率を決定するためのＣｒｅ分割レポーター系のための構築物の概略図を示す。ベクターＡは、別個のプロモーターによって駆動される追加のＣｒｅコード配列の有無にかかわらず、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ標的配列を含むイントロンによって連結された分割レポーター遺伝子を含む。ベクターＢは、ベクターＡにあるイントロン、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ標的配列を含む。ベクターＣは陽性対照である。 図７のベクターＡ、ＢおよびＣを細胞に導入した場合に予測される組換え産物を示す。 図７に図式化された構築物を使用した、ダイズプロトプラスト内のＧＦＰ発現細胞の割合として測定された組換え効率を示す。 ダイズ子葉プロトプラストにおける組換え効率を決定するためのＣｐｆ１分割レポーター系のための構築物の概略図を示す。ベクターＡは、別個のプロモーターによって駆動される追加のＣｐｆ１コード配列の有無にかかわらず、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ標的配列を含むイントロンによって連結された分割レポーター遺伝子を含む。ベクターＢは、ベクターＡにあるイントロン、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ標的配列を含む。ベクターＣは陽性対照である。 図１０に図式化された構築物を使用した、ダイズプロトプラスト内のＧＦＰ発現細胞の割合として測定された組換え効率を示す。 開示される分割レポーター系を含むトウモロコシ植物から収穫されたＲ１ホモ接合性種子における染色体再編成の概略図を示す。
特定の遺伝子座における組換えは、有益な遺伝物質を含むＤＮＡをレシピエント植物株に移動させるために極めて有用であり得る。しかし、シス染色体再編成またはトランス染色体再編成の検出は、費用がかかり大きな労働力を要する遺伝的選択法を使用して以前は行われていた。本開示は、シス染色体再編成またはトランス染色体再編成の効率を評価し、有利なゲノム改変を同定するための改良された方法を提供する。
染色体再編成を評価するための以前の系の欠点は、それらが単一のゲノム編集試薬の使用に集中しており、複数のゲノム編集試薬の評価および比較を同時に可能にしないという事実によって一層悪化する。ゲノム編集の評価はまた、従来、小さな分子変化の検出を目的としており、染色体のシス位置およびトランス位置などの染色体改変の評価のための効率的な系は開発されていない。
これらの制限に対処するために、本開示は、細胞内のゲノム編集を同定するための効率的かつ費用効果の高い系を提供する。一定の実施形態では、本明細書に開示される系は、第１のイントロンを介して第２の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第１の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む第１のＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、イントロンは、ゲノム編集試薬によって認識される少なくとも１つの標的部位、例えば、ＬｏｘＰ部位またはｇＲＮＡ標的部位を含む。第２のＤＮＡ分子は、第２のイントロンを介して第１の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第２の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含み、第２のイントロンはまた、ゲノム編集試薬によって認識される少なくとも１つの標的部位、例えば、ＬｏｘＰ部位またはｇＲＮＡ標的部位を含む。組換えにより、第１のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第１のイントロンを介して作動可能に連結され、第２のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第２のイントロンを介して作動可能に連結される。得られた配列を転写し、処理してイントロンを除去し、レポーターコード配列の一方または両方を発現させ、レポーターコード配列の一方または両方を検出することができるようにする。
開示された系は、蛍光マーカー、酵素マーカーまたは除草剤耐性マーカーを使用したゲノム編集の迅速かつ非破壊的な評価を可能にするため、当技術分野において重要な利点を意味する。シスまたはトランスのいずれかで交換が起こった場合、マーカーを発現させ、編集を測定することができる。開示された系に除草剤耐性マーカーを使用すると、編集されたゲノムの迅速な選択がさらに可能になる。
本明細書に記載の系はまた、シスおよびトランスにおける染色体再編成の頻度の決定、ならびに複数のゲノム編集試薬の同時評価を可能にする。様々なプロモーターによって駆動されるゲノム編集試薬の効率も試験することができる。開示された系を使用して、様々な調節エレメントの制御下でのゲノム編集試薬から生じるゲノム編集の頻度および伝達可能性を比較して、植物細胞における遺伝子編集を最適化することができる。
Ｉ．染色体再編成を検出および最適化するための構築物
染色体再編成の効率的な検出を可能にするために、第１および第２の分割レポーター遺伝子コード配列を含む方法および構築物が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、用語「分割レポーター」または「分割レポーターコード配列」は、レポーター遺伝子コード配列のＮ末端部分がレポーター遺伝子コード配列のＣ末端部分に作動可能に連結されていないレポーター遺伝子を指す。組換え事象は、分割レポーターのＮ末端部分を分割レポーターのＣ末端部分に作動可能に連結し、レポーター遺伝子を発現することができる配列をもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子対が提供される。第１のＤＮＡ分子は、第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含み得、上記第１のイントロンは、第１のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第１の標的部位を含む。第２のＤＮＡ分子は、上記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、上記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含み得、上記第２のイントロンは、第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第２の標的部位を含む。第１および第２のＤＮＡ分子が特定の染色体位置に位置すると、それらの遺伝子座間の組換えが起こり、第１および第２のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が作動可能に連結されて、第１および第２のレポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成する。そのため、レポーターコード配列の発現を使用して、ＤＮＡ分子が位置する染色体位置間の組換え効率を決定することができる。したがって、ここで提供される構築物および方法は、ゲノム編集の迅速かつ非破壊的な評価、異なる位置での、または染色体間のシスおよびトランスにおける染色体再編成の頻度の決定、ならびに様々なプロモーターによって駆動されるゲノム編集機構の効率を試験する方法を可能にする。
レポーターコード配列
