BR102017013120A2 - Metodologias e composições para criação de recombinação direcionada e ruptura de ligação entre traços - Google Patents

Abstract

a atual divulgação refere-se a métodos e composições para melhorar as variedades de planta através do cruzamento de plantas e da genética de plantas. por exemplo, a divulgação refere-se ao aumento da frequência de recombinação de um traço heterozigoto geneticamente ligado a um segundo traço dentro de plantas. além disso, a divulgação refere-se à ruptura da ligação genética entre um primeiro alelo e um segundo alelo.

Description

(54) Título: METODOLOGIAS E

COMPOSIÇÕES PARA CRIAÇÃO DE RECOMBINAÇÃO DIRECIONADA E RUPTURA DE LIGAÇÃO ENTRE TRAÇOS (51) Int. Cl.: C12N 15/09; A01H 5/00; C12N 15/11; C12N 9/16 (30) Prioridade Unionista: 20/06/2016 US 62/352,254 (73) Titular(es): DOW AGROSCIENCES LLC (72) Inventor(es): SANDEEP KUMAR; ANDREWF. WORDEN; STEPHEN NOVAK; RYAN M. LEE (74) Procurador(es): DANNEMANN, SIEMSEN, BIGLER & IPANEMA MOREIRA (57) Resumo: A atual divulgação refere-se a métodos e composições para melhorar as variedades de planta através do cruzamento de plantas e da genética de plantas. Por exemplo, a divulgação refere-se ao aumento da frequência de recombinação de um traço heterozigoto geneticamente ligado a um segundo traço dentro de plantas. Além disso, a divulgação refere-se à ruptura da ligação genética entre um primeiro alelo e um segundo alelo.

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para METODOLOGIAS E COMPOSIÇÕES PARA CRIAÇÃO DE RECOMBINAÇÃO DIRECIONADA E RUPTURA DE LIGAÇÃO ENTRE TRAÇOS.

[001] O presente pedido reivindica uma prioridade com base no pedido provisório 62/352254 que foi depositado no Departamento de Patentes e Marcas Registradas dos EUA em 20 de junho de 2016, cuja divulgação é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE [002] Está incorporada integralmente por referência uma listagem de sequência de nucleotídeos/aminoácidos legível em computador enviada simultaneamente junto deste e identificada como se segue: um arquivo de 31.2 KB ASCII (Texto) chamado 78126-US-PSP20160620-Sequence-Listing-ST25.txt criado em 6 de junho de 2016.

FUNDAMENTOS [003] O cruzamento moderno de plantas se baseia nas metodologias de cruzamento tradicionais para desenvolver e produzir novas variedades de espécies de plantas. Normalmente, o objetivo do cruzamento de plantas é identificar e produzir traços (como gene único ou múltiplos genes) seletivamente a partir das linhas parentais em plantas de progênie. Esses processos podem ser limitados pela ligação genética de traços desejáveis (por exemplo, traços que codificam um fenótipo com uma vantagem agronômica) com traços indesejáveis (por exemplo, traços que codificam um fenótipo prejudicial ou exemplifica uma desvantagem agronômica).

[004] As metodologias tradicionais de cruzamento vegetal e composições dependem da análise de grandes populações reprodutoras para identificar plantas de progênie que quebraram a ligação entre um primeiro traço localizado em um lócus genômico específico e um sePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 6/301

2/95 gundo traço localizado em um locus genômico específico. Especialmente, se o primeiro e o segundo traços estiverem fortemente ligados nas plantas de origem. Normalmente, os traços, que estão localizados em loci genômicos específicos e distintos podem segregar e recombinar em progênie através de eventos de crossover que dependem da ruptura e junção dos cromossomos. A frequência de recombinação entre os dois traços pode ser calculada e determinada uma vez que é conhecido que mais eventos de cross-over ocorrem aleatoriamente ao longo do comprimento do cromossomo, e que a frequência de recombinação é uma função da distância entre o primeiro locus genômico que compreende um traço e o segundo lócus genômico que compreende um segundo traço. Por conseguinte, quanto mais próximos dois loci que compreendem dois traços estiverem um do outro em um local, é menos provável que ocorra um cross-over entre dois loci que compreendem dois traços. O resultado é que os loci intimamente ligados que compreendem traços fortemente ligados não podem ser separados entre si e são transmitidos juntos para a progênie. Outra composição deste processo é a observação de que algumas regiões do cromossomo são caracterizadas como localizações genômicas que possuem, de forma inerente, baixos níveis de recombinação. Os loci geneticamente ligados que compreendem traços que estão localizados nesses locais genômicos permanecerão geneticamente ligados apesar de estarem localizados distalmente um do outro sendo transmitidos, assim, junto com a progênie.

[005] As metodologias e composições que permitem aumentar a frequência de recombinação entre dois traços localizados em loci genômicos separados e distintos permitiriam eficiências aprimoradas na ruptura da ligação genética entre dois traços. Consequentemente, o desenvolvimento de novas variedades de plantas poderia ser produzido de forma mais rápida e menos dispendiosa, tanto em termos finanPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 7/301

3/95 ceiros quanto em termos de recursos. Em última análise, a ligação firme dos traços desejáveis com traços indesejáveis pode ser quebrada para que os criadores de plantas possam produzir novas variedades de plantas ou de progênie que contenham apenas traços desejáveis que são desejados para introgressão na progênie pelo criador da planta, e qualquer arraste gênico (linkage drag) associado a traços indesejáveis é eliminado.

[006] Portanto, há uma necessidade de novas composições e metodologias que permitem aumentar a frequência de recombinação de um traço heterozigoto ligado a um locus dentro das plantas e quebrar a ligação genética entre um primeiro locus heterozigoto que compreende um traço e um segundo locus que compreende um traço. BREVE SUMÁRIO [007] Nas modalidades da divulgação em questão, a divulgação se relaciona a um método para aumentar a frequência de recombinação genética entre um primeiro locus geneticamente ligado a um segundo locus dentro de um genoma de uma planta, que compreende: a) introdução em uma nuclease específica de sítio no genoma da planta; b) produção de uma ruptura de fita dupla com a nuclease sítioespecífica em um dos dois cromossomos homólogos; c) recombinação no genoma da planta; e, d) modificação do genoma da planta, em que o genoma da planta modificado compreende aumento da frequência de recombinação genética entre o primeiro locus e o segundo locus. [008] Em uma modalidade deste método, cada um dos loci codifica pelo menos um traço. Em outras modalidades, a recombinação compreende recombinação meiótica ou recombinação mitótica. Em outras modalidades, a frequência da recombinação genética aumenta de 1,25 para 17,8 vezes. Em modalidades adicionais, a distância entre o primeiro locus e o segundo locus é de cerca de 0,01 cM a cerca de 500 cM. Em outras modalidades, a distância entre o primeiro locus e o

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4/95 segundo locus é de cerca de 10 pb a cerca de 10 Mbp. Como uma modalidade, o primeiro locus está localizado em um primeiro cromossomo e o segundo locus está localizado em um segundo cromossomo. Em uma modalidade adicional, o primeiro locus primeiro para o segundo locus estão presentes em um local genômico com baixos níveis de frequência de recombinação. Por exemplo, em uma modalidade, o traço compreende um traço desejável ou um traço indesejável. Nesse exemplo, o traço desejável ou o traço indesejável é um traço nativo ou um traço transgênico. Por exemplo, o traço indesejável pode ser um rendimento reduzido, uma resistência reduzida à doença, uma resistência reduzida a pragas, uma tolerância reduzida a herbicida, crescimento reduzido, tamanho reduzido, produção reduzida de biomassa, quantidade reduzida de sementes produzidas, resistência reduzida contra salinidade, resistência reduzida contra estresse por calor, reduzida resistência contra estresse por frio, resistência reduzida contra estresse por seca e qualquer combinação destes. Alternativamente, o traço desejável pode ser um traço de maior rendimento, maior resistência à doença, maior resistência a pragas, maior tolerância a herbicidas, aumento do crescimento, aumento do tamanho, aumento da produção de biomassa, aumento da quantidade de sementes produzidas, maior resistência à salinidade, maior resistência ao estresse por calor, maior resistência ao estresse por frio, maior resistência ao estresse por seca e qualquer combinação destes.

[009] Em outras modalidades, o primeiro locus compreende um marcador polimórfico e o segundo locus compreende um traço. Em uma modalidade adicional, o primeiro locus compreende um marcador polimórfico e o segundo locus compreende um marcador polimórfico. Em outras modalidades, a planta pode ser uma planta poliploide ou uma planta diploide.

[0010] Em modalidades subsequentes, a ruptura de fita dupla é

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5/95 produzida por uma nuclease sítio-específica. Por exemplo, a nuclease sítio-específica pode ser uma nuclease dedo de zinco, uma nuclease TALEN, uma nuclease CRISPR-Cas9, uma meganuclease e uma nuclease de zíper de leucina. Em outra modalidade, a nuclease sítioespecífica é distribuída a uma célula por recombinação intragenômica ou por distribuição direta.

[0011] Em outras modalidades, o método compreende: produzir uma planta de progênie que compreende o genoma da planta modificada; cruzar a planta de progênie com outra planta ou com ela mesma; e gerar uma semente da planta de progênie. Em uma modalidade, os primeiros loci que compreendem um primeiro traço são heterozigotos e localizados no primeiro cromossomo homólogo e, independentemente, se segregam dos primeiros loci que compreendem um segundo traço resultando, assim, em uma planta de progênie que compreende apenas os primeiros loci que compreendem o primeiro traço localizado no primeiro cromossomo homólogo. Em outra modalidade, os segundos loci que compreendem um segundo trato são heterozigotos e estão localizados no segundo cromossomo homólogo e permanecem geneticamente ligados a um terceiro locus genômico resultando, assim, em uma planta de progênie que compreende os segundos loci compreendendo o segundo traço geneticamente ligado a um terceiro locus genômico.

[0012] Em modalidades subsequentes, a planta é selecionada dentre uma planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledônea. Por exemplo, a planta pode ser uma planta de tabaco, uma planta de soja, uma planta de algodão, uma planta Brassica, uma planta de milho, uma planta de sorgo, uma planta de trigo ou uma planta de arroz.

[0013] As características anteriores e outras características se tornarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias modalidades as quais procedem com referência às figuras anexas.

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BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0014] Figura 1: Esta figura mostra um mapa de plasmídeo de pDAB105855 contendo sequência de DNA alvo que compreende; sequência RB7 MAR/sítio de ligação v1 eZFN4, promotor OsUbi3/Phi YFP/ZmPer5 3'UTR v2/eZFN1 sítio de ligação/ELP1 HR2 v2, ZmUbi1 promotor v8/Cry34Ab1 v2/StPinII 3' UTR v2, TaPer promotor v3/Cry35Ab1 v5/StPinII 3' UTR v2, SCBVv2/AAD-1v3/ZmLip 3'UTR v1 entre bordas do T-DNA.

[0015] Figura 2: Esta figura mostra um mapa de plasmídeo de pDAB113068 contendo sequência de DNA alvo que compreende: Sítio de Ligação eZFN1; íntron do promotor OsUbi3::transgene TraP4 DGT28::ZmLip 3'UTR; Sítio de Ligação SBS8196::Sítio de Ligação a eZFN4::SBS19354::Sítio de Ligação SBS15590::Sítio de Ligação eZFN8::Sítio de Ligação SBS18473::Sítio de Ligação eZFN1; promotor ZmUbi1::transgene PAT::ZmLip 3' entre bordas do T-DNA.

[0016] Figura 3: Esta figura mostra um mapa de plasmídeo de pDAB105825 contendo um cassete de expressão para nuclease sítioespecífica eZFN1.

[0017] Figura 4: Esta figura mostra a transformação e estratégia de cruzamento usada para exemplificar o aumento das frequências de recombinação entre dois alelos resultantes da clivagem de um dos dois cromossomos homólogos por uma nuclease sítio-específica (por exemplo, uma nuclease dedo de zinco).

[0018] Figura 5: Esta figura mostra um esquema dos construtos usados para a divulgação e localização do sítio de ligação eZFN1. DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Visão Geral [0019] No curso dos projetos de melhoria de cultivo envolvendo protocolos de cruzamento seletivo, é desejável, muitas vezes, interromper a ligação genética de um primeiro locus genômico primeiro e

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7/95 um segundo locus genômico próximo. Especialmente quando o segundo locus codifica um traço menos desejável ou até mesmo prejudicial. Por exemplo, o arraste gênico pode ser descrito como a presença de ligação genética entre dois traços, por exemplo, um traço desejável e outro traço não desejável. Como consequência desta ligação genética, os dois loci que compreendem dois traços são herdados juntos. A confiança na recombinação natural para gerar os recombinantes desejáveis é inadequada se os dois traços estiverem firmemente ligados. Infelizmente, com os métodos disponíveis na técnica, a remoção da ligação genética entre esses traços desejados e indesejados em uma planta e a obtenção de uma planta com apenas os traços desejados, acabaram se tornando difíceis, demoradas e, em vários casos, impossíveis. Se a frequência de recombinação pode ser maior durante o processo de cruzamento, de acordo com os métodos da presente divulgação, a recombinação entre os dois loci compreendendo os traços teria uma maior frequência na progênie e o criador de planta pode desenvolver plantas de progênie novas contendo apenas o traço desejável em uma forma mais eficiente e menos cara.

II. Definições [0020] Em todo o pedido, inúmeros termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente da especificação e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado em tais termos, são fornecidas as seguintes definições.

[0021] O termo alelos refere-se a uma ou mais modalidades alternativas de um gene em um locus específico, sendo que todos os alelos se relacionam a um traço ou característica em um locus específico. Em uma célula diploide de um organismo, os alelos de um determinado gene estão localizados em um local específico, ou locus (loci no plural) em um cromossomo. Um alelo está presente em cada um dos dois cromossomos homólogos. Uma espécie de planta diploide

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8/95 pode ter alelos diferentes em loci correspondentes nos cromossomos homólogos.

[0022] O termo retrocruzamento refere-se a um cruzamento entre um filhote e um dos seus pais ou de um indivíduo geneticamente idêntico com um dos seus pais. O termo retrocruzamento engloba retrocruzamento avançado, se referindo a cruzamentos entre uma progênie de retrocruzamento e um progenitor puro de uma geração anterior ou um indivíduo geneticamente idêntico a um progenitor puro de uma geração anterior. Os termos retrocruzamento ou retrocruzamento avançado são entendidos como a inclusão de acasalamento ou fertilização assistida para gerar progênie do retrocruzamento. Métodos preferenciais para fertilização ou reprodução assistida incluem, entre outros, clonagem, fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de esperma. Os métodos para fertilização assistida são bem conhecidos na técnica (Thornton et al., 1999; Loutradis et al., 2000; Nakagata, 2000) Patente US n° 5.453.366, 5.541.081, 5.849.713). O retrocruzamento pode ser usado para introduzir uma ou mais conversões de locus de um fundo genético em outro.

[0023] O termo gene quimérico (ou gene recombinante) refere-se a qualquer gene, que não é encontrado normalmente na natureza em uma espécie, em particular um gene em que uma ou mais partes da sequência de ácido nucleico estão o presente e que não estão associadas a outros na natureza. Por exemplo, o promotor não está associado, na natureza, à parte ou à totalidade da região transcrita ou à outra região reguladora. O termo gene quimérico é entendido como a inclusão de construtos de expressão em que um promotor ou sequência de transcrição reguladora está operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de codificação ou a uma sequência antisense (complemento reverso da fita sense) ou de repetição invertida (sense e antisense, por meio dos quais o transcrito de RNA forma RNA em fita duPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 13/301

9/95 pla mediante transcrição).

[0024] O termo cromátide refere-se a uma das duas partes de um cromossomo que existe após a replicação, havendo uma dupla hélice de DNA antes de replicação e duas duplas hélices idênticas após a replicação, elementos básicos das duas cromátides, ligados pelo centrômero de um cromossomo replicado; a recombinação intracromossômica provoca, muitas vezes, um parâmetro genético.

[0025] O termo cromossomo é uma das estruturas de autorreplicação, em formato de rosca ou haste dentro dos núcleos das células eucarióticas que consiste em cromatina extremamente condensada e contém informação genética para funções específicas da célula.

[0026] O termo cruzamento refere-se ao acasalamento de duas plantas de origem.

[0027] O termo crossing over ou crossover refere-se à troca recíproca de braços do cromossomo e pode, por exemplo, ser visualizado em fases finais da prófase meiótica I como quiasmata.

[0028] O termo traço desejável refere-se a qualquer traço herdável que confere uma vantagem ou maior valor para uma safra comercialmente cultivada, enquanto que a expressão traço indesejável refere-se a qualquer trato hereditário que seja prejudicial quando expresso na safra cultivada comercialmente. É concebível que, em alguns casos, os traços genéticos do candidato possam ser classificados como um traço desejável e um traço indesejável dependendo da aplicação do traço e da intenção do criador da planta. Exemplos específicos desses tratos mitigantes e comercialmente desejáveis são apresentados neste documento.

[0029] O termo diploide refere-se a uma planta de mamona típica com dois conjuntos (2N) de cromossomos, em que cada conjunto compreende 20 cromossomos. A planta diploide, usada neste documento, é isogênica à planta poliploide multiplicada, ou seja, os dois

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10/95 conjuntos de cromossomas contêm alelos essencialmente idênticos em todos os locais. A planta diploide pode ter ocorrência natural, ser geneticamente modificada ou ser um produto de cruzamento.

[0030] O termo traço dominante refere-se a organismos diploides ou outros poliploides um traço que é fenotipicamente manifesto no estado heterozigoto ou homozigoto e refere-se a alelos que manifestam plenamente suas expressões fenotípicas sobre outro alelo recessivo. [0031] O termo expressão de um gene refere-se ao processo em que uma região de DNA, que é operacionalmente ligada a regiões reguladoras apropriadas, especialmente um promotor, é transcrito em um RNA, que é biologicamente ativo, ou seja, que é capaz de ser traduzido em uma proteína ou peptídeo biologicamente ativo (ou fragmento de peptídeo ativo) ou que está ativo por si mesmo (por exemplo, silenciamento de gene pós-transcricional ou RNAi). A sequência de codificação é, preferencialmente, orientada por sense e codifica uma proteína ou peptídeo ativo biologicamente desejado ou um fragmento de peptídeo ativo. Em abordagens de silenciamento do gene, a sequência de DNA está preferencialmente presente na forma de um DNA antisense ou de um DNA de repetição invertido, compreendendo uma sequência curta do gene alvo antisense em orientação antisense ou sense e antisense.

