MXPA06009603A

MXPA06009603A - Evento de maiz mir

Info

Publication number: MXPA06009603A
Authority: MX
Inventors: Eric Chen; Henry-York Steiner; Moez Meghiji
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2006-11-20
Also published as: AR089141A2; ZA200606812B; KR101303110B1; US20050216970A1; US8884102B2; RU2006137474A; EP2281447A2; AR048190A1; NZ549466A; EP1737290A2; CN102260668A; US20080167456A1; UA94893C2; US7897748B2; MX273859B; CN1933724A; KR101268897B1; PT1737290E; PT2281447T; EP2289311A2

Abstract

Se describe un evento de maíz transgénico novedoso designado MIR604. La invención se refiere a secuencias de ADN de los constructos recombinantes insertados en el genoma del maíz y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de la inserción que resulta en el evento MIR604. La invención se refiere además a ensayos para detectar la presencia de las secuencias de ADN de MIR604, a plantas de maíz y semillas de maíz que comprenden el genotipo de MIR604 y a métodos para la producción de una planta de maíz al cruzar una planta de maíz que comprende el genotipo MIR604 consigo misma o con otra variedad de ma

Description

EVENTO DE MAÍZ MIR604 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente al campo de biología molecular de plantas, transformación de plantas, y reproducción de plantas. Más específicamente, la invención se relaciona a plantas de maíz transgénicas resistentes a insectos que comprenden un genotipo transgénico y a los métodos de detección de la presencia del ADN de la planta de maíz en una muestra y composiciones de esta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de plantas son un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas importantes del mundo. Alrededor de $8,000 millones de dólares se pierden cada año en los Estados Unidos solo debido a infestaciones de plagas no mamíferas que incluyen insectos. Las especies de gusanos de raíz de maíz se consideran las plagas de maíz más destructivas. Especies de plagas de gusanos de raíz importantes incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste; D. undecimpunctata howardi , el gusano de raíz de maíz del sur, y D. virigifera zeae, el gusano de raíz de maíz mexicano. El gusano de raíz de maíz se controla principalmente por aplicaciones intensivas de pesticidas químicos. Así se puede Ref: 175072 lograr un buen control del gusano de raíz de maíz, pero estos químicos algunas veces también pueden afectar organismos benéficos. Otro problema que resulta del amplio uso de pesticidas químicos es la aparición de variedades resistentes de insectos. Esto se ha mejorado parcialmente mediante varias prácticas de manejo de resistencia, pero existe una necesidad en aumento de estrategias de control de plagas alternativas. Una de tales alternativas incluye la expresión de genes externos que codifican proteínas insecticidas en plantas transgénicas. Esta propuesta ha proporcionado un medio eficiente de protección contra plagas de insectos seleccionadas, y se han comercializado plantas transgénicas que expresan 'toxinas insecticidas, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de insecticidas químicos. La expresión de genes externos en plantas puede ser influenciada por sus posiciones cro osomales, posiblemente debido a la estructura de cromatina o a la proximidad de elementos de regulación transcripcional cercanos al sitio de integración (Ver por ejemplo, Weising y colaboradores, 1988, "Foreign Genes in Plants", Ann. Rev. Genet. 22:421-477). Por lo tanto, es común producir cientos de eventos diferentes y separar por exclusión aquellos eventos para un evento único que tenga niveles y patrones de expresión de transgenes deseados para propósitos comerciales. Un evento que tiene niveles o patrones deseados de expresión de transgenes es útil para introgresión del transgen en otros antecedentes genéticos por cruza sexual usando métodos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruzas mantienen las características de expresión de transgen del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar la expresión del gen confiable en un número de variedades que están bien adaptadas a condiciones de crecimiento local. Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento particular con el propósito de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene un transgen de interés. Además, un método para la detección de un evento particular podría ser práctico para cumplir con regulaciones que requieren la aprobación de pre-mercado y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de maíz recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgen mediante cualquier método de detección de ácido nucleico bien conocido que incluye pero no se limita a amplificación térmica (reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) usando cebadores de polinucleótido o hibridización de ADN usando sondas de ácido nucleico. Comúnmente, por cuestión de simplicidad y uniformidad de reactivos y metodologías para uso en la detección de un constructo de ADN particular que se ha usado para transformar diversas variedades de plantas, estos métodos de detección generalmente se enfocan en elementos genéticos usados frecuentemente, por ejemplo, promotores, terminadores, y genes marcadores, porque para muchos constructos de ADN, la región de secuencia de codificación es intercambiable. Como un resultado, los métodos pueden no ser útiles para discriminar entre constructos que difieren solamente con referencia a la secuencia de codificación. Además, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aquellos producidos usando el mismo constructo de ADN a menos que la secuencia de ADN cromosomal adyacente al ADN heterólogo insertado ("ADN que flanquea") sea conocida. La presente invención incluye un evento de maíz transgénico resistente a insectos que ha incorporado en su genoma un gen cry3A055, descrito en la Publicación Internacional No. WO 03/019910, publicada