CN1933724B - Mir604 转基因玉米植物细胞 - Google Patents
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Abstract
公开了一种命名为MIR604的新的转基因玉米事件。本发明涉及产生MIR604事件的、插入至玉米基因组中的重组构建体的DNA序列和插入位点侧翼基因组序列的DNA序列。本发明进一步涉及用于检测MIR604的DNA序列存在的测定法，涉及含有MIR604基因型的玉米植物和玉米种子，并涉及通过将含有MIR604基因型的玉米植物与自身或另一玉米品种杂交来产生玉米植物的方法。
Description
发明领域
本发明一般涉及植物分子生物学、植物转化和植物育种领域。更具体地，本发明涉及含有新的转基因基因型的抗昆虫转基因玉米植物及在样品中检测该玉米植物DNA存在的方法以及其组合物。
背景
植物害虫是世界重要农作物损失的主要因素。由于非-哺乳动物害虫(包括昆虫)侵染仅在美国每年约损失80亿美元。玉米根虫(Cornrootworm)种被认为是最大破坏性的玉米害虫。重要的根虫害虫种类包括Diabrotica virgifera virgifera即西部玉米根虫；D.longicornis barberi即北部玉米根虫；D.undecimpunctata howardi即南部玉米根虫和D.virgifera zeae即墨西哥玉米根虫。
玉米根虫主要通过加强应用化学杀虫剂来控制。这样可以获得对玉米根虫的好的控制，但这些化学制品有时也会影响有益的生物体。广泛使用化学杀虫剂导致的另一个问题是出现抗药性的昆虫变种。这一问题已经通过多种抗药性管理实践部分地减轻，但对备选的害虫控制策略存在增长的需要。一种这样的备选策略包括在转基因植物中表达编码杀虫蛋白的外源基因。这种方法已经提供了一种对抗选择性害虫的有效手段，并且表达杀虫毒素的转基因植物已经商业化了，使得农民减少应用化学杀虫剂。
外源基因在植物体内的表达可受到它们的染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色质的结构或紧靠整合位点的转录调节元件的接近造成的(见例如，Weising等人，1988，″Foreign Genes in Plants，″Ann.Rev.Genet.22：421-477)。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件(events)并从这些事件中筛选出用于商业目的的具有预期转基因表达水平和模式的事件。具有预期转基因表达水平或模式
的事件可用于采用传统育种方法通过有性远交将转基因渐渗到其它遗传背景中。这种杂交产生的子代保持了原始转化体的转基因表达特性。这种策略用于在许多很好适应本地生长条件的品种中确保可靠的基因表达。
能够检测一特定事件的存在以确定有性杂交的子代是否含有目的转基因将是有利的。而且，用于测定特定事件的方法将有助于遵守例如要求源于重组作物的食物售前许可和标记的条例。通过任何熟知的核酸检测方法，包括但不限于使用多核苷酸引物进行热扩增(聚合酶链式反应(PCR))或使用核酸探针的DNA杂交来检测转基因的存在是可能的。通常，为了使用来检测已经用于转化多种植物品种的特定DNA构建体的试剂和方法简单并且一致，这些检测方法通常集中在频繁使用的基因元件，例如启动子、终止子和标记基因，因为对于许多DNA构建体，编码序列区是可互换的。因此，这些方法可能不能用于区分仅编码序列不同的构建体。而且，这种方法可能不能用于区分不同的事件，特别是那些使用相同的DNA构建体产生的事件，除非与插入的异源DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列已知。
本发明包括一种已经将cry3A055基因(其公开于公布于2003年3月6日的国际出版物No.WO03/018810，在此引入作为参考)掺入到其基因组中的昆虫抗性转基因玉米事件，cry3A055基因编码Cry3A055杀虫毒素，可用于控制Diabrotica spp.害虫。该转基因玉米事件也已经将pmi基因掺入到其基因组中，pmi基因编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)，这公开于美国专利No.5,767,378，其在此引入作为参考，该酶用作选择性标记，使植物能利用甘露糖作为碳源。本发明进一步包括该转基因玉米事件特有的新的分离的核酸序列，其可用于鉴别该转基因玉米事件并用于在生物学样品中检测该转基因玉米事件的核酸，本发明也包括包含用于在生物学样品中检测这些核酸所需的试剂的试剂盒。
概要
本发明涉及命名为MIR604的含有新的转基因基因型的转基因玉
米事件，所述的转基因基因型含有分别赋予MIR604玉米事件及其子代昆虫抗性和利用甘露糖作为碳源能力的cry3A055基因和pmi基因。本发明还提供了含有本发明基因型的转基因玉米植物、来自含有本发明基因型的转基因玉米植物的种子，并涉及通过将含有本发明基因型的玉米近交系(inbred)与其自身或与另一种不同基因型的玉米系杂交来产生含有本发明基因型的转基因玉米植物的方法。除了本发明新的基因型赋予玉米植物的那些特性，本发明的转基因玉米植物可以基本具有相应的等基因非-转基因玉米植物的全部形态学和生理学特性。本发明还提供用于检测来自事件MIR604的核酸的存在的组合物和方法，所述的方法基于插入至产生MIR604事件的玉米基因组的重组表达盒和插入位点侧翼基因组序列的DNA序列。MIR604事件可以进一步通过分析Cry3A055和PMI蛋白质的表达水平以及通过测试抗玉米根虫的有效力来表征。
根据一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，该核酸分子含有至少10个连续核苷酸，所述的连续核苷酸来自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列，和至少10个连续核苷酸，所述核苷酸来自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组的异源DNA序列插入位点侧翼的玉米植物基因组DNA。根据该方面的分离的核酸分子可以含有至少20或至少50个连续的核苷酸，所述连续核苷酸来自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组的异源DNA序列，和至少20或至少50个连续的核苷酸，所述连续核苷酸来自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列插入位点侧翼的玉米植物基因组DNA。
根据另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，所述分子包含含有至少一种选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2及其互补序列的、事件MIR604的接点序列(junction sequence)的核苷酸序列。该接点序列跨越了含有插入至玉米基因组中的表达盒的异源DNA和来自插入位点侧翼的玉米基因组的DNA之间的接点并可用于鉴别MIR604事件。
根据另一方面，本发明提供一种将异源DNA分子连接至玉米事件
MIR604中的玉米植物基因组的分离的核酸分子，其含有从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及其互补序列中选择的约11-约20个连续核苷酸的序列。
根据另一方面，本发明提供一种含有选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及其互补序列的核苷酸序列的分离的核酸分子。
根据本发明的另一方面，提供了含有本发明核酸分子的扩增子。
根据本发明的更另外方面，提供了用于检测事件MIR604的侧翼序列引物。这种侧翼序列引物含有分离的核酸序列，所述分离的核酸序列含有至少10-15个来自如SEQ ID NO：3(在此随意称为5′侧翼序列)中列出的核苷酸1-801的连续核苷酸或其互补核苷酸。在该方面的一个实施方案中，该侧翼序列引物选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及其互补序列。
在本发明的另一方面，侧翼序列引物包含分离的核酸序列，所述分离的核酸序列含有至少10-15个来自如SEQ ID NO：4(在此随意称为3′侧翼序列)中列出的核苷酸507-1570的连续核苷酸或其互补核苷酸。在该方面一个实施方案中，该侧翼序列引物选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及其互补序列。
根据本发明的另一方面，提供了可用于例如核酸扩增的引物对。这种引物对包含第一引物，其含有至少10-15个连续核苷酸长度的核苷酸序列，后者为上述基因组侧翼序列(SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)之一或与该侧翼序列之一互补，和第二引物，其含有至少10-15个插入至事件MIR604基因组中的外源DNA的连续核苷酸的核苷酸序列。第二引物优选含有是插入序列或与插入序列互补的核苷酸序列，所述的插入序列与如SEQ ID NO：3中从核苷酸位置802-1310和与SEQID NO：4中从核苷酸位置1-506所示的植物基因组侧翼DNA序列相邻。
根据本发明的另一方面，提供了检测在生物学样品中对应于事件
MIR604的DNA存在的方法。该方法包括：(a)将包含DNA的该样品与引物对接触，所述的引物对在用于与来自玉米事件MIR604的基因组DNA进行的核酸扩增反应时产生可鉴别玉米事件MIR604的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生该扩增子；并(c)检测该扩增子。在该方面一个实施方案中，扩增子含有选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4及其互补序列的核苷酸序列。
根据另一方面，本发明提供在生物学样品中检测对应于MIR604事件的DNA存在的方法。该方法包括：(a)将含有DNA的该样品与探针接触，所述的探针可在高严格条件下与来自玉米事件MIR604的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)让样品和探针接受高度严格杂交条件；并且(c)检测探针与DNA的杂交。
根据本发明的另一方面，提供用于在生物学样品中检测事件MIR604核酸的试剂盒。该试剂盒包括至少一种含有足够长的多核苷酸的DNA序列，所述的多核苷酸是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4或与之互补，其中该DNA序列可用作与来自事件MIR604的分离的DNA杂交的引物或探针，并且该引物或探针，在扩增样品中的核酸序列或与该核酸序列杂交、随后检测扩增子或检测与靶标序列的杂交之后，可用于鉴别样品中事件MIR604的核酸序列的存在。试剂盒另外包括实现核酸杂交或扩增方法所需的其它材料。
在另一方面，本发明提供了在生物学样品中检测玉米事件MIR604蛋白质的方法，所述的方法包括：(a)从玉米事件MIR604组织样品中提取蛋白质；(b)使用免疫学方法测定提取的蛋白质，所述方法包含对MIR604事件产生的杀昆虫蛋白质或选择性标记蛋白质有特异性的抗体；和(c)检测该抗体与杀昆虫蛋白质或选择性标记蛋白质的结合。
在另一方面，本发明提供源于事件MIR604玉米植物、组织或种子的生物学样品，其中该样品含有是选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2
的序列或与该序列互补的核苷酸序列，并且其中用核酸扩增或核酸杂交方法该序列在样品中是可检测的。在该方面一个实施方案中，样品选自玉米粉(corn flour)、玉米面(corn meal)、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和被全部或部分加工而含有玉米副产品的谷类食品(cereals)。
在另一方面，本发明提供了源于事件MIR604玉米植物、组织或种子的提取物，其含有是选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与该序列互补的核苷酸序列。在该方面一个实施方案中，该序列使用核酸扩增或核酸杂交方法在提取物中是可检测的。在这方面另一个实施方案中，样品选自玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和完全或部分加工而含有玉米副产品的谷类食品。
根据本发明的另一方面，提供了含有本发明核酸分子的玉米植物和种子。