[0032] O termo fold change é uma medida que descreve a mudança de uma quantidade de um valor inicial para um valor final. Por exemplo, um valor inicial de 30 e um valor final de 60 corresponde a um fold change de 1 (ou, equivalentemente, uma mudança de 2 vezes) ou, termos gerais, um aumento de duas vezes.

[0033] O termo gene refere-se a uma sequência de DNA que compreende uma região (região transcrita), que é transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, mRNA) em uma célula operacionalmente ligada a regiões reguladoras apropriadas (por exemplo, um

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11/95 promotor). Assim, um gene pode compreender várias sequências operacionalmente ligadas, como um promotor, uma sequência líder em 5' compreendendo, por exemplo, sequências envolvidos na iniciação da tradução, uma região de codificação (proteína) (cDNA ou DNA genômico) e uma sequência não traduzida em 3' compreendendo, por exemplo, sítios de terminação da transcrição.

[0034] O termo genoma, usado neste documento, refere-se a um material ou mistura de materiais, que contém material genético de um organismo. O termo DNA genômico, como utilizado neste documento refere-se aos ácidos desoxirribonucleico que são obtidos a partir de um organismo. Os termos genoma e DNA genômico abrangem a informação hereditária de um indivíduo normalmente codificada em ácidos nucleicos, DNA ou RNA e que inclui genes e sequências não codificantes. O genoma pode se referir a ácidos nucleicos que compõem um conjunto de cromossomos de um organismo (genoma haploide) ou ambos os conjuntos de um organismo (genoma diploide) dependendo do contexto em que é usado.

[0035] O termo recombinação genética usado neste documento tem um significado amplo que indica um fenômeno de clivagem de DNA/união envolvendo DNAs. O significado do termo recombinação genética usado na presente divulgação engloba recombinação homóloga, recombinação não homóloga, conversão de gene, inversão, crossover desigual, crossover, translocação, mudança de número de cópia, fusão de cromossomo e mutação. Além disso, o termo rearranjo refere-se a uma situação em que o aumento da frequência de recombinação genética causa uma recombinação entre sequências genômicas existentes, resultando em uma alteração parcial ou completa da sequência genômica.

[0036] O termo geneticamente ligado refere-se a um primeiro locus que está sendo espaçado dentro de uma determinada distância

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12/95 genética a partir de um segundo locus de modo que os dois loci sejam herdados em uma planta de progênie, esses traços estão em desequilíbrio de ligação e são estatisticamente determinado para não serem classificados independentemente.

[0037] O termo heterozigoto refere-se a uma célula individual diploide ou poliploide ou planta com alelos diferentes (formas de um determinado gene) pelo menos em um locus, por exemplo, o termo denota uma condição genética em que alelos diferentes residem no mesmos locus em cromossomos homólogos.

[0038] O termo homólogo, no contexto de um par de cromossomos homólogos, refere-se a um par de cromossomos de um indivíduo que são similares em tamanho, posição de gene e localização do centrômero e que se alinham e fazem sinapse durante a meiose. Em um indivíduo, um cromossomo de um par de cromossomos homólogos é proveniente da mãe do indivíduo (ou seja, maternalmente derivado) enquanto que outros cromossomos do par são provenientes do pai (ou seja, paternalmente derivado). No contexto dos genes, o termo homólogo refere-se a um par de genes em que cada gene reside em cada cromossomo homólogo na mesma posição e tem a mesma função. [0039] O termo recombinação homóloga refere-se a uma troca recíproca em posições correspondentes entre cromossomos homólogos, como entre cromátides não irmãs de cromossomos homólogos durante a meiose. A recombinação homóloga pode ocorrer também em células somáticas durante a mitose (Crossing over somático).

[0040] O termo homozigoto refere-se a uma célula individual ou planta com os mesmos alelos em um ou mais loci, por exemplo, o termo denota uma condição genética em que alelos idênticos residem nos mesmos loci em cromossomos homólogos.

[0041] O termo distribuição intragenômica refere-se à distribuição de um cassete de expressão de gene, em que o cassete de expressão

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13/95 de gene é incorporado ao genoma da planta, de uma planta para uma segunda planta (progênie ou outro pai) pelo cruzamento de duas plantas.

[0042] O termo introgressão refere-se à transmissão de um alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgressão de um alelo desejado em um locus especificado pode ocorrer através de cruzamento sexual entre duas plantas, em que pelo menos uma das plantas tem o alelo desejado dentro de seu genoma. O alelo sofreu introgressão na progênie. Em outro exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por recombinação entre dois genomas doadores in vitro, por exemplo, em um protoplasto fundido, onde pelo menos um dos protoplastos doadores tem o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um transgene ou um alelo selecionado de um marcador ou locus do traço quantitativo.

[0043] O termo sequência de ácido nucleico isolado refere-se a uma sequência de ácido nucleico que não está mais no ambiente natural do qual foi isolada, por exemplo, a sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira bacteriana ou no genoma vegetal nuclear ou do plastídeo.

[0044] O termo desequilíbrio de ligação refere-se a uma associação não aleatória de alelos de dois ou mais loci. Isso implica que um grupo de alelos marcadores ou alelos foram herdados juntos.

[0045] O termo arraste gênico refere-se aos efeitos (normalmente indesejáveis) dos traços ligados aos traços desejáveis que estão sofrendo introgressão em uma planta de progênie. Como resultado do arraste gênico, o traço indesejável é herdado com o traço desejável como resultado de estar geneticamente ligado ao traço indesejável. [0046] O termo locus refere-se à posição de um gene ou de qualquer sítio genético que foi definido geneticamente, por exemplo,

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14/95 em um mapa do cromossomo ou gene. Um locus pode ser um gene, ou parte de um gene ou uma sequência de DNA que tem uma função reguladora e pode estar ocupado por sequências diferentes. A distância relativa entre dois loci pode ser dada fazendo referência se à unidade de Morgan, mas um locus também pode ser identificado pela natureza dos genes vizinhos. Nos métodos de divulgação do objeto, o primeiro e o segundo locus são diferentes, ou seja, se primeiro locus está em uma posição específica em um primeiro cromossomo, o segundo locus está em uma posição específica no primeiro cromossomo cujo locus tem uma distância específica a partir do primeiro locus de modo que a frequência de recombinação entre os loci possa ser determinada.

[0047] O termo meiose ou meiótico refere-se a um processo de duas fases de divisão nuclear que reduz o número de cromossomos somáticos (2n) à metade (n) e que, geralmente, é seguido da formação de gametas. Na primeira fase da meiose o número de cromossomas é reduzido, em que na segunda fase da meiose há uma divisão equacional do cromossomo resultando em quatro núcleos da filha, tendo uma cromátide cada.

[0048] Apesar de o termo mitose ou mitótico ser comumente usado como se fossem sinônimo do termo divisão celular, mitose, corretamente, refere-se a apenas uma expressão do processo de divisão celular: processo em que as cromátides irmãs são divididas igualmente entre duas células filhas. Nas células eucarióticas, a mitose é seguida pela citocinesia, que é o processo pelo qual o citoplasma celular é clivado em duas células filhas geneticamente idênticas, mas distintas.

[0049] O termo modificar, modificado, modificando ou modificação não é especialmente limitado ao usado neste documento e inclui um ato definido por um ou mais dentre mudança, controle, alteraPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 19/301

15/95 ção, atenuação, transformação ou fazer diferente. Em uma modalidade, o termo modificar, modificado, modificando ou modificação inclui modificação química e modificação biológica. Em outra modalidade, o termo modificar, modificado, modificando ou modificação inclui alteração de um genoma da planta de modo que o genoma não contenha o mesmo material genético original como resultado da deleção, substituição, adições ou outro rearranjo.

[0050] O termo morgan ou unidade de mapa refere-se a uma unidade para expressar a distância relativa entre os genes em um cromossomo. Uma unidade de Morgan (cM) indica uma frequência de recombinação de 100%. Um centimorgan (cM) indica uma frequência de recombinação de 1%.

[0051] O termo sequência de ácido nucleico (ou molécula de ácido nucleico) refere-se a uma molécula de DNA ou RNA na forma de fita simples ou dupla, particularmente uma molécula de DNA que codifica uma proteína ou fragmento de proteína de acordo com a divulgação.

[0052] O termo traço nativo refere-se a um fenótipo de planta não transgênico reconhecido de ocorrência natural que é hereditário e que pode ser usado em diversas variedades de pelo menos uma espécie de planta. Alternativamente, um traço nativo é feita pelo homem e pode ser gerado através da mutagênese de plantas. Um traço nativo sofre, muitas vezes, introgressão, em uma variedade de espécies de escolha pelo cruzamento. A introgressão de um traço nativo pode ocorrer com o auxílio de marcadores moleculares flanqueando o locus ou loci compreendendo o trato de interesse nativo.

[0053] O termo fenótipo refere-se os caracteres observáveis de uma célula individual, cultura celular, planta ou grupo de plantas que resulta da interação entre a composição genética desse indivíduo (ou seja, o genótipo) e o ambiente.

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16/95 [0054] O termo planta refere-se à planta inteira ou a partes de uma planta, como células, tecidos ou órgãos (por exemplo, pólen, sementes, gametas, raízes, folhas, flores, botões de flores, anteras, fruta, etc.), que podem ser obtidos da planta, bem como os derivados de qualquer um desses e progênie derivada dessa planta por autopolinização (selfing) ou cruzamento. O termo células vegetais incluem protoplastos, gametas, culturas em suspensão, micrósporos, grãos de pólen, etc., isoladamente ou dentro de um tecido, órgão ou organismo. [0055] O termo poliploide refere-se a uma planta com três ou mais conjuntos de cromossomos (por exemplo, 3N, 4N, 5N, 6N e muito mais). De acordo com algumas encarnações deste aspecto da presente divulgação, a planta poliploide é autopoliploide.

[0056] O termo progênie refere-se à descendência direta de uma planta particular (autocruzamento) ou um par de plantas (polinizado cruzado) e inclui todas as plantas e sementes de todas as gerações subsequentes resultantes de uma determinada geração projetada. Os descendentes podem ser, por exemplo, da F₁, F₂ ou qualquer geração subsequente.

[0057] O termo promotor refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montante em relação ao sentido da transcrição do sítio de iniciação da transcrição do gene e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para polimerase de RNA dependente de DNA, sítios de iniciação da transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, entre outros, sítios de ligação do fator de transcrição e sítios de ligação proteína repressora e ativadora e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas por aqueles versados na técnica para atuar, direta ou indiretamente, para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo na maioria dos tecidos na maioria das

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17/95 condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor induzível é um promotor que é regulado de maneira fisiológica (por exemplo, por aplicação externa de certos compostos) ou por desenvolvimento. Um promotor específico de tecido só está ativo em tipos específicos de tecidos ou células, enquanto um promotor preferencial de tecido está, preferencialmente, mas não exclusivamente, ativo em certos tecidos ou células. Um promotor que está ativo em plantas ou células vegetais é um promotor que tem a capacidade de iniciar a transcrição em células vegetais.

[0058] Os termos proteína ou polipeptídeo são usados permutavelmente e referem-se a moléculas que consistem em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a um modo específico de ação, tamanho, estrutura em 3 dimensões ou origem. Um fragmento ou parte de uma proteína pode, portanto, ainda ser referido como proteína. Uma proteína isolada é usada para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em célula bacteriana recombinante ou hospedeira vegetal.

[0059] O termo traço recessivo refere-se a organismos diploides ou outros organismos poliploides um traço que é fenotipicamente manifesto no estado homozigoto, mas que é mascarado na presença de seu alelo dominante.

[0060] O termo recombinante usado neste documento significa que algo foi recombinado, de modo que quando feita referência a um construto do ácido nucleico, o termo refere-se a uma molécula que é composta de sequências de ácido nucleico que são unidas ou produzidas por meio de técnicas biológicas moleculares. O termo recombinante ou recombinação quando é feita referência à composição genética refere-se a um gameta ou progênie com novas combinações de alelos que não ocorreram nos genomas de origem.

[0061] O termo recombinação refere-se a um processo pelo qual

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18/95 a ligação dos genes é alterada. Devido ao processo de recombinação, a combinação de genes em uma molécula, célula ou organismo de progênie tem um padrão diferente do que da combinação de genes nas moléculas, células ou organismos de origem. A recombinação pode ocorrer devido à troca de sequências de DNA entre dois cromossomos ou à nova associação de genes em um recombinante. Na acepção da presente divulgação, a recombinação se deve à troca de sequências de DNA entre dois cromossomos pelo processo de crossing-over, ou seja, troca recíproca de segmentos de cromossomos homólogos pela ruptura simétrica e recombinação transversal. Portanto, os termos recombinação e crossing-over podem ser usados de forma intercambiável.

[0062] O termo frequência de recombinação ou frequência de crossing-over ou frequência de recombinação genética é usada para denotar a frequência por meio da qual o crossing-over e a recombinação ocorrem entre dois loci em um cromossomo. A frequência de recombinação é normalmente calculada como a porcentagem de indivíduos que têm o fenótipo recombinado pelo número total de indivíduos analisados. No processo de divulgação é calculado como o número de indivíduos que mostram a expressão da proteína repórter pelo número total de indivíduos analisados em uma população cruzada de teste como a do pólen da progênie de F1 ou as plantas da progênie de F2 como discutido mais abaixo. A frequência de recombinação basal é a frequência de recombinação em plantas que são cultivadas em condições normais, que não foram mutagenizadas ou tratadas com estímulos bióticos ou abióticos e que não foram transformados com cassetes de expressão além do primeiro e segundo e, opcionalmente, terceiro e quarto cassete de expressão. A frequência de recombinação induzida é a frequência de recombinação em plantas que contêm uma ruptura de fita dupla com um dos cromossomos homólogos influenciando,

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19/95 assim, recombinação entre os loci geneticamente ligados.

[0063] O termo separação refere-se a um ou mais processo usado para isolar completa ou parcialmente um do outro, um ou mais componentes, e/ou um ou mais processo que resulta em um ou mais componentes que não estão mais localizados no mesmo lugar. Um ou mais componentes incluem, opcionalmente, entre outros, um ou mais tipos de cromossomos, ou cromossomos simples ou cópias simples de um tipo de cromossomo. Os processos incluem, entre outros, manual, automático, semiautomático, por controle remoto e/ou robótico. As modalidades ilustrativas desses processos incluem, entre outros, classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).

[0064] O termo planta transgênica ou planta transformada refere-se, neste documento, a uma planta ou célula vegetal que foi transformada com um gene quimérico. O referido gene quimérico pode ou não ser integrado ao genoma da planta. Em uma modalidade preferencial ele não é integrado. Uma célula vegetal transgênica pode referir-se a uma célula vegetal, isoladamente ou em cultura de tecidos, ou uma célula vegetal contida em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado e ambas as possibilidades estão especificamente incluídas neste documento. Portanto, uma referência a uma célula vegetal na descrição ou reivindicações não pretende referir-se apenas a células isoladas ou protoplastos na cultura, mas refere-se a qualquer célula vegetal, em qualquer lugar que possa estar localizada ou em qualquer tipo de planta tecido ou órgão que possa estar presente.

[0065] O termo variedade refere-se a uma subdivisão de uma espécie, que consiste em um grupo de indivíduos dentro da espécie que é distinto na forma ou função de outros arranjos similares de indivíduos.

III. Modalidades [0066] Embora várias modalidades da invenção sejam divulgadas

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20/95 neste documento, muitas adaptações e modificações podem ser feitas no âmbito da invenção, de acordo com o conhecimento geral daqueles versados na técnica. Essas modificações incluem a substituição de equivalentes conhecidos por qualquer aspecto da invenção para obter o mesmo resultado substancialmente da mesma forma. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. No relatório descritivo, a palavra compreendendo é usada como um termo aberto, substancialmente equivalente à expressão incluindo, entre outros e a palavra compreende tem um significado correspondente. A citação de referências neste documento não pode ser interpretada como uma admissão de que essas referências são estado da técnica em relação à presente invenção. Todas as publicações, incluindo entre outras, patentes e pedidos de patente, citados neste relatório descritivo, são incorporadas a este documento por referência como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência a este documento e como se estivesse integralmente aqui prevista.

[0067] São apresentados métodos e composições para aumentar a frequência de recombinação genética entre loci ligados geneticamente no genoma de uma planta, em que os loci codificam um traço, compreendem um alelo ou compreendem um marcador polimórfico. Além disso, são apresentados métodos e composições para aumentar a quantidade de segregação entre loci ligados geneticamente no genoma de uma planta, em que os loci codificam um traço, compreendem um alelo ou compreendem um marcador polimórfico. São apresentados também métodos e composições para aumentar o desequilíbrio de ligação genética entre loci ligados geneticamente no genoma de uma planta, em que os loci codificam um traço, compreendem um alelo ou compreendem um marcador polimórfico. Geralmente, são apresentados métodos e composições para reduzir a ligação genética

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21/95 entre alelos ligados geneticamente no genoma de uma planta, em que o alelo codifica um traço, compreende um loci ou compreende um marcador polimórfico.

[0068] Em um aspecto, a divulgação do objeto refere-se ao aumento de recombinação genética entre dois loci genômicos. A distância entre os loci cromossômicos é regida pela frequência de recombinação entre cromossomos homólogos, nos quais os loci estão localizados. Ao monitorar a frequência de recombinação genética entre dois loci, um criador de planta pode determinar quantas gerações sucessivas de retrocruzamento são necessárias para quebrar a ligação de um primeiro locus com um segundo locus, de modo que apenas o primeiro locus passe para as plantas da progênie. Em uma modalidade, a ligação genética entre dois loci ligados geneticamente é rompida pela introdução de uma ruptura de fita dupla em um dos dois cromossomos homólogos resultando, assim, no aumento da recombinação genética. O aumento na recombinação genética pode ser determinado da seguinte forma.