en Marzo 6, 2003, la cual está incorporada en la presente por referencia, que codifica una toxina insecticida Cry3A055, útil en control de plagas de insectos especie Diabrotica . El evento de maíz transgénico también ha incorporado en su genoma un gen pmi , que codifica una enzima de isomerasa fosfomanosa (PMl, por sus siglas en inglés) , descrita en la Patente de EUA No. 5,767,378, la cual está incorporada por referencia, útil como un marcador seleccionable, el cual permite a la planta utilizar ma osa como una fuente de carbono. La presente invención además incluyen secuencias de ácido nucleico aisladas novedosas las cuales son únicas para el evento de maíz transgénico, útiles para identificación del evento de maíz transgénico y para detección de ácidos nucleicos para el evento de maíz transgénico en una muestra biológica, además de kits que comprenden - los reactivos necesarios para uso en la detección de estos ácidos nucleicos en una muestra biológica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se esboza para un evento de maíz transgénico, designado MIR604, que comprende un genotipo transgénico que comprende un gen cry3A055 y un gen pmi el cual confiere resistencia a insectos y la capacidad para utilizar mañosa como una fuente de carbono, respectivamente, al evento de maíz MIR604 y progenie del mismo. La invención también proporciona plantas de maíz transgénicas que comprenden el genotipo de la invención, semillas para plantas de maíz transgénicas que comprenden el genotipo de la invención, y los métodos para producción de una planta de maíz transgénica que comprende el genotipo de la invención por cruza de un maíz endogámico que comprende el genotipo de la invención con su propia u otra línea de maíz de un genotipo diferente. Las plantas de maíz transgénicas de la invención esencialmente pueden tener todas las características morfológicas y fisiológicas de la planta de maíz no transgénisa isogénica que corresponde además de aquellas conferidas en la planta de maíz por el genotipo novedoso de la invención. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de ácidos nucleicos del evento MIR604 con base en la secuencia de ADN de los casetes de expresión recombinantes insertados en el genoma de maíz que resultan en el evento MIR604 y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción. El evento MIR604 además puede estar caracterizado por niveles de expresión de análisis de proteínas Cry3A055 y PMl además por la evaluación de la eficacia contra el gusano de raíz de maíz. De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz de evento de maíz MIR604 y por lo menos 10 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz de evento de maíz MIR604. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con este aspecto puede comprender por lo menos 20 o por lo menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604 y por lo menos 20 o por lo menos 50 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido, que comprende por lo menos una secuencia de unión del evento MIR604 seleccionada del grupo que comprende de SEQ ID N0:1 y SEQ ID N0:2, y complementos de estas. Una secuencia de unión extiende la unión entre el ADN heterólogo que comprende los casetes de expresión insertados en el genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción y es diagnóstico para el vento MIR604. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia de desde alrededor de 11 hasta alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, y complementos de estos. De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, y complementos de estos . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un amplicón que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan los cebadores de secuencia de flanqueo para detectar el evento MIR604. Tales cebadores de secuencia de flanqueo comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1-801 como se establece en la SEQ ID NO: 3 (designadas arbitrariamente en la presente como la secuencia de flanqueo 5'), o los complementos de esta. En una modalidad de este aspecto los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, y complementos de estas. En otro aspecto de la invención, los cebadores de secuencia de flanqueo comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 507-1570 como se establece en la SEQ ID NO: 4 (designada arbitrariamente en la presente como la secuencia de flanqueo 3'), o los complementos de esta. En una modalidad de este aspecto los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 46, y complementos de estas . De acuerdo con otro- aspecto de la invención, se proporcionan los pares de cebadores que son útiles para amplificación de ácido nucleico, por ejemplo. Tales pares de cebadores comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos en longitud que están o son complementarios a una de las secuencias de flanqueo genómicas descritas anteriormente (SEQ ID NO: 3, ó SEQ ID NO: 4) y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de ADN heterólogo insertado en el genoma del evento MIR604. El segundo cebador preferiblemente comprende una secuencia de nucleótido la cual es o se complementa a la secuencia de inserto adyacente a la secuencia de ADN de flanqueo genómica como se establece en la SEQ ID NO: 3 de posición de nucleótido 802 a través de 1310 y en la SEQ ID NO : 4 de la posición de nucleótido 1 a través de 506. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan los métodos de detección de la presencia de ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica. Tales métodos comprenden: (a) el contacto de la muestra que comprende ADN con un par de cebadores que, cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz MIR604; produce un amplicón que es diagnóstico para el evento de maíz MIR604; (b) realización de una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esa manera el amplicón; y (c) detección del amplicón. En una modalidad de este aspecto, el amplicón comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, y complementos de estos. De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona métodos de detección de la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica. Tales métodos comprenden: (a) el contacto de la muestra que comprende ADN con una sonda que hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN genómico a partir del evento de maíz MIR604 y no hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN de una planta de maíz de control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridización de severidad alta; y (c) detección de hibridización de la sonda al ADN. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un kit para la detección de ácidos nucleicos del evento MIR604 en una muestra biológica. El kit incluye por lo menos una secuencia de ADN que comprende una longitud suficiente de polinucleótidos los cuales están o son complementarios a SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ó SEQ ID NO: 4, en donde las secuencias de ADN son útiles como cebadores o sondas que hibridizan a ADN aislado del evento MIR604, y las cuales, en la amplificación o hibridización a una secuencia de ácido nucleico en una muestra seguida por la detección del amplicón o hibridización de la secuencia objetivo, son diagnósticos de la presencia de secuencias de ácido nucleico del evento MIR604 en la muestra. El kit además incluye otros materiales necesarios para hacer posible métodos de hibridización o amplificación de ácido nucleico. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de detección de proteína de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica que comprende: (a) extracción de proteína de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604; (b) ensayo de la proteína extractada usando un método inmunológico que comprende anticuerpo específico para la proteína marcadora insecticida o seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detección del enlazamiento del anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable . En otro aspecto, la presente invención proporciona una muestra biológica derivada de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604, en donde la muestra comprende una secuencia de nucleótido la cual es o se complementa a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia es detectable en la muestra usando un método de amplificación o hibridización de ácido nucleico. En una modalidad de este aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste de harina de maíz, alimento de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz. En otro aspecto, la presente invención proporciona un extracto derivado de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604, que comprende una secuencia de nucleótido la cual es o se complementa a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. En una modalidad de este aspecto, la secuencia es detectable en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridización de ácido nucleico. En otra modalidad de este aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste de harina de maíz, alimento de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan las plantas y semillas de maíz que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención. De acuerdo con otro aspecto la presente invención proporciona un método para producción de una planta de maíz resistente a por lo menos infestación de gusano de raíz de maíz que comprende: (a) cruzamiento sexual de una primera planta de maíz precursora con una segunda planta de maíz precursora, en donde la primera o la segunda planta de maíz precursora comprende ADN de evento de maíz MIR604, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) selección de una planta de progenie de primera generación que es resistente a por lo menos infestación de gusano de raíz de maíz; (c) autofecundación de la planta de progenie de primera generación, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; (d) selección de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que por lo menos es resistente a infestación de gusano de raíz de maíz; en donde las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. De acuerdo con todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producción de semilla de maíz que comprende el cruzamiento de una primera planta de maíz precursora con una segunda planta de maíz precursora y cosecha de las semillas de maíz de primera generación resultantes, en donde la primera o segunda planta de maíz precursora es una planta de maíz endogámico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de semillas de maíz híbridas que comprenden los pasos de: (a) plantación de semillas de una primera línea de maíz endogámico de acuerdo con la invención y semillas de una segunda línea de maíz endogámico que tiene un genotipo diferente; (b) cultivo de plantas de maíz que resultan de la plantación hasta el momento del florecimiento; (c) emasculación de flores de plantas de maíz de las líneas maíz endogámico; (d) permitir que suceda la polinización de la otra línea endogámica, y (e) cosechar las semillas híbridas producidas de esta manera. Lo anterior y otros aspectos de la invención se volverán más palpables a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO SEQ ID NO: 1 es la unión de genoma-inserto 5'. SEQ ID NO: 2 es la unión de inserto-genoma 3'. SEQ ID NO: 3 es la secuencia de genoma + inserto 5'. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de inserto + genoma 3' . SEQ ID NO: 5 es genoma de maíz que flanquea 5 'para insertar. SEQ ID NO: 6 es genoma de maíz que flanquea 3 'para insertar. SEQ ID Nos: 7-15 son cebadores de secuencia que flanquean 5' útiles en la presente invención. SEQ ID Nos: 16-20 son cebadores de secuencia de promotor MTL útiles en la presente invención. SEQ ID Nos: 21-28 son cebadores de secuencia cry3A055 útiles en la presente invención.