根据另一方面，本发明提供了用于生产至少抗玉米根虫侵染的玉米植物的方法，包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交，其中所述的第一或第二亲本玉米植物含有玉米事件MIR604 DNA，从而产生多个第一代子代植物；(b)选择至少抗玉米根虫侵染的第一代子代植物；(c)将第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；(d)从第二代子代植物选择至少抗玉米根虫侵染的植物；其中第二代子代植物含有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
根据更另一方面，本发明提供了用于生产玉米种子的方法，该方法包括：将第一亲本玉米植物和第二亲本玉米植物杂交并收获产生的第一代玉米种子，其中第一或第二亲本玉米植物是本发明的近交玉米植物。
根据另一方面，本发明提供了生产杂种玉米种子的方法，该方法包括以下步骤：(a)种植根据本发明的第一近交玉米系的种子和具有不同基因型的第二近交玉米系的种子；(b)培养从所述种植得到的玉米植物直到其开花；(c)将玉米近交系之一的玉米植物的花去雄；(d)
让另一近交系进行授粉，并(e)收获由此产生的杂种种子。
本发明前述及其它方面从下面详细的描述中将变得更明确。
序列表中序列的描述
SEQ ID NO：1是5′基因组-插入序列接点。
SEQ ID NO：2是3′插入序列-基因组接点。
SEQ ID NO：3是5′基因组+插入序列的序列。
SEQ ID NO：4是3′插入序列+基因组的序列。
SEQ ID NO：5是插入序列5′侧翼的玉米基因组。
SEQ ID NO：6是插入序列3′侧翼的玉米基因组。
SEQ ID NO：7-15是用于本发明的5′侧翼序列引物。
SEQ ID NO：16-20是用于本发明的MTL启动子序列引物。
SEQ ID NO：21-28是用于本发明的cry3A055序列引物。
SEQ ID NO：29-30是用于本发明的ZmUbiInt序列引物。
SEQ ID NO：31-37是用于本发明的pmi序列引物。
SEQ ID NO：38是用于本发明的NOS序列引物。
SEQ ID NO：39-46是用于本发明的3′侧翼序列引物。
SEQ ID No：47-49是cry3A055 TAQMAN引物和探针。
SEQ ID No：50-52是pmi TAQMAN引物和探针。
SEQ ID NO：53-55是ZmADH TAQMAN引物和探针。
SEQ ID NO：56是用于本发明的MIR604探针。
SEQ ID NO：57是右边界区域的序列。
SEQ ID NO：58是MTL启动子的序列。
SEQ ID NO：59是cry3A055基因的序列。
SEQ ID NO：60是NOS终止子的序列。
SEQ ID NO：61是ZmUbInt启动子的序列。
SEQ ID NO：62是pmi基因的序列。
SEQ ID NO：63是左边界区域的序列。
附图简述
图1说明了命名为pZM26的植物表达载体。图谱确定了用于
Southern分析的Kpnl限制性位点。
图2是说明含有插入至玉米事件MIR604基因组中的异源核酸序列的元件之组织的图解图谱，并显示了插入的核酸序列连接位于插入的异源DNA序列末端侧翼的玉米基因组DNA序列之处的相对位置。1＝5′侧翼植物基因组(SEQ ID NO：5)；2＝右边界区域(SEQ ID NO：57)；3＝MTL启动子(SEQ ID NO：58)；4＝cry3A055基因(SEQ ID NO：59)；5＝NOS终止子(SEQ ID NO：60)；6＝ZmUbINT启动子(SEQ ID NO：61)；7＝pmi基因(SEQ ID NO：62)；8＝NOS终止子(SEQ ID NO：60)；9＝左边界区域(SEQ ID NO：63)；并且10＝3′侧翼植物基因组(SEQ IDNO：6)。
定义
提供下面的定义和方法以便更好地定义本发明并且在本发明的实践中指导本领域的一般技术人员。除非另外说明，在此使用的术语应该根据相关领域的那些一般技术人员的常规用法来理解。分子生物学中一般术语的定义也可在Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：NewYork，1994中找到。
如在此使用，术语“扩增”指使用至少一个核酸分子作为模板构建核酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增体系包括聚合酶链式反应(PCR)体系、连接酶链式反应(LCR)体系、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶体系、基于转录的扩增体系(TAS)和链置换扩增技术(SDA)。见，例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles andApplications，D.H.Persing等编辑，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.(1993)。扩增产物称为扩增子。
“编码序列”是可转录为RNA例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，RNA然后在生物体中经翻译而产生蛋白质。
在此使用的“检测试剂盒”指用于在样品中检测来自MIR604植物
的DNA的存在或缺乏的试剂盒，所述的试剂盒包含本发明的核酸探针和引物(其可在高度严格条件下与靶标DNA序列特异性地杂交)和实现核酸杂交或扩增方法所需的其它材料。
在此使用的术语转基因“事件(event)”指通过用异源DNA，例如包括目的基因的表达盒转化并再生单个植物细胞而产生的重组植物。术语“事件”指包括该异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也指通过该转化体和另一种玉米系之间进行有性远交(outcross)而产生的子代。即使经过与回归亲本进行反复回交，来自转化亲本的插入DNA和侧翼DNA仍存在于杂交子代中相同的染色体位置上。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。基于转基因或其它期望的特性的表达，选择特定的事件。因而，在此使用的“事件MIR604”、“MIR604”或“MIR604事件”指原始的MIR604转化体和/或MIR604转化体的子代。
如在此使用的“表达盒”指能在合适的宿主细胞中引导特定的核苷酸序列表达的核酸分子，其含有有效连接至目的核苷酸序列的启动子，所述的目的核苷酸序列有效地连接至终止信号。它还典型地包含核苷酸序列正确翻译所需要的序列。表达盒还可以含有在引导目的核苷酸序列表达中不需要的序列，但是其因为用于将表达盒从表达载体移除的合适的限制性位点而存在。含有目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，指至少一种它的组分相对于至少一种它的其它组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的但已经以可于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，通常表达盒相对于宿主来说是异源的，即表达盒的特定核酸序列在宿主细胞中不是天然存在的，并必须已经通过本领域已知的转化方法引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中的核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或仅当宿主细胞曝露于特定外界刺激时起始转录的诱导型启动子的控制下。在多细胞生物体例如植物的情况下，启动子也可以是特异于特定组织或器官或发育阶段。表达盒或其片段，当转化进植物时，也可以称为“插入的序列”或“插
入序列”。
“基因”是一确定的区域，其位于基因组内并且，除了上述的编码核酸序列，还包含负责控制表达，即转录和翻译编码部分的其它(主要是调节性的)核酸序列。基因还可以包含其它5′和3′非翻译序列和终止序列。可能存在的其它元件是，例如内含子。
“目的基因”指当转移至植物时赋予植物期望的特性例如抗生素耐药性、抗病毒性、抗昆虫性、抗病性或抗其它害虫的抗性、除草剂耐性、提高的营养价值、工业过程中的改良的性能或改变的繁殖能力的任何基因。“目的基因”还可以是转移至植物用以在植物中产生有商业价值的酶或代谢物的基因。
在此使用的“基因型”是从亲本玉米植物遗传的遗传物质，并不是所有的该遗传物质必定在子代玉米植物中表达。MIR604基因型指转化入植物基因组中的异源遗传物质以及插入序列侧翼的遗传物质。
“异源”核酸序列是与其导入的宿主细胞不是天然相联系的核酸序列，其包括天然存在的核酸序列的非天然出现的多拷贝。
“同源”核酸序列是与其导入的宿主细胞天然相联系的核酸序列。
“有效地连接”指将各核酸序列连接在单个核酸片段上以便一个的功能影响另一个的功能。例如，当启动子能影响编码序列或功能RNA的表达(即，编码序列或功能RNA受启动子的转录控制)时，其有效地连接至该编码序列或功能RNA。有义或反义方向的编码序列可以有效地连接至调节序列。
在此使用的“引物”是分离的核酸，它可以通过核酸杂交退火至互补靶标DNA链上，在引物和靶标DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿着靶标DNA链延伸。引物对或引物组可例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来用于扩增核酸分子。
“探针”是分离的核酸，其上连接有常规可检测标记物或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这种探针与靶标核酸的一条链互补，在本发明中，其与来自玉米事件MIR604的基因组
DNA的一条链互补。MIR604的基因组DNA可以来自玉米植物或包括该事件的DNA的样品。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性结合靶标DNA序列并可用于检测那些靶标DNA序列存在的聚酰胺及其它探针材料。
引物和探针通常长为10-15个核苷酸或更长，引物和探针也可以长为至少为20个核苷酸或更长，或至少长为25个核苷酸或更长，或至少长为30个核苷酸或更长。这些引物和探针在高度严格杂交条件下可特异性地与靶标序列杂交。根据本发明的引物和探针可以与靶标序列具有完全的序列互补性，尽管不同于靶标序列并且保持与靶标序列杂交能力的探针可以通过常规方法设计得到。
“严格条件”或“严格杂交条件”包括说明一种条件，在该条件下探针将以比与其它序列可检测地更高的程度与其靶标序列杂交。严格条件是靶标序列依赖性的并且将根据多核苷酸的结构而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补(同源探测(homologcus probing))的靶标序列。备选地，可调节严格条件以允许序列中的一些错配以便检测低水平的相似性(异源探测(heterologous proding))。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays″，Elsevier：New York；和Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，GreenePublishing and Wiley-Interscience：New York(1995)，以及Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第5版，Cols Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中找到。
特异性典型地是杂交后的洗涤的函数，最终的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。通常，高严格杂交和洗涤条件选择为比特定序
列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)约低5℃。Tm是50％的靶标序列与完全互补的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。典型地，在高度严格条件下探针将于它的靶标序列而不与其它序列杂交。
在Southern印迹或Northern印迹中的滤膜上具有多于100个互补残基的互补核酸杂交的高度严格杂交条件的一个实例是在42℃下含有1mg肝素的50％甲酰胺，杂交过夜进行。非常高的严格洗涤条件的实例是在72℃下用0.15M NaCl洗涤约15分钟。高度严格洗涤条件的一个实例是在65℃用0.2×SSC洗涤15分钟(对SSC缓冲液的描述见，Sambrook，下文)。
用于本发明示例性杂交条件包括于67℃在7％SDS、0.25M NaPO4 pH7.2中杂交过夜，随后于65℃在5％SDS、0.20M NaPO4 pH7.2中洗涤两次，每次洗涤30分钟，并于65℃在1％SDS、0.20M NaPO4 pH7.2中洗涤两次，每次洗涤30分钟。对例如多于100个核苷酸的双链体的示例性中等严格洗涤是在45℃下用1×SSC洗涤15分钟。对例如多于100个核苷酸的双链体的示例性低严格洗涤是在40℃下用4-6×SSC洗涤15分钟.