[0069] Em um aspecto, o aumento da frequência de recombinação genética é qualquer porcentagem maior que a frequência de recombinação genética de ocorrência natural entre dois loci ligados em um genoma de planta. A frequência de recombinação genética de ocorrência natural entre dois loci ligados em um genoma da planta pode ser determinada como uma porcentagem de recombinação genética. Em alguns aspectos, os métodos da divulgação do objeto resultam no aumento desta frequência de recombinação genética de um aumento de 1,25 vez a 17,8 vezes na recombinação genética. Em algumas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 1,25 vez na recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética

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22/95 resultam em um aumento de 2 vezes na recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 2,25 vez na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 3,2 vezes na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 8 vezes na recombinação genética. Em modalidades adicionais deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 8,6 vezes na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 13 vezes na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 17,8 vezes na recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 17,75 vezes na recombinação genética. Outros aumentos na frequência de recombinação genética que resultam de métodos da divulgação do objeto aumentam a recombinação genética com um aumento superior a 1,25 vez, 1,5 vez, 1,75 vez, 2 vezes, 2,25 vezes, 2,5 vezes, 2,75 vezes, 3 vezes, 3,25 vezes, 3,5 vezes, 3,75 vezes, 4 vezes, 4,25 vezes, 4,5 vezes, 4,75 vezes, 5 vezes, 5,25 vezes, 5,5 vezes, 5,75 vezes, 6 vezes, 6,25 vezes, 6,75 vezes, 7 vezes, 7,25 vezes, 7,5 vezes, 7,75 vezes, 8 vezes, 8,25 vezes, 8,75 vezes, 9 vezes, 9,25 vezes, 9,5 vezes, 9,75 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 21 vezes, 22 vezes, 23 vezes, 24 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 45 vezes, 50 vezes, 55 vezes, 60 vezes,

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23/95 vezes, 70 vezes, 75 vezes, 80 vezes, 85 vezes, 90 vezes, 95 vezes ou 100 vezes.

[0070] Em um aspecto, o aumento da frequência de recombinação genética é qualquer porcentagem maior que a frequência de recombinação genética que ocorre naturalmente entre dois loci ligados em um genoma de planta. A frequência de recombinação genética que ocorre naturalmente entre dois loci ligados em um genoma da planta pode ser determinada como uma porcentagem de recombinação genética. A frequência da frequência de recombinação genética pode ser calculada pela divisão do número de descendentes recombinantes contendo apenas o primeiro locus ou apenas o segundo locus, sozinho e não vinculado pelo número total de descendentes observados. Para esta divulgação, a porcentagem de recombinação genética que ocorreu naturalmente entre dois loci ligados no genoma da planta foi calculada em 3,5% como uma frequência exemplar de recombinação genética. Em alguns aspectos, os métodos da divulgação do objeto resultam no aumento desta frequência de recombinação genética de 4,4% para 62,3% de recombinação genética. Em algumas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 4,4% de recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 7,1% de recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 7,2% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 7,9% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 11,5% de recombinação genética. Nas modalidades adicionais deste aspecto, os métodos para aumentar esta frePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 28/301

24/95 quência de recombinação genética resultam em 27,8% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 30,2% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 45,6% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em 62,3% de recombinação genética. Em algumas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 4,4% na recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento de 7,1% na recombinação genética. Em outras modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 7,2% na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento superior a 7,9% na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 11,5% na recombinação genética. Em modalidades adicionais deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 27,8% na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento maior que 30,2% na recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em mais de 45,6% de recombinação genética. Nas modalidades deste aspecto, os métodos para aumentar esta frequência de recombinação genética resultam em um aumento

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25/95 maior que 62,0% na recombinação genética. Outros aumentos na frequência de recombinação genética que resultam de métodos da divulgação do objeto aumentam a recombinação genética em mais de

4,4%, 4,5%, 4,75%, 5%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6%, 6,25%, 6,75% 7%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8%, 8,25%, 8,75%, 9%, 9,25%, 9,5%, 9,75%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%.

[0071] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se à redução da ligação genética entre dois loci ligados. Em uma modalidade, a ligação genética entre dois loci ligados geneticamente é rompida pela introdução de uma ruptura de fita dupla em um dos dois cromossomos homólogos resultando, assim, no aumento da recombinação genética e na redução subsequente na ligação genética entre dois loci ligados. [0072] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se ao aumento da segregação entre dois loci ligados. Em uma modalidade, a capacidade de dois loci ligados geneticamente de se segregar como um único locus apenas que é transmitida para as plantas de progênie aumenta pela introdução de uma ruptura de fita dupla em um dos dois cromossomos homólogos resultando, assim, no aumento da recombinação genética e em um aumento subsequente da segregação.

[0073] Em outro aspecto, a divulgação do objeto se relaciona ao aumento do desequilíbrio da ligação genética entre dois loci ligados. Em uma modalidade, a capacidade de dois loci ligados geneticamente de permanecerem geneticamente ligados como apenas um locus único que é transmitido para as plantas de progênie aumenta pela introdução de uma ruptura de fita dupla em um dos dois cromossomos homólogos resultando, assim, no aumento da recombinação genética e em um aumento subsequente do desequilíbrio da ligação genética. [0074] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se à rePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 30/301

26/95 combinação que ocorre na fase de divisão celular. Em uma modalidade, pode ocorrer recombinação durante a meiose. Em outra modalidade, a recombinação pode ocorrer durante a mitose. A meiose e a recombinação meiótica estão intrincadas aos processos que foram estudados em graus, níveis e organismos diferentes. Durante a meiose e mitose a recombinação ocorre entre cromossomos homólogos por mecanismos de crossing-over, resultando na troca de segmentos de DNA entre os cromossomos homólogos.

[0075] A mitose e a meiose são, de muitas maneiras, processos opostos. Um papel principal da recombinação de DNA em células mitóticas é preservar a fidelidade das informações genéticas e garantir que elas sejam fielmente reproduzidas e repassadas para as células filhas. Em contraste, a recombinação de DNA durante a meiose atua para criar novas permutações de informações genéticas, facilitando a reorganização ou a miscigenação dos genomas maternos e paternos durante a formação de gametas para permitir a produção de descendência com novos genomas em comparação com qualquer um dos pais. Os diferentes propósitos de recombinação de DNA em células meióticas versus células mitóticas estão refletidos em rolos muitos diferentes e mecanismos de recombinação homóloga em cada tipo de célula.

[0076] Há uma distinção mecanicista fundamental entre os processos primários de recombinação homóloga em células meióticas (linha germinal) em comparação com células mitóticas (vegetativas/somáticas). Em células meióticas, a recombinação homóloga ocorre principalmente entre cromátides não irmãs (para embaralhar o genoma), enquanto que em células mitóticas, a recombinação homóloga ocorre principalmente entre cromátides irmãs (para corrigir erros genômicos). As cromátides irmãs são cópias replicadas de um cromossomo materno ou paterno específico. A recombinação entre cromátiPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 31/301

27/95 des não irmãs (ou seja, entre uma cromátide paterna e uma cromátide materna) ocorre 500-1000 vezes mais frequentemente em células meióticas versus células mitóticas. O processo meiótico de troca de cromátides não irmãs (NSCE) facilita a nova recombinação de informações genéticas de dois pais do organismo. Por outro lado, o processo mitótico de troca de cromátide-irmã (SCE) resultante do reparo mediado por recombinação é o principal mecanismo para manter a fidelidade do genoma em todo o organismo multicelular.

[0077] Em modalidades específicas, a recombinação ocorre durante uma fase citológica da meiose. Durante a meiose, várias fases citológicas são distintas e para cada fase vários mutantes foram descritos em plantas. Durante a fase inicial, a chamada prófase meiótica, vários estágios são discernidos. Durante o estágio inicial chamado Leptóteno, os cromossomos individuais que foram replicados e que consistem em duas cromátides irmãs começam a se condensar e a se tornar mais curtos e mais grossos. Simultaneamente, o envelope nuclear começa a se desintegrar e os cromossomos homólogos começam a associar. O próximo estágio, chamado Zigóteno, os cromossomos são totalmente condensados e os cromossomos homólogos se alinham e começam a formar o chamado complexo sinaptonemático (SC). O mutante dif1/syn1 de Arabidopsis é prejudicado na formação do SC (Bhatt, A. M. et al (1999) Plant J. 19, 463-472; Bai, X. et al (1999) Plant Cell 11, 417-430). Os produtos do gene SYN1/DIF1 são homólogos à coesina de levedura REC8/RAD21 que funciona na sinapse e recombinação. No Paquíteno, a formação do SC é concluída para todos os cromossomos. Nesta fase, a recombinação meiótica ocorre, a qual é iniciada pela formação de rupturas de fita dupla seguidas da troca de cromátide entre cromossomos homólogos. As ligações físicas que são estabelecidas entre as cromátides não irmãs e que persistem mesmo na ausência do complexo sinaptonemáticos são chamadas quiasmata. DuPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 32/301

28/95 rante Diplóteno e Diacinese, os cromossomos se condensam totalmente, o envelope nuclear desapareceu e as fibras do fuso foram formadas. Posteriormente, durante a Metáfase I, os pares de cromossomos homólogos estão localizados no plano equatorial da célula. Então, durante a Anáfase I, os cromossomos homólogos, sendo que cada um consiste em duas cromátides irmãs que sofreram vários eventos de recombinação e são unidas por um centrômero, se movem em direção a polos celulares opostos. Durante a Telófase I, o movimento polar é concluído, o fuso desaparece e a célula começa a se dividir.

[0078] Posteriormente, essas células entram na Prófase II, que é caracterizada pelo alinhamento dos cromossomos condensados no plano equatorial. Um completo do fuso está sendo formado. Durante a Metáfase II, os cromossomos estão totalmente alinhados no plano equatorial e o complexo do fuso é concluído. Durante a próxima fase, chamada Anáfase II, os centrômeros se dividem e as cromátides irmãs se movem em direção a polos opostos. Na Telófase II, este processo de movimento está concluído, o complexo do fuso começa a desaparecer e a divisão celular é iniciada. Posteriormente, os cromossomos retomam sua aparência da Interfase caracterizada por cromossomas desenrolados localizados no interior do envelope nuclear.

[0079] O produto final da meiose II é um conjunto de quatro células haploides geneticamente distintas, que podem sofrer mitose para que se desenvolvam em gametófitos. Os gametófitos produzem gametas que, após a fusão, resultam na formação de um zigoto, que se desenvolve, em um embrião que pode evoluir no esporófito da próxima geração.

[0080] A variação genética, que ocorre no esporófito, é determinada pelos genótipos dos gametas masculinos e femininos que se fundiram na formação do zigoto. Portanto, essa variação genética é criada durante a formação dos esporos masculinos e femininos durante a

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29/95 meiose, que resulta no reagrupamento genético dos cromossomos parentais originais, bem como em regiões cromossômicas devido a eventos de recombinação.

[0081] Em um aspecto, a divulgação se relaciona com loci ligados geneticamente. Geralmente, um locus é qualquer sequência de polinucleotídeos que está fisicamente localizado em um cromossomo. Como uma modalidade, o locus pode abranger qualquer intervalo de pares de bases de polinucleotídeo de 1 par de base até 1.0000.000 de pares de base (ou seja, 1 Mbp) de comprimento. Em outra modalidade, o locus pode compreender um alelo. Em outra modalidade, o locus pode compreender um traço. Em uma modalidade adicional, o locus pode compreender um marcador polimórfico.

[0082] Em outras modalidades, um traço pode incluir um traço transgênico. Os traços transgênicos que são adequados para uso nos presentes construtos divulgados incluem, mas não estão limitados a, sequências de codificação que conferem (1) resistência a pragas ou doenças, (2) tolerância a herbicidas, (3) características agronômicas de valor agregado, tais como: melhoria de rendimento, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de água e qualidade nutricional, (4) ligação de uma proteína ao DNA de uma forma sítio-específica, (5) expressão de pequeno RNA, e (6) marcadores selecionáveis. De acordo com uma modalidade, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto gênico que confere resistência a inseticidas, tolerância a herbicidas, expressão de pequeno RNA, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de água, ou qualidade nutricional.

1. Resistência a Insetos [0083] As várias sequências de codificação de resistência a insetos são uma modalidade de traço transgênico. As sequência operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas

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30/95 (transformantes). As sequências de codificação de resistência a insetos são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de resistência a insetos podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. As sequência de codificação que proporcionam resistência a insetos lepidópteros exemplares incluem: crylA; cry1A.105; crylAb; crylAb(truncada); cry1Ab-Ac (proteína de fusão); crylAc (comercializada como Widestrike®); crylC; crylF (comercializada como Widestrike®); cry1Fa2; cry2Ab2; cry2Ae; cry9C; mocry1F; pinlI (proteína inibidora da protease); vip3A(a); e vip3Aa20. As sequência de codificação que proporcionam resistência a insetos coleópteros incluem: cry34Ab1 (comercializada como Herculex®); cry35Ab1 (comercializada como Herculex®); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7; e mcry3A. As sequências de codificação que proporcionam resistência a múltiplos insetos exemplares incluem ecry31.Ab. A lista acima de genes de resistência a insetos não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de resistência a insetos estão abrangidos pela presente divulgação.

2. Tolerância a Herbicidas [0084] As várias sequências de codificação de tolerância a herbicida são uma modalidade de traço transgênico. Sequências de codificação de tolerância a herbicidas exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de tolerância a herbicidas podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. O herbicida glifosato contém um modo de ação através da inibição da enzima EPSPS (5-enolpiruvilchiquimato-3fosfato sintase). Esta enzima está envolvida na biossíntese de aminoácidos aromáticos que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento de plantas. São conhecidos na técnica vários mecanismos

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31/95 enzimáticos que podem ser utilizados para inibir esta enzima. Os genes que codificam essas enzimas podem ser operacionalmente ligados aos elementos reguladores do gene do objeto da divulgação. Em uma modalidade, os genes de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados aos genes que codificam os genes de resistência ao glifosato que incluem: genes EPSPS mutantes, tais como os genes 2mEPSPS, genes cp4 EPSPS, genes mEPSPS, genes dgt-28; genes aroA; e genes de degradação do glifosato, tais como os genes da glifosato acetil transferase (gat) e os genes da glifosato oxidase (gox). Essas características são atualmente comercializadas como Gly-Tol^TM, Optimum® GAT®, Agrisure® GT e Roundup Ready®. Os genes de resistência para os compostos glufosinato e/ou bialafos incluem os genes dsm-2, bar e pat. As características de bar e pat são atualmente comercializadas como LibertyLink®. Também incluídos estão os genes de tolerância que proporcionam resistência a 2,4-D, tais como os genes aad-1 (deve-se notar que os genes aad-1 têm atividade adicional sobre os herbicidas de ariloxifenoxipropionato) e os genes aad-12 (deve-se notar que os genes aad-12 têm atividade adicional sobre as auxinas sintéticas de piridiloxiacetato). Essas características são comercializadas como tecnologia de proteção de colheita Enlist®. Os genes de resistência para inibidores de ALS (sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidiniltiobenzoatos e sulfonilamino-carboniltriazolinonas) são bem conhecidos na técnica. Esses genes de resistência resultam mais comumente de mutações pontuais na sequência do gene codificante de ALS. Outros genes de resistência de inibidor de ALS incluem os genes hra, os genes csr1-2, genes Sr-HrA e os genes surB. Algumas das características são comercializadas sob o nome comercial Clearfield®. Os herbicidas que inibem HPPD incluem as pirazolonas, tais como pirazoxifeno, benzofenap e topramezona; tricetonas, tais como mesotriona, sulcotriona, tembotriona, benzobiciclona; e

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32/95 dicetonitrilas, tais como isoxaflutol. Esses herbicidas HPPD exemplares podem ser tolerados pelas características conhecidas. Exemplos de inibidores de HPPD incluem os genes hppdPF_W336 (para resistência ao isoxaflutol) e os genes avhppd-03 (para resistência à meostriona). Um exemplo de características tolerantes ao herbicida oxinil incluem o gene bxn, que mostrou conferir resistência ao herbicida/antibiótico bromoxinil. Os genes de resistência para dicamba incluem o gene da dicamba mono-oxigenase (dmo) conforme divulgado na Publicação PCT Internacional n° WO 2008/105890. Os genes de resistência para herbicidas do tipo inibidor de PPO ou PROTOX (por exemplo, acifluorfeno, butafenacil, flupropazil, pentoxazona, carfentrazona, fluazolato, piraflufeno, aclonifeno, azafenidina, flumioxazina, flumiclorac, bifenox, oxifluorfeno, lactofeno, fomesafeno, fluoroglicofeno e sulfentrazona) são conhecidos na técnica. Genes exemplares que conferem resistência a PPO incluem a superexpressão de uma enzima PPO de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Lermontova I e Grimm B, (2000) Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen. Plant Physiol 122:75-83.), o gene da PPO de B. subtilis (Li, X. e Nicholl D. 2005. Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops. Pest Manag. Sci. 61:277-285 e Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk YI, Han SU e Guh JO, (1998) Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide, oxyfluorfen, via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants. Biosci Biotechnol Biochem 62:558-560.) Genes de resistência para ácidos piridinoxi ou fenoxi propriônicos e ciclohexonas incluem os genes codificantes do inibidor da ACCase (por exemplo, Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3). Genes exemplares que conferem resistência a ciclohexanodionas e/ou ao ácido ariloxifenoxipropanoico incluem haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop e quizalofop. FinalmenPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 37/301

33/95 te, os herbicidas que podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina ou benzonitrila, adquirem tolerância pelos genes psbA (tolerância à triazina), genes 1s+ (tolerância à triazina) e pelos genes da nitrilase (tolerância à benzonitrila). A lista acima de genes de tolerância a herbicidas não pretende ser limitante. Qualquer um dos genes de tolerância a herbicidas estão englobados pela presente divulgação.

3. Características Agronômicas [0085] As várias sequências de codificação de traço agronômico são uma modalidade de traço transgênico. Sequências de codificação de características agronômicas exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de características agronômicas podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. O amolecimento retardado de frutas conforme proporcionado pelos genes pg inibe a produção da enzima poligalacturonase responsável pela quebra das moléculas de pectina na parede celular e provoca, assim, o amolecimento retardado da fruta. Além disso, o amadurecimento/senescência retardada da fruta dos genes acc age para suprimir a expressão normal do gene nativo da acc sintase, resultando na redução da produção de etileno e no amadurecimento retardado da fruta. Enquanto isso, os genes accd metabolizam o precursor do hormônio de amadurecimento da fruta, resultando em um amadurecimento retardado da fruta. Alternativamente, os genes sam-k provocam o amadurecimento retardado através da redução da Sadenosilmetionina (SAM), um substrato para a produção de etileno. Fenótipos de tolerância de estresse pela seca, conforme proporcionado pelos genes cspB, mantêm as funções celulares normais sob condições de estresse por água através da preservação da estabilidade e tradução do RNA. Outro exemplo inclui os genes EcBetA que catalisam a produção do composto osmoprotetor, glicina betaína, que conPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 38/301

34/95 fere tolerância ao estresse por água. Além disso, os genes RmBetA catalisam a produção do compostos osmoprotetor, glicina betaína, que confere tolerância ao estresse por água. A intensificação da fotossíntese e do rendimento é proporcionada com o gene bbx32 que expressa uma proteína que interage com um ou mais fatores de transcrição endógenos para regular os processos fisiológicos do dia/noite da planta. A produção de etanol pode ser aumentada pela expressão dos genes amy797E que codificam uma enzima alfa-amilase termoestável que aumenta a produção de bioetanol através do aumento da termoestabilidade da amilase usada na degradação do amido. Finalmente, as composições modificadas de aminoácidos pode resultar pela expressão dos genes cordapA que codificam uma enzima dihidrodipicolinato sintase que aumenta a produção do aminoácido lisina. A lista acima de sequências de codificação de características agronômicas não pretende ser limitante. Qualquer sequência de codificação de característica agronômica está abrangida pela presente divulgação.