本発明において有用なレポーターコード配列は、緑色蛍光タンパク質などの蛍光マーカー、酵素カラーマーカー（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｌｏｒ ｍａｒｋｅｒ）、または除草剤耐性選択マーカーを含む任意の検出可能なレポーター分子を含む。これらは、蛍光マーカー、酵素マーカーまたは選択可能マーカーなどの任意の種類の検出可能なマーカーをコードする配列を含む。一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子には、形質転換体を視覚的にスクリーニングする能力を提供するマーカー、例えば、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの着色タンパク質もしくは蛍光タンパク質を発現する遺伝子、またはそれについて様々な発色基質が知られているβ－グルクロニダーゼもしくはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）を発現する遺伝子が含まれる。抗生物質、例えば、カナマイシンおよびパロモマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）、スペクチノマイシン（ａａｄＡ）ならびにゲンタマイシン（ａａｃ３およびａａｃＣ４）に対する耐性、または除草剤、例えば、グルホシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）、ジカンバ（ＤＭＯ）およびグリホセート（ａｒｏＡまたはＥＰＳＰＳ）に対する耐性を付与するマーカーも、開示された系では有用である。そのような選択可能マーカーの例は、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第５，７８０，７０８号および米国特許第６，１１８，０４７号に示されている。
分割レポーターコード配列は、再構成されたＮ末端およびＣ末端によって生じる発現が、Ｎ末端またはＣ末端単独のいずれかよりも顕著に高いレベルで検出可能である限り、コード配列内の任意の点で分割され得る。例えば、分割レポーター配列のＮ末端は、完全長レポーターコード配列の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％を構成し得る。本明細書に記載されるように、再構成されたレポーターコード配列の検出がそれらの２つの染色体位置間の組換えを示すように、分割レポーター配列のＮ末端は、第１の特定の染色体位置で第１のＤＮＡ分子に組み込まれ得るが、分割レポーター配列のＣ末端は、第２の特定の染色体位置で第２のＤＮＡ分子に組み込まれ得る。
イントロン
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＤＮＡ構築物は、第１のイントロンを介して第２の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第１の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む第１のＤＮＡ分子を含む。イントロンは、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも１つの標的部位、例えば、ＬｏｘＰ部位またはｇＲＮＡ標的部位を含む。第２のＤＮＡ分子は、第２のイントロンを介して第１の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第２の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む。組換えにより、第１のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第１のイントロンを介して連結され、第２のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第２のイントロンを介して連結される。得られた配列を転写し、処理してイントロンを除去し、完全長レポーター配列を再構成し、したがって、レポーターの発現を検出することができる。
ゲノム編集試薬および標的部位
本明細書に記載のＤＮＡ構築物は、ゲノム編集試薬のための１つ以上の標的部位を含むイントロン配列を含む。本明細書で使用される場合、ゲノム編集試薬のための「標的部位」は、エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼなどのゲノム編集試薬によって結合および／または切断されるポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は、ゲノム編集試薬によって認識される配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２９または少なくとも３０の連続するヌクレオチドを構成し得る。ＲＮＡガイドヌクレアーゼのための標的部位は、標的部位に、二本鎖核酸（ＤＮＡ）分子の相補鎖、または染色体のいずれかの配列を含み得る。
ゲノム編集試薬は、例えば非コードガイド核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））を介して標的部位に結合し得る。ガイド核酸のターゲター配列（ｔａｒｇｅｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、標的部位に相補的（例えば、標的部位にある二本鎖核酸分子または染色体のいずれかの鎖に相補的）であり得る。ガイド核酸のターゲター配列が標的部位に結合またはハイブリダイズするために、完全な同一性または相補性は必要とされない場合があることが理解される。例えば、標的部位とガイド核酸のターゲター配列との間の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのミスマッチ（またはそれ以上）が許容され得る。「標的部位」はまた、ポリヌクレオチド配列および／またはその相補的ＤＮＡ鎖に二本鎖切断、一本鎖ニックまたは他の改変を導入するために、ガイド核酸分子によって誘導され得ない任意の他のゲノム編集試薬、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によって結合および切断されるポリヌクレオチド配列の位置を指す。一部の実施形態では、「標的部位」は、リコンビナーゼのための認識部位、例えば、Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位を指す。
本明細書に記載の標的部位は、リコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたまたは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－エンドヌクレアーゼ、ならびにＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、およびＣＲＩＳＰＲ系で使用される他のエンドヌクレアーゼを含むＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを含む任意のゲノム編集試薬によって認識され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによって認識される標的部位を含む（ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、ＣａｓＺ、Ｍａｄ７、それらのホモログ、またはそれらの改変されたバージョンが挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＴｎｐ１リコンビナーゼによって認識される標的部位を含む。リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである場合、標的部位は、Ｌｏｘ部位、例えば、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ２２７２部位、ＬｏｘＮ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、Ｍ２部位、Ｍ３部位、Ｍ７部位またはＭ１１部位であり得る。
調節エレメント
構築物は、構築物が発現される宿主細胞内で機能的である調節エレメントをさらに含み得る。当業者であれば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞およびヒト宿主細胞に使用するための調節エレメントを選択することができる。調節エレメントには、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサーおよびポリアデニル化エレメントが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「構築物」または「発現構築物」は、作動可能に連結された核酸配列の転写をもたらす核酸配列の組合せを指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、一方が他方の機能に影響を及ぼし得るように連結された２つのＤＮＡ分子を意味する。作動可能に連結されたＤＮＡ分子は、単一の隣接分子の一部であってよく、隣接していても隣接していなくてもよい。例えば、プロモーターは、ＤＮＡ構築物内のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と作動可能に連結され、ここで、２つのＤＮＡ分子は、プロモーターがＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼし得るように配置されている。