对于约10-50个核苷酸的探针，高度严格条件通常包括pH7.0-8.3，低于约1.0M Na离子，典型地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，并且温度典型地至少约30℃。高度严格条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得。通常，比在特定杂交测定中对于不相关探针观测到的高2倍(或更高)的信噪比表明是特异性杂交的检测。如果它们编码的蛋白质基本一致，则在高度严格条件下不互相杂交的核酸仍然是基本一致的。例如，当核酸的拷贝用遗传密码允许的最大密码子简并而产生时出现这一情况。
以下是可用于杂交与本发明参考核苷酸序列基本一致的核苷酸序列的杂交/洗涤条件的示例性组：参考核苷酸序列与参考的核苷酸序列优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于50℃在2×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选在于50℃，
7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于50℃在1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，于50℃在0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤，优选于50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于50℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。本发明的序列可使用上述的所有条件检测。为定义本发明的目的，使用高度严格条件。
“转化”是用于将异源核酸导入宿主细胞或生物内的方法。特别地，“转化”指将DNA分子稳定地整合进入目的生物的基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”涉及异源核酸分子已经导入其中的宿主生物例如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合入宿主的基因组或者该核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是指野生型生物如细菌或植物，其不含有该异源核酸分子。如此除使用的，“转基因的”涉及植物、植物细胞或许多结构化或非结构化的植物细胞，其经过公知的遗传操作和基因插入技术将代表目的基因的核酸序列整合至植物基因组，并且典型地整合进入细胞核、线粒体或其它包含染色体的细胞器的染色体中，该整合发生在与天然植物或植物细胞通常存在的不同的基因座，或以比通常存在于天然植物或植物细胞的拷贝更多的许多拷贝发生整合。与天然存在的突变相反，转基因植物通过操作和插入这种核酸序列而得到，产生非天然存在的植物或具有非天然存在的基因型的植物。转化植物和植物细胞的技术是本领域公知的，可包括例如电穿孔、显微注射、农杆菌介导的转化和ballistic转化。
在此使用如37 C.F.R.§1.822中列出的DNA碱基和氨基酸的命名法。
详述
本发明涉及在遗传学上改良的玉米系，其产生昆虫防治蛋白Cry3A055和使得植物能利用甘露糖作碳源的磷酸甘露糖异构酶(PMI)。本发明特别涉及含有新的基因型的命名为MIR604的转基因玉米事件，也涉及用于在生物学样品中检测来自该事件的核酸的组合物和方法。本发明进一步涉及含有MIR604基因型的玉米植物、涉及来自该玉米植物的转基因种子，以及涉及通过将含有MIR604基因型的近交玉米与自身或另一种玉米系杂交来产生含有MIR604基因型的玉米植物的方法。含有本发明的MIR604基因型的玉米植物可用于控制鞘翅目昆虫害虫，包括Diabrotica virgifera virgifera即西部玉米根虫、D.virgifera zeae即墨西哥玉米根虫和D.longicornisbarberi即北部玉米根虫。含有本发明的MIR604基因型的玉米植物还能够利用甘露糖为碳源。
在一个实施方案中，本发明包括一种分离的核酸分子，该分子含有至少10个或更多(例如15、20、25或50个)插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列的连续核苷酸，和至少10个或更多(例如15、20、25或50个)位于插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列插入点侧翼的玉米植物基因组DNA的连续核苷酸。还包括核苷酸序列，其含有来自事件MIR604的连续插入序列的10或更多核苷酸，并含有与插入序列邻接的、来自事件MIR604的侧翼DNA的至少一个核苷酸。这种核苷酸序列可用于鉴别事件MIR604。来自MIR604事件的基因组DNA的核酸扩增产生扩增子，其含有这种鉴别性的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括一种分离的核酸分子，所述核酸分子含有这样的核苷酸序列，该序列含有至少一个选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2及其互补序列的、事件MIR604的接点序列，其中该接点序列跨越插入至玉米基因组的异源表达盒和位于插入位点侧翼的玉米基因组的DNA之间的接点，并且可用于鉴别该事件。
在另一个实施方案中，本发明包括将异源DNA分子连接至玉米事
件MIR604的玉米植物基因组的分离的核酸，其含有从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及其互补序列中选择的约11-约20个连续核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，本发明包括一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及其互补序列的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了含有选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及其互补序列的核苷酸序列的扩增子。
在另一个实施方案中，本发明包括用于检测事件MIR604的侧翼序列引物。这种侧翼序列引物含有分离的核酸序列，该分离的核酸序列含有来自SEQ ID NO：3(在此随意指定为5′侧翼序列)的核苷酸1-801或其互补序列的至少10-15个连续核苷酸。在该实施方案的一个方面，侧翼序列引物选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及其互补序列。
在另一个实施方案中，本发明包括侧翼序列引物，所述的侧翼序列引物含有来自SEQ ID NO：4(在此随意指定为3′侧翼序列)的核苷酸507-1570或其互补序列的至少10-15个连续核苷酸。在该实施方案的一个方面，侧翼序列引物选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及其互补序列。
在另一个实施方案中，本发明包括多核苷酸引物对，其含有第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，它们可在存在样品中的玉米事件MIR604 DNA模板时一起发挥作用而产生可用于鉴别玉米事件MIR604的扩增子，其中第一引物序列是位于插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列插入点侧翼的玉米植物基因组或是与其互补的序列，第二多核苷酸引物序列是插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA序列或是与其互补的序列。
在该实施方案的一个方面，第一多核苷酸引物含有来自SEQ ID NO：
3的位置1-801或其互补序列的至少10个连续核苷酸。在这个实施方案的其它方面，第一多核苷酸引物含有在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或其互补序列中列出的核苷酸序列。在该实施方案的另一个方面，第一多核苷酸引物含有来自SEQ ID NO：4的位置507-1570或其互补序列的至少10个连续核苷酸。在该实施方案的另一方面，第一多核苷酸引物含有在SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或其互补序列中列出的核苷酸序列。而在该实施方案的另一方面，第二多核苷酸引物含有来自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63或其互补序列的至少10个连续核苷酸。在这个实施方案的其它方面，第二多核苷酸引物含有在SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：38或其互补序列中列出的核苷酸序列。
在该实施方案的另一方面，在SEQ ID NO：15中列出的第一多核苷酸引物和在SEQ ID NO：28中列出的第二多核苷酸引物在存在样品中玉米事件MIR604 DNA模板的情况下一起发挥作用，产生(如实施例4中描述的)可鉴别玉米事件MIR604的扩增子。在这个实施方案的另一方面，在SEQ ID NO：45中列出的第一多核苷酸引物和在SEQ ID NO：27中列出的第二多核苷酸引物在存在样品中玉米事件MIR604 DNA模板的情况下一起发挥作用，产生(如实施例4中描述的)可鉴别玉米事件MIR604的扩增子。
当然，获得进一步向外移动到位于插入的异源DNA序列任一末端侧翼的基因组序列内的额外序列用作如下这样的引物序列完全处于本领域的技术范围内，所述的引物序列可用于这种用于扩增可鉴别MIR604事件的序列的引物对中。为本公开的目的，短语“进一步向外移动到位于插入的异源DNA序列任一末端侧翼的基因组序列内”特定地指从插入的异源DNA序列的末端(插入的DNA序列邻接天然的基因