4. Proteínas de Ligação ao DNA [0086] As várias sequências de codificação de proteína de ligação de DNA são uma modalidade de um traço de transgênico. As sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades das sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, os seguintes tipos de proteínas de ligação ao DNA podem incluir dedos de zinco, Talens, CRISPRS e meganucleases. A lista acima de sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA estão abrangidas pela presente divulgação.

5. Pequeno RNA [0087] Vários RNAs pequenos são uma modalidade de um traço

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35/95 transgênico. Características de pequenos RNAs exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de pequenos RNAs podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. Por exemplo, o amadurecimento/senescência retardada da fruta do pequeno RNA anti-efe retarda o amadurecimento através da supressão da produção de etileno através do silenciamento do gene ACO que codifica uma enzima formadora de etileno. A produção alterada de lignina do pequeno RNA de ccomt reduz o teor de guanacil (G) lignina através da inibição da S-adenosil-Lmetionina: trans-cafeoil CoA 3-O-metiltransferase endógena (gene CCOMT). Além disso, a tolerância ao esmagamento com mancha negra em Solanum verrucosum pode ser reduzida pelo pequeno RNA Ppo5 que desencadeia a degradação de transcritos de Ppo5 para impedir o desenvolvimento do esmagamento com mancha negra. Também está incluído o pequeno RNA dvsnf7 que inibe a larva da lagartada-raiz do milho com dsRNA contendo um fragmento de 240 pb do gene Snf7 da larva da lagarta-da-raiz do milho. Amido/carboidratos modificados podem resultar de pequenos RNAs, tal como o pequeno RNA pPhL (degrada os transcritos de PhL para limitar a formação de açúcares reduzidos através da degradação do amido) e o pequeno RNA pR1 (degrada os transcritos de R1 para limitar a formação de açúcares reduzidos através da degradação do amido). Adicionalmente, benefícios, tais como acrilamida reduzida, resultam do pequeno RNA asn1 que desencadeia a degradação de Asn1 para diminuir a formação de asparagina e reduzir a poliacrilamida. Finalmente, o fenótipo não escurecido do pequeno RNA de supressão pgas resulta na supressão de PPO para produzir maçãs com um fenótipo não escurecido. A lista acima de pequenos RNAs não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de pequeno RNA estão abrangiPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 40/301

36/95 das pela presente divulgação.

6. Marcadores Selecionáveis [0088] Vários marcadores selecionáveis descritos também como genes repórter são uma modalidade de um traço transgênico. Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação em cadeia da polimerase), Southern blotting, RNA blotting, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressa a partir do vetor. Mas, geralmente os genes repórter são observados através da observação visual de proteínas que, quando expressas, produzem um produto colorido. Genes repórter exemplares são conhecidos na técnica e codificam β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP, Phi-YFP), proteína vermelha fluorescente (DsRFP, RFP, etc.), β-galactosidase, e similares (ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo está incorporado integralmente neste documento por referência).

[0089] Genes de marcadores selecionáveis são utilizados para seleção de células ou tecidos transformados. Os genes de marcadores selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO), resistência à espectinomicina/estreptinomicina (AAD) e higromicina fosfotransferase (HPT ou HGR), bem como os genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicidas geralmente codificam uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes deste agir. Por exemplo, a resistência ao glifosato foi obtida através do uso de genes que codificam enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Os genes e

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37/95 mutantes para EPSPS são bem conhecidos, e descritos mais detalhadamente abaixo. A resistência ao glufosinato de amônio, bromoxinil e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida através do uso de genes bacterianos que codificam PAT ou DSM-2, uma nitrilase, uma AAD-1, ou uma AAD-12, cada uma das quais são exemplos de proteínas que desintoxicam seus respectivos herbicidas.

[0090] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e os genes para resistência/tolerância da acetohidroxiácido sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência ao glifosato incluem os genes mutantes da 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs) e dgt-28 (através da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou diversas formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes da glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros fosfono-compostos incluem os genes bar e pat das espécies Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes, e ácidos piridinoxi ou fenoxi propriônicos e ciclohexonas (genes codificantes do inibidor da ACCase). Os genes exemplares que conferem resistência às ciclohexanodionas e/ou ao ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop, quizalofop) incluem os genes da acetil coenzima A carboxilase (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene da nitrilase). Além disso, esses marcadores selecionáveis podem incluir marcadores de seleção positivos, tais como a enzima fosfomanose isomerase (PMI).

[0091] Em uma modalidade, os genes de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados aos genes que codificam: 2,4-D;

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38/95 neomicina fosfotransferase II; cianamida hidratase; aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase; triptofano descarboxilase; dihidrodipicolinato sintase e aspartato quinase dessensibilizada; gene bar; triptofano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); dihidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico dehalogenase; acetohidroxiácido sintase; 5-enolpiruvilchiquimato-fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; dihidropteroato sintase (sul I); e polipeptídeo do fotossistema II de 32 kD (psbA). Uma modalidade também inclui os genes de marcadores selecionáveis que codificam a resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato; e fosfinotricina. A lista acima de genes de marcadores selecionáveis não se destina a ser limitante. Qualquer gene repórter ou de marcador selecionável está abrangido pela presente divulgação.

[0092] Em algumas modalidades, as sequências de codificação são sintetizadas para a expressão ótima em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por códon otimizado para intensificar a expressão em plantas. Um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência do uso de nitrogênio, um transgene de eficiência do uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, ou um transgene de marcador selecionável pode ser otimizado para a expressão em uma espécie específica de planta ou, alternativamente, pode ser modificado para a expressão ótima em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons vegetais preferenciais podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas em maior quantidade, nas espécies vegetais específicas de interesse. Em uma modalidade, uma sequência de codificação, gene, ou transgene é

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39/95 manipulado para ser expresso em plantas em um maior nível, resultando em maior eficiência de transformação. Os métodos para a otimização de genes vegetais são bem conhecidos. Orientação em relação à otimização e produção de sequências sintéticas de DNA podem ser encontradas, por exemplo, em WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, Patente US n° 6166302, e Patente US n° 5380831, incorporadas neste documento por referência.

[0093] Em outras modalidades, um traço pode incluir um traço não transgênico, como um traço nativo ou um traço endógeno. Os traços nativos exemplares podem incluir traços de rendimento, resistência a traços de doença, resistência a traços de pestes, tolerância a traços de tolerância a herbicida, traços de crescimento, traços de tamanho, produção de traços de biomassa, quantidade de traços de sementes produzidas, resistência a traços de salinidade, resistência a traços de estresse por calor, resistência a traços de estresse por frio, resistência a traços de estresse por seca, traços de esterilidade masculina, traços de amido ceroso, traços de metabolismo de ácido graxo modificado, traços de metabolismo de ácido fítico modificado, traços de metabolismo de carboidrato modificado, traços de metabolismo de proteína modificada e qualquer combinação dos referidos traços.

[0094] Em outras modalidades, os traços nativos exemplares podem incluir vigor precoce, tolerância a estresse, tolerância à seca, maior eficiência do uso de nutrientes, aumento da massa da raiz e maior eficiência do uso de água. Os traços de nativos exemplares adicionais podem incluir resistência a patógenos fúngicos, bacterianos e virais, resistência a inseto da planta; tamanho da flor modificado, número de flor modificada, pigmentação e forma da flor modificada, número de folhas modificadas, pigmentação e forma da folha modificada, número de sementes modificadas, padrão ou distribuição modificada de folhas e flores, comprimento modificado do caule entre nós, massa

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40/95 da raiz modificada e características de desenvolvimento e maior tolerância à seca, sal e antibiótico. Os traços nativos específicos da fruta incluem conteúdo de licopeno modificado, conteúdo modificado de metabólitos derivados do licopeno incluindo carotenoides, antocianinas e xantofilas, conteúdo modificado de vitamina A, conteúdo modificado de vitamina C, conteúdo modificados de vitamina E, pigmentação e forma da fruta modificadas, características modificadas do amadurecimento da fruta, resistência da fruta a patógenos fúngicos, bacterianos e virais, resistência da fruta a insetos, tamanho modificado da fruta e textura modificada da fruta, por exemplo, sólidos solúveis, sólidos totais e componentes da parede celular.

[0095] Em um aspecto, os traços nativos podem ser específicos de uma determinada colheita. Os traços nativos exemplares no milho podem incluir os traços descritos na Patente US n° 9.288.955, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares na soja podem incluir os traços descritos na Patente US n° 9.313.978, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares no algodão podem incluir os traços descritos na Patente US n° 8.614.375, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares no sorgo podem incluir os traços descritos na Patente US n° 9.080.182, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares no trigo podem incluir os traços descritos no Pedido de Patente US n° 2015/0040262, incorporado a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares no trigo podem incluir os traços descritos na Patente US n° 8.927.833, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemplares nas plantas Brassica podem incluir os traços descritos na Patente US n° 8.563.810, incorporada a este documento por referência na sua totalidade. Os traços nativos exemPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 45/301

41/95 plares nas plantas de tabaco podem incluir os traços descritos na Patente US n° 9.096.864, incorporada a este documento por referência na sua totalidade.

[0096] Em outro aspecto, marcadores polimórficos exemplares podem incluir perfis de marcador genético obtidos por técnicas como polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs), DNAs polimórficos aleatoriamente amplificados (RAPDs), reação em cadeia de polimerase arbitrariamente primada (AP-PCR), leitura de amplificação de DNA (DAF), regiões amplificadas caracterizadas por sequência, polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs), repetições de sequência simples (SSRs) também denominadas microssatélites ou polimorfismos de nucleotídeo único. Por exemplo, ver Cregan et al. (1999) An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome Crop Science 39:1464-1490 e Berry et al. (2003) Assessing Probability of Ancestry Using Simple Sequence Repeat Profiles: Applications to Maize Inbred Lines and Soybean Varieties Genetics 165:331-342, sendo que cada um deles é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

[0097] Mapas genéticos definidos com marcadores polimórficos podem ser usados também com o método divulgado. Este processo de seleção assistida por marcador ou cruzamento assistido por marcador envolve a ligação de marcadores polimórficos um traço desejado ou alelo que determina a frequência da co-herança de marcadores polimórficos com o traço/alelo. Uma vez que os marcadores polimórficos foram encontrados, os quais são herdados em grande frequência com o traço alvo, ele pode ser usado como uma sonda molecular para selecionar uma biblioteca de DNA do organismo para identificar um fragmento de DNA que codifique o gene cognato ou loci do traço quantitativos. Uma grande dificuldade com a seleção assistida por marcador ou cruzamento assistido por marcador é que a relação entre distância

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42/95 genética e distância física pode variar entre espécies e mesmo entre diferentes regiões do genoma em uma dada espécie. Portanto, um marcador molecular pode mostrar ligação absoluta com o locus do traço alvo, mas pode estar fisicamente a centenas de quilobases do gene de interesse real. Isto dificulta a identificação e introgressão do gene real responsável pela dificuldade do traço porque pode haver vastas extensões de DNA para avaliar a fim de identificar o traço/alelo. Além disso, é possível mapear mais de um marcador polimórfico que mostre ligação absoluta com o locus do trato alvo. No entanto, o uso de um tamanho de população razoável, pode não ser possível para identificar qual marcador está fisicamente mais perto do gene alvo. Assim, enquanto um marcador pode ter 10 quilobases a partir do gene alvo e o outro ter 400 quilobases a partir do gene alvo, com métodos convencionais que dependem de níveis naturais de frequência de recombinação, pode não haver nenhuma maneira de diferenciar qual dos dois marcadores deve ser usado para clonar com mais eficiência o gene alvo. Portanto, seria benéfico que projetos de clonagem baseados em mapa utilizassem o presente método da divulgação do objeto para fornecer níveis elevados de recombinação de modo a aumentar a precisão na determinação da distância genética entre marcadores polimórficos e loci do traço alvo.

[0098] Meios de executar perfis genéticos de marcador polimórfico usando polimorfismos são bem conhecidos na técnica. SSRs, RFLPs, RAPDs, AP-PCT, DAF, SCARs, AFLPs e SNPs são marcadores genéticos baseados em polimorfismos em sequências de nucleotídeos repetidos, como microssatélites. Os polimorfismos podem se referir a trocas de nucleotídeo único ou repetições de di-, tri- ou tetranucleotídeo dentro de um genoma. A região de repetição pode variar em comprimento entre genótipos enquanto o DNA que flanqueia a repetição é conservado de modo que os iniciadores funcionarão em uma pluraliPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 47/301

43/95 dade de genótipos. Um polimorfismo entre dois genótipos representa repetições de comprimentos diferentes entre as duas sequências de DNA conservadas de flanqueamento de DNA. Um sistema de marcador baseado em SSRs, RFLPs, RAPDs, AP-PCT, DAF, SCARs, AFLPs ou SNPs podem ser altamente informativos na análise de ligação relativa a outros sistemas de marcador em que vários alelos podem estar presentes. Outra vantagem deste tipo de marcador é que, através do uso de iniciadores de flanqueamento, a detecção de marcadores polimórficos pode ser obtida, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR). A detecção por PCR é feita pelo uso de dois iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiam o segmento polimórfico do polimorfismo seguida da amplificação de DNA. Esta etapa envolve ciclos repetidos de desnaturação térmica do DNA seguida do anelamento dos iniciadores para suas sequências complementares em baixas temperaturas e a extensão de iniciadores anelados com DNA polimerase. A separação por tamanho dos fragmentos de DNA em géis de agarose ou poliacrilamida após a amplificação compreende a maior parte da metodologia. Essas metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas aos versados na técnica. Os métodos moleculares de confirmação que podem ser usados para identificar plantas transgênicas são conhecidos aos versados na técnica. Vários métodos exemplares são descritos em mais detalhes abaixo.

[0099] Feixes Moleculares foram descritos para serem usados na detecção de sequência, como uma sequência polimórfica, um traço ou um alelo. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada para se sobrepor à junção de DNA de inserto e genômico flanqueador. A estrutura exclusiva da sonda FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as frações fluorescente e supressora em estrita proximidade. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência

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44/95 genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação por PCR bem sucedida, a hibridização da(s) sonda(s) FRET na sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das frações fluorescente e supressora. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto genômico/transgene flanqueadora devido a amplificação e hibridação bem-sucedida. Tal um ensaio com sonda de hibridização molecular para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00100] O ensaio de sonda de hidrólise, também conhecido com TAQMAN^® (Life Technologies, Foster City, Califórnia), é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA, como uma sequência polimórfica, um traço ou um alelo. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e uma na sequência genômica de flanqueamento para a detecção de eventos específicos. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da fração fluorescente longe da fração supressora na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto genômico/flanqueadora devido a amplificação e hibridação bem-sucedida. Tal um ensaio com sonda de hidrolise para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00101] Os ensaios de KASPar® são um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA, como uma sequência polimórfica, um traço ou um alelo. Brevemente, a amostra de DNA genômica compreendendo o polinucleotídeo de cassete de expressão gênica integrado é exibida usando um ensaio bom base em reação em

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45/95 cadeia de polimerase (PCR) conhecido como sistema de ensaio de KASPar®. O ensaio de KASPar® utilizado na prática da divulgação do assunto pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR de KASPar® que contenha vários iniciadores. Os iniciadores utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender em pelo menos um iniciador forward e pelo menos um iniciador reverse. O iniciador forward contém uma sequência correspondente a uma região específica do polinucleotídeo de DNA e o iniciador reverse contém uma sequência correspondente a uma região específica da sequência genômica. Além disso, os iniciadores utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender em pelo menos um iniciador forward e pelo menos um iniciador reverse. Por exemplo, o mistura de ensaio de PCR de KASPar® pode usar dois iniciadores forward correspondente a dois alelos diferentes e um iniciador reverse. Um dos iniciadores forward contém uma sequência correspondente a região específica da sequência genômica endógena. A segunda iniciador forward contém uma sequência correspondente a uma região específica do polinucleotídeo de DNA. Um iniciador reverse contém uma sequência correspondente a região específica da sequência genômica. Tal um ensaio de KASPar® para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00102] Em algumas modalidades o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado do grupo que consiste em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.

[00103] Em outras modalidades a reação de amplificação é executada usando os segundos corantes de DNA fluorescentes apropriados

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46/95 que são capazes de marcar o DNA celular em um intervalo de concentração detectável por citometria de fluxo e tem um espectro de emissão fluorescente que é detectável por um termociclador em tempo real. Esse deve ser apreciado por aqueles de conhecimento comum que outros corantes de ácidos nucleicos são conhecidos e estão continuamente sendo identificados. Qualquer corante de ácido nucleico apropriado com espectros de emissão e excitação apropriados podem ser empregados, tais como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® e TOTO®. [00104] Em outras modalidades, o Sequenciamento da Próxima Geração (NGS) pode ser usado para a detecção de uma sequência, como uma sequência polimórfica, um traço ou um alelo. Conforme descrito por Brautigma et al., 2010, a análise de sequências de DNA pode ser usada para determinar a sequência nucleotídica do fragmento amplificado e isolado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e sub clonados em um vetor e sequenciado usando o método de terminador de cadeia (também conhecido como sequenciamento Sanger) ou sequenciamento de terminador de corante. Além disso, o amplicon pode ser sequenciado com o Sequenciamento de Próxima Geração. Tecnologias de NGS não exigem a etapa de sub clonagem e várias leituras de sequenciamento podem ser concluídas em uma única reação. Três plataformas de NGS estão comercialmente disponíveis, a Genome Sequencer FLX™ de 454 Life Sciences / Roche, o Illumina Genome Analyser™ de Solexa and Applied Biosystems' SOLiD™ (acrônimo para: Sequencing by Oligo Ligation and Detection). Além disso, existem dois métodos de sequenciamento de molécula que atualmente estão sendo desenvolvidos. Isso inclui true Single Molecule Sequencing (tSMS) de Helicos Bioscience™ e sequenciamento Single Molecule Real Time™ (SMRT) de Pacific Biosciences.