本明細書で使用される場合、用語「異種」は、異なる供給源に由来し、したがって通常自然界で関連しない２つ以上の項目間の関係を指す。例えば、タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、そのような組合せが通常自然界では見出されない場合、作動可能に連結されたプロモーターに関して異種である。さらに、特定の組換えＤＮＡ分子は、それが挿入される細胞、種子または生物に関して、その特定の細胞、種子または生物内に天然に存在しない場合、異種であり得る。
ＩＩ．染色体再編成を検出および最適化するための方法
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の構築物を含む植物細胞、植物組織、植物および種子に関する。植物細胞、植物部分および種子は、当技術分野で公知の任意の方法によって、開示されたＤＮＡ構築物によって形質転換され得る。宿主植物細胞の形質転換に適した方法は当技術分野で周知であり、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入することができる実質的にあらゆる方法を含む（例えば、組換えＤＮＡ構築物が植物染色体に安定に組み込まれる場合、または組換えＤＮＡ構築物もしくはＲＮＡが植物細胞に一過性に提供される場合）。細胞形質転換のための２つの有効な方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換および微粒子銃媒介形質転換である。微粒子銃法は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号および米国特許第６，３９９，８６１号に示されている。アグロバクテリウム媒介形質転換法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６１６号に記載されている。植物材料の形質転換は、栄養培地、例えば、細胞がインビトロで増殖することを可能にする栄養素の混合物を用いた組織培養時に実施される。レシピエント細胞標的には、限定するものではないが、分裂組織細胞、茎端、胚軸、カルス、未成熟胚または成熟胚、ならびに小胞子および花粉などの生殖細胞が含まれる。カルスは、限定するものではないが、未成熟胚または成熟胚、胚軸、実生の頂端分裂組織、小胞子などを含む組織供給源から開始され得る。トランスジェニック核を含む細胞をトランスジェニック植物に生長させる。次いで、再生植物を使用して、追加の植物を繁殖させることができる。
形質転換では、ＤＮＡは、典型的には、任意の１つの形質転換実験時に、ごくわずかな割合の標的植物細胞に導入される。マーカー遺伝子は、組換えＤＮＡ分子を受容し、それらのゲノムに組み込むことによって安定に形質転換される細胞を同定するための効率的な系を提供するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、抗生物質または除草剤などの選択剤に対する耐性を付与する選択マーカーを提供する。本開示の植物が抵抗性であり得る除草剤のいずれも、選択マーカーのための薬剤である。形質転換された可能性がある細胞が選択剤に曝露される。生存細胞の集団は、一般に、耐性付与遺伝子が組み込まれ、細胞生存を可能にするのに十分なレベルで発現される細胞である。細胞をさらに試験して、外因性ＤＮＡの安定な組込みを確認することができる。さらに、標的配列決定によって、植物細胞のゲノムに導入された遺伝物質の位置を決定することができる。
別個の構築物上のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１の分割レポーターおよび第２の分割レポーターを含む構築物を植物細胞内に形質転換し、植物を細胞から再生する。例えば標的配列決定によって、ゲノム内の導入遺伝子位置を決定する。第１の特定の染色体位置にある第１の分割レポーター構築物と、第２の特定の位置にある第２の分割レポーター構築物とを含む事象を同定する。第１の分割レポーター構築物を含む植物を、第２の分割レポーター構築物を含む植物と交配して、両構築物を含むＦ１植物を作製する。これらのＦ１植物を、第１および／または第２の分割レポーター構築物内の標的部位に対応するリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはＣｒｅタンパク質などのゲノム編集試薬をコードする追加の構築物によって形質転換する。レポーター配列の発現を検出することによって、分割レポーター構築物が位置する特定の染色体位置での組換えを評価する。
分割レポーター構築物上のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ
さらなる実施形態では、第１および／または第２の分割レポーター構築物は、プロモーターの制御下で、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはＣｒｅタンパク質などのゲノム編集試薬をコードする配列をさらに含む。第１および第２の分割レポーター構築物を植物細胞内に形質転換し、植物を細胞から再生する。例えば標的配列決定によって、植物ゲノム内の導入遺伝子位置を決定する。第１の特定の染色体位置にある第１の分割レポーター構築物と、第２の特定の位置にある第２の分割レポーター構築物とを含む事象を同定する。第１の分割レポーター構築物を含む植物を、第２の分割レポーター構築物を含む植物と交配して、両構築物を含むＦ１植物を作製する。レポーター配列の発現を検出することによって、分割レポーター構築物が位置する特定の染色体位置での組換えを評価する。
分割レポーター構築物上のガイドＲＮＡ
なおさらなる実施形態では、第１の分割レポーター構築物は、プロモーターの制御下で、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質などのゲノム編集試薬をコードする配列をさらに含む。第２の分割レポーター構築物は、第１の分割レポーター配列のイントロン内の標的配列を対象とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列をさらに含む。第１および第２の分割レポーター構築物を植物細胞内に形質転換し、植物を細胞から再生する。例えば標的配列決定によって、植物ゲノム内の導入遺伝子位置を決定する。第１の特定の染色体位置にある第１の分割レポーター構築物と、第２の特定の位置にある第２の分割レポーター構築物とを含む事象を同定する。第１の分割レポーター構築物を含む植物を、第２の分割レポーター構築物を含む植物と交配して、両構築物を含むＦ１植物を作製する。レポーター配列の発現を検出することによって、分割レポーター構築物が位置する特定の染色体位置での組換えを評価する。
いくつかの実施形態は、本明細書に開示される方法によって作製される植物細胞、植物組織、植物種子および植物に関する。植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、モロコシ、トウモロコシ、ブドウ、トマト、ジャガイモ、レタス、ブロッコリー、キュウリ、ピーナッツ、メロン、ニラ、タマネギ、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、キャノーラおよびテンサイ植物を含み得る。
ＩＩＩ．定義
本明細書で他に定義されない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。本明細書で使用される、分子生物学に関連する用語の多くを説明する資料の例は、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７；Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７に見出され得る。３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ １．８２２に記載のＤＮＡ塩基の命名法が使用される。