SEQ ID Nos: 29-30 son cebadores de secuencia ZmUbilnt útiles en la presente invención. SEQ ID Nos: 31-37 son cebadores de secuencia pmi útiles en la presente invención. SEQ ID NO: 38 es cebador de secuencia NOS útil en la presente invención. SEQ ID Nos: 39-46 son cebadores de secuencia de flanqueo 3' útiles en la presente invención. SEQ ID Nos: 47-49 son cebadores y sondas TAQMAN de cry3A055. SEQ ID Nos: 50-52 son cebadores y sondas TAQMAN pmi . SEQ ID Nos: 53-55 son cebadores y sondas TAQMAN ZmADH. SEQ ID NO: 56 es una sonda MIR604 útil en la presente invención. SEQ ID NO: 57 es la secuencia para la región del límite derecho . SEQ ID NO: 58 es la secuencia del promotor MTL. SEQ ID NO: 59 es la secuencia del gen cry3A055. SEQ ID NO: 60 es la secuencia del terminador de NOS. SEQ ID NO: 61 es la secuencia del promotor ZmUblnt . SEQ ID NO: 62 es la secuencia del gen pmi . SEQ ID NO: 63 es la secuencia de la región del límite izquierdo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra un vector de expresión de planta designado pZM26. El mapa identifica el sitio de restricción Kpnl usado para' análisis de Southern. La Figura 2 es un mapa gráfico que ilustra la organización de los elementos que comprenden las secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas dentro del genoma de evento de maíz MIR604 y establece las posiciones relativas a las cuales la secuencia de ácido nucleico se ligan a secuencias de ADN genómico de maíz las cuales flanquean las terminaciones de las secuencias de ADN heterólogas insertadas. 1 = genoma de planta de flanqueo 5' (SEQ ID NO: 5); 2 = región de límite derecho (SEQ ID NO: 57); 3 = promotor MTL (SEQ ID NO: 58); 4 = gen cry3A055 (SEQ ID NO: 59); 5 = terminador NOS (SEQ ID NO: 60); 6 = promotor ZmUbINT (SEQ ID NO: 61); 7 = gen pmi (SEQ ID NO : 62); 8 = terminador NOS (SEQ ID NO: 60); 9 = región de límite izquierdo (SEQ ID NO: 63); y 10 = genoma de planta de flanqueo 3' (SEQ ID NO: 6) .

