MXPA00004745A - Un metodo novedoso para la integracion de adn estraño en genomas eucarioticos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para introducir un ADN de interés en un sitio objetivo genómico. En particular, los métodos y composiciones implican el uso de una combinación de sitios objetivo para dos recombinasas específicas en el sitio y la expresión de una recombinasa quimérica con carácter específico de sitio objetivo doble. Así, las composiciones comprenden recombinasas específicas en el sitio novedosas con caracteres específicos a sitios objetivo múltiple, y secuencias de nucleótido y casetes de expresión que codifican estas recombinasas o sitios objetivos. Los métodos implican transformar una célula eucariótica que tienen sitios objetivos para la recombinasa novedosa con un ADN de interés que es flanqueado por sitios objetivos correspondientes. La expresión de la recombinasa da como resultado la integración del ADN de interés en el genoma de la célula. Las composiciones y métodos de la invención tienenuso en la construcción de células eucarióticas establemente trans formadas y en particular, células de plantas. Los métodos dan como resultado la integración genómica activada eficiente del ADN c-i través de la recombinación específica en el sitio.

Description

UN MÉTODO NOVEDOSO PARA LA INTEGRACIÓN DE ADN EXTRAÑO EN GENOMAS EUCARIOTICOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la modificación genética de --cromosomas. En particular, se proporcionan métodos y composiciones para la integración de ADN en un genoma eucariótico. Se han utilizado varios aspectos para integrar un ADN de interés en el genoma de una planta. En el método más simple, el ADN es introducido a una célula y aleatoriamente se integra en el genoma a través de recombinación legitima. Una desventaja de este método es que los efectos posicionales debido a la integración aleatoria, hacen que la expresión de gen sea difícil de analizar. Como una alternativa a la recombinación ilegitima, la integraciói' puede ser activada hacia un sitio particular sobre el genoma a través del uso de recombinación homologa o recombinación especifica en el sitio. En plantas, en donde no se ha desarrollado una tecnología de recombinación, se utiliza la recombinación especifica en el sitio para integrar una secuencia de interés a un sitio de integración que ha sido previamente insertado en el genoma huésped de la planta. Si la integración especifica en el sitio ocurre a través de un evento de entrelazamiento individual entre un cromosoma y un replicón extracromosomal circular, todo él replicón será insertado en el cromosoma. Cuando la inserción de todo el replicón es indeseable, un fragmento del replicón comprende el ADN de interés, flanqueado por sitios objetivo para una recombinasa especifica en el sitio, puede ser introducida por un doble evento del cruce reciproco doble, en un cromosoma que tiene una integración del sitio que corresponde a los sitios objetivos que flanquean el ADN de interés. En cualquier caso, la integración es ineficiente ya que es irreversible, es decir, el ADN integrado puede ser separado a través de recombinación especifica en el sitio subsecuente entre los sitios objetivos que flanquean el ADN integrado. Se han tomado varios aspectos para evitar la excisión de un ADN integrado. En un aspecto, la expresión de una recombinasa especifica en el sitio, tal como Cre o FLP, es temporalmente regulada. Ver O' Gorman et al . (1 991 ) Science 251:1351-1355; Logie and Stewart (1995) Proc Na ti Acad Sci 92:5940-5944; Zhang et al . (1996) Nuc Acid Res 24:543-548; Nichols et al . (1997) Mol Endocinol 11:950-961; y Feil et al . (1997) Biochem Biophys Res Comm 237 : 152-151 ; los contenidos de la cuales se incorporan aquí para referencia. En estos métodos, la recombinasa es brevemente expresada, ya sea pasajera o en forma inducible, con el fin de permitir la integración. Sin embargo, la excisión del ADN integrado puede ocurrir antes que la recombinasa activa desaparezca de las células. Además, la excisión intramolecular es cinéticamente favorecida con respecto a la integración biomolecular. Por lo tanto, el ADN integrado es aparentemente inestable e;-presencia de recombinasa. Un segundo aspecto reduce la excisión de ADN integrado utilizando pares de sitios objetivos individualmente mutados tanto en el cromosoma como en el ADN flanqueado de interés. Ver Albert et al . (1995) Plan t J 7:649-659; Schlake and Bode (1994) Biochemis try 33:12746-" 12751; O'Gorman et al . (1997) Proc Na ti Acad Sci 94:14602-14607; y Araki et al . (1997) Nuc Acid Res 25:868-872; los contenidos de las cuales se incorporan aquí para referencia. La recómbinación entre los sitios objetivos individualmente mutados dan como resultado sitios objetivos doblemente mutados que flanquean el ADN de insertado en el cromosoma. Los sitios objetivo doblemente mutados no son bien reconocidos por la recombinasa. De esta manera el ADN insertado es separado del cromosoma a través de una reacción inversa solamente a bajos niveles. Sin embargo, este sistema tiene la desventaja de que los sitios objetivo individualmente mutados por lo general no actúa como sustratos de recombinación eficientes y, de esta manera se reduce la frecuencia de integración. Además, los transformantes son inestables ya que la excisión sigue ocurriendo, aunque a frecuencia reducida. Por consiguiente, es un objeto de la invención proporcionar métodos eficientes para la integración específica en el sitio de ADN en genomas eucarióticos que evita reacciones de excisión subsecuentes y otras reacciones de recombinaciones no productivas. Se proporcionan composiciones y métodos para introducir un ADN de interés en un sitio de integración genómico. En particular, los métodos y composiciones implican el uso de una combinación de sitios objetivo para do-recombinasas específicas en el sitio distintas, tales como Cre y FLP, y la expresión de una recombinasa quimérica con carácter específico de sitio específico -doble. De esta manera, las composiciones comprenden recombinasas específicas en el sitio novedosas con caracteres específicos a sitios objetivo múltiples, y secuencias de nucleótidos y casetes de expresión que codifican estas recombiná-as o sitios objetivos. Los métodos implican transformar una célula eucariótica que tienen sitios objetivos para la recombinasa novedosa con un ADN de interés que es flanqueado por sitios objetivo correspondientes. La expresión tanto de la recombinasa quimérica novedosa como de las dos recombinasas específicas en el sitio en la célula eucariótica da como resultado la integración del ADN de interés en el genoma. Las composiciones y métodos de la invención tienen uso en la construcción de células eucarióticas establemente transformadas y en particular, células de plantas. Los métodos dan como resultado una eficiente integración genómica activada del ADN a través de recombinación específica en el sitio . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 esquemáticamente representa vectores de transformación de planta, PHP13164 y PHP13147 para la expresión de recombinasa moCRE y recombinasa Cre: FLPm respectivamente . La Figura 2 gráficamente representa la activación de la expresión de GUS a través de excisión mediada por FLPm o CRE: FLPm de una secuencia flanqueada por sitios FRT que separan el promotor de ubiquitina y el marco de lectura abierto GUS. La Figura 3 representa gráficamente la activación de la expresión GUS a través de CRE: FLPm de una secuencia flanqueada por sitios" loxP que separa el promotor de ubiquitina y el marco der lectura abierto GU? . Se proporcionan composiciones y métodos para la integración específica en el sitio de ADN en sitios de integración genómicos predeterminados en un "genoma huésped. La invención proporciona el uso de recombinasas quiméricas- que catalizan la recombinación específica en" el sitio entre sitios objetivo que se originan de diferentes sistemas de recombinación específica en el sitio. Dicha recombinasa quimérica de doble función asegura que dos extremos del ADN extremo no se ligan entre sí, sino que más bien se recombinan con su sitio objetivo asociados cognado que residen en el ADN gendmico. Los métodos facilitan la activación direccional de genes deseados y secuencias de nucleótido en, sitios de integración correspondientes previamente introducidos en el genoma . En los métodos de la invención", una combinación de sitios objetivos para dos recombinasas específicas en el sitio es introducida en el genoma de un organismo de interés, estableciendo un sitio de integración para inserción de secuencias de nucleótido de interés. Para los propósitos de la invención, un sitio de integración comprenderá sitios objetivo de flanqueo en donde los sitios objetivo corresponden a los sitios de recombinación para dos distintas recombinasas específicas en el sitio. Esta recombinación o sitios objetivo puede flanquear otras" secuencias de nucleótido o pueden ser contiguos. Los métodos para la producción de plantas transgénicas conteniendo sitios de recombinación específicos integrados en el genoma de la planta se describen en la solicitud provisión co-pendiente No. de serie 60/065,627, intitulada Composiciones y Métodos para la Modificación Genética de Plantas, presentada el 18 de noviembre de 1997, e incorpora aquí para referencia. Una vez que se establece una planta estable o tejido cultivado, un cásete de transferencia comprendiendo un ADN de interés, flanqueado por sitios objetivos que corresponden a aquellos del sitio de integración genómica es introducido en la planta o tejidos establemente transformados en presencia de recombinasa quimérica con caracteres específicos para cada uno de los sitios objetivos. Alternativamente, dos recombinasas distintas que corresponden a los sitios objetivo queden estar presentes en la célula en lugar de un recombinante quimérico. Este proceso resulta en el intercambio de las secuencias nucleótidas entre los dos sitios objetivo idénticos del sitio de integración genómico y el cásete de transferencia. De esta manera, la invención proporciona un método -para integrar un ADN de interés en el genoma de una célula eucariótica, que comprende: a) transformar una célula con un cásete de transferencia comprendiendo el ADN, en donde el ADN es flanqueado por un sitio objetivo para una recombinasa específica en el sitio y un sitio objetivo para una segunda reaombinasa específica en el sitio, el genoma contiene un sitio de integración que comprende sitios objetivo que corresponden a los sitios objetivos flanqueando el ADN; y b) proporcionar en dicha célula una proteína recombinante que comprende la primera recombinasa fusionada en el marco con la segunda recombinasa. La invención además proporciona un método para" integrar un ADN de interés en el genoma de una célula eucariótica, que comprende: a) transformar una célula con un cásete d " transferencia comprendiendo el ADN, en donde el ADN es flanqueado por un sitio objetivo para una primera recombinasa específica en el sitio y el sitio objetivo para una segunda recombinasa específica en el sitio, y el genoma comprende un sitio de integración que comprende sitios objetivo que corresponden a dichos sitios objetivos que flanquean el ADN; y b) proporcionar en la célula la primera recombinasa y la segunda recombinasa. Por "recombinasa de sitio específico" significa cualquier enzima que cataliza la recombinación de sitio específico conservador entre sus sitios de recombinación correspondiente. Para revisión de las recombinasas de sitio específico ver Sauer (1994) Current Opinión in Biotechnology 5:521-527; y Sadowski (1993) FASEB 7:760-767; los contenidos de los cuales se incorporan en la presente por referencia. La primera y segunda recombinasas de sitio específico pueden ser recombinasas de longitud completa y/o fragmentos activos o derivados de los mismos. Las recombinasas de sitio especifico útiles para crear las recombinasas quiméricas de la invención incluyen recombinasas de la familia integrasa derivadas de los mismos, que catalizan la recombinación de sitio específico conservador entre los sitios de ADN específico. La familia de integrasa de las recombinasas tiene más de treinta miembros e incluye FLP, Cre, Int y R. Preferiblemente, las recombinasas no requieren de co-factores o un sustrato supercoloidal . Muy preferiblemente, las recombinasas son Cre y FLP. El bacteriófago Pl 2oxP-Cre y los sistemas de recombinaciones específicas en el sitio de FRT/FLP de plásmido Saccharomyces 2µ han sido estudiados extensamente y sus usos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Cre y FLP se sabe que funcionan en una variedad de organismos incluyendo bacterias, levadura, Drosophila, mamíferos y plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Además, estas recombinasas no requieren de factores auxiliares para que funcionen. Las