[00105] Genome Sequencher FLX™ que é comercializado por 454

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Life Sciences/Roche é um NGS de longa leitura, que usa a emulsão de PCR e pirossequenciamento para gerar leituras de sequenciamento. Os fragmentos de DNA de 300 - 800 pb ou bibliotecas contendo fragmentos de 3 - 20 kb podem ser usados. As reações podem produzir mais de um milhão de leituras de cerca de 250 a 400 bases por execução para um rendimento total de 250 a 400 megabases. Essa tecnologia produz as leituras mais longas, mas a saída total de sequência por execução é baixa em comparação a outras tecnologias de NGS. [00106] Illumina Genome Analyser™ que é comercializada pela Solexa™ é uma leitura curta de NGS que usa o sequenciamento por síntese aproximar com nucleotídeos de terminador reversível marcado com corante fluorescente e baseia-se em PCR em fase sólida. A construção de bibliotecas de sequenciamento extremidades em pares contendo fragmentos de DNA de até 10 kb pode ser usada. As reações produzem mais 100 milhões leituras curtas que são 35 - 76 bases de comprimento. Esses dados podem produzir 3 - 6 gigabases por execução.

[00107] O sistema Sequencing by Oligo Ligation and Detection (SOLiD) comercializado pela Applied Biosystems™ é uma tecnologia de leitura curta. Essa tecnologia de NGS usa DNA de cadeia dupla fragmentado que são de até 10 kb de comprimento. O sistema usa o sequenciamento pela ligação de iniciadores de oligonucleotídeo marcado com corante e PCR de emulsão para gerar um bilhão leituras curtas que resultam em uma saída de sequência total de até 30 gigabases por execução.

[00108] tSMS de Helicos Bioscience™ e SMRT de Pacific Biosciences™ aplicar uma abordagem diferente que utiliza as moléculas de DNA única para as reações de sequência. O sistema de tSMS Helicos™ produz até 800 milhões leituras curtas que resultam em 21 gigabases por execução. Essas reações são concluídas usando nucleotíPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 52/301

48/95 deos de terminador virtual marcado com corante fluorescente que são descritas como uma abordagem de sequenciamento por síntese. [00109] O sistema de SMRT Next Generation Sequencing comercializado pela Pacific Biosciences™ usa uma sequência em tempo real por síntese. Essa tecnologia pode produzir leituras de até 1.000 pb de comprimento como resultado de não ser limitada por terminadores reversíveis. O rendimento de leitura bruta que é equivalente uma cobertura de uma dobra de um genoma humano diploide pode ser produzido por dia usando essa tecnologia.

[00110] Em outras modalidades, os alelos exemplares estão incluídos na divulgação do objeto. Assim, um polimorfismo é dito como alélico, em que, devido à existência do polimorfismo, alguns membros de uma espécie podem ter a sequência padrão (ou seja, o alelo padrão), enquanto que outros membros podem ter uma sequência variante (ou seja, alelo variante). Assim, como usado neste documento, um alelo é um dentre duas ou mais versões alternativas de um gene ou outra região genética em um local específico em um cromossomo. No caso mais simples, apenas uma sequência variante pode existir, então, o polimorfismo é dito como sendo bialélico. Em outros casos, a população da espécie pode conter múltiplos alelos, e o polimorfismo é denominado trialélico, etc.

[00111] Um gene único que codifica o traço ou região genética pode ter vários polimorfismos diferentes e independentes. Por exemplo, pode haver um polimorfismo bialélico em um sítio, outro polimorfismo bialélico em outro sítio e um polimorfismo multialélico em outro sítio. Quando todas as sequências para um grupo de alelos em um locus cromossômico em uma planta forem iguais, os alelos são ditos homozigotos naquele locus. Quando a sequência de qualquer alelo em um locus específico em uma planta for diferente, a população de alelos é dita heterozigota naquele locus. Em uma modalidade, o locus podem

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49/95 estar presente no genoma da planta como um locus heterozigoto. Em outra modalidade, o locus podem ser composto de um traço que está presente no genoma vegetal como um traço heterozigoto. Em outra modalidade, o locus pode ser composto de um alelo que está presente no genoma vegetal como um alelo heterozigoto. Em outra modalidade, o locus podem ser composto de um marcador polimórfico que está presente no genoma vegetal como um marcador polimórfico heterozigoto.

[00112] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se a traços desejáveis. Em uma modalidade, o traço desejável pode estar intimamente ligado a outro traço indesejável. O criador de plantas decide qual traço é desejável e qual traço é indesejável. Geralmente, o objetivo do criador da planta é produzir uma planta de progênie que possui traços desejáveis e não traços indesejáveis. Os métodos da divulgação fornecem uma solução para superar a ligação genética firme entre dois traços (ou seja, um traço geneticamente desejável ligado a traço indesejável). A ligação genética de um traço desejável a um traço indesejável resulta na herança de dois traços em plantas de progênie e é comumente referida como arraste gênico. Em uma modalidade, o traço desejável pode ser um traço nativo. Em outra modalidade, o traço desejável pode ser um traço transgênico. Em uma modalidade, o traço indesejável pode ser um traço nativo. Em outra modalidade, o traço indesejável pode ser um traço transgênico.

[00113] Os traços indesejáveis exemplares podem incluir traços de redução de rendimento, resistência reduzida a traços de doença, resistência reduzida a traços de pestes, tolerância reduzida a traços de tolerância a herbicida, traços de crescimento reduzido, traços de tamanho reduzido, produção reduzida de traços de biomassa, quantidade reduzida de traços de sementes produzidas, resistência reduzida a traços de salinidade, resistência reduzida a traços de estresse por caPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 54/301

50/95 lor, resistência reduzida a traços de estresse por frio, resistência reduzida a traços de estresse por seca, traços de esterilidade masculina, traços de amido ceroso, traços de metabolismo de ácido graxo modificado, traços de metabolismo de ácido fítico modificado, traços de metabolismo de carboidrato modificado, traços de metabolismo de proteína modificada e qualquer combinação dos referidos traços.

[00114] Os traços desejáveis exemplares podem incluir aumento dos traços de rendimento, aumento da resistência a traços de doença, aumento da resistência a traços de pestes, aumento da tolerância a traços de herbicida, aumento dos traços de crescimento, aumento dos traços de tamanho, aumento da produção de traços de biomassa, aumento da quantidade de traços de sementes produzidas, aumento da resistência a traços de salinidade, aumento da resistência a traços de estresse por calor, aumento da resistência a traços de estresse por frio, aumento da resistência a traços de estresse por seca, traços de esterilidade masculina, traços de amido ceroso, traços de metabolismo de ácido graxo modificado, traços de metabolismo de ácido fítico modificado, traços de metabolismo de carboidrato modificado, traços de metabolismo de proteína modificada e qualquer combinação dos referidos traços.

[00115] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se a um método para selecionar traços recessivos e segregar esses traços de traços dominantes em plantas de progênie. Em uma modalidade, o traço recessivo pode estar presente em um genoma vegetal como um traço heterozigoto com um traço dominante. O criador da planta pode decidir produzir plantas de progênie que possuem o traço recessivo. Os métodos de divulgação fornecem uma solução para repassar o traço recessivo em plantas de progênie. Por exemplo, uma ruptura de fita dupla pode ser especificamente introduzida ao traço dominante de modo que apenas o traço recessivo seja repassado para as plantas de

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51/95 progênie. Em uma modalidade, um primeiro alelo pode codificar um traço dominante e um segundo alelo pode codificar um traço recessivo. Em outras modalidades, um método para introduzir uma ruptura de fita dupla nos traço dominante resulta na produção de plantas de progênie que contêm o traço recessivo.

[00116] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se a um método para selecionar traços dominantes e segregar esses traços de traços recessivos em plantas de progênie. Em outra modalidade, o traço recessivo pode estar presente em um genoma vegetal como um traço heterozigoto com um traço recessivo. O criador da planta pode decidir produzir plantas de progênie que possuem o traço dominante. Os métodos de divulgação fornecem uma solução para repassar o traço dominante em plantas de progênie. Por exemplo, uma ruptura de fita dupla pode ser especificamente introduzida ao traço recessivo de modo que apenas o traço dominante seja repassado para as plantas de progênie. Em uma modalidade, um primeiro alelo pode codificar um traço recessivo e um segundo alelo pode codificar um traço dominante. Em outras modalidades, um método para introduzir uma ruptura de fita dupla no traço recessivo resulta na produção de plantas de progênie que contêm o traço dominante.

[00117] Em outros aspectos, o locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode estar localizado em uma posição específica no cromossomo. Em algumas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) no cromossomo pode ser espaçada para que o primeiro locus esteja fisicamente separado do segundo locus. Em uma modalidade, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode variar de 0,01 cM a 500 cM. Em outras modaPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 56/301

52/95 lidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,01 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,05 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,1 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,2 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,3 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,4 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,5 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,6 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,7 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,8 cM.

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Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 0,9 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 1,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 2,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 3,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 4,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 5,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 6,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 7,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 8,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 9,0 cM.

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Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 10,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 11,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 12,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 13,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 14,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 15,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 16,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 17,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 18,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos)

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55/95 pode ser pelo menos 19,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 20,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 25,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 30,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 35,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 40,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 45,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 50,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 55,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 60,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos)

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56/95 pode ser pelo menos 65,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 70,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 75,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 80,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 85,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 90,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 95,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 100,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 125,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 150,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos)

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57/95 pode ser pelo menos 175,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 200,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 225,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 250,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 275,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 300,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 325,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 350,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 375,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 400,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos)

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58/95 pode ser pelo menos 425,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 450,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 475,0 cM. Nas modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 499,0 cM.

[00118] Em um aspecto, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode variar de 10 pb a 10 Mbp. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 10 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 20 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 30 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 40 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 50 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 63/301

59/95 ços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 60 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 70 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 80 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 90 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 100 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 200 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 300 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 400 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 500 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo

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60/95 menos 600 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 700 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 800 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 900 pb. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos de 1 Kbp. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos de 10 Kbp. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos de 100 Kbp. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 1.000 Kbp. Em outras modalidades, a distância entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode ser pelo menos 1 Mbp.

[00119] Na genética tradicional, a frequência de recombinação entre dois loci genéticos distintos é usada como uma medida da distância genética entre esses loci em um determinado cromossomo. A frequência máxima de recombinação entre quaisquer dois loci é 50%, o mesPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 65/301

61/95 mo valor que seria observado se os genes estivessem em cromossomos não homólogos e independentemente agrupados. Uma frequência de recombinação de 50% ocorre quando os genes estão tão distantes no cromossomo que pelo menos um crossing-over quase sempre ocorre entre eles. Em um aspecto, a frequência de recombinação entre um primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) e segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode variar de 1% a 50%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 1%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 2%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 3%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 4%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 6%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 7%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 8%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 9%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 10%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 15%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 20%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 22,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 25%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 27,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 30%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 32,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 35%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação

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62/95 pode ser pelo menos 37,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 40%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 42,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 45%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 47,5%. Em outras modalidades, a frequência de recombinação pode ser pelo menos 49%.

[00120] Em outras modalidades, o primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode estar localizado em uma posição específica em um primeiro cromossomo e o segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) no cromossomo pode estar localizado em uma posição específica em um segundo cromossomo que não homólogo ao primeiro cromossomo.

[00121] Em outras modalidades, o primeiro locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) pode estar localizado em uma posição específica em um primeiro cromossomo homólogo primeiro e o segundo locus (incluindo alelos, traços e/ou marcadores polimórficos) no cromossomo pode estar localizado em uma posição específica em um segundo cromossomo homólogo.

[00122] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um genoma vegetal. Como uma modalidade da divulgação do objeto, o genoma está contido nos cromossomos homólogos. Durante a recombinação, tanto na meiose quanto na mitose, os loci diferentes ao longo dos cromossomos homólogos irão se recombinar resultando, assim, na segregação genética entre os loci. Normalmente, os loci em u cromossomo homólogo irão se segregar de forma independente, dependendo do espaçamento físico entre os dois loci. Quanto maior a distância entre os dois loci, maior a probabilidade de que o locus irá se segregar em plantas de progênie. Por outro lado, se os dois loci estão muito perto um do outro, é menos provável que os loci irão se segregar nas planPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 67/301

63/95 tas de progênie. Esses loci, ou seja, aqueles que estão muito perto um do outro, são descritos na técnica como geneticamente ligados. Pode ser desejável para o criador de planta aumentar a frequência de recombinação genética entre dois loci geneticamente ligados introduzindo uma ruptura de fita dupla em apenas um dos dois cromossomos homólogos. Em uma modalidade, o cromossomo homólogo paterno é clivado com uma nuclease sítio-específica para introduzir uma ruptura de fita dupla apenas no cromossomo homólogo paterno e o cromossomo homólogo materno não é clivado com uma nuclease sítioespecífica. Em outra modalidade, o cromossomo homólogo materno é clivado com uma nuclease sítio-específica para introduzir uma ruptura de fita dupla somente no cromossomo homólogo materno e o cromossomo homólogo paterno não é clivado com uma nuclease sítioespecífica.

[00123] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um genoma de planta poliploide. Muitas plantas possuem genomas complexos que contêm mais de duas cópias de cromossomos homólogos. Por exemplo; milho, tomate, sorgo e arroz são tipicamente diploides; banana e melancia são tipicamente triploides; trigo duro, algodão e batata são tipicamente tetraploides; trigo de pão e kiwis são tipicamente hexaploides; e, morango e cana-de-açúcar são tipicamente octoploides. Pode ser desejável para o criador de planta aumentar a frequência de recombinação genética entre dois loci geneticamente ligados introduzindo uma ruptura de fita dupla em apenas um dos muitos cromossomos homólogos presentes em uma espécie de planta poliploide. Em uma modalidade, um primeiro cromossomo é clivado com uma nuclease sítio-específica para introduzir ruptura de fita dupla em apenas um dos muitos cromossomos homólogos presentes em uma espécie de planta poliploide e os outros cromossomos homólogos não são clivados com nuclease sítio-específica. Em uma modalidade, a frequência de rePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 68/301

64/95 combinação entre os loci próximos à ruptura de fita dupla do cromossomo homólogo clivado aumenta a frequência de modo que a frequência de recombinação genética entre dois loci aumenta como resultado da ruptura de fita dupla que é produzida apenas em um dos muitos cromossomos homólogos presentes em uma espécie de planta poliploide. Em outra modalidade, a ligação genética entre dois loci é rompida devido à ruptura de fita dupla que é produzida apenas em um dos muitos cromossomos homólogos presentes em uma espécie de planta poliploide. Em outra modalidade, a ligação entre dois loci é interrompida devido à ruptura de fita dupla que é produzida apenas em um dos muitos cromossomos homólogos presentes em uma espécie de planta poliploide.

[00124] Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se à nuclease sítio-específica para introdução de uma ruptura de DNA de fita dupla. De acordo com uma modalidade, a nuclease sítio-específica pode incluir uma nuclease dedo de zinco (ZFN) que é usada para introduzir uma ruptura de fita dupla em um locus genômico direcionado para facilitar a inserção de um ácido nucleico de interesse. A seleção de um sítio alvo dentro do locus genômico selecionado para ligação por um domínio de dedo do zinco pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na Patente US n° 6.453.242, cuja divulgação é incorporada a este documento, que também divulga métodos para projetar proteínas dedo de zinco (ZFPs) para que se liguem a uma sequência selecionada. Ficará claro pelos versados na técnica que a inspeção visual simples de uma sequência de nucleotídeos também pode ser usada para a seleção de um sítio alvo. Por conseguinte, quaisquer meios para a seleção do sítio podem ser usados nos métodos descritos neste documento.

[00125] Para domínios de ligação a DNA de ZFP, os sítios alvos são geralmente compostos de uma pluralidade de subsítios alvos adPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 69/301

65/95 jacentes. Um subsítio alvo refere-se à sequência, geralmente um tripleto de nucleotídeo quadrupleto de nucleotídeo que pode se sobreposto por um nucleotídeo com um quádruplo adjacente está ligado por uma dedo de zinco individual. Ver, por exemplo, WO 077227/02, cuja divulgação é incorporada este documento. Um sítio alvo geralmente tem um comprimento de pelo menos 9 nucleotídeos e, por conseguinte, está ligado por um domínio de ligação de dedo de zinco que compreende pelo menos três dedos de zinco. No entanto, a ligação de, por exemplo, domínio de ligação com 4 dedos a um sítio alvo com 12 nucleotídeos, domínio de ligação com 5 dedos a um sítio alvo com 15 nucleotídeos ou um domínio de ligação de 6 dedos com um sítio alo de 18 nucleotídeos, também é possível. Como ficará evidente, a ligação de domínios de ligação maiores (por exemplo, com 7, 8, 9 dedos e mais) aos sítios alvo também é consistente com a divulgação do objeto.

[00126] De acordo com uma modalidade, não é necessário para um sítio alvo ser um múltiplo de três nucleotídeos. Nos casos em que as interações de fita cruzada (vide, por exemplo, Patente US n° 6.453.242 e WO 077227/02), uma ou mais dedos de zinco individuais de um domínio de ligação de múltiplos dedos podem se ligar para que se sobreponham aos subsítios do quadrupleto. Como resultado, uma proteína com três dedos pode se ligar a uma sequência com 10 nucleotídeos, em que o décimo nucleotídeo faz parte de um quadrupleto ligado por um dedo terminal, uma proteína com quatro dedos pode se ligar a uma sequência com 13 nucleotídeos, em que o décimo terceiro nucleotídeo faz parte de um quadrupleto ligado a um dedo terminal.