组DNA序列的点)顺序地离开，并向外移动到该异源DNA序列插入的特定染色体的基因组DNA内。优选地，与插入序列的一部分对应或互补的引物序列应该引导DNA或RNA的新生链的朝最近的侧翼序列接点转录延伸。因此，与基因组侧翼序列的一部分对应或互补的引物序列应该引导DNA或RNA的新生链的朝最近的侧翼序列接点转录延伸。引物序列可以是插入至植物染色体中的异源DNA序列或基因组侧翼序列，或者可以是与该序列互补。本领域的技术人员将容易认识到，取决于将要通过使用一组嵌套引物获得的产物的特性，引物序列需要是如插入的异源DNA序列内所示的或如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的序列或需要与其互补的益处，其中所述的嵌套引物旨在用于扩增含有基因组DNA序列和插入的异源DNA序列之间接头的特定的侧翼序列。
在另一个实施方案中，本发明包括在生物学样品中检测对应于事件MIR604的DNA的存在的方法，其中该方法包括：(a)将含有DNA的样品与探针接触，所述的探针可在高严格条件下与来自玉米事件MIR604的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)让样品和探针接受高度严格杂交条件；并且(c)检测探针与DNA的杂交。在该实施方案的一方面，扩增子含有选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及其互补序列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括在生物学样品中检测对应于MIR604事件的DNA的存在的方法，其中所述的方法包括：a)将含有DNA的样品与探针接触，所述的探针可在高严格条件下与来自玉米事件MIR604的基因组DNA杂交并且在高严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)让样品和探针接受高度严格杂交条件；并且(c)检测探针与DNA的杂交。检测可以通过本领域公知的任何方法，包括但不限于荧光方法、化学发光方法、放射学方法、免疫学方法或其它方法来进行。在其中旨在将杂交用作扩增特定序列的手段以产生可用于鉴定MIR604玉米事件的扩增子的情况中，通过本领域中公知的任何手
段的扩增子的产生和检测旨在指示与一个靶标序列(使用一个探针或引物时)或多个靶标序列(使用两个或更多的探针或引物时)的期望的杂交。术语“生物学样品”旨在包括含有或怀疑含有这样的核酸的样品，所述的核酸含有某点任意一侧的5-10个核苷酸，在所述的点处，插入的异源DNA序列的两个末端的一个或另一个与该异源DNA序列插入的染色体内的基因组DNA序列接触，这里将所述的核酸也称为接点序列。另外，接点序列可含有少至两个核苷酸：即侧翼基因组DNA内的第一个核苷酸和与该核苷酸邻接并共价地连接的插入的异源DNA序列内的第一个核苷酸。
然而在另一个实施方案中，本发明包括用于在生物学样品中检测MIR604核酸存在的试剂盒，其中该试剂盒包含至少一种具有足够长度的连续核苷酸的核酸分子及其它实现核酸杂交或扩增所必需的材料，其中所述的连续核苷酸与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列同源或互补，所述核酸分子用作事件MIR604特异性的DNA引物或探针。可使用多种检测方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)、热扩增法、连接酶链反应、Southern杂交、ELISA法以及比色和荧光检测法。特别是，本发明提供了用于在含有来自MIR604的基因组核酸的样品中检测靶标序列，即至少一个插入DNA和MIR604玉米植物的基因组DNA的接点的存在的试剂盒。该试剂盒包括至少一个能结合至靶位点或基本邻接靶位点的序列的多核苷酸和至少一种用于检测多核苷酸与靶位点结合的手段。该检测方法可以是荧光法、化学发光法、比色法或同位素法并至少可以与用于检测该结合的免疫法结合使用。也考虑了一种试剂盒，其能利用两种或多种多核苷酸序列在样品中检测靶标位点(即插入的DNA和MIR604玉米植物的基因组DNA的至少一个接点)的存在，所述的多核苷酸序列一起能结合至与约100个靶标序列的碱基对，或约200个靶标序列的碱基对，或约500个靶标序列的碱基对或约1000个靶标序列的碱基对邻接或在其中的核苷酸序列，并且所述的核苷酸序列能朝向彼此延伸以形成至少含有该靶位的扩增子。
在另一个实施方案中，本发明包括用于在生物学样品中检测事件MIR604蛋白质的方法，该方法包括：(a)从玉米事件MIR604组织的样品中提取蛋白质；(b)使用包括特异于MIR604事件产生的杀虫蛋白或选择性标记蛋白的抗体的免疫法，测定提取的蛋白质；和(c)检测上述的抗体与杀虫蛋白或选择性标记蛋白的结合。
本发明的另一个实施方案包括含有转基因事件MIR604的基因型的玉米植物或其部分，其中该基因型含有在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中列出的核苷酸序列或其互补序列。在该实施方案的一个方面，玉米植物来自近交玉米系CG5NA58、CG5NA58A、CG3ND97、CG5NA01、CG5NF22、CG4NU15、CG00685、CG00526、CG00716、NP904、NP948、NP934、NP982、NP991、NP993、NP2010、NP2013、NP2015、NP2017、NP2029、NP2031、NP2034、NP2045、NP2052、NP2138、NP2151、NP2166、NP2161、NP2171、NP2174、NP2208、NP2213、NP2222、NP2275、NP2276、NP2316、BCTT609、AF031、H8431，894、BUTT201、R327H、2044BT和2070BT。然而本领域的技术人员将理解，MIR604基因型可以渐渗入至能与玉米杂交的任何植物品种，包括野生玉米物种，因而该实施方案的优选近交系并不意味着限制。
在另一个实施方案中，本发明包括至少包含连接在一起形成连续核苷酸序列的第一和第二DNA序列的玉米植物，其中第一DNA序列在接点序列内并含有至少约11个选自SEQ ID NO：3的核苷酸792-811；SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸497-516；及其互补序列的连续核苷酸，其中第二DNA序列在选自SEQID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及其互补序列的异源插入DNA序列内；并且其中第一和第二DNA序列可用作在生物学样品中检测玉米事件MIR604的核酸序列存在的核苷酸引物或探针。在该实施方案的一个方面，核苷酸引物在DNA扩增方法中用于从提取自玉米植物的模板DNA扩增靶标DNA序列，并且通过产生对应于含有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的DNA序列的扩增子可将该玉米植物从其它玉米植物中鉴定出
来。
本发明的玉米植物还可以通过如下方式表征：用限制性内切核酸酶KpnI消化植物的基因组DNA，并在高度严格条件下，使用cry3A055-特异性探针杂交，产生单个cry3A055杂交条带。在此作为实例的是含有SEQ ID NO：56或SEQ ID 59中列出的核苷酸序列的cry3A055探针。
本发明的玉米植物还可以通过如下方式表征：用限制性内切核酸酶KpnI消化植物的基因组DNA，并在高度严格条件下，使用pmi-特异性探针杂交，产生单个pmi杂交条带。在此作为实例的是含有SEQ IDNO：62中列出的核苷酸序列的pmi探针。
在一个实施方案中，本发明提供一种玉米植物，其中MIR604基因型赋予该玉米植物对昆虫的抗性或使之具有利用甘露糖的能力。在该实施方案中的一个方面，赋予玉米植物对昆虫的抗性的基因型含有cry3A055基因。在该个实施方案中的另一个方面，赋予玉米植物利用甘露糖的能力的基因型含有pmi基因。
在一个实施方案中，本发明提供源于事件MIR604玉米植物、组织或种子的生物学样品，其中该样品含有如下核苷酸序列，该序列是选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列或是与其互补的序列，并且其中该序列在样品中是可采用核酸扩增或核酸杂交方法检测的。在该实施方案的一个方面，该样品选自玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和被完全或部分地加工而含有玉米产品的谷类食品。
在另一个实施方案中，本发明提供源于含有如下核苷酸序列的事件MIR604玉米植物、组织或种子的提取物，所述的核苷酸序列是选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列或是与其互补的序列。在该实施方案中的一个方面，该序列在提取物中是可采用核酸扩增或核酸杂交的方法检测的。在该实施方案的另一方面，该样品选自玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和被完全或部分地加工而含有玉米产品的谷类食品。
在再一个实施方案中，本发明提供用于产生至少抗玉米根虫侵染的玉米植物的方法，方法包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本
玉米植物进行有性杂交，其中所述的第一或第二亲本玉米植物含有玉米事件MIR604的DNA，从而产生大量的第一代子代植物；(b)选择至少抗玉米根虫侵染的第一代子代植物；(c)将此第一代子代植物自交，从而产生大量的第二代子代植物；和(d)从第二代子代植物中选择至少抗玉米根虫侵染的植物；其中该第二代子代植物含有选自SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供产生杂种玉米种子的方法，方法包括：(a)种植含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列的第一近交玉米系的种子，以及具有不同基因型的第二近交系的种子；(b)栽培从上述种植得到的玉米植物直到其开花；(c)将上述的玉米近交系之一的植物的花去雄；(d)让这两种不同的近交系相互有性杂交；和(e)收获因而产生的杂种种子。在该实施方案的一个方面，第一近交玉米系提供母本。在该实施方案的另一方面，第一近交玉米系提供父本。本发明还包括通过此实施方案的方法产生的杂种种子和由该种子生长得到的杂种植物。