本明細書で使用される「構築物」または「ＤＮＡ構築物」または「発現構築物」は、第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも第１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される「ドナー分子」または「ドナーＤＮＡ」または「鋳型分子」または「鋳型ＤＮＡ」または「ドナーＤＮＡカセット」は、多くの場合ゲノム内の特定の位置で、ゲノムの改変のための鋳型として機能することができる核酸分子を指す。一例では、ゲノム編集技術は、特定の位置でゲノムを破壊し（例えば、エンドヌクレアーゼを使用して）、ドナー分子の配列に基づいてその位置でゲノムを改変することを含み得る。「ドナーＤＮＡカセット」は、相同組込みの標的となるゲノム部位の５’側および３’側に隣接するゲノム領域と同一のドナーＤＮＡカセットの領域である相同アーム（ＨＡ）を含み得る。ドナーＤＮＡカセットは、３’相同性アームに作動可能に連結されたドナーＤＮＡに作動可能に連結された５’相同性アームによって構成され得る。一例では、相同アームは、ドナーＤＮＡの部位特異的標的組込みをもたらす組換え部位である。
本明細書で使用される「発現カセット」は、作動可能に連結された第２のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができる少なくとも第１のポリヌクレオチド配列と、場合により、第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写終結配列とを含むポリヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される「ゲノム編集」または「ゲノム改変」は、多くの場合ゲノム内の特定の位置で生物のゲノムを改変するプロセスを指す。ドナーポリヌクレオチドを植物ゲノムに導入するか植物のゲノムＤＮＡを改変するための例示的な方法には、配列特異的ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたもしくは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの使用が含まれ、例には、ゲノム内の特定の位置にドナーＤＮＡ配列または鋳型ＤＮＡ配列を導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系およびＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用が含まれる。
本明細書で使用される「ガイド分子」または「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」は、ゲノム編集技術を使用して改変のためにゲノムの少なくとも１つの領域を標的とするために使用される核酸分子を指す。
「回文配列」は、二重らせんを形成する一方の鎖上の５’から３’または相補鎖上の３’から５’を読み取っても同じ核酸配列である。ヌクレオチド配列は、その逆相補体に等しい場合、回文である。回文配列は、ヘアピンを形成することができる。
「パーセント同一性」または「％同一性」は、２つの最適にアライメントされたＤＮＡまたはタンパク質セグメントが、構成要素、例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のアライメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を意味する。試験配列および参照配列のアライメントされたセグメントに対する「同一性画分」は、２つのアライメントされたセグメントの配列によって共有される同一の構成要素の数を、完全な試験配列または完全な参照配列の小さい方であるアライメントのウィンドウにわたる参照セグメント内の配列構成要素の総数で割ったものである。
「植物」は、植物全体、植物成分または器官（例えば、葉、茎、根など）、植物組織、種子、植物細胞、および／またはそれらの子孫のいずれかを含む、植物全体その任意の部分、または植物に由来する細胞もしくは組織培養物を指す。植物細胞は、植物の生物学的細胞であるか、植物から採取されるか、植物から採取された細胞から培養によって誘導される。
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（またはタンパク質コード領域）の翻訳開始コドンの上流または５’に位置し、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩおよび他のタンパク質（トランス作用転写因子）の認識および結合に関与して転写を開始する核酸配列を指す。「植物プロモーター」は、植物細胞内で機能的である天然または非天然のプロモーターである。構成的プロモーターは、植物の発達を通して植物のほとんどまたは全部の組織内で機能的である。組織特異的プロモーター、器官特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、それぞれ、特定の組織、器官または細胞型内でのみまたは主に発現される。プロモーターは、所与の組織、植物部分または細胞型内で「特異的に」発現されるのではなく、植物の１つの細胞型、組織または植物部分内で、植物の他の部分と比較して「増強された」発現、高いレベルの発現を示し得る。時間的に調節されるプロモーターは、例えば、概日リズムに関連する遺伝子の場合のように、植物の発達の特定の期間中、または１日の特定の時間でのみまたは主に機能的である。誘導性プロモーターは、内因性または外因性の刺激の存在に応答して、例えば、化学化合物（化学誘導物質）によって、または環境シグナル、ホルモンシグナル、化学シグナルおよび／または発達シグナルに応答して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。
核酸またはポリペプチドに関して「組換え」は、材料（例えば、組換え核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）がヒトの介入によって改変されていることを示す。組換えという用語はまた、組換え材料を有する生物を指すことができ、例えば、組換え核酸を含む植物は組換え植物と考えられる。
「トランスジェニック植物」は、その細胞内に異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定に組み込まれ、その結果、ポリヌクレオチドは連続した世代に引き継がれる。異種ポリヌクレオチドは、単独で、または組換え発現カセットの一部としてゲノムに組み込まれ得る。「トランスジェニック」は、本明細書では、最初にそのように変化したトランスジェニック生物またはトランスジェニック細胞、および最初のトランスジェニック生物またはトランスジェニック細胞からの交配または無性繁殖によって作製されたものを含め、異種核酸の存在によって遺伝子型が変化した任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分または植物を指すために使用される。本明細書で使用される用語「トランスジェニック」は、従来の植物育種法（例えば交配）による、または自然発生事象、例えば、ランダム交配、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位もしくは自然変異によるゲノム（染色体または染色体外）の変化を包含しない。
「ベクター」は、細胞間で核酸を移入するポリヌクレオチドまたは他の分子である。ベクターは、多くの場合、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスに由来し、ベクターの維持を媒介し、その意図された使用を可能にする部分を含んでいてもよい。本明細書で使用される用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物内でコード配列の発現を促進する作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを指す（例えば、細菌発現ベクターまたは植物発現ベクター）。