[00127] O comprimento e a natureza das sequências do ligante de aminoácido entre dedos de zinco individuais em um domínio de ligação com múltiplos dedos também afetam a ligação com uma sequência alvo. Por exemplo, a presença de um chamado ligante não canôPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 70/301

66/95 nico, ligante longo ou ligante estruturado entre as dedos de zinco adjacentes em um domínio de ligação com múltiplos dedos possibilita que esses dedos se liguem a subsítios que não estejam imediatamente adjacentes. Exemplos não limitantes desses ligantes estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. n° 6.479.626 e WO 53480/01. Por conseguinte, um ou mais subsítios, em um sítio alvo para um domínio de ligação com dedo de zinco, podem ser separados uns dos outros por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais nucleotídeos. Um exemplo não limitante seria um domínio de ligação com quatro dedos que se liga a sítio alvo com 13 nucleotídeos compreendendo, na sequência, dois subsítios contíguos com 3 nucleotídeos, um nucleotídeo interveniente e dois subsítios de tripleto contíguos.

[00128] Enquanto os polipeptídeos de ligação a DNA identificados das proteínas que existem na natureza normalmente se ligam a uma sequência ou motivo de nucleotídeo discreto (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de consenso), existem métodos e eles são conhecidos na técnica para modificar muitos desses polipeptídeos de ligação a DNA para reconhecer uma sequência ou motivo de nucleotídeo diferente. Os polipeptídeos de ligação de DNA incluem, por exemplo, entre outros, domínios de ligação de DNA com dedo de zinco, zíperes de leucina; domínios de ligação de UPA DNA, GAL4; TAL; LexA; repressor de Tet; LacR e um receptor do hormônio esteroide.

[00129] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de ligação de DNA é uma dedo de zinco. Os motivos de dedo de zinco individuais podem ser projetados para que direcionem e se liguem especificamente a qualquer um dentre a ampla variedade de sítios de DNA. Os polipeptídeos de dedo de zinco Cys₂His₂ canônica (assim como Cys₃His não canônica) se ligam ao DNA inserindo uma hélice α no principal sulco da hélice dupla do DNA alvo. O reconhecimento de DNA por um dedo de zinco é modular; cada dedo entra em contato principalmente com

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67/95 três pares de bases consecutivas no alvo e alguns dos principais resíduos no polipeptídeo mediam o reconhecimento. Ao incluir vários domínios de ligação de DNA com dedo de zinco em uma endonuclease de direcionamento, a especificidade de ligação de DNA da endonuclease de direcionamento pode aumentar (e, portanto, a especificidade de quaisquer efeitos reguladores do gene então conferidos também pode aumentar). Ver, por exemplo, Urnov et al. (2005) Nature 435:64651. Assim, um ou mais polipeptídeos de ligação de DNA com dedo zinco podem ser projetados e utilizados de modo que uma endonuclease de direcionamento introduzida em uma célula hospedeira interaja com uma sequência de DNA que é única dentro do genoma da célula hospedeira. Preferencialmente, a proteína dedo do zinco tem ocorrência não natural em que é projetada para se ligar a um sítio alvo de escolha. Vide, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patente US Nos 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicação de Patente US Nos 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, sendo que todos são incorporados a este instrumento por referência em suas totalidades. [00130] Um domínio de ligação de dedo de zinco projetado pode ter uma outra especificidade de ligação em comparação com uma proteína dedo do zinco de ocorrência natural. Os métodos de engenharia incluem, entre outros, concepção racional e vários tipos de seleção. A concepção racional inclui, por exemplo, o uso de banco de dados que compreendem sequências de nucleotídeos em tripleto (ou quadrupleto) e sequências de aminoácidos de dedo de zinco individual, nas quais cada sequência de nucleotídeos em tripleto ou quadrupleto está

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68/95 associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco que se ligam à sequência de tripleto ou quadrupleto particular. Vide, por exemplo, Patentes compartilhadas US n° 6.453.242 e 6.534.261, incorporadas por referência a este documento em sua totalidade.

[00131] Alternativamente, o domínio de ligação de DNA pode ser derivado de uma nuclease. Por exemplo, as sequências de reconhecimento de homing endonucleases ou meganucleases como I-SceI, ICeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII são conhecidas. Vide também Patente US n° 5.420.032; Patente US n° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo da New England Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação do DNA das homing endonucleases e meganucleases pode ser manipulada geneticamente para se ligar a sítios alvo não naturais. Ver, por exemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicação de Patente U.S. n° 20070117128.

[00132] Como outra alternativa, o domínio de ligação de DNA pode ser derivado de uma proteína com zíper de leucina. Os zíperes de leucina são uma classe de proteínas que estão envolvidas em interações proteína-proteína em muitas proteínas reguladoras eucarióticas que são fatores de transcrição importantes associados à expressão do gene. O zíper de leucina refere-se a um motivo estrutural comum compartilhado nesses fatores transcricionais em vários reinos, incluindo animais, plantas, leveduras, etc. O zíper de leucina é formado por dois

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69/95 polipeptídeos (homodímero ou heterodímero) que se ligam a sequências de DNA específicas de uma maneira em que os resíduos de leucina são espaçados de maneira uniforme através de uma hélice α, de modo que os resíduos de leucina dos dois polipeptídeos terminem na mesma face da hélice. A especificidade de ligação do DNA dos zíperes de leucina pode ser utilizada nos domínios de ligação de DNA divulgados neste documento.

[00133] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de DNA é um domínio projetado a partir de um efetor TAL derivado do patógeno vegetal Xanthomonas (vide, Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29(2):143-8; Boch et al, (2009) Science 29 de outubro de 2009 (10.1126/science.117881) e Moscou e Bogdanove, (2009) Science 29 de outubro de 2009 (10.1126/science.1178817; e Publicação de Patente US n° 20110239315, 20110145940 e 20110301073).

[00134] O sistema de nuclease CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) Cas (Associadas a CRISPR) é um sistema de nuclease recentemente manipulado geneticamente com base em um sistema bacteriano que pode ser usado para engenharia de genomas. Baseia-se em parte da resposta imune adaptativa de muitas bactérias e Archaea. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bactéria, os segmentos do DNA invasor são convertidos em RNAs de CRISPR (crRNA) pela resposta imune. Esse crRNA então se associa através de uma região de complementariedade parcial com outro tipo de RNA chamado de tracrRNA para guiar a nuclease Cas9 para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamada de um protoespaçador. Cas9 cliva o DNA para gerar extremidades cegas em DSB nos sítios especificados por uma sequência guia de 20 nucleotídeos contida dentro do transcrito de crRNA. Cas9 requer tanto crRNA como tracrRNA para reconhecimento e clivagem de DNA específico de sítio. Esse sistema foi agora projetado de forma

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70/95 que o crRNA e tracrRNA possam ser combinados em uma molécula (RNA guia único) e a parte equivalente de crRNA do RNA guia único pode ser projetada para guiar a nuclease de Cas9 para direcionar qualquer sequência desejada (vide Jinek et al., (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Assim, o sistema CRISPR Cas pode ser projetado para criar uma ruptura de fita dupla (DSB) em um alvo desejado em um genoma e o reparo do DSB pode ser influenciado pelo uso de inibidores de reparo para causar um aumento no reparo propenso a erros. Outros sistemas CRISPR Cas são conhecidos na técnica e incluem CRISPR CasX, CRIXPR CasY, CRISP Cpf1 e outras enzimas que funcionam da mesma forma.

[00135] Em certas modalidades, a proteína Cas pode ser um derivado funcional de uma proteína Cas de ocorrência natural. Um derivado funcional de um polipeptídeo de sequência nativa é um composto com uma propriedade biológica qualitativa em comum com um polipeptídeo de sequência nativa. Os derivados funcionais incluem, entre outros, fragmentos de uma sequência nativa e derivados de um polipeptídeo de sequência nativa e seus fragmentos, desde que eles tenham uma atividade biológica em comum com um polipeptídeo de sequência nativa correspondente. Uma atividade biológica contemplada neste documento é a capacidade do derivado funcional de hidrolisar um substrato de DNA em fragmentos. O termo derivado abrange ambas as variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, modificações covalentes e suas fusões. Os derivados adequados de um polipeptídeo Cas ou seu fragmento incluem, entre outros, mutantes, fusões, modificações covalentes de proteína Cas ou seu fragmento. A proteína Cas, que inclui a proteína Cas ou seu fragmento, bem como derivados da proteína Cas ou seu fragmento, pode ser obtida a partir de uma célula ou quimicamente sintetizada ou por uma combiPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 75/301

71/95 nação desses dois procedimentos. A célula pode ser uma célula que produz naturalmente a proteína Cas, ou uma célula que produz naturalmente proteína Cas e é geneticamente manipulada para produzir a proteína endógena Cas em um nível de expressão mais alto ou produzir uma proteína Cas a partir de um ácido nucleico exogenamente introduzido, cujo ácido nucleico codifica uma Cas que é igual ou diferente da Cas endógena. Em alguns casos, a célula não produz naturalmente a proteína Cas e é geneticamente manipulada para produzir uma proteína Cas. A proteína Cas é implantada em células de mamíferos (e, presumidamente, em células vegetais) pela co-expressão da nuclease Cas com RNA guia. Duas formas de RNAs guias podem ser usadas para facilitar a clivagem de genoma mediada por Cas conforme divulgado em Le Cong, F.et al., (2013)Science 339(6121):819-823. [00136] Em outras modalidades, o domínio de ligação de DNA pode estar associado a um domínio de clivagem (nuclease). Por exemplo, as homing endonucleases podem ser modificadas em sua especificidade de ligação de DNA, mantendo a função da nuclease. Além disso, as proteínas dedo de zinco também podem ser fundidas a um domínio de clivagem para formar uma nuclease dedo de zinco (ZFN). A parte do domínio de clivagem das proteínas de fusão divulgados neste documento pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. As endonucleases exemplares a partir das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, entre outros, endonucleases de restrição e homing endonucleases. Vide, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. As enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, S1 Nuclease; nuclease mung bean; DNase pancreática I; nuclease microcócica; endonuclease HO de levedura; Vide também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). Os exemplos não limitantes de homing

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72/95 endonucleases e meganucleases incluem I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, PISce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, ITevII e I-TevIII são conhecidos. Vide também Patente U.S. n° 5.420.032; Patente U.S. n° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo da New England Biolabs. Uma ou mais destas enzimas (ou seus fragmentos funcionais) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e meios-domínios de clivagem.

[00137] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação sequênciaespecífica ao DNA (em um sítio de reconhecimento) e DNA de clivagem em ou próximo ao sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm ligação e domínios de clivagem separados. Por exemplo, a enzima Fokl tipo IIS catalisa a clivagem de DNA em fita dupla, em 9 nucleotídeos a partir do seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos a partir do seu sítio de reconhecimento no outro. Vide, por exemplo, Patentes US Nos 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:27642768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Assim, em uma modalidade, as proteínas da fusão compreendem o domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) a partir de pelo menos uma enzima de restrição do Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que pode ou não ser manipulado.

[00138] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplar, cujo domínio

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73/95 de clivagem pode ser separado do domínio de ligação, é a Fokl. Esta enzima específica é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95: 10,570-10,575. Nesse sentido, para efeitos da presente divulgação, a parte da enzima Fokl usada nas proteínas de fusão divulgadas é considerada um meio-domínio de clivagem. Assim, para clivagem de dupla fita e/ou substituição direcionada das sequências celulares usando fusões de dedo de zinco e Fokl, duas proteínas de fusão, sendo que cada uma compreende um meio-domínio de clivagem de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma molécula de polipeptídeo única contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e dois meios-domínios de clivagem de Fokl também podem ser usados. Os parâmetros para clivagem direcionada e alteração da sequência direcionada usando fusões dedo de zinco-Fokl são fornecidos em outros lugares na divulgação.

[00139] Um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem pode ser qualquer parte de uma proteína que mantenha atividade de clivagem ou que tenha a capacidade de multimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional. As enzimas de restrição de Tipo IIS exemplares são descritas na Publicação Internacional WO 2007/014275, incorporada por referência a este documento em sua totalidade.

[00140] Para melhorar a especificidade de clivagem, os domínios de clivagem também podem ser modificados. Em certas modalidades, as variantes do meio-domínio de clivagem são empregadas; essas variantes minimizam ou impedem a homodimerização dos meiosdomínios de clivagem. Os exemplos não limitantes desses meiosdomínios de clivagem modificados são descritos com detalhes em WO 2007/014275, incorporado por referência a este documento em sua totalidade. Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreenPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 78/301

74/95 de um meio-domínio de clivagem projetado (também denominado mutantes de domínio de dimerização) que minimiza ou impede a homodimerização. Essas modalidades são conhecidas pelos versados na técnica e descreveram, por exemplo, Publicação de Patente US N° 20050064474; 20060188987; 20070305346 e 20080131962, sendo que todas as suas divulgações são incorporadas por referência a este documento em sua totalidade. Os resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fokl são todos alvos para influenciar a dimerização dos meios-domínios de clivagem de Fokl.

[00141] Os meio-domínios de clivagens projetados adicionais de Fokl que formam heterodímeros obrigatórios também podem ser usados em ZFNs descritas neste documento. Os meios-domínios de clivagem projetados exemplares de Fokl que heterodímeros obrigatórios incluem um par em que um primeiro meio-domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácidos nas posições 490 e 538 de FokI e um segundo meio-domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácidos 486 e 499. Em uma modalidade, uma mutação em 490 substitui Glu (E) por Lys (K); a mutação em 538 substitui Iso (I) por Lys (K); a mutação em 486 substituiu Gln (Q) por Glu (E); e a mutação na posição 499 substitui Iso (I) por Lys (K). Especificamente, os meios-domínios de clivagem projetados descritos neste documento foram preparados pela mutação das posições 490 (E^K) e 538 (I^K) em um meio-domínio de clivagem para produzir um meio-domínio de clivagem projetado designado E490K:I538K e pela mutação das posições 486 (Q^E) e 499 (I^L) em outro meio-domínio de clivagem para produzir um meio-domínio de clivagem projetado designado Q486E:I499L. Os meios-domínios projetados descritos neste documento são mutantes de heterodímero obrigatório em que a clivagem aberrante é minimizada ou abolida. Vide, por exemplo, Publicação de

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Patente US n° 2008/0131962, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade para todos os efeitos. Em certas modalidades, o meio-domínio de clivagem projetado compreende mutações nas posições 486, 499 e 496 (numeradas em relação à Fokl de tipo selvagem), por exemplo mutações que substituem o resíduo de Gln (Q) de tipo selvagem na posição 486 pelo resíduo de Glu (E), resíduo de Iso (I) de tipo selvagem na posição 499 por um resíduo de Leu (L) e resíduo de Asn (N) de tipo selvagem na posição 496 pelo resíduo de Asp (D) ou Glu (E) (também denominados domínios ELD e ELE, respectivamente. Em outras modalidades, o meio-domínio de clivagem projetado compreende mutações nas posições 490, 538 e 537 (numeradas em relação à Fokl de tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem resíduo de Glu (E) de tipo selvagem na posição 490 por um resíduo de Lys (K), resíduo de Iso (I) de tipo selvagem na posição 538 por um resíduo de Lys (K) e o resíduo de His (H) de tipo selvagem na posição 537 por um resíduo de Lys (K) ou um resíduo de Arg (R) (também denominados domínios KKK e KKR, respectivamente). Em outras modalidades, o meio-domínio de clivagem projetado compreende mutações nas posições 490 e 537 (numeradas em relação à Fokl de tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem resíduo de Glu (E) de tipo selvagem na posição 490 por um resíduo de Lys (K) e resíduo de His (H) de tipo selvagem na posição 537 por um resíduo de Lys (K) ou resíduo de Arg (R) (também denominados domínios KIK e KIR, respectivamente). (Vide Publicação de Patente US n° 20110201055). Em outras modalidades, o meio-domínio de clivagem projetado compreende mutações Sharkey e/ou Sharkey' (vide Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).

[00142] Os meio-domínios de clivagem manipulados descritos neste documento podem ser preparados usando qualquer método adequado, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida dos meios-domínios de

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76/95 clivagem do tipo selvagem (Fok I), conforme descrito na Publicação de Patente U.S. n° 20050064474; 20080131962; e 20110201055. Alternativamente, as nucleases podem ser montadas in vivo no sítio alvo do ácido nucleico usando a assim chamada tecnologia de divisão por enzima split-enzyme (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. n° 20090068164). Componentes dessas enzimas de divisão podem ser expressos em construtos de expressão separados, ou podem estar ligados em um quadro de leitura aberto, onde os componentes individuais são separados, por exemplo, por um peptídeo 2A de autoclivagem ou sequência IRES. Os componentes podem ser domínios de ligação de dedo de zinco individuais ou domínios de um domínio de ligação de ácido nucleico de meganuclease.

[00143] As nucleases podem ser triadas para a atividade antes do uso, por exemplo, em um sistema cromossômico baseado em levedura, conforme descrito em WO 2009/042163 e 20090068164. Os construtos de expressão da nuclease podem ser facilmente projetados usando os métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Publicações de Patente dos Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação Internacional WO 07/014275. A expressão da nuclease pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, por exemplo, o promotor da galactoquinase, que é ativado (desreprimido) na presença de rafinose e/ou galactose e reprimido na presença de glicose.

[00144] A distância entre os sítios alvo refere-se ao número de nucleotídeos ou pares de nucleotídeos que ficam entre os dois sítios alvo, conforme medido a partir das bordas das sequências mais próximas entre si. Em certas modalidades nas quais a clivagem depende na ligação de duas moléculas de fusão de meio-domínio de clivagem/domínio com dedos de zinco para separar os sítios alvo, os dois

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77/95 sítios alvo podem estar em fitas opostas de DNA. Em outras modalidades, ambos os sítios alvo estão na mesma fita de DNA. Para integração direcionada no locus genômico ótimo, uma ou mais ZFPs são projetadas para se ligar a um sítio alvo no ou próximo ao sítio de clivagem predeterminado, e uma proteína de fusão compreendendo o domínio de ligação a DNA projetado e um domínio de clivagem é expresso na célula. Após a ligação da porção de dedo de zinco da proteína de fusão ao sítio alvo, o DNA é clivado, preferencialmente através de uma ruptura de fita dupla, próximo ao sítio alvo pelo domínio de clivagem.

[00145] Em certas modalidades, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao DNA e um meio-domínio de clivagem, são expressas em uma célula, e se ligam a sítios alvo que são justapostos de tal forma que um domínio de clivagem funcional seja reconstituído e o DNA seja clivado nas proximidades dos sítios alvo. Em uma modalidade, a clivagem ocorre entre os sítios alvo dos dois domínios de ligação ao DNA. Um ou ambos os domínios de ligação ao DNA podem ser manipulados. Ver também, Patente U.S. n° 7.888.121; Publicação de Patente U.S. 20050064474 e Publicações de Patente Internacionais WO05/084190, WO05/014791 e WO

03/080809.