recombinasas que especifican el sitio y secuencias que las codifican que son utilizadas en los métodos y composiciones de la invención pueden ser variantes de recombinasas de existencia natural y genes que las codifican. El término "variantes conservadoramente modificadas" aplica a aminoácido y secuencias de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particular, conservadoramente modifica variantes respecto a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservativamente modificadas de las secuencias de aminoácido. Debido a la degeneración del código genético, un amplio número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican la alanina del aminoácido. De esta forma, en cualquier posición en donde una alanina está especificada por un codón, el codón puede ser alterado en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan un especie de variación conservativamente modificada. Un experto ordinario reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Como las secuencias de aminoácidos, uno de los expertos reconocerá que las sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que altera agrega o elimina un aminoácido sencillo o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente codificada" en donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, cualquier número de residuos de aminoácido seleccionados del grupo de enteros que consiste de 1 a 15 puede ser así alterado. De esta manera, por"ejemplo se pueden hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7, ó 10 alteraciones. Las variantes conservadoramente modificadas típicamente proporcionan actividad biológica similar como la secuencia de-polipéptido no modificado a partir de la cual se derivan. Por ejemplo, el carácter específico del sustrato, la actividad de enzima o la unión de ligando/receptor es generalmente de al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de la proteína nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. - Los siguientes seis grupos cada uno contienen aminoácidos que son conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspártico (D) , ácido Glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) ; Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W) . Ver-Xreighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Más bien el uso de recombinasas de longitud completa, fragmentos funcionales de recombinasas específicos en el sitio pueden ser utilizadas en los métodos y composiciones de la invención. Los fragmentos funcionales de recombinasas específicas en el sitios pueden ser identificadas utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, los fragmentos funcionales de la prsteína FLP pueden ser identificados por su habilidad, después de la introducción a células que contienen sustratos de FRT-apropiados, a catalizar la recombinación específica en el sitio y dar como resultado una excisión de un gen marcador que se puede analizar. Un aspecto general de tal análisis funcional implica subclonación de fragmentos de ADN de un clon genómico, un clon de ADNc o secuencia de gen sintetizada en un vector de expresión, introduciendo el vector de expresión a un huésped heterólogo y clasificando para detectar el producto de recombinación (es decir, utilizando análisis de restricción para verificar el producto de recombinación al nivel de ácido nucleico, o con base en un sistema de ensayo para-recombinación, como se describió anteriormente) . Los métodos para generar fragmentos de un ADNc o clon genómico son bien conocidos. Las variantes de un ADN aislado que codifica una recombinasa específica de sitio pueden ser producidas eliminando, agregando y/o sustituyendo nucleótidos. Tales variantes pueden ser obtenidas por ejemplo, a través de mutagénesis dirigida al oligonucléotido, mutagénesis de exploración de eslabonador, mutagénesis utilizando la reacción de cadena de polimerasa y los similares. Ver por ejemplo, Ausubel, Current Protocols In Molecular Bislogy, Wiley Interscience (1990) páginas 8.0.3- 8.5.9 y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis : A Practical Approach , (IRL Press, 1991) . Las proteínas recombinantes de función doble de la invención comprenden una primera recombinasa específica de sitio fusionada en marco con una recombinasa especifica en el sitio. Se reconocerá que en los métodos de la invención, las recombinasas que comprenden la recombinasa quimérica deben corresponder a los sitios objetivo del organismo transformado y el cásete de activación. Es decir, si los sitios FRT y l oxP son usados, se necesitará una recombinasa FLP:Cre quimérica. Los marcos de lectura abiertos que codifican la primera y segunda recombinasas directamente pueden ser fusionados entre sí o pueden ser unidos a través de un eslabonador que mantenga el correcto marco de lectura de la recombinasa quimérica. Se debe entender que las recombinasas pueden ser fusionadas al término amino a carboxi, al término amino a amino, o al término carboxi a amino. Los genes que codifican recombinasas específicas en el sitio quiméricas y sitios de recombinación pueden hacerse utilizando métodos recombinantes estándares, técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y eslabonadores bien conocidos en la técnica, y puede encontrarse en tales referencias tales como Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Labora tory Manual, 2nd de. (Cold Pring Harbor, New York, 1989) . Una variedad de estrategias está disponible para ligar fragmentos de ADN, la elección de la cual depende de la naturaleza de los términos de los fragmentos de ADN y qué elecciones pueden ser fácilmente hechas por aquellos expertos en la técnica. El gen de recombinasa FLP de levadura { Sa ccharomyces cerevisa e) está comercialmente disponible en el plásmido pOG44 de Strategene Cloning Systems (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) . Para una descripción del gen FLP y varios ácidos nucleicos, ver por ejemplo, Stratagene Cloninq Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) ; y Amérsham Life Sciences, Inc., Catálogo =97 (Arlington Heights, IL) . Similarmente, las secuencias de muchas recombinasas específicas en el sitio y sus sitios de recombinación cognados están pública o comercialmente disponibles. Los genes que codifican FLP y Cre también pueden ser obtenidos por ejemplo de síntesis de los genes con oligonucleótidos de cadena larga mutuamente de iniciación. Ver, por ejemplo, Ausubel et a l . (eds.), Current Protocols In Molecular Biology, páginas 8.28 a 8.2.13, Wiley Interscience (1990) . También, ver Wosniak et al . (1987) Gene 60:115. Además, las técnicas actuales que usan la reacción de cadena de polimerasa proporcionan la habilidad para sintetizar genes tan grandes como de una longitud de 1.8 kilobases (Adang et al . (1993) Plan t Mol . Biol . 21:1131; Bombat et al . (1993) PCR' Methods and Applica tions 2:266) . Cuando el ácido nucleico es preparado o alterado-sintéticamente, se pueden tomar ventajas de preferencias de . codón conocidas del huésped pretendido, en donde el ácido nucleico va a ser expresado. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser expresadas tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden se modificadas para representar las preferencias de codón específicas y preferencias del contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que estas preferencias se han mostrado que difieren (Murray et al . (1989) Nucí . Acids Res . 17:477-498; y Campbell e t al . (1990 Plant Physiol . 92:1) . Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular puede ser derivado desde cualquier secuencia de gen conocido del maíz.. El uso de codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray e t a l . , supra . Ejemplos de genes que codifican recombinasas, utilizando codones preferidos de maíz incluyen FLPm, descrito en la solicitud copendiente 08/972,258; los conteñidos de la cual se incorporan aquí para referencia, y moCre, mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NOS. 1 y 2. FLPm se deriva de la recombinasa FLp "del plásmido Succharomyces 2µ, pero se codifica a través de una secuencia de ácido nucleico utilizando codones preferidos del maíz. Aunque la secuencia de ácido nucleico de FLPm incluye codones prefer.Jos de expresión de aminoácidos en maíz, se debe entender que una secuencia útil puede contener codones de existencia en el maíz con menos de las secuencias de codón de maíz reportadas más altas. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican recombinasas quiméricas incluyen Cre: FLPm (SEC. DE IDENT. NO. 4), moCre: FLPm (SEC. de IDENT. NO: 5), Cre: FLP (SEC. DE IDENT. No. 7) y FLPm: Cre (SEC. DE IDENT. NO. 8) . La invención también proveer casetes de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica una recombinación específica en el sitio quimérica, operablemente enlazada a otro motor que activa la expresión en una célula eucariótica. Preferiblemente, el promotor es un promotor de planta. Por ejemplo, el vector de expresión de planta PHP13147, mostrado en la Figura 1, contiene un cásete de expresión para Cre: FLPm, en donde el gen que codifica la recombinasa quimérica está operablemente enlazado a un promotor de ubiquitina. Como se usa en la presente, "operablemente enlazado" incluye una referencia a un enlace" funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora se inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que se están enlazando son contiguas, y cuando es necesario se unen dos regiones de. codificación de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura . Como se usa en la presente, "promotor" incluye la referencia a una región de ADN corriente arriba desde el inicio de la transcripción e involucrado en el reconocimiento y unión de polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de plantas. Promotores de plantas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y genes de bacterias que son expresados en células de plantas tales como aquellas de Agrobacteri um o Rhi zob um . Se pueden emplear promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir la expresión de una secuencia que codifica una recombinasa específica en el sitio. El promotor puede ser constitutiva, capaz de inducción o específico en el tejido. Muchos promotores constitutivos diferentes pueden ser utilizados en la presente invención. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen promotores de virus de planta tales como el promotor 35 de CaMV (Od_ell et al . (1985) Na t ure 313:810-812) y los promotores del gen tal como actina de arroz (McElroy et al . (1 990) Plan t Cell 2:163-171), ubiquitinas (Christensen et al . (1989) Plan t Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen et al . (1992) Plan t Mol . Biol . 18:675-689); pEMU (Last et al . (1991) Theor. Appl . Genet^_ 81:581-588); MAS (Velten et al . (1984) ?MBO J. 3: 2723-2730) 7 histona H3 de maíz (Lepetit et al . (1992) Mol . Gen . Genet . 231:276-285 y Atanassova et al . (1992) Plan t Journal 2 (3) ;291-300) ; el promotor 1 ' o 2 ' derivado de ADN-T de Agroba cteri um tumefa ciens, el promotor Smas, el promotor de deshidrogenasa de alcohol cinamílico (Patente Norteamericana No. 5,683,439), los promotores Nos, el promotor Pemu, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8 y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidos por aquellos expertos en la técnica. El promotor ALS, un fragmento de Xbal/Ncol de 5-prima para el gen estructural Brassica napus ALS3 (o una secuencia dé nucleótido que tiene una similitud de secuencia sustancial a dicho fragmento Xbal/Ncol) representa un promotor constitutivo particularmente útil (Ver Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente de Pioneer Hi-Bred 08/409,297, los contenidos de la cual se incorporan aquí para referencia) . Una variedad de promotores capaces de inducción fueron utilizados en la presente invención. Ver Ward et aJ. (1993) Plan t Mol . Biol . 22:361-366. Los ejemplos de"" promotores a base de inducción incluyen aquellos del sistema ACE1 el cual corresponde a cobre (Mett et al . (1993) PNAS 90:4567-4571); gen In2 de maíz que responde a aseguradores de herbicida de bencensulfonamida (Hershey et al . (1991) Mol. Gen- Genetics 227:229-237 y Gatz et al . (1994) Mol . Gen . Genetics 243:32-38); él promotor Adhl, el cual es capaz de inducción a través de hipoxia o tensión, el promotor Hsp70, el cual es capaz de inducción a través de tensión por calor, y el promotor PPDK el cual es capaz de inducción por luz; o el represor Tet de TnlO (Gatz et a l . (1991) Mol . Gen . qenet . 227 :"229-237. Un promotor capaz de inducción particularmente preferido es un promotor que responde a un agente de inducción al cual las plantas normalmente no responden. Un promotor capaz de inducción ilustrativo es el promotor capaz de inducción de un gen de hormona esteroidal de actiyidad transcripcional que es inducida por una hormona glucocorticoesteroide (Schena et al . (1991) Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A . 