本领域中的技术人员将意识到，本发明的转基因基因型可以通过育种而渐渗至含有不同转基因基因型的其它玉米系中。例如，含有本发明转基因基因型的玉米近交系可以与含有本领域已知的抗鳞翅目抗性Bt11事件的转基因基因型的玉米近交系杂交，从而产生含有本发明转基因基因型和Bt11转基因基因型两者的玉米种子。能与本发明近交系杂交的其它转基因事件的实例包括：草甘膦耐受性事件GA21和NK603、草甘膦耐受性/鳞翅目昆虫抗性的MON802事件、鳞翅目昆虫抗性的DBT418事件、鳞翅目昆虫抗性的事件DAS-06275-8、雄性不育事件MS3、膦丝菌素耐受性事件B16、鳞翅目昆虫抗性的事件MON 80100、膦丝菌素耐受性事件T14和T25、鳞翅目昆虫抗性的事件176和鞘翅目昆虫抗性的事件MON863，上述的所有事件是本领域已知的。另外应该认识到，也可以与本发明转基因基因型构成其它组合并因而不应将这些实施例看作限制。
本领域的技术人员也将认识到，含有本发明转基因基因型的转基
因玉米种子可以用各种处理种子的化学药品剂(包括杀虫剂)来处理以增强或协同地加强Cry3A055蛋白质的杀虫活性。例如，本发明的转基因玉米种子可以用商品化杀虫剂Cruiser处理。这种组合可用于增加活性谱并增加所表达的蛋白和化学药品的效力。
育种
采用本领域公认的育种技术可将本发明的转基因基因型渐渗至任何近交玉米或杂种玉米中。植物育种的目的是将多种期望的性状组合在单个品种或杂种中。对于大田作物，这些性状可包括对昆虫和疾病的抗性、对除草剂的耐受性、对热和干旱的耐受性、缩短农作物成熟的时间、更高产量和更好的农艺学品质。随着许多农作物的机械收割，植物特性例如萌发和立株(stand establishment)、生长速率、成熟期以及株高和穗高的均一性是重要的。
大田作物通过利用植物的授粉方法的技术来育种。如果来自一朵花的花粉转移至自身或相同植物的另一朵花时，植物是自花授粉。如果花粉来自不同植物的花则植物是异花授粉。
经过多代自花授粉并选择某类型的植物在几乎所有基因座变成纯合并产生均一的纯育子代群。两种不同纯合系之间的杂交产生均一的杂种植物群，该杂种植物群的许多基因座可能是杂合的。各在许多基因座是杂合的两种植物，其杂交将产生不均一的一群在遗传学上不同的杂种植物。
玉米可以通过自花授粉和异花授粉技术育种。玉米在相同的植株上具有分开的雄花和雌花，它们分别位于雄花穗和雌穗上。当风将花粉从雄花穗吹到雌穗顶端伸出的穗丝上时则玉米植物中发生自然授粉。
一种在植物中控制雄性能育性的可靠方法为改良植物育种提供了机会。这对依赖某种雄性不育体系的玉米杂种的开发来说尤其是如此。存在多种可选方案供育种者控制雄性能育性，例如：手工或机械去雄(或去除雄花穗)、细胞质雄性不育性、遗传性雄性不育性、杀配子剂，等等。
杂种玉米种子典型地通过雄性不育体系结合手工或机械去除雄花穗来产生。将两种近交系在田间作交替的带状种植，并将带花粉的雄花穗从一种近交系(雌株)中去除。假设充分地与外来的玉米花粉源隔离，去除雄花穗的近交系的雌穗将只从所述另一近交系(雄株)获得受精，因此得到的种子是杂种并将会形成杂种植物。
通过使用本领域赋予遗传雄性不育的许多方法之一(备具有自身的优缺点)可以避免采用这种费力的、并有时不可靠的去除雄花穗方法。这些方法使用多种途径，例如将编码与雄性组织特异性启动子结合的细胞毒性物质的基因递送入植物，或者反义系统(其中鉴别对生育力具有决定性的基因并将该基因的反义物插入进该植物中)(见：Fabinjanski等人，EPO 89/3010153.8 publication no.329，308和PCT application PCT/CA90/00037，发表为WO 90/08828)。
玉米近交系的开发
雄性不育的近交系的使用仅是开发玉米杂种的一个因素。本领域已知并用于玉米植物育种计划的植物育种技术包括但不限于轮回选择(recurrent selection)、回交、谱系育种、限制性长度多态性增强的选择(restriction length polymorphism enhanced selection)、遗传标记增强的选择和转化。玉米植物育种计划中玉米杂种的开发需要(一般而言)开发纯合近交系，将这些系杂交并评价该杂交。谱系育种和轮回选择育种方法用于从繁殖种群开发近交系。玉米植物育种计划将来自两种或更多种近交系或各种其它的种质源(germplasmsource)的遗传背景组合成繁殖库(breeding pool)，通过自交和选择期望的表现型而从上述的繁殖库中开发新的近交系。将新的近交系与其它近交系杂交并评价从这些杂交得到的杂种以确定那些杂种中哪些具有商业潜力。植物育种和杂种开发(如在玉米植物育种计划中实践的)是昂贵并耗时的过程。
谱系育种开始于两种基因型的杂交，所述的基因型各可以具有一种或多种另一基因型缺少的期望的特性或者两种基因型彼此互补。如果这两种最初的亲本不能提供所有期望的特性，则可将其它的来源包
括于繁殖种群中。在谱系法中，将优良的植株自交并在连续世代中选择。在随后的世代中，由于自花授粉和选择而使杂合情况让位于纯合品系。典型地，在育种的谱系法中进行五代或更多代的自交和选择：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5等。
轮回选择育种、回交可以例如用于改善近交系和使用这些近交系得到的杂种。回交可用于将特定期望的性状从一种近交系或来源转移至缺少该性状的近交系。这可以例如通过首先将优良的近交系(轮回亲本)与携带编码目的性状的合适基因的供体近交系(非轮回亲本)杂交而完成。然后将这种杂交得到的子代与优良的轮回亲本回交，随后在得到的子代中选择具有从非轮回亲本转移的期望的性状的子代。在五代或更多代的回交和选择期望的性状后，子代中控制被转移的性状的基因座将是纯合的，但基本上所有其它的基因将与优良的亲本一样。然后将最后的回交世代自交以产生对于被转移的基因而言的纯育子代。从含有所转移的基因的近交系开发的杂种基本上与从没有该转移基因的相同近交系开发的杂种相同。
原种(elite)近交系，即纯育、纯合的近交系，也可用作育种的起始材料或开发其它近交系的源群体。这些源于原种近交系的近交系可使用先前描述的谱系育种和轮回选择育种方法开发。举例来说，当回交育种在玉米植物育种计划中用于产生这些衍生系时，原种近交系可用作亲本系或起始材料或源群体并可用作供体亲本或轮回亲本。
玉米杂种的开发
单交玉米杂种由两种近交系杂交产生，这两种近交系各具有与对方的基因型补充的基因型。第一代杂种子代命名为F1。在玉米植物育种计划中商品化杂种的开发只寻求F1杂种植物。优选的F1杂种比它们的近交亲本更有活力。这种杂种优势(hybridvigor或heterosis)可以在许多多基因性状，包括增加的营养生长和增加的产量中显示。
在玉米植物育种计划中玉米杂种的开发包括三个步骤：(1)从各种种质库中选择植物用于最初育种杂交；(2)将从该育种杂交选择的植物自交几代以产生一系列的近交系，它们虽然彼此不同，但是纯育
的，并且是高度均质的；并且(3)将选择的近交系与不同的近交系杂交以产生杂种子代(F1)。在玉米的近交过程中，该系的优势降低。当两种不同的近交系杂交产生杂种子代(F1)时优势得以恢复。近交系的纯合性和同质性的重要价值是，一对确定的近交系之间的杂种将总是一样的。一旦产生优良杂种的近交系已经确定，只要维持近交系亲本的同质性则可无限地再生产杂种种子。F1杂种显示的许多杂种优势在下一代(F2)中丧失。因此，杂种的种子不用于培植原种。
杂种种子的产生需要除去或失活由母本产生的花粉。不完全地除去或失活该花粉提供了自花授粉的可能。这种非有意的自花授粉产生的种子可能会无意识地收获并与杂种种子一起包装。
一旦种植该种子，可以鉴定并选出这些自花授粉的植株。这些自花授粉的植株在遗传上等价于用于产生杂种的雌性近交系。
对本领域技术人员显而易见，前述的方法只是可以通过依赖于将本发明的转基因型渐渗入至其它玉米系的那些手段获得本发明的近交系的各种方法中的一些方法。其它的方法也是可获得的，并且上述的实例只用作举例说明。
实施例
本发明通过参考下面详细的实施例来进一步描述。除非另外说明，否则提供下列的实施例仅用于举例说明目的，并不旨于限定。在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的并由Ausubel(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons，Inc.(1994)；J.Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor，NY：Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)；以及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)描述。
实施例1.MIR604事件的转化和选择
MIR604事件通过近交玉米(玉蜀黍)系A188的农杆菌-介导的转化而产生。I-型胚性(ambryogenic)愈伤组织用来自质粒pZM26的
DNA片段(图1)，基本上如Negrotto等人描述的方法(Plant CellReports 19：798-803，2000)进行转化，将此文献在此引入作为参考。pZM26包含含有串联表达盒的核苷酸序列。第一个表达盒由有效连接至cry3A055编码序列的MTL启动子序列(美国专利6,018,099)组成，其中cry3A055编码序列进一步有效连接至胭脂碱合酶3′末端转录终止序列和多腺苷酸化序列。第二个表达盒由有效连接至pmi编码序列的玉米泛素(ubiquitin)启动子(ZmUbiInt)(Christensen等人，1992 PMB 18：675)组成，其中的pmi编码序列进一步有效连接至胭脂碱合酶3′末端转录终止序列和多腺苷酸化序列。