一部の実施形態では、本開示の一定の実施形態を説明および特許請求するために使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す数は、場合によっては用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。一部の実施形態では、用語「約」は、値が、値を決定するために使用されている装置または方法の平均の標準偏差を含むことを示すために使用される。一部の実施形態では、明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。一部の実施形態では、数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本開示の一部の実施形態の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の例に示される数値は、実行可能な限り正確に報告される。本開示の一部の実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを単に意図している。本明細書に別段の指示がない限り、各個々の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに特定の実施形態を説明する文脈で（特に、添付の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される同様の言及は、特に明記しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈することができる。一部の実施形態では、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される用語「または」は、代替物のみを指すことが明示されていないか、代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、オープンエンドの連結動詞である。これらの動詞のうちの１つ以上の任意の形態または時制、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」もオープンエンドである。例えば、１つ以上の工程を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、それらの１つ以上の工程のみを有することに限定されず、他の列挙されていない工程も包含することができる。同様に、１つ以上の特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の組成物または装置は、それらの１つ以上の特徴のみを有することに限定されず、他の列挙されていない特徴を包含することができる。
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書の一定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、本開示をさらによく明らかにすることを単に意図しており、特許請求される本開示の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
本明細書に開示される、本開示の代替的な要素または実施形態の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個々に、または群の他のメンバー、もしくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて言及および特許請求され得る。群の１つ以上のメンバーは、利便性または特許性の理由から、群に含まれ得るか、群から削除され得る。
本開示を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲から逸脱することなく、修正、変形、および同等の実施形態が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は、非限定的な例として提供されることを理解されたい。
［実施例］
［実施例１］
トランス染色体アーム交換およびトランス断片標的化を含む染色体再編成を検出および最適化するための構築物
植物細胞におけるシス染色体再編成またはトランス染色体再編成の効率を試験するための系を設計した。いくつかの実施形態では、この系は、レポーターコード配列のＮ末端部分と、イントロンに隣接する、レポーターコード配列のＣ末端部分とをそれぞれが含むキメラレポーター構築物を使用する。イントロン配列は、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な少なくとも１つの標的部位を含む。標的部位でのキメラレポーター構築物間の組換え後、レポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分はそれぞれ、レポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成する。これらの構築物内の有用なレポーターコード配列は、蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＹＰ）、酵素カラーマーカー（例えばＧＵＳ）または除草剤耐性選択マーカー（例えばＣＰ４）を含むレポーターをコードする。
一実施形態では、第１のＤＮＡ分子は、第１のイントロンを介して第２の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第１の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含む。イントロンは、ゲノム編集試薬によって認識可能な少なくとも１つの標的部位、例えば、ＬｏｘＰ部位、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位を含む。第２のＤＮＡ分子は、第２のイントロンを介して第１の分割レポーターコード配列のＣ末端部分に連結された、第２の分割レポーターコード配列のＮ末端部分を含み、第２のイントロンはまた、ゲノム編集試薬によって認識可能な少なくとも１つの標的部位、例えば、ＬｏｘＰ部位、またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位を含む。組換えにより、第１のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第１のイントロンを介して作動可能に連結され、第２のレポーターコード配列のＮ末端部分およびＣ末端部分が第２のイントロンを介して作動可能に連結される。得られた配列を転写し、処理してイントロンを除去し、レポーターコード配列のうちの少なくとも１つを発現させ、レポーターコード配列のうちの少なくとも１つを検出することができるようにする。
一定の実施形態では、組換えの部位、例えば、天然および合成のＬｏｘＰ部位、ならびにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位は、エラーが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の結果としての潜在的なフレームシフトを回避するためにイントロン内に含まれる。イントロン内の標的部位で小さなインデルが起こると、イントロンの正しいスプライシングが起こり、レポーターは依然として発現される。
図１および図２に示すように、植物細胞におけるシス染色体交換およびトランス染色体交換の効率を試験するための例示的な構築物を設計した。図１は、ＣａＭＶプロモーターと、ＧＦＰコード配列のＮ末端部分と、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位を含むキメライントロンと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位と、ＣＰ４コード配列のＣ末端部分とを含む第１の構築物を示す。
図２は、シス染色体再編成またはトランス染色体再編成の効率を試験するための系において図１の構築物と組み合わせて使用するための第２の構築物を示す。第２の構築物は、ユビキタスプロモーター１と、ＣＰ４コード配列のＮ末端部分と、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位を含むキメライントロンと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位と、ＧＦＰコード配列のＣ末端部分とを含む。