88 : 10421) . Ejemplos de promotores bajo el control de desarrollo-incluyen promotores que inician solamente la transcripción, o preferiblemente en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor también pueden variar dependiendo su ubicación en el genoma. De esta manera, un promotor capaz de inducción puede volverse total o parcialmente constitutivo en ciertas localizaciones. La recombinasa quimérica debe ser expresada en las células de la planta con el fin de la integración del ADN de interés en el cromosoma huésped. Por consiguiente, el cásete de expresión que codifica la recombinasa específica en el sitio puede ser suministrado en ci s al ADN de interés; en trans en un cromosoma huésped o replicón extracromosomal; o puede ser transferido el huésped y pasajeramente expresado cercana del momento en el que se desea la recombinación. Las composiciones de la invención incluyen casetes de transferencia que comprenden secuencias de nucleótido que codifican las recombinasas quiméricas de la invención. Por cásete de transferencia se quiere dar a entender cualquier secuencia de nucleótido que pueda ser utilizada para transformar una célula de interés. Por ejemplo, el cásete de transferencia puede ser un replicón independiente tal como un plásmido, vector promiscuo, plásmido Ti, vector viral o similares. Alternativamente, el cásete de transferencia puede ser un ácido nucleico que no es capaz de replicación independiente, aún puede ser translerido en un organismo de interés a través de una variedad de protocolos de transferencia, tales como bombardeo de partículas, electroporación, y similares. De esta manera, la invención proporciona un cásete de transferencia que comprende una secuencia de nucleótido que codifica- una proteína recombinante que comprende una primera recombinasa específica en el sitio fusionada en marco con una segunda recombinasa específica en el sitio, en donde la secuencia de nucleótido está operablemente enlazada al promotor que dirige la expresión en una célula eucariótica. - En las composiciones y métodos de la invención, el ADN de interés es flanqueado por sitios objetivo para dos distintas recombinasas específicas en el sitio. Por "flanqueado por" se quiere dar a entender la recombinación de sitios objetivo que pueden estar directamente contiguos con el ADN de interés, o pueden ser una o más secuencias de intervención presentes entre uno o ambos extremos de ADN de-. interés y los sitios de recombinación específicos en el--sitio. Las secuencias de intervención de interés particular pueden incluir eslabonadores , adaptadores, marcadores seleccionables y/u otros sitios que ayudan en la construcción o análisis de vector y cásete de expresión para un gen de interés. Los sitios objetivos para recombinasas específicas en el sitio son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se discuten en la solicitud provisional co-pendiente 60/065,613. Ejemplos de sitios objetivo incluyen, pero no se limitan a FRT, FRT1, FRT5, FRT6, FRT7 u otros mutantes FRT, loxP, mutantes loxP y similares. Ver por ejemplo, Schlake and Bode (1994) Bi ochemis try 33:12746-127'51; Huang et al . (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; "Sadowski (1995) en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, pp. 53-91; Cox (1989) In Mobil e DNA, Berg and Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D.C., pp . 116^ 670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf and Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant and Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Lox Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; y Dale and Ow (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; y Dale et al (1990) Gene 91:79-85; todas de las cuales se incorporan aquí para referencia. Por "sitio objetivo para una recombinasa específica en el sitio" se quiere dar a entender una secuencia de ADN que es reconocida por una recombinasa específica en el sitio particular. Una variedad de sitios de recombinación es reconocida por aquellos expertos en la técnica y puede ser usada en los métodos y composiciones de la invención. Li sitio puede tener una secuencia de cognado para una recombinasa dada, o puede ser modificado, siempre que sea capaz de actuar como un sitio de recombinación. El sitio puede contener las secuencias mínimas necesarias para la recombinación, o puede contener secuencias adicionales que mejoran la recombinación. Ejemplos de sitios de recombinación para utilizar en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen sitios FRT y loxP (Ver por ejemplo, Schlake and Bode (1994) Biochemistry 3 :12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) In Prógress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51 pp . 53-91; Michael M. Cox (1989) In Mob±le DNA, Berg and Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D.C., pp . 116-670; Díxon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf and Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant and Geagy (1995) Wat. Med. 1: 592-594; Lox Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659; Bayley eñ al T1992) Plan^ Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; y Dale y Ow (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui ét al. (1994) Proc. "Nati. Acad. Sci. USA 91: 1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; Hartley et al. (1980) Nature 286:860-864; Sauer (1994) Current Opinión in Biotechnology 5:521-527; y Dale et al (1990) Gene 91:79-85; todas éstas se incorporan aquí por referencia) . Cada sitio loxP y FRT contiene repeticiones invertidas de 13 pares de bases, las cuales flanquean un-separador de 8 pares de base. El sitio r-T contiene una repetición de 13 pares de base no esencial. Las secuencias de los- sitios loxP y FRP han sido descritas en muchas publicaciones. Un sitio FRT mínimo que comprende repeticiones de 13 pares de base, separadas por un separador de 8 bases, es : 5' -GAAGTTCCTATTC [TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3 ' en donde los nucleótidos entre corchetes indican (SEC. DE IDENT. No. 10) . Los nucleótidos en la región separadora pueden ser remplazados con una combinación de nucleótidos, siempre que las 13 repeticiones de base estén separados por ocho nucleótidos. FLP es una recombinasa específica en el sitio, conservadora, capaz de catalizar la inversión de una secuencia de ácido nucleico posicionada entre dos FRT inversamente orientados; recombinaciones de dos moléculas cada una conteniendo un sitio FRT; y la excisión entre sitios FRT. La región de núcleo no es simétrica, y su" asimetría dicta la direccionalidad de la reacción. La recombinación entre sitios FRT invertidos ocasiona la inversión de una secuencia de ADN entre ellos, mientras que la recombinación en sitios directamente orientados conduce a la excisión del ADN entre ellos. Las secuencias de nucleótidos que contienen un ADN de interés flanqueado por sitios objetivo, casetes de transferencia para dos recombinasas especificas en el sitio distintas y vectores que llevan estas secuencias pueden ser construidas utilizando técnicas de - biología molecular estándares. Ver, por ^ejemplo, Sambrook et al (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold. Spring Harbor, NY 1989) . Las técnicas para transformar una amplia variedad de células eucarióticas, incluyendo especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen con detalle técnica, científico y literatura de patentes. Ver por ejemplo, Weising et al . , Ann . Rev. Genet . 22: 421-477 (1988) . Estos métodos son útiles para transformar una célula de planta con los casetes de expresión de recombinasa quimérica de la invención y ADNs de interés flanqueados por sitios objetivos para la recombinasa quimérica. El cásete de expresión que codifica la recombinasa específica del sitio puede estar presente en el genoma de planta antes de la transformación del ADN de interés, o puede ser transformado a la planta alrededor del tiempo de la transformación con el ADN-T a la célula de planta de manera que será pasajeramente expresada. Por ejemplo, la construcción de ADN puede ser introducida directamente "en el ADN genómico "en la célula de planta utilizando técnicas tales como electroporación, poración PEG, bombardeo de partículas, suministro de fibra de silicio, o una microinyección de protoplastos de célula de planta o callo embriogénico. Las técnicas de transformación mediadas por Agroba cteri um tumefaciens se describen muy bien en la literatura científica. Ver por ejemplo, Horsch et al . , Science 233: 496-498 (1984), Fraley et al. Proc. Nati. Acad. Sel. 80: 4803 (1983) y Kado, (1991), Crit. Rev. Plant. Sci 10:1. Las descripciones de los sistemas del vector Agrobacterium y métodos para la transferencia de gen mediada por Agrobacterium se proporcionan • -i Gruber et al., supra; Miki, et al. , supra; y Maloney et al. (1989), Plant Cell Reports 8:238. Aunque el Agrobacterium es principalmente útil e,n dicotiledóneas, ciertas monocotiledoneas pueden ser transformadas por Agrobacterium. Por ejemplo, la transformación por Agrobacterium de maíz se describe en la Patente Norteamericana No. 5,550,318. Otros métodos de agroinfección incluyen transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (ver por ejemplo, Lichtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol. 6 PWJ Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; and Lichtenstein, C.P., y" Draper, J. , In: DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985), Solicitud PCT/US87/02512 (WO" 88/02405 publicado el -7 de abril de 1988) describe el uso a-e la cepa A4 de A. rhizogenes y su plásmido Ri junto con vectores de A. tumefaciens pARC8 o pARC16. Los métodos y vectores optimizados para la transformación mediada por Agrobacterium de plantas en la familia Graminae, tales como arroz y maíz "se han descrito por Heath et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact.. 10:221-227; Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282 e~--shida et al. (1996) Nat. Biotech. 14:745-750 , los contenidos de las cuales re incorporan aquí para referencia. La eficiencia de la transformación de maíz es afectada por una variedad de factores que incluyen los tipos y etapas de tejido infecto, la concentración de "" Agrobacterium, medios de cultivo de tejido, los vectores Ti y el genotipo de maíz. Los vectores super binario que llevan los genes vir de las cepas A281 y A348 de Agrobacterium son útiles para -la transformación de eficiencia de monocotiledónea . La introducción de construcciones de ADN utilizando precipitación con polietilenglicol se describe en Paszkowski et -al., Embo J. 3: 2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen por Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 82: 5824 (1985) . Las técnicas de transformación balísticas se describen por Klein et al, Nature 327: 70-73 (1987) . Los medios virales para introducir ADN a células de mamíferos son conocidos en la técnica. En particular, un número de sistemas de vector es conocido para la introducción de genes extraños o nativos a células de mamíferos. Estos incluyen el virus SV40 (ver por ejemplo, Okayama et al. (1985) Molec. Cell Biol. 5:1136-1142); virus de papiloma de bovino (ver por ejemplo, DiMaio et al (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73:4030-4034); adenovirus (Ver por ejemplo, Morin et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:4626; Yifan et al. 1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1401-1405; Yang et al. (1996) Gene Ther. 3:137-144; Tripathy et al. (1996) Natr 2:545-550; Quantin et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Scir USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431--434; Wagner (1992) Proc. Nati. Acad. Sci, USA 89: 6099-6103; Curiel et al. (1992) Human Gene Therapy 3:147-154; Curiel (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8850-8854; LeGal LaSalle et al. (1993) Science 259: 590-599) ; Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:11498-11502); virus adeno-asociado (Ver, por ejemplo, Muzyczka et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:1351; Xiao et al. (1996) J. Virol. 70:8098-8108); virus de herpes simple (Ver, por ejemplo, Geller et al. (1988) Science 241:1661; Huard et al. (1995) Gene Therapy 2.--- 5-392; Patente Norteamericana No. 5,501,979); vectores a base de retrovirus (Ver, por ejemplo, Curran et al. (1982) J. Virol. 44:674-682; Gazít et al. (1986) J. Virol. 60:1-9-28;-Miller, A.D. (1992) Curr. Top. Microbiol. ImmnncZL. 158:1-24; Cavanaugh et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:7071-7075; Smith et al. (1990) Molecular and Cellular Biology 10 ;-3268 -3271) ; incorpora aquí para referencia. Ver también Wu, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14338-14342; Wu and Wu ( - Biol. Chem. (1988)) 255:14621-14624; Wu et al. (1989) J.