将未成熟胚从8-12天龄的穗中切取并用新鲜培养基漂洗以便预备用于转化。将胚与包含转化载体pZM26的农杆菌细胞悬液混合，涡旋30秒，并再将其温育5分钟。吸去过量的农杆菌溶液并然后将胚移至装有非选择性培养基的平板上。将胚和剩余的农杆菌于22℃在黑暗中共培养2-3天。将胚转移至补加有羧噻吩青霉素钠(ticarcillin)(100mg/ml)和硝酸银(1.6mg/l)的培养基中并在黑暗中培养10天。将产生胚性愈伤组织的胚转移至含有甘露糖的细胞培养基中。
通过TAQMAN
PCR分析(见实施例2)测验再生的小植株是否存在pmi和cry3A055基因，也测验其是否不存在抗生素抗性壮观霉素(spectinomycin)(spec)基因。将对于两种转基因呈阳性并对spec基因呈阴性的植株转移至温室进一步繁殖。使用对抗玉米根虫的昆虫生物测定法鉴定并筛选阳性的事件。通过TAQMAN分析表征杀昆虫的事件的拷贝数。基于具有转基因的单拷贝、通过ELISA鉴定的好的蛋白质表达以及对抗玉米根虫的好的杀昆虫活性而选择MIR604用于进一步分析。
将T0 MIR604与近交玉米系CG00526回交，产生T1群体。将T1植株自花授粉产生T2代，并且重复该过程产生T3代。采用T3植株的子代检验鉴定纯合的(转化的)家族。将MIR604-转化的CG00526近交系与其它原种近交系杂交产生用于进一步研究的杂种。
实施例2.通过TAQMAN PCR检测MIR604
TAQMAN分析基本上如Ingham等人(Biotechniques，31：132-140，2001)描述的方式进行，在此将该文献引入作为参考。简单地说，使用Puregence
基因组DNA提取试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN)，除了所有的步骤在1.2ml 96孔的平板中进行外，基本上根据生产商的说明书，从转基因和非转基因玉米植物的叶中分离基因组DNA。将干燥后的DNA沉淀物再悬浮于TE缓冲液(10Mm Triss-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。
TAQMAN PCR反应在96孔平板中进行。对于内源玉米基因对照，设计特异于玉米醇脱氢酶(adh)基因(Genbank登记号AF044295)的引物和探针。本领域技术人员将理解，其它玉米基因也可以用作内源对照。进行多元反应同时扩增cry3A055和adh或pmi和adh。对于每种样品，母混合物(master mixture)通过将20μL提取的基因组DNA与35μL 2×TAQMAN通用PCR Master Mix(Applied Biosystems)混合并补加引物至每种终浓度为900nM、补加探针至每种终浓度为100nM以及补加水至终体积70μL而产生。将这种混合物分成同样的3份，每份20μL于96-孔扩增平板中并用光学透明的热封薄膜(Marsh BioProducts)密封。使用下面的扩增参数在ABI Prism 7700仪中进行PCR：在50℃下2分钟和在95℃下10分钟，随后做35次循环，每次在95℃下15秒钟和在60℃下1分钟。
TAQMAN分析的结果表明事件MIR604具有cry3A055基因的一个拷贝和pmi基因的一个拷贝。使用的合适的引物/探针序列组合的实例是：
引物名称 引物序列 序列号
Cry3A055-正向 5′-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3′ SEQ ID NO：47
Cry3A055-反向 5′-CGATCAGGTCCAGCACGG-3′ SEQ ID NO：48
Cry3A055-探针 5′-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3′ SEQ ID NO：49
(5′标记物＝FAM，3′标记物＝TAMRA)
PMI-正向 5′-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3′ SEQ ID NO：50
PMI-反向 5′-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3′ SEQ ID NO：51
PMI-探针 5′-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3′ SEQ ID NO：52
(5′标记物＝FAM，3′标记物＝TAMRA)
ZmADH-267正向 5′-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3′ SEQ ID NO：53
ZmADH-337反向 5′-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3′ SEQ ID NO：54
ZmADH-316探针 5′-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3′SEQ ID NO：55
(5′标记物＝TET，3′标记物＝TAMRA)
实施例3.通过DNA印迹检测MIR604
用于DNA印迹分析的基因组DNA基本上使用Thomas等人的方法(Theor.Appl.Genet.86：173-180，1993)(在此引入作为参考)，从汇集的叶组织中分离，所述的叶组织来自十株代表MIR604的回交六代(BC6)的植株。用于DNA分离的所有植株用TAQMAN PCR(如实施例2中描述)分别独立地分析以验证cry3A055基因和pmi基因的单拷贝的存在。作为阴性分离子(segregant)对照，从代表事件MIR604的BC4代的五株植物的汇集的叶组织中分离DNA。这些阴性分离子植物用TAQMANPCR分别独立地分析并且这些试验对于cry3A055基因和pmi基因的存在呈阴性，但是(正如期望的)，对于试验的内部对照，即内源玉米adh基因呈阳性。
DNA印迹分析用常规的分子生物学技术进行。将基因组DNA(7.5μg)用KpnI限制性酶消化，该酶在来自质粒pZM26的MIR604 T-DNA插入序列中具有单一识别位点(图1)。这种方法能测定已经掺入MIR604中的元件的拷贝数，所述的元件对应于用于每个DNA印迹的特定探针。这导致MIR604中存在的每个拷贝元件一个杂交条带的结果。在琼脂糖凝胶电泳和碱性转移至Nytran
膜后，用PCR-产生的元件-特异性全长探针进行杂交。用于cry3A055和pmi DNA印迹法的探针分别含有在SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：61中列出的核苷酸序列。使用RediprimeTM II体系(Amersham Biosciences，Cat.No.RPN1633)，通过随机引物法将探针用32P标记。
使用下面的高度严格杂交条件：将1-2百万cpm/ml加入至补加有预热至65℃的100μg/ml小牛胸腺DNA(Invitrogen)的PerfectHyb
(Sigma)中。预杂交在同上的溶液中，于相同温度下过夜进行或进行至少1小时。杂交在65℃下进行3小时，随后在65℃的2×SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20分钟，并在65℃的0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次20分钟。
每个Southen上包括三种对照样品：(1)来自阴性(未转化的)分离子的DNA，其用于鉴定任何可与元件-特异性探针杂交的内源玉米(Zea mays)序列；(2)来自阴性分离子的DNA，其中引入了KpnI-消化的pZM26，其量基于探针长度等价于一个拷贝数，以说明在检测玉米基因组内的单个基因拷贝时该实验的灵敏度；和(3)基于探针长度等价于一个拷贝数的KpnI-消化的pZM26质粒，其作为杂交的阳性对照并用于说明实验的灵敏度。
杂交数据提供了确证的证据支持TAQMAN PCR分析，即MIR604含有cry3A055和pmi基因的单拷贝，并且MIR604不包含存在于pZM26中的任何载体骨架序列。如对cry3A055和pmi探针两者所预期的，KpnI消化物得到正确大小的单个杂交条带，这说明每种基因各一个拷贝存在于MIR604事件中。另外，对于骨架探针，不存在杂交，说明在转化过程中未有任何pZM26载体骨架序列被掺入MIR604中。
实施例4.T-DNA插入序列的测序
确定存在于事件MIR604中的全部转基因DNA插入序列的核苷酸序列，以证明插入序列的整体完整性、功能元件的相邻性以及检测任何个别的碱基对改变。MIR604插入序列作为两个独立的重叠片段从源于BC5代的DNA进行PCR扩增。每个片段均使用一个与位于MIR604插入序列侧翼的植物基因组序列同源的多核苷酸引物和一个与cry3A055基因同源的多核苷酸引物扩增。为产生5′片段，将与5′侧翼序列同源的第一多核苷酸引物即5′S1(SEQ ID NO：15)和与cry3A055基因内的插入DNA同源的第二多核苷酸引物5′AS1(SEQ ID NO：28)组合。为产生3′片段，将与3′侧翼序列同源的第一多核苷酸引物即9268AS(SEQ ID NO：45)和与cry3A055基因内的插入DNA同源的第二多核苷酸引物即5161S(SEQ ID NO：27)组合。
PCR扩增使用Expand高保真PCR扩增系统(Roche，Ca t.No.1732650)和下面的扩增参数进行：在94℃下2分钟1个循环，随后在94℃下15秒钟、在55-65℃下30秒钟和在68℃下5分钟进行10个循环，随后在94℃下15秒钟、在55-65℃下30秒钟和在72℃下5分钟+5秒钟/循环进行20个循环，随后在72℃下7分钟进行1个循环。
从使用SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28的PCR产生的扩增子含有5′接点序列(SEQ ID NO：1)。从使用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：27的PCR产生的扩增子含有3′接点序列(SEQ ID NO：2)。将每个测序片段独立地克隆进pCR
-XL-TOPO载体(Invitrogen，Cat.No.K4700-20)中并针对每个片段分别鉴定和测序了三个独立的克隆。测序采用ABI BigDye