図１および図２に示される構築物を使用して、ＧＦＰおよびＣＰ４の発現について選択することによって植物または植物細胞内の組換えを検出することができる。
［実施例２］
シス染色体交換またはトランス染色体交換を検出および最適化するための方法
分割レポーター系は、植物における精密染色体改変を試験および最適化するために、任意の遺伝子編集系、例えば、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ系またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ系およびＣｒｅ／ｌｏｘ系とともに使用することができる。特に、本明細書に開示される系は、編集されたゲノムに関する細胞の迅速かつ非破壊的な評価、シスおよびトランスにおける染色体再編成の頻度を決定するための方法、ならびに様々なプロモーターによって駆動されるゲノム編集機構の効率を試験するための選択肢を提供する。
図３は、実施例１に記載され、図１および図２に示される構築物を使用して、本明細書に記載される染色体再編成を検出および最適化するための方法を示す。これらの構築物のいずれかまたは両方は、標準的な植物形質転換法を使用して植物内に形質転換され得る。ベクターＡまたはベクターＢを含む形質転換事象を生じさせ、例えば標的配列決定法を使用して、ゲノム内の導入遺伝子位置を決定した。次いで、ベクターＡおよびベクターＢ非依存性事象のライブラリーを使用して、誘導された染色体再編成を試験した。
図３に示すように、特定の染色体位置にベクターＡを含む植物を、異なる染色体位置にベクターＢを含む植物と交配した。リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ、またはＣｒｅなどのゲノム編集試薬をコードする配列によって、交配から得られたＦ１植物を形質転換した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系またはＣｐｆ１／ｇＲＮＡ系の場合にはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド系のための標的部位での組換え、またはＣｒｅの場合にはＬｏｘＰ部位での組換えにより、ＧＦＰマーカーおよびＣＰ４マーカーの発現がもたらされる。次いで、ＧＦＰ、ＧＵＳまたはＣＰ４などのレポーターの発現を使用して、シス染色体交換またはトランス染色体交換を同定することができる。
さらなる実施形態では、リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ、Ｃｐｆ１またはＣｒｅをコードする配列は、プロモーターの制御下で、分割レポーターおよび標的配列を含むＤＮＡ構築物の一方または両方に作動可能に連結され得る。この方法はまた、Ｃｒｅ／Ｃａｓ９を細胞または植物に導入するための第２の形質転換工程を排除する。所望の発現パターンを有するプロモーター、例えば、ユビキタスプロモーター１、ＯｓＡｃｔ、ＡｔＥＡＳＥ ３５ＳｍｉｎおよびＡｔＤＭＣ１が使用され得る。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列も、プロモーターの制御下で、分割レポーターおよび標的配列を含むＤＮＡ構築物の一方または両方に作動可能に連結され得る。一定の実施形態では、ベクターＡおよびベクターＢは、異なる標的部位を含み、ベクターＡは、ベクターＢの標的部位を認識するｇＲＮＡをコードする配列をさらに含み得るが、ベクターＢは、ベクターＡの標的部位を認識するｇＲＮＡをコードする配列をさらに含み得る。ｇＲＮＡおよびその標的部位を異なるベクター、したがって異なる親植物に配置することは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、標的部位およびそのガイドＲＮＡを含むＦ１子孫が作製されるまで、エンドヌクレアーゼがｇＲＮＡ標的部位を切断するのを防ぐ。
［実施例３］
トウモロコシプロトプラストにおける分割レポーター構築物の設計および検証
シス染色体交換またはトランス染色体交換の同定のために分割レポーターを使用する方法を試験し、単離されたトウモロコシプロトプラストで確認した。編集試薬（ＣｒｅまたはＣａｓ９）の発現によって誘導されたプラスミド組換えの概略図を図４に示す。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１によって導入された二本鎖切断は、プラスミドの線形化、それに続くイントロンでの連結、発現、および修復されたレポーターｍＲＮＡのスプライシングを引き起こす。Ｃｒｅの発現は、ＬｏｘＰ部位での２つのプラスミド間の組換えを引き起こす。
図４に示すように分割レポーター構築物を設計して、表１に示す成分を使用してトウモロコシプロトプラストにおける組換え効率を試験した。一例では、レポーターＡには、Ｎ末端ＧＦＰ配列（配列番号１）、ｇＲＮＡ配列（配列番号２３）、ｌｏｘＰ配列（配列番号６）およびＣ－ＧＵＳ配列（配列番号４）を含めた。レポーターＡは、本明細書に開示されるか、当技術分野で公知のプロモーター配列、イントロン配列およびターミネーター配列をさらに含み得る。レポーターＢには、Ｎ－ＧＵＳ配列（配列番号３）、ｇＲＮＡ配列（配列番号２３）、ｌｏｘＰ配列（配列番号６）およびＣ－ＧＦＰ配列（配列番号２）を含めた。レポーターＢは、本明細書に開示されるか、当技術分野で公知のプロモーター配列、イントロン配列およびターミネーター配列をさらに含み得る。例えば、Ｃｒｅ＿プロモーター（配列番号１４）、Ｃｒｅ＿５’＿イントロン（配列番号１５）、Ｃｒｅコード配列（配列番号１３）およびＣｒｅ＿ターミネーター（配列番号１６）を含むＣｒｅ構築物、または例えば、Ｃａｓ９＿プロモーター（配列番号１９）、Ｃａｓ＿９＿５’＿イントロン（配列番号２０）、Ｃａｓ９コード配列（配列番号１７）およびＣａｓ９＿ターミネーター（配列番号１８）を含むＣａｓ構築物は、レポーターＡまたはＢに含まれ得るか、レポーターＡまたはＢを含む植物内に形質転換され得る。本明細書に開示される成分または当業者に公知の成分を使用したレポーター構築物の構築は、十分に当業者の能力の範囲内であり得る。
Figure 2022544084000001
ＧＦＰを発現する細胞の割合として、トウモロコシプロトプラストで測定された組換え効率を図５に示す。これらのプロトプラストアッセイの結果は、２つの異なる実験で、Ｃｒｅ発現またはトウモロコシコドン最適化Ｃａｓ９（配列番号１７）の存在下でのベクターＡプラスミドとベクターＢプラスミドとの間の組換えを実証している。ＧＦＰ発現細胞の数、または組換えが起こった細胞の数もしくは割合を表すＧＦＰ発現細胞の割合によって、組換え活性を検出した。組換えはプラスミド濃度依存性であり、Ｃｒｅ駆動組換えでは、０．４／０．４ｐｍｏｌｅのベクターＡ／ベクターＢの濃度で最も高いレベルの組換えが観察された。Ｃａｓ９駆動組換えでは、最も高いレベルの組換えは、０．８／０．８ｐｍｏｌｅの濃度で観察された。
［実施例４］
ダイズプロトプラストにおけるＣｒｅ分割レポーター構築物の設計および検証
ダイズ子葉プロトプラストにおける組換え効率を決定するためのＣｒｅ分割レポーター系のためのベクターを図６に示す。ベクターＡは、別個のプロモーターによって駆動される追加のＣｒｅコード配列の有無にかかわらず、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ配列を含むイントロンによって連結された分割レポーター遺伝子を含む。ベクターＢは、ベクターＡにあるイントロン、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ配列を含む。ベクターＣは陽性対照である。図７は、細胞内の予測される組換え産物を示す。