Biol. Chem. 264:16985-16987; Zenke et al. (1990) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 87:3655-3659; Wagner et al. (1990) 87:3410-3414.

El ADN también puede ser introducido en plantas a través de transferencia directa de ADN al polen como se describe por Zhou et al . Methods in Enzymol ogy, 101:433 (1983); D. Hess, In tern Rev. Cytol . , 107:367 (1987); Luo et al . , Plañe Mol . Biol . Repórter, 6:165 (1988). La expresión de genes que codifican polipéptido puede ser obtenida a través de inyección del ADN a órganos reproductivos de una planta como se describe por Pena et al . , Na t ure , 325:-274 (1987)". El ADN también puede ser inyectado directamente a las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones desecados como se describe por Neuhaus et a l . , Theor. Appl . Genet . , 75:3- "(1987); y Benbrook et al., en Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stone. am, Mass., pp . 27-54 (1986) . Una variedad de virus de plantas que puede ser empleada como vectores es conocida en la técnica e incluye virus de mosaico de coliflor (CaMV) , geminivirus, virus de mosaico de bromo y virus de mosaico de tabaco. Las células de plantas establemente transformadas con un cásete de expresión de recombinasa quimérica pueden ser -regenerada, por ejemplo, de células individuales, tejido de callo o discos de hoja de acuerdo con técnicas de cultivo de te ido de planta estándares. Es bien conocido en la técnica que varias células, tejidos y órganos de cualquier planta puede ser exitosamente cultivados para regenerar una planta completa. La regeneración de planta a partir de protoplastos cultivados se describe por Evans et al., Protoplast Isolation and Cultur , Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, pp . 124-176 (1983); y Binding, .Regener, tion of Plants, Plant Protoplast, CRC Press, Boca Ratón, pp . 21-73 (1985) . La regeneración de plantas que contienen los genes recqmbinantes puede lograrse como se describe por Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985) . En este procedimiento, se desarrollan transformantes de un agente "de selección y en un medio que induce la regeneración de brotes en la especie de planta que está siendo transformada como se describe por Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Esté procedimiento típicamente produce brotes en dos a cuatro semanas y estos brotes transformantes después son transferidos a un medio de inducción de raíz apropiado conteniendo el agente selectivo y un antibiótico para evitar el desarrollar bacteriano. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o estériles. La regeneración también puede ser obtenida del callo-de planta, ex plantas, órganos o partes de- los mismos. Dichas técnicas de regeneración se describen en general en Klee et-al., Ann. Rev. of - Plant Phys. 38: 467-486 (1987). Xa-T regeneración de plantas a partir ya sea de protoplastos o varias plantas es bien conocida en la técnica. Ver por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A". Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif . (1988) . Esté proceso de regeneración y desarrollo incluye los pasos de selección de células transformantes y brotes, formación de raíz de los brotes transformantes y desarrollo d, las plántulas en el suelo. Para el cultivo y regeneración de célula de maíz, ver en general, the Maize Handbook , Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvemen t , 3ra edición, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988) . Un experto reconocerá que después de que un ADN, tal como un cásete de expresión de recombinasa quimérica o sitio objetivo para una recombinasa quimérica es establemente incorporado en plantas transgénicas y confirmado como operable, éste puede ser introducido a otras plantas a través de cruce sexual. Cualquier número de técnicas de cruce estándares puede ser usada, dependiendo de la especie que se va a cruzar. Los métodos y composiciones de la invención son útiles para integrar un ADN de interés en el genoma de cualquier célula huésped, incluyendo cualquier huésped de planta. Como se usa en la presente, el término "planta" incluye la referencia a plantas enteras, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células de planta y la progenie de la misma. Xa célula de planta, como se usa en la presente incluye, sin limitación,- cultivos de suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametopitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas que puede ser utilizada en los métodos de la invención generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores que se pueden manejar para técnicas de transformación, incluyendo plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Una monocotiledónea particularmente preferida es maíz. Otras monocotiledóneas de interés particular incluyen trigo, arroz, cebada, sorgo y centeno. Las dicotiledóneas de interés particular incluyen soya, Brassica," girasol, alfalfa y cártamo. Debido al uso de las recombinasas específicas en el sitio quiméricas y sitios objetivo provistas en la presente, las células transformadas a través de lo-s métodos de la invención pueden distinguirse de otros métodos- de transformación como las células modificadas de la invención contendrán secuencias de nucleótido de interés insertadas en el genoma flanqueado por los sitios objetivos para distintas recombinasas . Los siguientes ejemplos se presentan a manera de ilustración y no a manera de limitación. PARTE EXPERIMENTAL - Ejemplo 1 Construcción de Vectores que Contienen un" ADN de Interés Flanqueado por Sitios Objetivo para una Recombinasa Específica de Sitio Quimérica Se construyeron fragmentos de -ADN conteniendo un-ADN de interés flanqueado por los sitios objetivo loxP y FRT ya sea sintetizando, aplicando calor y lígando_ oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para la amplificación de PCR de un ADN de interés que contiene los sitios de loxP y FRT, además de los sitios- de -restricción útiles para la clonación en un vector de elección. Por ejemplo, se pueden diseñar iniciadores de PCR largos en donde el extremo 3' del iniciador - hibridiza el extremo 5' del ADN de interés y el extremo 5' de los iniciadores además contiene sitios loxP y FRT y sitios de clonación útiles. El producto de PCR resultante es digerido con la enzima de restricción apropiada e insertado en un. vector apropiado. Ejemplo 2 Excisión del Sitio FRT a través de FLPm y la Recombinación Quimérica Cre: FLPm Un cásete de transferencia que codifica una"-recombinasa quimérica Cre-FLPm a células de plantas teniendo un cásete de expresión que codifica el GUS activado por el promotor de ubiquitina, en donde una secuencia flanqueada ya sea por FRT idéntico o sitios de loxP interrumpió el marco de lectura abierto de GUS. Las Figuras 2 y 3 muestran que la recombinasa quimérica Cre-FLPm es funcional independientemente ya sea del sitio de FRT o del sitio loxP, según medido por la capacidad para activar la activación de GUS después de la excisión de secuencias entre dos sitios objetivo idénticos, llevando así a la actividad GUS bajo el control del promotor de ubiquitina. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece -esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan aquí para referencia al mismo grado, si cada publicación individual o solicitud de patente fue específica e individualmente indicada para ser incorporada para referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Baszczynski, Christopher L. Lyznik, Leszek A. Gordon-Kamm, William J. Guan, Xueni Rao, Gurú Tagliani, Laura A. <12O> Un Método Novedoso Para La Integración De ADN Extraño En Genomas Eucarióticos <130> 5718-66-1 " - X <140> PCT/US98/24608 <141> 1998-11-17 - -- - <150> 60/099,435 X " " <151> 1998-09-08 "" "" -X <150> 60/065,627 <151> 1997-11-18 ~_ <150> 60/065,613 <151> 1997-11-18 _ " -X <16J> 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <22"0> <223> Descripción de Secuencia Artificial: La proteína Cre del Bacteriófago Pl con los codones de maíz preferidos (moCRE) <400> 1 Met Ser Asn Leu Leu Thr"Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val ~~ 1 5 10 15 - - Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg 20 25 3JD Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His "Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 - - Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala 65 70 75 80 Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr lie Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn 85 " 90 I 95 "X Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala 100 - 105 X 11Q Val Ser Leu Val Met Arg Arg lie Arg Ly.s Glu Asn Val Asp Ala Gly 115 120 125 Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu 7.1a Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arq Cys Gln Asp lie Arg Asn 145 150 155 - --- 160 . --,.