[00146] As nucleases sítio-específicas, conforme descrito neste documento, podem ser introduzidas como polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Por exemplo, dois polinucleotídeos, cada um compreendendo sequências que codificam um dos polipeptídeos mencionados acima, podem ser introduzidos em uma célula, e quando os polipeptídeos são expressos e cada um se liga a sua sequência alvo, a clivagem ocorre na ou próxima à sequência alvo. Alternativamente, um único polinucleotídeo compreendendo sequências que codificam ambos os polipeptídeos de fusão é introduzido em uma célula. Os polinucleotídeos poPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 82/301

78/95 dem ser DNA, RNA ou quaisquer formas modificadas ou análogos ou DNA e/ou RNA. Em um aspecto, a divulgação do objeto refere-se à distribuição direta da nuclease sítio-específica a uma célula vegetal. Em outro aspecto, a divulgação do objeto refere-se à distribuição intragenômica da nuclease sítio-específica a uma célula vegetal.

[00147] Através da aplicação de técnicas, tais como essas, as células de praticamente qualquer espécie pode ser estavelmente transformada. Em algumas modalidades, o DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies pluricelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas de ácido doadoras no genoma da planta transgênica.

[00148] A distribuição intragenômica ou a distribuição direta de ácidos nucleicos pode ser introduzida em uma célula vegetal nas modalidades da divulgação por qualquer método conhecido aos versados na técnica, incluindo, por exemplo e sem limitação: por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184); por dessecação/absorção do DNA mediada por inibição (ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8); por eletroporação (ver, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253); por agitação com fibras de carbeto de silício (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765); por transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840 e 6.384.301);, por aceleração de partículas revestidas por DNA (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865) e por nanopartículas, nanocarreadores e peptídeos de penetração celular (WO201126644A2; WO2009046384A1; WO2008148223A1) nos méPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 83/301

79/95 todos para distribuir DNA, RNA, peptídeos e/ou proteínas ou combinações de ácidos nucleicos e peptídeos em células vegetais.

[00149] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas de plantas que transformam geneticamente as células vegetais. Os plasmídeos T_i e R_i de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos T_i (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo T_i, a região vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é limitada pelas bordas esquerda e direita que são, cada uma, compostas por sequências nucleotídicas repetidas terminais. Em alguns vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram deletados, e as funções da região vir são utilizadas para transferir o DNA estranho limitado pelas sequências de borda do T-DNA. A região T também pode conter, por exemplo, um marcador selecionável para a recuperação eficiente de plantas e células transgênicas, e um sítio de clonagem múltipla para a inserção de sequências para transferir esse ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão da divulgação.

[00150] Assim, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente Europeia EP 0 122 791) ou um plasmídeo R_i de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983), supra; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516, e

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80/95 aqueles derivados de qualquer um dos expostos anteriormente. Outras bactérias, tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium, que naturalmente interagem com plantas, podem ser modificadas para mediar a transferência de gene para uma série de plantas diversas. Essas bactérias simbióticas associadas a plantas podem ser feitas competentes para a transferência de gene através da aquisição de um plasmídeo Ti desarmado e de um vetor binário adequado.

[00151] Adicionalmente, uma vez que uma nuclease sítio-específica tenha sido estavelmente integrada no genoma de uma primeira planta, a nuclease pode ser reproduzida em uma planta da progênie e empregada para ligar e clivar um alvo específico observado pelo cruzamento da primeira e segunda plantas pais. Nesse exemplo, o genoma da primeira planta não contém uma sequência alvo que é ligada e clivada por uma nuclease sítio-específica. No entanto, a segunda planta pai não contém uma sequência alvo que é ligada e clivada pela nuclease sítio-específica localizada na primeira planta pai. Nesse sentido, a reprodução da primeira e segunda plantas pai permite que a nuclease sítio-específica da primeira planta pai seja funcional nas plantas da progênie que herdam a nuclease sítio-específica da primeira planta pai e a sequência alvo da segunda planta pai. Nessa modalidade, a nuclease sítio-específica é distribuída a uma célula vegetal por recombinação intragenômica.

[00152] Em um aspecto da divulgação do objeto, os métodos fornecidos são aplicáveis para a produção de uma planta de progênie que compreende um genoma modificado. O desenvolvimento das plantas de progênie é normalmente obtido através de técnicas de reprodução de plantas convencionais. Essas técnicas de reprodução são bem conhecidas aos versados na técnica. Para uma discussão de técnicas de reprodução de plantas, ver Poehlman (1995) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn, 4^a Edição, incorporado integralPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 85/301

81/95 mente neste documento por referência. Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um gene nas plantas. Esta técnica tem sido usada por décadas para introduzir traços em uma planta. Em exemplo de uma descrição desta e de outras metodologias de reprodução de plantas que são bem conhecidas pode ser encontrado em referências, tais como Poelman, supra, e Plant Breeding Methodology, edição. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Em um protocolo de retrocruzamento típico, a variedade original de interesse (pais recorrentes) é cruzada com uma segunda variedade (pais não recorrentes) que carrega o único gene de interesse a ser transferido. A progênie resultante deste cruzamento é então cruzada novamente com os pais recorrentes e o processo é repetido até que seja obtida uma planta, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas dos pais recorrentes sejam recuperadas na planta convertida, além do único gene transferido dos pais não recorrentes. [00153] Certas modalidades referem-se a processos de produção de cruzamentos usando uma planta de uma modalidade desta divulgação como, pelo menos, um dos pais. Por exemplo, modalidades específicas referem-se a uma planta híbrida F1 que tem, como um ou como ambos os pais, qualquer uma das plantas exemplificadas neste documento. Outras modalidades referem-se à semente produzida por esses híbridos F1. Outras modalidades ainda referem-se a um método de produção de uma semente híbrida F1 por cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, pai endogâmico) e coleta da semente híbrida resultante. Outras modalidades referem-se a uma planta exemplificada que é tanto um antecedente fêmea quanto macho. As caraterísticas das plantas resultantes podem ser melhoradas por consideração cuidadosa das plantas pais.

[00154] Como uma modalidade da divulgação do sujeito, uma planta de progênie pode ser reproduzida primeiramente por cruzamento

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82/95 sexual de uma primeira planta pai e de uma segunda planta pai, produzindo, desse modo, uma pluralidade de plantas de primeira progênie; em seguida, seleção de uma planta da primeira progênie que contém os loci de interesse não ligados aos segundos loci; autofertilização da planta da primeira progênie, produzindo, desse modo, uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e então, seleção, a partir das plantas da segunda progênie, de uma planta que contenha os loci de interesse não ligados aos segundos loci. Essas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da planta da primeira progênie ou da planta da segunda progênie com a segunda planta pai ou com uma terceira planta pai. Uma colheita composta por sementes de modalidades específicas, ou progênies da mesma, pode então ser plantada.

[00155] Também deve ser entendido que duas plantas também podem ser cruzadas para produzir descendentes que contenham genes de segregação independente como um resultado do método divulgado. A autofertilização da progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta pai e a fertilização cruzada com outra planta também são contempladas, assim como a propagação vegetativa. Outros métodos de cruzamento comumente usados para diferentes traços e cultivos são conhecidos na técnica. A reprodução por retrocruzamento tem sido usada para transferir genes para um traço altamente passível de se herdar, simplesmente herdado, em um cultivar homozigoto ou linha endogâmica desejável, que é o pai recorrente. A fonte do traço a ser transferido é chamada de pai doador. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do pai recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido do pai doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do pai doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzados) com o pai recorrente. Espera-se que o pai resultante tenha os atributos do pai

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83/95 recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido do pai doador.

[00156] As metodologias para a regeneração de plantas são conhecidas aos versados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil e Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). A planta descrita neste documento pode ser cultivada em um meio de fermentação ou cultivada em um meio adequado, tal como o solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode incluir qualquer meio de crescimento para plantas, incluindo, mas não se limitando a, solo, areia, qualquer outro meio particulado que suporte o crescimento de raízes (por exemplo, vermiculita, perlita, etc.) ou cultura hidropônica, bem como luz adequada, água e complementos nutricionais que otimizem o crescimento da planta superior.

[00157] As células vegetais transformadas que são produzidas por qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira, que possua o genótipo transformado e, assim, o fenótipo desejado. Essas técnicas de regeneração dependem da manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, dependendo normalmente de um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com as sequências nucleotídicas desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos é descrita em Evans, et al., Protoplasts Isolation and Culture em Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, Nova York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos de plantas, explantes, órgãos, pólens, embriões ou partes dos mesmos. Essas técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al. (1987)

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Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

[00158] Nas modalidades, a presente divulgação refere-se a células regeneráveis para uso em culturas de tecido. A cultura de tecido preferencialmente será capaz de regenerar plantas com características fisiológicas e morfológicas das plantas anteriores e de regenerar plantas com substancialmente o mesmo genótipo que as plantas anteriores. Preferencialmente, as células regeneráveis nessas culturas de tecido serão embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raízes, flores, sementes, vagens ou caules. Adicionalmente, as modalidades da presente divulgação referem-se a plantas regeneradas a partir de culturas de tecido das modalidades da divulgação.

[00159] Em um aspecto da divulgação do objeto, os métodos fornecidos são aplicáveis em uma ampla variedade de plantas e sistemas de células vegetais. Nas modalidades, plantas alvo e células vegetais para manipulação incluem, mas não estão limitadas a, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como colheitas, incluindo colheitas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), colheitas de frutos (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), colheitas de forragem (por exemplo, alfafa), colheitas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas, inhame), colheitas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas com flores (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, abeto branco, abeto vermelho); plantas usadas na fitorremediação (por exemplo, plantas de acúmulo de metais pesados); colheitas de oleaginosas (por exemplo, girassol, colza) e plantas usadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Assim, os métodos e composições divulgados têm utilidade sobre uma ampla gama de plantas, incluindo, mas não se limitando a, espécies dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, ErigePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 89/301

85/95 ron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna e Zea mays.

[00160] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certas particularidades e/ou modalidades. Os exemplos não devem ser interpretados para limitar a divulgação para as particularidades ou modalidades exemplificadas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Design do Construto de Expressão Gênica [00161] A Plataforma de Integração de Transgene Manipulado (Engineered Transgene Integration Platform - ETIP) foi descrita anteriormente no Pedido de Patente U.S. n° 20140090113A1, incorporado integralmente neste documento por referência. A ETIP contém uma sequência de área de destino projetada, diversos sítios de ligação a dedos de zinco projetados (eZFN), e cassetes de expressão gênica, conforme mostrado no vetor de plasmídeo binário pDAB105855 (Figura 1; SEQ ID NO:1). Conforme descrito no Pedido de Patente U.S. n° 20140090113A1, o plasmídeo binário, pDAB105855, foi transformado e integrado no genoma de Zea mays c.v. B104 (ver, Exemplo 8 do Pedido de Patente U.S. n° 20140090113A1). Plantas transgênicas positivas contendo eventos de inserção simples de comprimento total do inserto de fita T de pDAB105855 foram confirmados através de análise molecular (ver, Exemplo 6 do Pedido de Patente U.S. n° 20140090113A1). Os cassetes de expressão gênica nas regiões de borda de Agrobacterium de pDAB105855 foram localizados dentro do cromossomo do genoma de Zea mays c.v. B104 como um inserto de fita T de comprimento total. A planta transgênica resultante contendo o evento transgênico, pDAB105855-#2, foi autopolinizada para produzir plantas de progênie homozigóticas que contivessem cópias de comPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 90/301

86/95 primento total do inserto de fita T de pDAB105855. Essas plantas de progênie foram confirmadas como sendo homozigóticas por ensaios de confirmação molecular.

EXEMPLO 2: Design do Construto de Expressão Gênica [00162] Um segundo construto de expressão gênica contendo o transgene dgt-28 e diversos sítios de ligação a eZFN foram desenhados e construídos. Este construto de expressão gênica foi marcado como pDAB113068 (Figura 2; SEQ ID NO:2) e continha os seguintes elementos gênicos: o sítio de ligação a eZFN1; o íntron da Ubiquitina 3 de Oryza sativa (íntron de OsUbi3; Sivamani, E., Qu, R., (2006) Plant Molecular Biology 60; 225-239) que conduz a expressão do transgene dgt-28 (DGT-28; Pedido de Patente Internacional n° 2013116700) fundido com o peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP4 (Pedido de Patente Internacional n° 2013158766) e encerrado pela 3'UTR da lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. n° 7.179.902); uma região ligante contendo múltiplos sítios de ligação à nuclease sítio-específica (sítio de ligação SBS8196::sítio de ligação a eZFN4::sítio de ligação SBS19354::sítio de ligação SBS15590::sítio de ligação a eZFN8::sítio de ligação SBS18473::sítio de ligação a eZFN1); e o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (promotor de ZmUbi1; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689) que conduz a expressão do transgene pat (PAT; Wohlleben et al. (1988) Gene 70(1); 25-37) e encerrado pela 3'UTR da lipase de Zea mays. Este construto de expressão gênica foi transformado em plantas Zea mays do evento pDAB105855-#2 que foram anteriormente confirmadas como contendo cópias homozigóticas de pDAB105855.

EXEMPLO 3: Produção de Cepa de Agrobacterium e Transformação de Zea mays

Inoculação de Agrobacterium tumefaciens [00163] O plasmídeo binário pDAB113068 foi transformado em

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87/95 plantas Zea mays do evento pDAB105855-#2 através de um protocolo de transformação mediada por Agrobacterium. Os vetores de expressão binária foram transformados na cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens. As colônias bacterianas foram selecionadas e DNA de plasmídeo binário foi isolado e confirmado através da digestão da enzima de restrição. As culturas de Agrobacterium foram riscadas a partir de estoques de glicerol e incubadas para o crescimento. No dia de um experimento, as culturas resultantes de Agrobacterium foram usadas para a transformação de plantas Zea mays contendo o evento pDAB105855-#2.

Transformação de Zea mays [00164] Os construtos experimentais foram transformados em plantas de Zea mays contendo o evento pDAB105855-#2 através a transformação mediada por Agrobacterium de embriões imaturos isolados da linhagem endogâmica, plantas Zea mays c.v. B104 contendo o evento pDAB105855-#2. O método usado é semelhante ao publicado por Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol 14:745-750 e Frame et al. (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034, mas com várias modificações e melhorias para tornar o método passível de transformação de alta produtividade. Um exemplo de um método usado para produzir uma série de eventos transgênicos em Zea mays é dado no Pedido de Patente U.S. n° 20130157369A1, começando com a infecção do embrião e etapas de cocultivo.

EXEMPLO 4: Confirmação Molecular do Número de Cópias em T0 [00165] As plantas de Zea mays transgênicas putativas foram amostradas no estádio de desenvolvimento de folha V2-3 para a presença de transgene usando um ensaio de PCR quantitativo de transgene pat. O DNA total foi extraído de perfurações de folha usando o kit de extração de DNA MagAttract® (Qiagen) conforme as instruções do fabricante.

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88/95 [00166] Para detectar os genes de interesse, os fragmentos de DNA gene-específicos foram amplificados com conjuntos de iniciador/sonda de TaqMan® contendo uma sonda fluorescente marcada por FAM para o transgene pat e uma sonda fluorescente marcada por HEX para um gene de referência endógeno controle. Em seguida, as reações de PCR foram realizadas em um volume final de 10 μΐ de reação contendo 5 μl de Master Mix de sondas 480 Roche LightCycler® (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN); 0,4 μl de cada iniciador de 10 μΜ de soluções-mãe para uma concentração final de 400 nM; 0,4 μl de cada sonda de 5 μM de soluções-mãe para uma concentração final de 200 nM, 0,1 μl de polivinilpirrolidona 10% (PVP) para uma concentração final de 0,1%; 2 μl de 10 ng^l de DNA genômico e 0,5 μl de água. O DNA foi amplificado em um sistema 480 Roche LightCycler® sob as seguintes condições: 1 ciclo de 95 °C por 10 min; 40 ciclos das seguintes 3 etapas: 95°C por 10 segundos; 58°C por 35 segundos e 72°C por 1 segundo, e um ciclo final de 4°C por 10 segundos. O número de cópias do transgene pat foi determinado pela comparação dos valores do Alvo (gene de interesse)/Referência (gene da Invertase) para amostras desconhecidas (rendimento pelo LightCycler^® 480) com os valores do Alvo/Referência dos controles do número de cópias do transgene pat. As plantas T0 resultantes foram autofertilizadas para obter sementes T1, que foram triadas para identificar plantas transgênicas que fossem homozigotas. A triagem de zigosidade foi concluída nas plantas de progênie T1 para identificar as plantas que eram homozigotas para os eventos de gene alvo e doador. Estas plantas de progênie foram utilizadas para experimentos adicionais.

EXEMPLO 5: Mapeamento da Localização Cromossômica dos Eventos [00167] A planta transgênica contendo o evento pDAB105822-#2 alvo, e o evento pDAB113068-#250 doador foi analisada usando o SePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 93/301

89/95 quenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing NGS) para determinar as localizações do sítio de inserção genômica de ambos os transgenes. As leituras de sequência foram alinhadas ao genoma de referência de Zea mays B73 de GDB de milho (Andorf et al. (2015) MaizeGDB 2015: New tools, data, and interface for the maize model organism database. Nucleic Acids Research doi: 10.1093/nar/gkv1007). O evento pDAB105822#2 alvo e pDAB113068#250 doador foram encontrados inseridos no mesmo cromossomo. O evento pDAB105855-#2 alvo foi mapeado para o Cromossomo 5: 188.528.595..188.528.607, enquanto o evento pDAB113068-#250 doador foi mapeado para o Cromossomo 5: 147.625.397..147.625.455. EXEMPLO 6: Design de ZFNs e Construto de Expressão Gênica [00168] As proteínas dedo de zinco direcionadas contra a sequência de DNA de eZFN1 que compreendem um sítio de clivagem sítioespecífico no T-DNA de pDAB105855 (ver a Figura 1) foram projetadas conforme descrito anteriormente. Ver, por exemplo, Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651. As hélices de reconhecimento exemplares fora anteriormente divulgadas como designs de região de hélice de reconhecimento no Pedido de Patente U.S. n° 20140090113A1 (incorporado integralmente neste documento por referência). O sítio da sequência alvo que o dedo de zinco reconheceu e se ligou é fornecido na Tabela 1 como SEQ ID NO:3.