図６に示すように分割レポーター構築物を設計して、表２に示す成分を使用してダイズプロトプラストにおける組換え効率を試験した。一例では、レポーターＡには、プロモーター配列（配列番号２３）、リーダー配列（配列番号２４）、Ｎ－ｔｅｒｍ ＧＦＰ配列（配列番号２５）、Ｎ－ｔｅｒｍ ＬＳ１イントロン配列（配列番号２６）、ＬｏｘＰ配列（配列番号２７）、ｇＲＮＡ標的部位配列（配列番号２８）、ＰＡＭ部位配列（配列番号２９）、Ｃ－ｔｅｒｍ Ａｃｔ７イントロン配列（配列番号３０）、Ｃ－ｔｅｒｍ ＣＰ４配列（配列番号３１）およびターミネーター配列（配列番号３２）を含めた。レポーターＡは、本明細書に開示されるか、当技術分野で公知のプロモーター配列、イントロン配列およびターミネーター配列をさらに含み得る。レポーターＢには、プロモーター（配列番号３３）、リーダー（配列番号３４）、プロモーターイントロン（配列番号３５）、輸送ペプチド（配列番号３６）、Ｎ－ｔｅｒｍ ＣＰ４（配列番号３７）、Ｎ－ｔｅｒｍイントロン（配列番号３８）、ＬｏｘＰ（配列番号３９）、ｇＲＮＡ標的部位（配列番号４０）、ＰＡＭ部位（配列番号４１）、Ｃ－ｔｅｒｍイントロン（配列番号４２）、Ｃ－ｔｅｒｍ ＧＦＰ（配列番号４３）およびターミネーター（配列番号４５）を含めた。レポーターＢは、本明細書に開示されるか、当技術分野で公知のプロモーター配列、イントロン配列およびターミネーター配列をさらに含み得る。例えば、プロモーター（配列番号４５）、１つ以上のＣｐｆ１リピート非コードＲＮＡ（配列番号４６）およびｇＲＮＡ標的部位（配列番号４７）を含むＣｐｆ１構築物は、レポーターＡまたはＢに含まれ得る。本明細書に開示される成分または当業者に公知の成分を使用したレポーター構築物の構築は、十分に当業者の能力の範囲内であり得る。
Figure 2022544084000002
ダイズプロトプラストにおける組換え効率の尺度としてＧＦＰ発現を評価するために、ダイズ子葉アッセイを開発した。４０～６０日齢の子葉から種皮を除去し、組織を１ｍｍにスライスし、２６℃で１時間原形質分離に供し、２６℃で２時間消化し、５分間放出した。プロトプラストを９６ウェルプレートに移し、ＰＥＧ媒介形質転換によって形質転換した。
ダイズプロトプラストに、ベクターＡ＋／－ＣｒｅをベクターＢと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に、Ｌｏｘ部位でのベクターＡおよびベクターＢの組換えによって生じたＧＦＰ発現を評価した。図８は、ダイズ子葉プロトプラスト内でトランス交換が検出されたことを示す平均ＧＦＰ率のＯｐｅｒｅｔｔａ分析を示す。これらの結果は、ダイズプロトプラストに対するＣｒｅ分割レポーター系の使用を検証し、Ｌｏｘ部位でのベクターＡ＋ＣｒｅとベクターＢとの間で組換えが起こったことを実証している。
［実施例５］
ダイズ子葉プロトプラストにおけるダイズＣｐｆ１分割レポーター系の検証
ダイズ子葉プロトプラストにおける組換え効率を決定するためのＣｐｆ１分割レポーター系のためのベクターを図９に示す。ベクターＡは、別個のプロモーターによって駆動される追加のＣｐｆ１コード配列の有無にかかわらず、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ配列を含むイントロンによって連結された分割レポーター遺伝子を含む。ベクターＢは、ベクターＡにあるイントロン、ＬｏｘおよびｇＲＮＡ配列を含む。ベクターＣは陽性対照である。
実施例４に記載のアッセイに従って、ダイズプロトプラストに、ベクターＡ＋／－Ｃｐｆ１をベクターＢと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に、ベクターＢへのベクターＡのＮＨＥＪによって生じたＧＦＰ発現を評価した。図１０は、陽性ＧＦＰ細胞率およびＮＨＥＪ率を示す。これらの結果は、ダイズプロトプラストに対するＣｆｐ１分割レポーター系の使用を実証している。
［実施例６］
形質転換された植物および細胞の作製
図４に示す第１の分割レポーターおよび第２の分割レポーター（レポーターＡおよびレポーターＢ）を含む構築物をトウモロコシ植物内に形質転換した。標的配列決定（ＳＣＩＰ）によって、トウモロコシゲノム内の導入遺伝子位置を決定した。その後の試験のために、ゲノムへのレポーターＡ導入遺伝子またはレポーターＢ導入遺伝子のランダムな組込みが明確に定義されている７つの事象を選択した。これらの事象を自己交配させて、Ｒ１ホモ接合性導入遺伝子事象を生じさせた。図１１に示すように、独立したホモ接合性レポーターＡ事象とホモ接合性レポーターＢ事象とを交配して、両構築物を含むＦ１植物のヘミ接合性集団を作製した。さらに、各レポーター事象についてヘミ接合性６つのうち３つを自己交配して、各導入遺伝子（レポーターＡおよびレポーターＢ）がホモ接合性であるＦ２世代を作製した。これらのＦ１材料およびＦ２材料を回収し、染色体再編成について評価する。

Claims (27)

  1. ａ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子であって、前記第１のイントロンが、第１のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第１の標的部位を含む第１のＤＮＡ分子、および
    ｂ）前記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、前記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子であって、前記第２のイントロンが、第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第２の標的部位を含む第２のＤＮＡ分子
    を含む組換えＤＮＡ分子対であって、
    前記標的部位での前記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換え後、前記第１のレポーターコード配列の前記Ｎ末端部分およびＣ末端部分が、前記第１のレポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成し、
    前記標的部位での前記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換え後、前記第２のレポーターコード配列の前記Ｎ末端部分およびＣ末端部分が、前記第２のレポーターコード配列を発現することができる発現カセットを形成する組換えＤＮＡ分子対。
  2. 前記第１および／または前記第２のレポーターコード配列が、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび除草剤耐性選択マーカーからなる群から選択されるマーカーをコードする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  3. 前記第１または前記第２のレポーターコード配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはＣＰ４をコードする、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  4. 前記第１または前記第２のリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  5. 前記第１または前記第２のリコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼであり、前記第１または前記第２の標的部位がＬｏｘ部位である、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  6. 前記第１または前記第２のエンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  7. 前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  8. 前記第１のＤＮＡ分子が、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含み、前記第２のＤＮＡ分子が、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  9. リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする前記配列の発現が、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは減数分裂プロモーターによって駆動される、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  10. 前記第１のＤＮＡ分子が、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み、前記第２のＤＮＡ分子が、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  11. リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする前記配列の発現が、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは減数分裂プロモーターによって駆動される、請求項１０に記載の組換えＤＮＡ分子対。