Leu Ala Phe Leu Gly lie Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg lie Ala Glu 165 170 175 lie Ala Arg lie Arg Val Lys Asp lie Sei Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 190 Mef Leu lie His lie Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 lie Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 255 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly lie Phe Glu Ala Thr His Arg Leu lie 260 265 270 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly 275 280 285 His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 Ser lie Pro Glu lie Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn He 305 310 315 320 Val Met Asn Tyr He Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val 325 330 335 Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 340 <210> 2 <211> 1032 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: La secuencia de Nucleótido que codifica la proteína Cre del Bacteriófago Pl, codones de maíz preferido (moCRE) <400> 2 atgtccaacc tgctcacggt tcaccagaac cttccggc.< ttccagtgy-i cgcgacgtcc 60 _ gatgaagtca ggaagaacct catggacatg ttccgcgaca ggcaagcgt. cagcgagcac 120 acctggaaga tgctgctctc cgtctgccgc tcctgggctg catggtgcaa gctgaacaac 180 agga^gtggt tccccgctga gcccgaggac gtgagggatt accttctgta cctgcaagct 240 cgcgggctgg cagtgaagac catccagcaa caccttgga< actgaacdt gctteacagg _ 300 _~ cgctccggcc tcccgcgccc cagcgactcg aacgccgtg gcctcgtc<-t grgrcgcatc 360 aggaaggaaa acgtcgatgc cggcgaaagg gcaaagcagg rcctcgcgt t _ cgagaggacc 420 gatttcgacc aggtcrgcag cctgatggag aacagcgacn ggtgccagya cattaggaac 480 -_ ctggcgttcc tcggaattgc atacaacacg ctcctcaggn tcgcggaacit tgcccgcatt 54Q cgcgtgaagg acattagccg caccgacggc ggcaggatgc ttatccacat tggcaggacc 600 aagacgctcg tttccaccgc aggcgtcgaa aaggccct- gcctcggaqt gaccaagctc 660 gtcgaacgct ggatctccgt gtccggcgtc gcggacgacr caaacaactu cctcttctgc 720 cgcgtccgca agaacggggt ggctgcccct agcgccacca gccaactcag cacgagggcc 780 ! tggaaggta tttf cgaggc cacccaccgc ctgatctac gcgcgaagga tgucagcggt 840 caacgctacc tagcatggtc cgggcactcc gcccgcgtt i gagctgct.icj ggacatggrr 900 cgcgccggtg ttttcatc-c cgaaatcatg caggcgggty gatggacga.- cgtgaacatt 96Q --_ gtcatgaact acattcgcaa ccttgacagc gagacgggcj eaatggtttg cctcctggaa 1020--^ gatggtgact ga 1032 <210> 3 <211> 781 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223 Descripción de la Secuencia Artificial: Cre: polipéptido FLPm, Cre del Bacteriófago Pl y FLP del Saccharomyces con los codones de maíz preferidos -<400> 3 Met Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu "Pro Ala Leu Pro Val 1 5 10 - - 15 Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg 20 25 30 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala 65 70 75 JO Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr He Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn 85 90 - _ 95 Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala 100 105 110 - X Val Ser Leu Val Met Arg Arg He Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly 115 120 125 Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp He Arg Asn 145 150 155 - _ 160 Leu Ala Phe Leu Gly He Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg He Ala Glu 165 170 175 He Ala Arg He Arg Val Lys Asp He Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 190 Met Leu He His He Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 He Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 " 255 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly He Phe Glu Ala Thr His Arg Leu He 260 265 270 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly 275 280 285 His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 Ser He Pro Glu He Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn He 305 310 315 3-20 Val Met Asn Tyr He Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val 325 330 " X 335 Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Gly Gly Gly Ser Gly G-y Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Asp Pro Thr Met Pro Gln Phe Asp He Leu Cys Lys Thr 355 360 365 Pro Pro Lys Val Leu Val Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro 370 375 380 Ser Gly Glu Lys He Ala Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys 385" 390 395 400 Trp Met He Thr His Asn Gly Thr Ala He Lys Arg Ala Thr Phe Met 405 410 415 Ser- Tyr Asn Thr He He Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp He Val Asn 420 - 425 430 Lys Ser Leu Gln Phe Lys Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr He Leu Glu 435 440 445 Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Pro Ala Trp Glu Phe Thr He He Pro 450 455 460 __ Tyr Tyr Gly Gln Lys His Gln Ser Asp He Thr Asp He Val Ser Ser 465 470 475 " "" 480 Leu Gln Leu Gln Phe Glu Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser 485 490 495 " His Ser Lys Lys Met Leu Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser He 500 505 510 Trp Glu He Thr Glu Lys He Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg 515 520 525 Phe Thr Lys Thr Lys Thr Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe 530 535 54Q He Asn Cys Gly Arg Phe Ser Asp He Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser 545 550 555 560 Phe Lys Leu Val Gln Asn Lys Tyr Leu Gly Val He He Gln Cys Leu 565 570 _ ""575 Val Thr Glu Thr Lys Thr Ser Val Ser Arq His He Tyr Phe Phe Ser 580 585 590 Ala Arg Gly Arg He Asp Pro Leu Val Tyi Leu Asp &lu Phe Leu Arg 595 600 605 Asn Ser Glu Pro Val Leu Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Asn Lys Gln Glu Tyr Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser 625 630 635 640 Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Lys Asn Ala Pro Tyr Ser He Phe Ala He - 645 650 655 Lys Asn Gly Pro Lys Ser His He Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe 660 665 670 Leu Ser Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp 675 680 685 Ser Asp Lys Arg Ala Ser Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln 690 695 700 He Thr Ala He Pro Asp His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr 705 710 " 715 - 720 Ala Tyr Asp Pro He Ser Lys Glu Met He Ala Leu Lys Asp Glu Thr 725 730 735 Asn Pro He Glu Glu Trp Gln His He Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala 740 745 750 Glu Gly Ser He Arg Tyr Pro Ala Trp Asn Gly He He Ser Gln Glu 755 760 765 Val Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Tyr He Asn Arg Arg He 770 775 780 <210> 4 <211> 234 6 <212> -ADN <213> Secuencia Artificial <22O> <223> Descripción de la Secuenci a Artificial : Nucleotido secuencia de nucleótido codificando una Cre : polipéptido FLPm, Cre del Bacteriófago Pl y FLP ( codones de Maí z preferidos ) de Saccha romyces <4 0 Q> 4 atggccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat. taccggtcga tgcaacgagt 60 gatgaggttc gcaagaacct- gatggacatg ttcagggar t gccaggcgt t ttctgagcat 120 acctggaaaa tgcttctgtc cgtt -gccgg tcgtgggcgg catqqtqcaa gt tqaataac 180 qqaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcga t atettetata tcttcaggcg 240 cgcggtctgg cagtaaaaac tatecageaa catttgggci agetaaac it gcttcatcgt 300 cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttdt gcggcggatc 360_ cqaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcg t cgaacgcact 420 gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgati gctgccagga^ tatacgtaat 480 ctggcatttc tggygattgc ttataacacc ctgttacgt i tagccgaaat tgccaggatc 540 agggttaaag atat tcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcarfaacg 600 aaaacgctgg tta jcaccgc aggtgtagag aaggcacttn gcctggggqt aactaaactg 660 gtcgagcgat ggatt ccgt ctctggtgta gctgatgat - cgaataac a cctgttttgc ^20 <_gggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gecagetat aactcgcgcc '80 ctggaaggga tttttgaagc aaetcatega ttgatttacq gcgctaagqa tgactctggt 840 cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcq gagccgcg -y agatatggc ^00 < gcgctggag ttt aatacc ggagatcatg caagctggtq gctggaccaa tgtaaatatt -0^ gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgi q cctgctggaa 1020 gatggcgatg gtggcggcag cggtggcggc tccggcggty gctcggatce aacaatgccc 1080_ ragttcgaca tcctd gcaa gacccccccc aaggtgctrq tgaggcag f _ cgtgg_agagg 1140 i tcgagaggc cctccqgcga gaagategee ctctgcgccq ccgagctc^r ctacctctgc 1200 tggatgatca cccacaacgg caccgccatt aagagggcca ccttcatgtc atacaacacc 1260 at -atctcca actccctctc cttcgacatc gtgaacaagt ccctccagtt .-caaatacaag 1320- cccagaa-gg ccaccatcct cgaggcctcc etcaagaage tcatccccqc ctgggagttc 1380_ accatcatcc cctactacgg ccagaagcac cagtccgaca tcaccgacat cgtgtcatcc 1440 i -ccagcttc agtt cqagtc ctccgaggag gctgacaaq i gcaactcct a etecaagaag 1500 i. yctgaagg cc-.t< ' tete cgagggcgag tccatctgyy agatcacrq . gaagatcetc 1560_ aactccttcg agtacacctc caggttcact aagaccaag i ccctctací a gt tcctcttc 16-0-ctcgccacct tcatcaactg cggcaggttc tcagacatca agaacgtggj cccaaagtcc 1680 ttcaagctcg tgcagaacaa gtacctcggc gtgatcatc. agtgcctcgt gaccgagacc _ 1740 _ aagafcctccg tgt caggca catctacttc ttctccgct. gcggcaggat cgaccccctc 18QXL-.--. gtgtacctcg acgagttcct caggaactca gagcccgtg-. tcaagagggt gaaeaggace 1860_-ggcaactcct cctccaacaa gcaggagtac cagctcctca aggacaacrt cgtgaggtcc __ 1920 — tacaacaagg ccctcaagaa gaacgccccc tactccatct tcgccatcaa gaacggcccc 1980 aagtcccaca tcggtaggca cctcatgacc tccttcctc caatgaagyy ceteaccgag __ 2040_ rtcaccaacg tggtgggcaa ctggtccgac aagagggc t ccgccgtgge caggaccacc 2100 ^_ t acacccacc agatcaccgc catccccgac cactacttcg ccctcgtgt<__ aaggtactac 2160 gcctacgacc ccatctccaa ggagatgatc gccctcaayy acgagactaa_ccccatcgag 2220 gagtggcagc acatcgagca gctcaagggc tccgccgagg gctccatcag gtaccccgcc 2280 tggaacggca tcatctccca ggaggtgctc gactacctct cctactaaat jcaacaggagg 2340 atctga 2346 <210> 5 <21-1> 2346 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia codificando moCre:FLPm, Cre de Bacteriófago Pl y FLP de Saccharomyces, ambos codones de maíz preferido <220> <221> CDS <222> (1) .. (2346) <400> 5 atg tcc aac ctg ctc acg gtt cac cag aac ctt ccg gct ctt cea gtg 48 Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val 1 5 10 -15 gac "gcg acg tcc gat gaa gtc agg aag aac ctc atg gac atg ttc cgc 96 Asp -laX.hr Ser Asp Glu Val" Arg Lys Asn Leu Met Asp Met P e" Arg 20 25 30 gac agg caá gcg ttc age gag cac acc tgg aag atg ctg ctc tcc gtc 144 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 tgc cgc tcc tgg gct gca tgg tgc aag ctg aac aac agg aag tgg ttc - 192 Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe 50 55 60 ct-.c gct gag ccc gag gac gtg agg gat tac ctt ctg tac ctg caá gct - 240 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala 65- 70 75 80 cgc ggg ctg gca gtg aag acc atc cag caá cac ctt gga caá ctg aac 288 Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr He Gln Gln His Leu""Gly Gln Leu Asn 85 90 95 atg ctt cac agg cgc tcc ggc ctc ccg cgc ccc age gac tcg aac gcc 336 Met- Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala 100 105 110 gtg age ctc gtc atg cgc cgc atc agg aag faa aac qtc gat gcc ggc 384 Val Ser Leu Val Met Arg Arg He Arg Lys Glu Asñ Va l Asp Ala Gly 115 120 125 gaa agg gca aag cag gcc ctc gcg ttc gag agg acc gat ttc gac cag 432 Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 gtc cgc age ctg atg gag aac age gac agg tgc cag_ gac att agg aac _ 480 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg c ys Gln Asp He Arg Asn 145 150 155 -- 160 "" ctg gcg ttc ctc gga att gca tac aac acg ctc ctc agg atc gcg gaa 528 Leu. Ala Phe Leu Gly He Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg lie Ala Glu 165 170 175 att gcc cgc att cgc gtg aag gac att age cgc acc gac ggc ggc agg 576 He Ala Arg He Arg Val Lys Asp He Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 190 atg ctt atc cac att ggc agg acc aag acg ctc gtt tcc acc gca ggc 624 Met Leu He" His He Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 gtc gaa aag gcc ctc age ctc gga gtg acc aag ctc gtc gaa cgc tgg 672 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu "Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 atc tcc gtg tcc ggc gtc gcg gac gac cea aac aac tac ctc ttc tgc 720 He Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 cgc gtc cgc aag aac ggg gtg gct gcc cct age gcc acc age caá ctc 768 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 Z55" age acg agg gcc ttg gaa ggt att ttc gag gcc acc cac cgc ctg atc 816 Sen Thr Arg Ala Leu Glu Gly He Phe Glu Ala Thr His Arg Leu He 260 265 270 tac ggc gcg aag gat gac age ggt caá cgc tac ctc gca tgg tcc ggg 864 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu" "Ala Trp Ser Gly 275 280 285 cac tcc gcc cgc gtt gga gct gct agg gac atg gcc cgc gcc ggt gtt 912 His -Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 tec -atc ccc gaa atc atg cag gcg ggt gga tgg acg aac gtg aac att 960 _ Ser He Pro Glu He Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn He 305 310 315 - - 320 gtc atg aac tac att cgc aac ctt gac age gag acg ggc gca atg gtt 1008 Val Met Asn Tyr He Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val - 325 - 330 . -- 335 cgc OtC ctg gaa gat ggc gat ggt ggc ggc age ggt ggc ggc tcc ggc 1056- Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 ggt -age tcg gat cea acá atg ccc cag ttc gac atc ctc tgc aag acc 1104.