1.1或Big Dye 3.1 dGTP(用于富含GC的模板)化学和ABI3730XL分析仪进行。序列分析使用来自华盛顿大学的Phred、Phrap和Consed软件包进行并且实现错误率为10,000个碱基中少于1个(Ewing and Green，1998)。最后的共有序列通过组合来自六个独立克隆(每种测序片段三个)的序列数据产生MIR604插入序列的一段共有序列而确定。为进一步确认MIR604插入序列和pZM26质粒之间任何单个碱基对差异，使用上述相同的方法扩增特异于任何如下区域的小的(约300-500bp)PCR产物，其中所述区域为在初始共有序列中发现碱基对差异的区域。对于MIR604插入序列中所有推断的碱基对差异，直接的PCR产物测序导致在所关注的所有碱基对上有清晰的单峰，表明这些差异可能存在于MIR604插入序列中。比对使用下列参数采用ClustalW程序进行：打分矩阵blosum55，缺口开放罚分15，缺口延伸罚分6.66(Thompson等人，1994，Nucleic AcidsResearch，22，4673-4680)。
MIR604 T-DNA插入序列的共有序列的数据表明：插入序列的整体完整性和(如pZM26中设计的)插入序列中功能元件的相邻性已经得以维持。序列分析显示在产生事件MIR604的转化过程中，在T-DNA插入序列的右边界(RB)(SEQ ID NO：57)和左边界(LB)(SEQ ID NO：
62)末端发生一些截断。T-DNA插入序列的RB部分截短了44bp并且T-DNA插入序列的LB末端截短了43bp。这些缺失不影响该T-DNA插入序列的功效并且这种现象以前已经在农杆菌转化中观察到过(Tinland&Hohn，1995.Genetic Engineering，17：209-229)。另外，在MIR604 T-DNA插入序列中注意到三个碱基对改变。一个差异发生在MTL启动子内，其为一个不编码蛋白质的调节区。剩下的两个差异发生在pmi编码序列内并导致两个氨基酸改变：在位置61的缬氨酸已经由丙氨酸替代(V61A)并且在位置210的谷氨酰胺已经由组氨酸替代(Q210H)。丙氨酸和缬氨酸两者都是脂肪族氨基酸，导致保守替换。组氨酸置换谷氨酰胺导致酸性残基被碱性残基替代。
实施例5.侧翼DNA序列的分析
位于插入事件MIR604的玉米植物基因组中的异源DNA侧翼的玉米基因组DNA序列，使用基本上如Kamberov等人描述的方法(Proceedings of SPIE，Tools for Molecular Analysis andHigh-Throughput Screening，4626：1-12，2002)以及OmniPlexTM技术获得，在此将该文献引入作为参考。
使用标准PCR方法确认5′和3′侧翼序列和接点序列。5′侧翼序列和接点序列使用在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中列出的第一多核苷酸引物，组合在SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中列出的第二多核苷酸引物来确认。3′侧翼序列和接点序列使用在SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44中列出的第一多核苷酸引物，组合在SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36中列出的第二多核苷酸引物来确定。本领域技术人员将理解，其它引物序列也可用于确认侧翼序列和接点序列。
发现在SEQ ID NO：5中显示的玉米基因组序列在MIR604插入序列右边界侧翼(5′侧翼序列)并且在SEQ ID NO：6中显示的玉米基因
组序列在左边界侧翼(3′侧翼序列)。5′接点序列在SEQ ID NO：1中列出。3′接点序列在SEQ ID NO：2中列出。
实施例6.通过ELISA检测MIR604蛋白质
为了表征Cry3A055(活性杀昆虫成分)和磷酸甘露糖异构酶(PMI)(选择性标记)蛋白质在MIR604植物中的表达范围。在两种杂种(MIR604-B和MIR604-C)和一种近交系(MIR604-A)的四个生长阶段(轮生(whorl)，开花、种子成熟和衰老)通过ELISA测定了几种植物组织和整个植株中Cry3A055蛋白质和PMI的浓度。对于事件MIR604中的转基因，这些杂种是半合子，而近交系在这些转基因上是纯合的。
整株植物和各单个部分(花粉除外)使用咖啡碾磨器(coffeegrinder)、搅拌机、GrindomixTM碾磨器(Brinkmann Instruments；Westbury，NY，USA)、具有研棒的研钵或磨机，或这些设备的组合，通过加工研磨成细粉。所有的加工都在存在干冰或液氮的情况下进行。将样品很好地混合以确保均匀性。保留全部植物组织样品或代表性子样品用于分析，使得可以有足够的样品大小以便备案存储后备植物组织样品。测定每一样品的百分比干重并在约-80℃下保存经加工的样品直到冻干。
提取新鲜的组织(花粉和青贮料除外)和整株植物样品。对分析的每一样品，称取1.0g粉末化新鲜材料等分试样至15ml的聚丙烯试管中，将其悬浮于3ml提取缓冲液[50mM CAPS、0.1M NaCl、2mMEDTA、1mM二硫苏糖醇、1mM 4-(1-氨乙基)苯磺酰氟HCl、1mM亮抑蛋白酶肽，pH10]中，并使用Autogizer匀浆器(Tomtek；Hamden，CT，USA)提取。于4℃在10,000×g下离心15分钟后，通过ELISA将上清液用于分析Cry3A055和PMI。在如Hill和Straka(1988)所述的用碘乙酰胺处理后，用BCATM蛋白质测定试剂(Pierce；Rockford，IL，USA)定量提取物中的总蛋白量。
花粉提取物通过将花粉以1∶30(w/v)悬浮于提取缓冲液中制备。在冰上30分钟后，以约15,000psi三次通过弗氏压碎器(French
pressure cell)以破裂花粉悬液，随后于4℃在14,000×g下离心5分钟。如下面描述通过ELISA在上清液上进行Cry3A055和PMI分析。如上面描述定量总蛋白量。
通过将青贮料以1∶25(w/v)悬浮于2×提取缓冲液中制备青贮料提取物。在冰上30分钟后，用Brinkmann Polytron
匀浆器(Brinkmann；Westbury，NY，USA)提取青贮料悬液。于4℃在10,000×g下离心15分钟后，将上清液用于通过ELISA分析Cry3A055和PMI。如上面描述定量总蛋白量。
Cry3A055定量
使用免疫-亲和纯化的兔抗-Cry3A055多克隆抗体和免疫-亲和纯化的山羊抗-Btt(来自苏云金芽孢杆菌tenebrionis亚种(Bacillusthuringiensis subsp.tenebrionis)的天然Cry3A)多克隆抗体，通过ELISA(Tijssen，1985)定量分析如上面描述制备的提取物的Cry3A055。依靠标准曲线的线性部分、可分析而无本底干扰的对照提取物的最大体积以及等分试样代表的样品的相应重量，基于纯参考蛋白质的最低浓度，估计双-夹心ELISA定量的下限。
除花粉以外，分析的所有源于MIR604的植物组织中检测到Cry3A055蛋白质的可计量水平。在多数情况下，结果用5份相同组织样品的平均值表示。对于青贮料，分析了一个样品；因此，不能计算平均值。对照样品的水平低于用于所有阶段和组织的定量界限。
横跨所有的生长阶段，在叶、根和整个植物中测量的平均Cry3A055水平分别是约3至23μg/g鲜重(4-94μg/g干重)、约2-14μg/g鲜重(7-62μg/g干重)和约0.9-11μg/g鲜重(3-28μg/g干重)。种子成熟和衰老时在玉米粒中测量的平均Cry3A055水平是约0.6-1.4μg/g鲜重(0.8-2.0μg/g干重)。在开花期在穗丝组织中测量的平均Cry3A055水平低于定量的下限(LOQ)，即＜0.1μg/g鲜重(＜1.0μg/g干重)。种子成熟时在穗丝组织中测量的平均Cry3A055水平是约0.6-1.9μg/g鲜重(1-3μg/g干重)。在近交MIR604-A或杂种MIR604-B和MIR604-C的花粉中均检测不到Cry3A055蛋白质
[检测限(LOD)＝0.07μg/g鲜重，0.15μg/g干重]。
在每个时间点，对于每一组织类型，在杂种之间Cry3A055水平普遍相似。对于近交系，轮生阶段和开花阶段在叶、根和整个植株中，以及种子成熟时在根中Cry3A055的表达通常高于杂种中的表达。经过15、29和75天，青贮料组织中测量的Cry3A055水平平均为2.5μg/g鲜重(7.3μg/g干重)。相较而言，青贮之前(青贮前0天)在剁碎的植物材料中测量的Cry3A055水平是约8μg/g鲜重(20μg/g干重)。
PMI定量
使用PMI特异性的蛋白质A-纯化的多克隆兔抗体和免疫-亲和纯化的多克隆山羊抗体，通过ELISA(Tjissen，1985)定量分析如上面描述制备的提取物的PMI。依靠标准曲线的线性部分、可分析而无本底干扰的对照提取物的最大体积以及等分试样代表的样品的相应重量，基于纯参考蛋白质的最低浓度，估计双-夹心ELISA定量的下限。
在分析的大多数源于MIR604的植物组织中检测到PMI蛋白质，尽管使是处于低水平。在多数情况下，结果表示为5份相同组织样品的平均值。对于青贮料，只分析了一份；因而，不能计算平均值。对照样品的水平低于用于所有阶段和组织的定量界限。
横跨所有植物阶段，在叶、根和整个植物中测量的平均PMI水平分别是不可检测(ND)至约0.4μg/g鲜重(ND-2.1μg/g干重)、低于LOQ(＜0.03μg/g鲜重)至约0.2μg/g鲜重(＜0.1-1.0μg/g干重)和低于LOQ(＜0.02μg/g鲜重)至约0.3μg/g鲜重(＜0.04-2μg/g干重)。种子成熟和衰老期在玉米粒中测量的平均PMI水平是低于LOQ(＜0.06μg/g鲜重)至约0.4μg/g鲜重(＜0.07-0.5μg/g干重)。开花和种子成熟期在穗丝组织中测量的平均PMI水平为低于LOQ(＜0.1μg/g鲜重)至约0.8μg/g鲜重(＜0.2-6.8μg/g干重)。花粉中的PMI为约1.9-2.6μg/g鲜重(3.9-5.2μg/g干重)。
PMI水平在近交系和杂种基因型之间在每一时间点对于每一组织类型而言普遍相似。在青贮料中在全部三次取样时间(15、29和75