Tabela 1: Sequência alvo da nuclease sítio-específica

Nome do sítio	SEQ ID NO:	Sequência alvo
Sítio de ligação a eZFN1	3	caatcctgtccctagtggataaactgcaaaaggc

[00169] Os designs da nuclease dedo de zinco sítio-específica foram incorporadas nos vetores que codificam uma proteína com pelo

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90/95 menos um dedo com uma estrutura CCHC. Ver, Pedido de Patente U.S. n° 20080182332. Em particular, o último dedo em cada proteína tinha uma estrutura principal CCHC para a hélice de reconhecimento. As sequências codificantes de dedos de zinco não canônicas foram fundidas ao domínio da nuclease da enzima de restrição FokI tipo IIS (aminoácidos 384-579 da sequência de Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569) através de um ligante de ZC de quatro aminoácidos e um sinal de localização nuclear opaque-2 derivado de Zea mays para formar as nucleases dedo de zinco específicas, eZFN1 (ZFNs). Expressão das proteínas de fusão em um construto de expressão bicistrônico utilizando um sinal de stuttering ribossômico 2A, conforme descrito em Shukla et al. (2009) Nature 459:437-441 foi acionado por um promotor constitutivo, relativamente forte, da Ubiquitina 1 de Zea mays.

[00170] Os dedos de zinco ideais foram verificados pela atividade de clivagem usando um sistema à base de levedura de germinação mostrada anteriormente para identificar as nucleases ativas. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. n° 20090111119; Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708; Geurts et al. (2009) Science 325:433. Os dedos de zinco para os diversos domínios funcionais foram selecionados para utilização in-vivo. Das inúmeras ZFNs que foram projetadas, produzidas e testadas para se ligar aos sítios alvo de polinucleotídeo de eZFN1 putativo, um par de ZFNs foi identificado como tendo atividade in vivo em altos níveis, e selecionadas para experimentação posterior. Essas ZFNs foram caracterizadas como sendo capazes de se ligar e clivar eficientemente os sítios alvos de polinucleotídeo genômico de eZFN1 sítio-específico em plantas. Após testar os pares de ZFN no ensaio de levedura de germinação, os pares de ZFN que se ligaram idealmente ao sítio de ligação a eZFN1 foram avançados para testes em Zea mays.

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91/95 [00171] Construtos de nuclease dedo de zinco para expressão em Zea mays;

[00172] Os vetores de plasmídeo contendo construtos de expressão de ZFN das nucleases dedo de zinco exemplares, que foram identificados usando o ensaio com levedura e descritos acima, foram projetados e concluídos usando habilidades e técnicas comumente conhecidas na técnica. Cada sequência codificante de dedo de zinco foi fundida a uma sequência que codifica um sinal de localização nuclear opaque-2 (Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532), que foi posicionada a montante da nuclease dedo de zinco.

[00173] Em seguida, a sequência de sinal de localização nuclear opaque-2:: de fusão de nuclease dedo de zinco foi pareada com a sequência de sinal de localização nuclear opaque-2 complementar::de fusão de nuclease dedo de zinco. Como tal, cada construto consistia em um quadro de leitura aberto composto por duas sequências de sinal de localização opaque-2::de fusão de nuclease dedo de zinco separadas pela sequência 2A do vírus de Thosea asigna (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127). A expressão da sequência codificante de ZFN foi acionada pelo promotor de expressão altamente constitutiva da Ubiquitina 1 de Zea mays (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89) e flanqueada pela região não traduzida poliA 3' Per 5 de Zea mays (Patente U.S. n° 6.699.984). Os quatro construtos de plasmídeo resultantes foram confirmados através da digestão por enzima de restrição e através do sequenciamento de DNA. A Figura 3 fornece uma representação gráfica do construto de plasmídeo concluído de pDAB105825. A ZFN expressa no construto de plasmídeo, pDAB105825, continha Fok-Mono que é uma endonuclease Fokl do tipo selvagem.

EXEMPLO 7: Transformação de Zea mays [00174] O construto da nuclease dedo de zinco resultante,

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92/95 pDAB105825, foi transformado em plantas Zea mays c.v. B104 usando os métodos descritos anteriormente no Exemplo 3 acima. A planta transgênica resultante foi autopolinizada para produzir plantas de progênie homozigóticas que contivessem cópias de comprimento total do inserto de fita T de pDAB105825. Essas plantas de progênie foram confirmadas como sendo homozigóticas por ensaios de confirmação molecular, conforme descrito no Exemplo 4 acima.

EXEMPLO 8: Cruzamento das Plantas T1 Homozigóticas para Produção de uma População F1 [00175] Os eventos de pDAB105825 de T1 foram triados para zigosidade e expressão do transgene aad-1. Com base nesses resultados, as plantas homozigóticas T1 de um evento pDAB105825 foram selecionadas para o cruzamento com os eventos de planta pDAB105855/pDAB113068 para produzir a progênie F1. Foram feitos cruzamentos recíprocos de modo que os pais foram ambos machos e fêmeas. As plantas foram cruzadas manualmente; o pólen das anteras de um pai macho maduro foi introduzido ao estigma da mãe madura. Plantas prontas para o cruzamento foram removidas das outras plantas para reduzir a probabilidade de que pólen não desejado fertilize as plantas de milho fêmeas. As plantas fêmeas foram emasculadas (as anteras foram removidas antes da deiscência) através do desfolhamento. As anteras do pai macho foram totalmente removidas da planta macho, e o pólen foi isolado das anteras e usadas para fertilizar a fêmea emasculada. O pólen isolado foi esfregado nas sedas receptivas de plantas fêmeas, revestindo as sedas para reduzir a chance de qualquer polinização não intencional. As sementes das plantas fertilizadas foram coletadas e semeadas no solo. As populações de F1 resultantes foram cultivadas em estufa com condições de crescimento de milho padrão.

EXEMPLO 9: Cruzamento das Plantas F1 com Plantas Nulas Irmãs

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93/95 para Produzir uma População BC1 [00176] As plantas de progênie F1 resultantes que continham todos os três eventos (isto é, pDAB105855/pDAB113068/pDAB105825) foram cultivadas até a maturidade e retrocruzadas com as plantas nulas irmãs para produzir uma população BC1. A estratégia de cruzamento está estabelecida abaixo e diagramada na Figura 4. As populações BC1 resultantes foram molecularmente caracterizadas para calcular as frequências de recombinação que ocorreram entre os transgenes geneticamente ligados entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068. Como um resultado da clivagem de um de dois cromossomos homólogos com nucleases dedo de zinco, criou-se a hipótese de que a frequência de recombinação entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 aumentaria como resultado da introdução de uma ruptura de fita dupla no sítio de ligação de eZFN1 por uma nuclease dedo de zinco Figura 5.

EXEMPLO 10: Cruzamento das Plantas BC1 com Plantas Nulas Irmãs para Produzir uma População BC2 [00177] As plantas de progênie BC1 resultantes que continham todos os três eventos (isto é, pDAB105855/pDAB113068/pDAB105825) foram cultivadas até a maturidade e retrocruzadas com as plantas nulas irmãs para produzir uma população BC2. A estratégia de cruzamento está estabelecida abaixo e diagramada na Figura 4. As populações BC2 resultantes foram molecularmente caracterizadas para calcular as frequências de recombinação que ocorreram entre os transgenes geneticamente ligados; o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068. Como um resultado da clivagem de um de dois cromossomos homólogos com nucleases dedo de zinco, criou-se a hipótese de que a frequência de recombinação entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 aumentaria como resultado da introdução de uma ruptura de fita dupla no sítio de ligação de eZFN1 por uma nuclease

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94/95 dedo de zinco Figura 5.

EXEMPLO 11: Cálculo da Porcentagem da Frequência de Recombinação [00178] A frequência de recombinação entre os transgenes geneticamente ligados, por exemplo, o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068, foi calculada e é fornecida na Tabela 2. O gene 1 e 2 estão geneticamente ligados e, portanto, frequentemente cosegregados. A porcentagem de frequência de recombinação foi determinada pela divisão do número de descendentes recombinantes (contendo o gene 1 ou o gene 2 sozinho) pelo número total de descendentes observados.

[00179] As plantas de progênie de controle, que não incluem a introdução de uma nuclease dedo de zinco nos experimentos de cruzamento de planta resultaram em uma baixa porcentagem de recombinação entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 foi calculado em 3,5%. Essas plantas controle não contêm uma ruptura de fita dupla entre os transgenes geneticamente ligados, o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068, e qualquer segregação que ocorra entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 resultou de processos celulares naturais que ocorrem durante os diversos ciclos celulares e fases de desenvolvimento da planta.

[00180] Comparativamente, a frequência de recombinação aumentou em até 62,3% nas plantas de progênie experimentais, e a frequência de recombinação variou de 4,4% a 62,3%. As plantas de progênie experimentais, que incluíam a introdução de uma nuclease dedo de zinco nos experimentos de cruzamento de planta resultaram em uma maior porcentagem de recombinação entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 que calculado foi muito maior que 3,5% de frequência de recombinação das plantas controle. Essas plantas experimentais não contêm uma ruptura de fita dupla entre os transgenes gePetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 99/301

95/95 neticamente ligados do gene pDAB105855 e gene pDAB113068, e o aumento na segregação que ocorre entre o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068 resultou da introdução da ruptura de fita dupla. A frequência de descendentes recombinantes aumentou dramaticamente (até 62%) com a introdução de uma ZFN e com a indução da ruptura de fita dupla direcionada em um sítio de ligação localizado entre dois genes geneticamente ligados; o gene pDAB105855 e o gene pDAB113068.

[00181] Embora uma variedade de aspectos e modalidades exemplares foram discutidos acima, aqueles de versados na técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e subcombinações respectivas. Pretende-se, portanto, que as seguintes reivindicações anexadas e reivindicações doravante sejam interpretadas para incluir todas essas modificações, permutações, adições e subcombinações como são dentro de seu verdadeiro espírito e escopo.

Tabela 2: Frequência de Recombinação em Plantas de Progênie após Cruzamento entre Plantas de Origem para Introduzir uma Ruptura de Fita Dupla entre Genes Geneticamente Ligados.

Cruzamento/ Geração	Des- cen- dentes totais	Nu- lo/pDAB10 5825	pDAB105855/ pDAB113068/ pDAB105825	pDAB113068/ pDAB105825	pDAB10585/ pDAB105825	Descen- dentes recom- binantes	Porcen- tagem de Recom- binação
BC1 controle	57	35	20	1	1	2	3,5%
1ZFN BC1	68	62	3	2	1	3	4,4%
1ZFN BC2	61	29	25	3	4	7	11,5%
2ZFN BC1	70	31	34	4	1	5	7,1%
2ZFN BC2	68	37	28	3	0	3	4,4%
3ZFN BC1	53	28	9	0	16	16	30,2%
3ZFN BC2	63	29	28	4	1	5	7,9%
4ZFN BC1	69	26	0	0	43	43	62,3%
4ZFN BC2	57	31	0	0	26	26	45,6%
5ZFN BC1	69	23	41	2	3	5	7,2%
5ZFN BC2	72	21	31	12	8	20	27,8%

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Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar a frequência de recombinação genética entre um primeiro locus geneticamente ligado a um segundo locus dentro de um genoma de uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) introduzir uma nuclease sítio-específica no genoma da planta;

   b) produzir uma ruptura de fita dupla com a nuclease sítioespecífica em um dos dois cromossomos homólogos;

   c) sofrer recombinação dentro do genoma da planta; e

   d) modificar o genoma da planta, em que o genoma modificado da planta compreende maior frequência de recombinação genética entre o primeiro locus e o segundo locus.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus e o segundo locus codificam pelo menos um traço.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a recombinação compreende a recombinação meiótica ou recombinação mitótica.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a maior frequência de recombinação genética varia de 1,25 a 17,8 vezes.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a distância do primeiro locus para o segundo locus varia de cerca de 0,01 cM a cerca de 500 cM.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a distância do primeiro locus para o segundo locus varia de cerca de 10 pb a cerca de 10 Mbp.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus está localizado em um primeiro croPetição 870170041853, de 19/06/2017, pág. 101/301

   2/4 mossomo, e o segundo locus está localizado em um segundo cromossomo.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus e o segundo locus estão presentes em uma localização genômica com baixos níveis de frequência de recombinação.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o traço compreende um traço desejável ou um traço indesejável.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o traço desejável ou o traço indesejável é tanto um traço nativo quanto um traço transgênico.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o traço indesejável é selecionado do grupo consistindo em rendimento reduzido, resistência reduzida à doença, resistência reduzida a pragas, tolerância reduzida à tolerância de herbicidas, crescimento reduzido, tamanho reduzido, produção reduzida de biomassa, quantidade reduzida de sementes produzidas, resistência reduzida contra salinidade, resistência reduzida contra estresse por calor, resistência reduzida contra estresse por frio, resistência reduzida contra estresse pela seca, e qualquer combinação destes.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o traço desejável é selecionado do grupo consistindo em maior rendimento, maior resistência à doença, maior resistência a pragas, maior tolerância a herbicidas, aumento do crescimento, aumento do tamanho, aumento da produção de biomassa, aumento da quantidade de sementes produzidas, maior resistência contra salinidade, maior resistência contra estresse por calor, maior resistência contra estresse por frio, maior resistência contra estresse pela seca, e qualquer combinação destes.

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13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus compreende um marcador polimórfico e o segundo locus compreende um traço.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus compreende um marcador polimórfico e o segundo locus compreende um marcador polimórfico.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ruptura de fita dupla é produzida por uma nuclease sítio-específica em um dos dois cromossomos homólogos, e uma ruptura de fita dupla não é produzida no segundo cromossomo homólogo.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease sítio-específica é selecionada do grupo consistindo em uma nuclease dedo de zinco, uma nuclease TALEN, uma nuclease CRISPR, uma meganuclease, e uma nuclease de zíper de leucina.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease sítio-específica é distribuída a uma célula por recombinação intragenômica ou através de distribuição direta.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma da planta é um poliploide.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de:

    e) produzir uma planta de progênie compreendendo o genoma modificado da planta;

    f) cruzar a planta de progênie com outra planta ou consigo mesma; e

    g) gerar uma semente a partir da planta de progênie.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus que compreende um primeiro traço está localizado no primeiro cromossomo homólogo e o segundo locus

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    4/4 que compreende um segundo traço está localizado no primeiro cromossomo homólogo.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a ruptura de fita dupla resultante ocorre entre o primeiro locus que compreende o primeiro traço e o segundo locus que compreende o segundo traço, resultando, desse modo, em uma planta de progênie que compreende apenas o primeiro locus compreendendo o primeiro traço.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro traço é um traço recessivo ou dominante.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro traço é um traço de heterozigoto ou homozigoto.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre uma planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledônea.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta de tabaco, uma planta de soja, uma planta de algodão, uma planta Brassica, uma planta de milho, uma planta de sorgo, uma planta de trigo, e uma planta de arroz.

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    FIGURA 1:

    Overdrive Borda B de T-DNA oriT

    Borda A de T-DNA Borda A de T-DNA

    Borda A de T-DNA ZmLip 3’ UTR ví AAD-1 v3 íntron 6 de Adh 1 líder v2 de MSV promotor v2 de SCBV

    StPinll 3’ UTR v2

    Cry35Ab1 v5

    Promotor v1 de TaPer

    RB7 MAR v3

    Sitio de ligação v1 de eZFN4 região do promotor a montante V2 de rubi3 promotor v3 de OsUbi3 γ íntron de rubi3 potencializador 9NT rubi3 íntron V2 de ST-LS1 PhyYFP v3 (com íntron) parada transicional 6-frame

    ZmPer5 3’ UTR v2

    ELP1 HR2 v2 erro de mutação/sequenciamento região de promotor a montante v1 de ZmUbil promotor v8 de ZmUbit íntron v4 de Zmubi \ \ \ Consenso de Milho \ \ Cry34Ab1 v2 \ Parada seis frame StPinll 3’ UTR v2

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    FIGURA 2:

    Overdrive Borda B de T-DNA

    SpnR pDAB113068

    13390 bp

    Sítio de ligação a eZFNl íntron Os Ubi3 oriT

    Borda A de T-DNA

    Borda A de T-DNA

    Borda A de T-DNA

    ZmLip3' UTR

    PAT

    TraP4 DGT-28

    ZmLip 3' UTR Sítio de ligação a SBS8196 Sítio de ligação a eZFN4 K Sítio de ligação a SBS19354 ÚSítio de ligação a SBS15590 \Sítio de ligação a eZFN8

    Sítio de ligação a SBS18473 Sítio de ligação a eZFNl promotor de ZmUbil

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    FIGURA 3:

    Overdrive Borda B de T-DNA

    SpnR_ pDAB105825 13270 bp oriT

    Borda A de T-DNA

    Borda A de T-DNA

    Borda A de T-DNA promotor de ZmUbil

    ....

    24090

    Fok-Mono

    2A

    NLSop2-24090-Fok-Mono-2a-NLSop2-24088-Fok-Mono NLSop2

    24088

    Fok-Mono

    ZmPer5 3'UTR promotor OsActl

    ZmLip3' UTR

    Intron OsAct

    PAT

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    FIGURA 4;

    Estratégia de transformação e cruzando a

    Transformação por > Transformação por

    Agro com Transgene 1 * Agro com Transgene (Trl) e TO auto para Homo

    2 (Tr2) e auto para Homo

    Milho tipo selvagem Trl/Trl

    Fl

    Trl/Trl ZFN1/ZFN1 Tr2/Tr2 ’ è í

    Trl/Tr2/ZFN1 1 ^{Milho li}P° ^selvaS^em

    O

    BC1 I Milho tipo selvagem

    Transformação por Agro com ZFN1 e auto para Homo

    Milho tipo selvagem

    BC2

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    5/5

    FIGURA 5:

    Transgene 1 (pDAB105855)

    I MAR

    Transgene 2 (pDAB113068)

    I ubi de arroz | |_ntron | phiyfp-3'UTR TLP1 | Ubi-cry34-3'UTR | TaPer-cry35-3'UTR | SCBV-aarfl-3'UTR — i W-*--- W sítio de ligação a V sítio de ligação a

    Intron | glifosfato-3'UTR B TLP1 Γ Ubil-pat-3'UTR ] Τ _eZFN1 T _eZFN8

    Transgene ZFN1 (105825)

    Γ Ubi-eZFNl-3'UTR | Ubil-pot-3'UTR

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