Gly Gly Ser Asp Pro Thr Met Pro Gln Phe Asp He Leu Cys Lys Thr 355 -360 365 ccc ccc aag gtg ctc gtg agg cag ttc gtg gag agg ttc gag a g ccc 1152 Pro Pro Lys Val Leu Val Arg Gln Phe Val (Xu Arg Phe Glu Arg Pro 370 375 380 tcc ggc gag aag atc gcc ctc tgc gcc gcc gag ctc acc t¡ac ctc tgc 1200 Ser Gly Glu Lys He Ala Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys 385 390 395 400 tgg atg atc acc cac aac ggc acc gcc att aag a99- 9CC acc ttc atg 1248 Trp""Met He Thr His Asn Gly Thr Ala He Lys Arg Ala Thr Phe Met 405 410 415 tea tac aac acc atc atc tcc aac tcc ctc tcc ttc gac atc gtg aac 1296 Ser Tyr Asn Thr He He Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp He Val Asn 420 425 430 aag tcc ctc cag ttc aaa tac aag acc cag aag gcc acc atc ctc gag 1344 Lys Ser Leu Gln Phe Lys Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr He Leu Glu 435 440 445 gcc tcc ctc aag aag ctc atc ccc gcc tgg gag ttc acc _ate^ ate ccc 1392 Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Pro Ala Trp Glu Phe Thr He He Pro - 450 455 460 tac tac ggc cag aag cac cag tcc gac atc acc gac ate gtg tea tcc -.1440 Tyr Tyr Gly Gln Lys His Gln Ser Asp He Thr Asp He Val Ser Ser 465 470 475 " 480 " ctc cag ctt cag ttc gag tcc tcc gag gag gct gac aag ggc aac tcc 1488 Leu G'ln Leu Gln Phe Glu Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser 485 490 495 cac tcc aag aag atg ctg aag gcc ctc ctc tcc gag ggczgag tcc atc 1536 His Ser Lys Lys Met Leu Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser He 500 505 510 tgg gjag atc acc gag aag atc ctc aac tcc ttc gag tac acc tcc agg 1584 Trp Glu He Thr Glu Lys He Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg 515 520 525 ttc act aag acc aag acc ctc tac cag ttc ctc ttc ctc gcc acc ttc 163-2 Phe Thr Lys Thr Lys Thr Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe 530 535 540 atc aac tgc ggc agg ttc tea gac atc aag aac gtg gac ccc aag tcc 1680 He Asn Cys Gly Arg Phe Ser Asp He Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser 545 550 555 " 560 --ttc aag ctc gtg cag aac aag tac ctc ggc gtg atc ate cag tgc ctc 1728 Phe Lys Leu Val Gln Asn Lys Tyr Leu Gly Val lie Ha Ein Cys Leu 565 570 57^5 gtg acc gag acc aag acc tcc gtg tcc agg cac atc tac ttc ttc tcc 1776 Val Thr Glu Thr Lys Thr Ser Val Ser Arg His He Tyr Phe Phe Ser 580 585 590 gct cgc ggc agg atc gac ccc ctc gtg tac ctc gac gag ttc ctc agg 1824 Ala Arg Gly Arg He Asp Pro Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg 595 600 505 aac tea gag ccc gtg ctc aag agg gtg aac agg acc ggc _aac _tcc tcc 1872 Asn Ser Glu Pro Val Leu Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser 610 615 620 tcc aac aag cag gag tac cag^ ctc ctc aag gac aac ctc gtg agg tcc 1920 Ser Asn Lys Gln Glu Tyr Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser 625 - 630 635 640 tac aac aag gcc ctc aag aag aac gcc ccc tac tcc atc ttc gcc atc 1968 Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Lys Asn Ala Pro Tyr Ser He Phe Ala He 645 650 655 aag aac ggc ccc aag tcc cac atc ggt agg r-n c ctc_ atg acc tcc ttc 2016 Lys Asn Gly Pro Lys Ser His He Gly Arg llis Leu Met Thr Ser Phe 660 665 670 ctc-tca atg aag ggc ctc acc gag ctc acc aac gtg gtg ggc aac tgg 2064.

Leu Ser Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp 675 680 685 tcc gac aag agg gcc tcc gcc gtg gcc agg acc acc tac acc cac .cag 2112 Ser Asp Lys Arg Ala Ser Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln 690 695 700 atc acc gcc atc ccc gac cac tac ttc gcc ctc gtg tea agg tac tac 2160 lie Thr Ala lie Pro Asp His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr 705 - 710 715 720 gcc tac gac ccc atc tcc aag gag atg atc gcc ctc aag gac gag act 2208 Ala Tyr Asp Pro He Ser Lys T31u Met He ?la Leu Lys Asp Glu Thr 725 730 735 aac "ccc atc gag gag tgg cag cac atc gag cag ctc aag ggc tcc gcc 2256 Asn Pro He Glu Glu Trp Gln His He Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala 740 745 750 gag ggc tcc atc agg tac ccc gcc tgg aac ggc atc atc. tcc cag gag 2304 Glu Gly Ser He Arg Tyr Pro Ala Trp Asn Gly He He Ser Gln Glu 755 760 765 gtg ctc gac tac ctc tcc tcc tac atc aac agg agg atc tga 2346 Val Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Tyr He Asn Arg Arg He 770 775 780 <210> 6 <211> 781 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia codificando moCre:FLPm, Cre de Bacteriófago Pl y FLP de Saccharomyces, ambos codones de maíz preferidos <400> 6 Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg 20 25 30 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg T-ys Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala 65 70 75 80 Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr He Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn 85 90 95 Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala - 100 105 110 Val Ser Leu Val Met Arg Arg He Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly 115 120 125 Glu "Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp He Arg Asn 145 150 155 160 Leu Ala Phe Leu Gly He Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg He Ala Glu 165 170 175 He Ala Arg He Arg Val Lys Asp He Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 19O Met Leu He His He Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 He Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 i 255 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly He Phe Glu Ala Thr His Arg Leu He 260 265 270 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly 275 280 285 His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 Ser He Pro Glu He Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn He 305 310 315 320 Val Met Asn Tyr He Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val 325 330 "335 Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly "Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Asp Pro Thr Met Pro Gln Phe Asp He Leu Cys Lys Thr 355 360 365 Pro Pro Lys Val Leu Val Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro 370 375 380 Ser Gly Glu Lys He Ala Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys 385 390 395 - 400 Trp Met He Thr His Asn Gly Thr Ala He Lys Arg Ala Thr Phe Met 405 410 - 415 Ser Tyr Asn Thr He He Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp He Val Asn 420 425 430" Lys Ser Leu Gln Phe Lys Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr He Leu Glu 435 440 445 Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Pro Ala Trp Glu Phe Thr He He Pro 450 455 460 Tyr Tyr Gly Gln Lys His Gln Ser Asp He Thr Asp He Val Ser Ser 465 - 470 475 480 Leu Gln Leu Gln Phe Glu Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser 485 490 _495 -His Ser Lys Lys Met Leu Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser He 500 505 510 Trp Glu He Thr Glu Lys He Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg 515 520 525 Phe Thr Lys Thr Lys Thr Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe 530 535 540 He Asn Cys Gly Arg Phe Ser Asp He Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser 545 550 555 ~ 560 Phe Lys Leu Val Gln Asn Lys Tyr Leu Gly Val Ile_ He GlrXCys Leu 565 570 575 Val Thr Glu Thr Lys Thr Ser Val Ser Arg His He Tyr Phe Phe Ser 580 585 590~ Ala Arg Gly Arg He Asp Pro Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg 595 600 605 Asn Ser Glu Pro Val Leu Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Asn Lys Gln Glu Tyr Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser 625 630 635 ,- . 640 Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Lys Asn Ala Pro Tyr Ser He Phe Ala He 645 650 - -.,655 Lys Asn Gly Pro Lys Ser His He Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe 660 665 670 Leu Ser Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp 675 680 685 Ser Asp Lys Arg Ala Ser Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln 690 695 700 He Thr Ala He Pro Asp His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr 705 710 715 720 Ala Tyr Asp Pro He Ser Lys Glu Met He Ala Leu Lys Asp* Glu Thr 725 730 735 Asn Pro He Glu Glu Trp Gln His He Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala 740 745 750 Glu Gly Ser He Arg Tyr Pro Ala Trp Asn Gly He He Ser Gln Glu 755 760 765 Val Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Tyr He Asn Arg Arg He 770 775 780 <210> 7 <211> 234 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuenci a Arti ficial :~ secuencia codi f icando un polipéptido Cre : FLP , Cre de Bacteriófago Pl y FLP de Saccharomyces <22Ü> <4 00> 7 atggccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcar t accggtcga tgcaacgagt 60 gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatt gccaggcg X ttctgagcat 120 acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac _ 180 cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctat--. tcttcaggcg _ 240 cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat jcttcatcgt _ 300 __ cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360 cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420 -_ gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480 ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540 agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600 aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactgaactg 660 __ gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720 cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctat r.aactcgcgcc 780. _ ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacq gcgctaagga-tgactctggt 840 --cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtr gagccgcgrg agatatggcc 900 _ cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa_tgtaaatatt 96Q gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 1020 gatggcgatg gtggcggcag cggtggcggc tccggcggtg gctcggatcc aacaatgcca 1080_ caatttgata tattatgtaa aacaccacct aaggtgctty ttcgtcagt t _tgtggaaagg 1140 tttgagagac cttccggaga gaaaatagca