天)未检测到PMI，而在青贮之前(青贮前0天)在剁碎的植物材料中测量的水平是约0.3μg/g鲜重(0.7μg/g干重)。
估计的每英亩和每公顷总的Cry3A055蛋白质水平
对于近交系(MIR604-A)和两种杂种(MIR604-B和MIR604-C)，植株在种子成熟期达到它们最高生物量。植株在种子成熟期也达到了它们每英亩(和每公顷)最高估计平均Cry3A055水平，并据估计MIR604-A、MIR604-B和MIR604-C分别含有约78、141和240gCry3A055/英亩(193、348和592g/公顷)。在整个生长季以及对于全部基因型，假定每英亩26,500株植株的种植密度(65,500植株/公顷)，源于MIR604的植物中Cry3A055的估计值为衰老期的约8gCry3A055/英亩(21g Cry3A055/公顷)至种子成熟期的约240gCry3A055/英亩(592g Cry3A055/公顷)的平均水平。
实施例7.MIR604的田间效力
西部玉米根虫和北部玉米根虫
在美国12个地点，试验MIR604植物抗西部玉米根虫和北部玉米根虫的效力。在加上或未加上杀昆虫的种子处理Crusier
的情况下试验MIR604。对照组由用两种不同比率的Crusier处理的种子和未处理的标准(check)组成。处理由按随机化完全区组(randomizedcomplete block)设计的四个重复组成，每个有17.5-20英尺的两行，两行中心间隔30″。对每种处理随机选取十株植株并用0-3的等级评价其功效，其中0＝无虫食损害(可以给出的最低等级)；1＝1个茎节(环绕着根)或等价于一整节被吃回茎杆的约2英寸内(土壤线在第7节上)；2＝吃掉两个完整的节；3＝吃掉3个或更多的节(可给出的最高等级)。对于处在整节被吃掉的中间的损伤，记录为失去的节的百分比，即1.50 ＝吃掉11/2节，0.25＝吃掉一节的1/4。
结果(在表1中显示)说明，MIR604的两姊妹系(sibling line)即3-11和3-12的根比经Cruiser处理的根或未处理的对照根承受了明显少的虫食损害。MIR04-3-11和MIR604-3-12分别具有0.44和0.42的根损伤等级，相较而言，0.25和1.25mgA/种子Cruiser处
理分别具有1.6和0.9的损伤级，并且对照系具有2.14的损伤级。在其种子经Cruiser处理的MIR604植株中存在更低根损伤级的趋势，这表明Cruiser
加强了Cry3A055蛋白质或者在Cruiser和Cry3A055之间可能存在协同作用。这在1.0和1.25mgA/MIR604种子处理中特别明显，其分别具有0.33和0.29的根损伤级。
表1.经或未经Crusier
种子处理的MIR604的效力。
| 玉米系 | Cruiser |
根损伤级 (0-3 CRW等级) |
| MIR604-3-11 | 0 | 0.44 |
| MIR604-3-12 | 0 | 0.42 |
| MIR604 | 0.25 | 0.43 |
| MIR604 | 0.50 | 0.39 |
| MIR604 | 1.0 | 0.33 |
| MIR604 | 1.25 | 0.29 |
| 对照杂种 | 0.25 | 1.60 |
| 对照杂种 | 1.25 | 0.99 |
| 对照杂种 | 0 | 2.14 |
将MIR604的效力与在犁耕(in-furrow)时施用的商品化的颗粒杀虫剂标准比较。试验的设计如上描述。表2中的结果显示在保护植物不受玉米根虫食害方面MIR604的效力比得上该商品化标准品。
表2.MIR604的效力与在犁耕时应用的商品化杀虫剂的比较。
| 处理 | 根损伤级(0-3 CRW等级) |
| MIR604 | 0.4 3 |
Force |
0.44 |
Aztec |
0.32 |
| Lorsban15G | 0.75 |
| 未经处理的标准品 | 2.14 |
墨西哥根虫
在德克萨斯州的2个地点评价MIR604植物对墨西哥根虫的抗性。试验的设计基本上与如上面描述的一样。
表3中显示的结果说明，MIR604姊妹系都比未处理的标准品遭受了较少的食害。当加入Cruiser至MIR604种子时对控制墨西哥根虫有正反应。明显存在清晰的比率反应。表4中显示的结果表明，在保护植物不受墨西哥根虫食害方面MIR604的效力比得上商品化标准品。
表3.经或未经Crusier种子处理的MIR604的抗墨西哥根虫效力。
| 处理 | Crusier比率 (mg/种子) | 根损伤级 (0-3 CRW等级) |
| MIR604-3-11 | 0 | 1.14 |
| 0.125 | 0.19 | |
| 0.25 | 0.18 | |
| 0.50 | 0.09 | |
| 1.25 | 0.02 | |
| MIR604-3-12 | 0 | 0.68 |
| 0.125 | 0.46 | |
| 0.25 | 0.18 | |
| 0.50 | 0.21 | |
| 1.25 | 0.04 | |
| 对照杂种 | 0.125 | 1.59 |
| 1.25 | 0.71 | |
| 0 | 2.76 |
表4.与在犁耕时施用的商品化杀虫剂比较，MIR604的抗西哥根虫的效力。
| 处理 | 根损伤级(0-3 CRW等级) |
| MIR604 | 0.68 |
| Force3G | 0.66 |
| Aztec6.7G | 0.88 |
Lorsban |
0.81 |
| 未经处理的标准 | 2.76 |
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请在此引入作为参考，
就如同每一出版物或专利申请被明确和单独地指明引入作为参考一样。
虽然为了清楚地理解的目的已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地描述了前述的发明，但是显然可以做出某些改变和修饰而不脱离本发明的范围。
Claims (11)
1.来自MIR604转基因玉米植物的核酸分子，所述MIR604转基因玉米植物含有编码Cry3A055杀昆虫蛋白质的cry3A055基因即SEQ IDNO：59和编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因即SEQ ID NO：62，其中所述核酸分子含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4的互补序列的核苷酸序列。
2.MIR604转基因玉米植物的玉米植物细胞，所述MIR604转基因玉米植物含有编码Cry3A055杀昆虫蛋白质的cry3A055基因即SEQ IDNO：59和编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因即SEQ ID NO：62，所述玉米植物细胞含有在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中任一个的互补序列中列出的核苷酸序列。
3.根据权利要求2的玉米植物细胞，其中用限制性内切核酸酶KpnI消化植物的基因组DNA，在高度严格条件下使用cry3A055-特异性探针，产生单个cry3A055杂交条带，其中所述高度严格条件是：于50℃，在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于65℃在0.1×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠中洗涤。
4.权利要求3的玉米植物细胞，其中所述的探针含有在SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：59中列出的核苷酸序列。
5.根据权利要求2的玉米植物细胞，其中用限制性内切核酸酶KpnI消化植物的基因组DNA，在高度严格条件下使用pmi-特异性探针，产生单个pmi杂交条带，其中所述高度严格条件是：于50℃，在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并于65℃在0.1×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠中洗涤。
6.权利要求5的玉米植物细胞，其中探针含有在SEQ ID NO：62中列出的核苷酸序列。
7.源于含有编码Cry3A055杀昆虫蛋白质的cry3A055基因即SEQID NO：59和编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因即SEQ ID NO：62的MIR604转基因玉米植物的玉米植物、组织或种子的生物学样品，其中该样品含有是SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中该序列在样品中是能使用核酸扩增或核酸杂交方法检测的。
8.权利要求7的生物学样品，其中该样品选自玉米糖浆和玉米油。
9.权利要求7的生物学样品，其中该样品是玉米淀粉。
10.权利要求7的生物学样品，其中该样品是玉米粉或玉米面。
11.用于产生抗至少玉米根虫的玉米植物的方法，所述的方法包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交，其中所述的第一或第二亲本玉米植物包含含有编码Cry3A055杀昆虫蛋白质的cry3A055基因即SEQ ID NO：59和编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因即SEQ ID NO：62的MIR604转基因玉米植物的DNA，从而产生多个第一代子代植物；(b)选择抗至少玉米根虫侵染的第一代子代植物；(c)将第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；和(d)从第二代子代植物中选择抗至少玉米根虫侵染的植物；其中第二代子代植物含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
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