  12. 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対を含む細胞。
  13. 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子対を含むトランスジェニック植物、植物種子または植物部分。
  14. シス染色体再編成またはトランス染色体再編成を検出するための方法であって、
    ａ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を得ること、
    ｂ）前記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、前記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を得ること、
    ｃ）前記第１のトランスジェニック植物を前記第２のトランスジェニック植物と交配して、前記第１のＤＮＡ分子と前記第２のＤＮＡ分子とを含む子孫植物を作製すること、
    ｄ）前記第１のＤＮＡ分子と前記第２のＤＮＡ分子とを含む前記子孫植物またはその子孫の少なくとも第１の細胞に、前記第１のイントロン内の標的部位または前記第２のイントロン内の標的部位を認識するリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを提供すること、ならびに
    ｅ）前記第１および第２のレポーターコード配列の発現に基づいて、前記標的部位での前記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換えを検出すること
    を含む方法。
  15. 前記第１のＤＮＡ分子が、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含み、前記第２のＤＮＡ分子が、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１のＤＮＡ分子が、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み、前記第２のＤＮＡ分子が、Ｃａｓタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記第１および／または前記第２のレポーターコード配列が、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび除草剤耐性選択マーカーからなる群から選択されるマーカーをコードする、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記第１または前記第２のレポーターコード配列が、ＧＦＰ、ＧＵＳまたはＣＰ４をコードする、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥＲからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記エンドヌクレアーゼがＣａｓエンドヌクレアーゼである、請求項２０に記載の方法。
  22. シス染色体再編成またはトランス染色体再編成を検出するための方法であって、
    ａ）ｉ）第１のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第１のイントロンに隣接する、第２のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第１のＤＮＡ分子であって、前記第１のイントロンが、第１のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第１の標的部位を含む第１のＤＮＡ分子、および
    ｉｉ）前記第２のレポーターコード配列のＮ末端部分と、第２のイントロンに隣接する、前記第１のレポーターコード配列のＣ末端部分とを含む第２のＤＮＡ分子であって、前記第２のイントロンが、第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識可能な第２の標的部位を含む第２のＤＮＡ分子
    を含むトランスジェニック植物を得ること、ならびに
    ここで、前記第１のＤＮＡ分子または前記第２のＤＮＡ分子が、前記第１または前記第２のリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする配列をさらに含み、
    ｂ）前記第１および第２のレポーターコード配列の発現に基づいて、前記標的部位での前記第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子との間の組換えを検出すること
    を含む方法。
  23. 前記第１および／または前記第２のレポーターコード配列が、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび除草剤耐性選択マーカーからなる群から選択されるマーカーをコードする、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１または前記第２のレポーターコード配列が、ＧＦＰ、ＧＵＳまたはＣＰ４をコードする、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第１または前記第２のリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼおよびＴＡＬＥＲからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記第１または前記第２のエンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記第１または前記第２のエンドヌクレアーゼがＣａｓエンドヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
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US7351877B2 (en) * 2002-03-29 2008-04-01 Syngenta Participations Ag Lambda integrase mediated recombination in plants
US10793867B2 (en) * 2013-03-15 2020-10-06 Monsanto Technology, Llc Methods for targeted transgene-integration using custom site-specific DNA recombinases
CA3194412A1 (en) * 2014-02-27 2015-09-03 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for site directed genomic modification
BR112019004530A2 (pt) * 2016-09-02 2019-10-22 Commw Scient Ind Res Org plantas com traços modificados
CA3036234A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for genome editing via haploid induction
WO2018195555A1 (en) * 2017-04-21 2018-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Crispr/cas 9-mediated integration of polynucleotides by sequential homologous recombination of aav donor vectors

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