ttatgtgctg ctgaactaac ctatttatgt _ 1200 tggatgatta cacataacgg aacagcaatc aagagagcca cattcatgag^ ctataatact 126Q?r atcataagca attcgctgag tttggatatc gtcaacaagt cactgcagtt taaatagaag __ 1320-acgcaaaaag caacaattct ggaagcctca ttaaagaaat tgattcctgc ttgggaattt 1380 acaattattc cttactatgg acaaaaacat caatctgata tcactgatat tgtaagtagt 1440 ttgcaattac agttcgaatc atcggaagaa gcagataagg gaaatagcca cagtaaaaaa 150Q atgettaaag cacttctaag tgagggtgaa agcatctggg agatcactga-_gaaaatacta _ 1560-aattcgtttg agtatacttc gagatttaca aaaarraaaací ctttatacca attcctcttc 1620 etagetaett tcatcaattg tggaagattc agcgatatta agaacgttya tccgaaatca - 16&£L-tttaaattag tccaaaataa gtatctggga gtaataatcc agtgtttagt gacagagaca 1740 aagacaagcg ttagtaggca catatacttc tttagcgcaa ggggtaggat cgatccactt 1800 gtatatttgg atgaattttt gaggaattct gaaccagtcr taaaacgagt aaataggacc 1860 ggcaattctt caagcaacaa gcaggaatac caattattaa aagataactt agtcagatcg 1920 tacaacaaag ctttgaagaa aaatgcgcct tattcaatct ttgctataaa aaatggccca 1980 aaatctcaca ttggaagaca tttgatgacc tcatttcttt caatgaaggg cctaacggag 2040 ttgactaatg ttgtgggaaa ttggagcgat aagcgtgctt ctgccgtggc caggacaacg 2100 tatactcatc agataacagc aatacctgat cactacttcg cactagtttc tcggtactat 2160 -gcatatgatc caatatcaaa ggaaatgata gcattgaagg atgagacta-a tccaattgag 2220 gagtggcagc atatagaaca gctaaagggt agtgctgaay gaagcatacg ataccccgca 2280 tggaatggga taatatcaca ggaggtacta gactaccttt catcctacat aaatagacgc 2340 atataa 2346 <210> 8 <211> 2346 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <22Q> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia codificando un polipéptido FLPm: Cre, FLP de Saccharomyces (codones de maíz preferidos) , y Cre de Bacteriófago Pl <220> <221> CDS <222> (1) .. (2346) <400> 8 atg ccc cag ttc gac atc ctc tgc aag acc ccc ccc aag gtg ctc gtg 48 Met Pro Gln Phe Asp He Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val 1 5 10 15 agg cag ttc gtg gag agg ttc gag agg ccc tcc ggc gag aag ate gcc 96 Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro Ser Gly GLu Lys He Ala 20 25 30 ctc tgc gcc gcc gag ctc acc tac ctc tgc tgg atg atc acc cac aac 144 -Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys Trp Met He Thr His Asn 35 40 45 ggc acc gcc att aag agg gcc acc ttc atg tea tac aac acc atc atc 192 Gly Thr Ala He Lys Arg Ala Thr Phe Met Ser Tyr Asn Thr He He 50 55 60 tcc -aac tcc ctc tcc ttc gac atc gtg aac aag tcc ctc cag ttc aaa 240 Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp He Val Asn Lys Ser Leu Gln Phe Lys 65 70 75 80 tac aag acc cag aag gcc acc atc ctc gag gcc tcc ctc aag aag ctc 288 Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr He Leu Glu Ala Ser Leu Lys Lys Leu 85 90 55 atc ccc gcc tgg gag ttc acc atc atc ccc tac tac ggc cag aag cac 336 lie Pro Ala Trp Glu Phe Thr He He Pro Tyr Tyr Gly Gln Lys His 100 105 110 cag tcc gac atc acc gac atc gtg tea tcc ctc cag ctt cag ttc gag 384 Gln Ser Asp He Thr Asp He Val Ser Ser Leu Gln Leu Gln Phe Glu 115 120 125 tcc tcc gag gag gct gac aag ggc aac tcc cac tcc aag aag atg ctg 432 Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser His Ser Lys Lys Met Leu 130 135 140 aag gcc ctc ctc tcc gag ggc gag tcc atc tgg gag atc acc gag aag 480 Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser He Trp Glu He Thr Glu Lys 145 150 155 y^~ leo atc ctc aac tcc ttc gag tac acc tcc agg ttc act aag acc aag acc 528 He Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg Phe Thr Lys Thr Lys Thr 165 170 175 ctc tac cag ttc ctc ttc ctc gcc acc ttc atc aac tgc ggc agg ttc 576 Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe He Asn Cys Gly Arg Phe 180 185 190 tea gac atc aag aac gtg gac ccc aag tcc ttc aag ctc gtg cag aac 624 Ser Asp He Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser Phe Lys Leu Val Gln Asn 195 200 -2Q5-. -aag tac ctc ggc gtg atc atc cag tgc ctc gtg acc gag acc aag acc 672 Lys Tyr Leu Gly Val He He Gln Cys Leu Val Thr Glu Thr Lys Thr 210 215 220 tcc gtg tcc agg cac atc tac ttc ttc tcc gct cgc ggc agg atc gac 720 Ser Val Ser Arg His He Tyr Phe Phe Ser Ala Arg Gly Arg He Asp 225 230 235 240 ccc ctc gtg tac ctc gac gag ttc ctc agg aac tea gag ccc gtg ctc 768 Pro Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg Asn Ser Glu Pro Val Leu 245 250 255 aag ágg gtg aac agg acc ggc aac tcc tcc tcc aac .aag cag gag tac 816 Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser Ser Asn Lys Gln Glu Tyr 260 ~ ~ 265 270 cag ctc ctc aag gac aac ctc gtg agg tcc tac aac aag gcc ctc aag 864 Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 275 280 285 aag aac gcc ccc tac tcc atc ttc gcc atc aag aac ggc ccc aa.g tcc 912 Lys Asn Ala Pro Tyr Ser He Phe Ala He Lys Asn Gly Pro Lys Ser 290 295 300 cac atc ggt agg cac ctc atg acc tcc ttc ctc tea atg aag ggc ctc .. 960 His He Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu 305 " 310 315 320 acc gag ctc acc aac gtg gtg ggc aac tgg tcc gac aag . agg . gcc tcc 1008 Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser -. " 325 330 335 gcc gtg gcc agg acc acc tac acc cac cag atc acc gcc ate c-cc gac X056 Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln He Thr Ala He Pro Asp 340 345 350 cac tac ttc gcc ctc gtg tea agg tac tac gcc tac gac-ccc ate tcc -1104. His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro Ile Ser 355 360 365 _ aag gag atg atc gcc ctc aag gac gag act aac ccc atc gag gag tgg 1152 Lys Glu Met He Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro. lie Glu Glu Trp 370 375 380-- . cag cac atc gag cag ctc aag ggc tcc gcc gag ggc tcc atc agg tac 1200 Gln His He Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser He Arg Tyr 385 390 395 400 ccc gcc tgg aac ggc atc atc tcc cag gag gtg ctc gac tac ctc tcc 1248 Pro Ala Trp Asn Gly He He Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser 405 410 415 tcc tac atc aac agg agg atc ggt ggc ggc age ggt ggc ggc tcc ggc 1296. Ser Tyr He Asn Arg Arg He Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 420 425 430 ggt ggc tcg gat cea acc atg gcc aat tta ctg acc gta cac caá aat 1344 Gly Gly Ser Asp Pro Thr Met Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn 435 440 445 ttg cct gca tta ccg gtc gat gca acg agt gat gag gtt cgc aag aac _1392 Leu Pro Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn 450 455 460 ctg atg gac atg ttc agg gat cgc cag gcg ttt tet gag cat acc tgg 1440. Leu Met Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp 465 470 475 480 aaa atg ctt ctg tcc gtt tgc cgg tcg tgg gcg gca tgg tgc aag ttg 1488. Lys Met Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu 485 490 495 aat aac cgg aaa tgg ttt ccc gca gaa cct gaa gat gtt cgc gat tat 1536 Asn Asn Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr 500 505 510 ctt cta tat ctt cag gcg cgc ggt ctg gca gta aaa act atc cag caá 1584 Leu Leu Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr He G-ln Gln 515 520 525 cat ttg ggc cag cta aac atg ctt cat cgt cgg tcc ggg ctg cea cga 1632_ His Leu Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg 530 535 540 cea agt gac age aat gct gtt tea ctg gtt atg cgg cgg atc cga aaa 1680 Pro Ser Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg A g He Arg Lys 545 550 555 560 gaa aac gtt gat gcc ggt gaa cgt gca aaa cag gct cta gcg ttc gaa 1728 - Glu Asn Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu 565 570 575 cgc act gat ttc gac cag gtt cgt tea ctc atg gaa aat age gat cgc 177-T Arg Thr Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg 580 585 590 _ tgc cag gat ata cgt aat ctg gca ttt ctg ggg att gct tat aac acc 1824 Cys Gln Asp He Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly He Ala Tyr Asn Thr 595 600 605 ctg tta cgt ata gcc gaa att gcc agg atc agg gtt aaa gat ate tea 1872^ Leu Leu Arg He Ala Glu lie Ala Arg He Arg Val Lys Asp He Ser 610 615 620 cgt act gac ggt ggg aga atg tta atc cat att ggc aga acg aaa acg 1920 Arg Thr Asp Gly Gly Arg Met Leu He His He Gly Arg Thr Lys Thr 625 630 635 640 ctg gtt age acc gca ggt gta gag aag gca ctt age ctg ggg gta act 1968 Leu Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr 645 650 655 aaa ctg gtc gag cga tgg att tcc gtc tet qgt gta grt gat gat ccg 2016 Lys Leu Val Glu Arg Trp He Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro 660 665 6 0 aat aac tac ctg ttt tgc cgg gtc aga aaa aat ggt gtt gcc gcg_ cea 2064 Asn Asn Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro 675 680 685 tet gcc acc age cag cta tea act cgc gcc ctg gaa ggg att ttt cjaa 2112 Ser Ala Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly He Phe Glu 690 695 700 gca act cat cga ttg att tac ggc gct aag gat gac tet ggt cag aga 2160 Ala Thr His Arg Leu He Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg 705 710 715 - " 720 tac ctg gcc tgg tet gga cac agt gcc cgt gtc gga gcc gcg cga gat 2208 Tyr Leu Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg~ Asp 725 730 735 atg gcc cgc gct gga gtt tea ata ccg gag atc atg caá gct ggt. ggc 2256-Met Ala Arg Ala Gly Val Ser He Pro Glu He Met Gln Ala Gly Gly 740 745 750 tgg acc aat gta aat att gtc atg aac tat atc cgt aac ctg gat agt 2304 Trp Thr Asn Val Asn lie Val Met Asn Tyr lie Arg Asn Leu Asp Ser 755 760 765 gaa acá ggg gca atg gtg cgc ctg ctg gaa gat ggc gat tag 2346 Glu Thr Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 770 775 780 <210> 9 <211> 781 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia codificando un polipéptido FLPm: Cre, FLP de Saccharomyces (codones de maiz preferidos), y Cre de Bacteriófago Pl <400> 9 Met Pro Gln Phe Asp He Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val 1 5 10 15 Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro Ser Gly Glu Lys He Ala - 20 25 30 Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys Trp Met He Thr His Asn 35 40 45 Gly Thr Ala He Lys Arg Ala Thr Phe Met Ser Tyr Asn Thr He He 50 55 60 Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp He Val Asn Lys Ser Leu Gln_Phe Lys 65 70 ' 75 80 Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr He Leu Glu Ala Ser Leu Lys Lys Leu 85 90 95 He Pro Ala Trp Glu Phe Thr He He Pro Tyr Tyr Gly Gln Lys His 100 105 110 Gln Ser Asp He Thr Asp He Val Ser Ser Leu Gln Leu Gln Phe Glu 115 120 ' 125 Ser -Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser His Ser". Lys Lys Met Leu 130 135 140 Lys Ala Leu 'Leu Ser Glu Gly Glu Ser He Trp Glu lie Thr" Glu Lys 145 150 155 . _ 160 He ..Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg Phe Thr Lys Thr Lys Thr 165 170 . .. " _" X175 .__ Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe He Asn"Cys Gly-Arg Phe 180 . - . 185 - .: 1.90- - Ser .Asp He Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser Phe Lys Leu Val Gln Asn 195 200 . . , 205- X. Lys Tyr Leu Gly Val He He Gln Cys Leu Val Thr Glu hr Lys Thr 210 215 2'20 Ser Val Ser Arg His lie Tyr Phe Phe Ser Ala Arg Gly Arg lie Asp 225- 230""* 235 . _. 240 Pro -Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg Asn Ser Glu Pro Val Leu 245 250 ..-._ _ . ._ .. X-255 Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser Ser Asn Lys Gln.Glu Tyr . . " 260 "_ ".'" ". ..265 - -X .27CX- Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 275 280 285 Lys Asn Ala Pro Tyr Ser He -Phe Ala He Lys Asn"" Gl"y Pro Lys Ser 290- ' 295 300 """ His He Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu 305 310 315 320 Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser 325 330 335 - Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln He Thr Ala He Pro Asp 340 345 350 His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro He Ser 355 360 365 Lys Glu Met He Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro He Glu Glu Trp 370 375 380 -_ Gln His He Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser He Arg Tyr 385- 390 395 400 Pro Ala Trp Asn Gly He He Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser 405 410 415 Ser Tyr He Asn Arg Arg He Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Asp Pro Thr Met Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn 435 440 445 Leu- Pro Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn 450 455 460 Leu Met Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp 465 470 475 480 Lys~Met Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu 485 490 495 Asn Asn Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr 500 505 510 Leu Leu Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr He Gln Gln 515 520 525 His Leu Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg 530 535 540 Pro Ser Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg He Arg Lys 545 550 555 -- __ 560 Glu Asn Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu 565 570 --575 Arg Thr Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg 580 585 590 Cys Gln Asp He Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly He Ala Tyr^Asn Thr 595 600 605 Leu_Leu Arg -IXe Ala Glu He Ala Arg He Arg Val Lys Asp He Ser 610 615 620 Arg Thr Asp Gly Gly Arg Met Leu He His He Gly Arg Thr Lys Thr 625 630 635 _. 640 Leu Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr 645 650 - I 655 Lys Leu Val Glu Arg Trp He Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro 660 665 670 Asn Asn Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro 675 680 685 Ser Ala Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly He Phe Glu 690 695 700 Ala Thr His Arg Leu He Tyr Gly Ala Lys Asp Asp "Ser sly Gln Arg 705 710 715 - 720 --Tyr Leu Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp 725 730 735 -X Met Ala Arg Ala Gly Val Ser He Pro Glu He Met Gln Ala Gly Gly 740 745 750 Trp Thr Asn Val Asn He Val Met Asn Tyr He Arg Asn Leu Asp Ser 755 760 765 Glu Thr Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 770 775 780 <210> 10 <211> 34 <212> ADN <2TI3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio de- recombinación FRT tipo silvestre mínimo <400> 10 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc _ ~ 34 -

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES 1. Una proteína recombinante que comprende : una primera recombinasa específica en el sitio fusionada con una segunda recombinasa específica en el sitio distinta.
2. 2. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las primera y segunda recombinasas específicas en el sitio son miembros de la familia de integrasa de recombinasas o derivados activos de los mismos, en donde tales derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservadora.
3. 3. La proteína recombinante de- conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la primera y segunda recombinasas se seleccionan del grupo que consiste de Cre, FLP y derivados del mismo, en donde los derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservador .
4. 4. Una proteína recombinante caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que Consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 3, 6 y 9.
5. 5. Una molécula de ácido nucleico que codifica una primera recombinasa específica en el sitio fusionada en marco con una segunda recombinasa específica en el sitio distinta.
6. 6. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la primera y segunda recombinasas específicas en el sitio son miembros de la familia de integrasa de recombinasas o sus derivados activos, en donde dichos derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservadora.
7. 7. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque las primera y segunda recombinasas se seleccionan del grupo que consiste de Cre, FLP y sus derivados activos, en donde los derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservadora . -
8. 8. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque Cre y sus derivados activos son codificados por moCre y sus derivados, y FLP y sus derivados activos son codificados por FLPm y sus derivados, en donde los derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservadora. 9. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótido que comprende la secuencia establecida en SEC. DE IDENT. NOS. 4, 5, 7, y 8 ; y, b) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido establecida en SEC. DE IDENT. NOS: 3, 6 y
9. 9.
10. 10. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la secuencia de nucleótido está operablemente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una célula eucariótica.
11. 11. Una célula eucariótica que tiene establemente incorporada en su genoma la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.
12. 12. La célula eucariótica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula es una planta de célula.
13. 13. Una planta transformada que tiene establemente incorporada en su genoma la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.
14. 14. La semilla de la planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el ácido nucleico está establemente incorporado en el genoma de la semilla.
15. 15. Un método para integrar un ADN de interés en el genoma de una célula eucariótica, evaracterizado porque comprende : a) transformar tal célula con un ácido nucleico- que comprende el ADN en donde el ADN está flanqueado por un sitio objetivo para una primera recombinasa específica en el sitio y un sitio objetivo para una segunda recombinasa específica en el sitio distinta, y el genoma contiene al menos un sitio de integración que comprende sitios objetivos que corresponden a sitios objetivo que flanquean el ADN; y b) proveer en la célula una proteína recombinante que comprende la primera recombinasa fusionada con la segunda recombinasa .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula es una célula de planta.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula de planta es monocotiledónea .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula de planta es de maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula de planta es dicotiledónea .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula de planta es soya, Brassica, girasol, alfalfa o cártamo.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, -caracterizado porque la primera recombinasa es Cre o un derivado activo de la misma y la segunda recombinasa es FLP o un derivado • activo de la misma, en donde dichos derivados activos catalizan la recombinación específica en el sitio conservador.
22. 22. Una planta que tiene establemente integrado a un cromosoma, por lo menos un sitio de integración que comprende un sitio objetivo para una primera recombinasa específica en el sitio y un sitio objetivo para una segunda reco binasa específica en el sitio, en donde los sitios objetivo son contiguos.
23. 23. La planta de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea.
24. 24. La planta de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno. - -
25. 25. La planta de conformidad con lá reivindicación 22, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.
26. 26. La planta de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la planta es soya, Brassica, girasol, alfalfa o cártamo. -
27. 27. La semilla de la planta de las reivindicaciones 22-26 caracterizada porque el sitio de integración está establemente incorporado en el genoma de la semilla.
28. 28. Un método para integrar un ADN de interés en el gerooma de una célula eucariótica, que comprende: - a) transformar la célula con un ácido nucleico que_ comprende el ADN, en donde el ADN es flanqueado por un sitio-objetivo para una primera recombinasa específica en el sitio-y un sitio objetivo para una segunda recombinasa específica en el sitio, y el genoma contiene un sitio de integración que comprende sitios objetivo contiguos que corresponden a los sitios objetivo que flanquean el ADN; y b) proveer en la célula dicha primera recombinasa y la segunda recombinasa.