Definiciones Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a aguellos de experiencia ordinaria en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos usados en la presente están para ser entendidos de acuerdo con el uso convencional por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica relevante. Las definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger y colaboradores, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1994. Como se usa en la presente, el término "amplificado" significa la construcción de copias múltiples de una molécula de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la molécula de ácido nucleico que usan por lo menos una de las moléculas de ácido nucleico como una plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción de cadena de polimerización (PCR) , sistema de reacción de cadena de ligasa (LCR) , amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) , sistemas de Replicación Q-Beta, sistema de amplificación basada en transcripción (TAS) , y amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) . Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing y colaboradores, Ed. American Society for Micro biology, Washington, D. C. (1993) . El producto de amplificación se denomina un amplicón. Una "secuencia que codifica" es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARN tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNsn, ARN codificante o ARN no codificante. Preferiblemente el ARN se traslada luego en un organismo para producir una proteína. "Kit de detección" como se usa en la presente se refiere a un kit usado para detectar la presencia o ausencia de ADN de plantas de MIR604 en una muestra que comprende sondas y cebadores de ácido nucleico de la presente invención, los cuales hibridizan específicamente bajo condiciones de severidad alta para una secuencia de ADN objetivo, y otros materiales necesarios para hacer posibles los métodos de hibridización o amplificación de ácido nucleico. Como se usa en la presente el término "evento" transgénico se refiere a una planta recombinante producida por transformación y regeneración de una célula de planta única con ADN heterólogo, por ejemplo, un cásete de expresión que incluye un gen de interés . El término "evento" se refiere al transformante original y/o progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. El término "evento" también se refiere a progenie producida por un cruce sexual entre el transformante y otra línea de maíz. Aún después de repetir el cruce de retroceso a un precursor recurrente, el ADN insertado y el ADN de flanqueo del precursor transformado está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromosomal. Normalmente, la transformación de tejido de planta produce eventos múltiples, cada uno de los cuales representan inserción de un constructo de ADN en una ubicación diferente en el genoma de una célula de planta. Con base en la expresión del transgen u otras características deseables, se selecciona un evento particular. Así, "evento MIR604", "MIR604" o "MIR604 evento" como se usan en la presente, significan el transformante de MIR604 original y/o progenie del transformante MIR604. "Cásete de expresión" como se usa en la presente significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótido particular en una célula hospedera apropiada, que comprende un promotor ligado operablemente a la secuencia del nucleótido de interés el cual se liga operablemente a señales de terminación. También comprende comúnmente secuencias requeridas para traducción propia de la secuencia de nucleótido. El cásete de expresión también puede comprender secuencias no necesarias en la expresión directa de una secuencia de nucleótido de interés pero las cuales están presentes debido a sitios de restricción convenientes para remoción del cásete de un vector de expresión. El cásete de expresión que comprende la secuencia de nucleótido de interés puede ser quimérico, significando que por lo menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a por lo menos uno de sus otros componentes . El cásete de expresión también puede ser uno que está ocurriendo naturalmente pero se ha obtenido en una forma recombinante útil para expresión heteróloga. Comúnmente, sin embargo, el cásete de expresión es heterólogo con respecto al hospedero, esto es, la secuencia de ácido nucleico particular del cásete de expresión no ocurre naturalmente en la célula hospedera y debe haber sido introducida dentro de la célula hospedera o en un antecesor de la célula hospedera mediante un proceso de transformación conocido en la técnica. La expresión de la secuencia de nucleótido en el cásete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solamente cuando la célula hospedera se expone a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido particular, u órgano, o etapa del desarrollo. Un cásete de expresión, . o fragmento de este, también puede ser referido como "secuencia insertada" o "secuencia de inserción" cuando se transforma en una planta. Un "gen" es una región definida que se localiza dentro de un genoma y que, además de la secuencia de ácido nucleico de codificación antes mencionada, comprende otras secuencias de ácido nucleico reguladoras primarias responsables del control de la expresión, esto es por decir la transcripción y traducción de la porción de codificación. Un gen también puede comprender otras secuencias no traducidas 5' y 3' y secuencias de terminación. Más elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones. "Gen de interés" se refiere a cualquier gen el cual, cuando se transfiere a una planta, confiere en la planta una característica deseada tal como resistencia antibiótica, resistencia a virus, resistencia a insecto, resistencia a enfermedad, o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicida, valor nutrimental mejorado, desempeño mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El "gen de interés" también puede ser uno que se transfiere a plantas para la producción de enzimas o metabolitos de valor comercial en la planta. "Genotipo" como se usa en la presente es el material genético heredado de plantas de maíz precursoras de las cuales no todas necesariamente están expresadas en las plantas de maíz descendientes. El genotipo MIR604 se refiere al material genético heterólogo transformado en el genoma de una planta además del material genético que flanquea la secuencia insertada. Una secuencia de ácido nucleico "heteróloga" es una secuencia de ácido nucleico no asociada naturalmente con una célula hospedadora en la cual se introduce, incluyendo copias múltiples que ocurren no naturalmente de una secuencia de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Una secuencia de ácido nucleico "homologa" es una secuencia de ácido nucleico asociada naturalmente con una célula hospedera dentro de la cual se introduce esta. "Ligado operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico único tal que la función de uno afecta la función del otro. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente con una secuencia de codificación o ARN funcional cuando esta es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia de codificación o ARN funcional (esto es, que la secuencia de codificación o ARN funcional está bajo el control transcripcional del promotor) . La codificación de secuencias en orientación de codificación y no codificación se puede ligar operablemente a secuencias reguladoras. "Cebadores" como se usa en la presente son ácidos nucleicos aislados que son combinados en sus pares de bases para una hebra de ADN objetivo complementaria mediante hibridización de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN objetivo, luego se extiende a lo largo de la hebra de ADN objetivo mediante una polimerasa, tal como polimerasa de ADN. Los pares o conjuntos de cebador se pueden usar para amplificación de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico convencionales. Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se acopla una etiqueta detectable convencional o molécula reportera, tales como un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. Una sonda tal es complementaria a una hebra de un ácido nucleico objetivo, en el caso de la invención presente, a una hebra de ADN genómico de evento de maíz, MIR604. El ADN genómico de MIR604 puede ser de una planta de maíz o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solamente ácidos desoxiribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otras materiales de sonda que enlazan específicamente a una secuencia de ADN objetivo y se pueden usar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo . Los cebadores y sondas generalmente tienen entre 10 y 15 nucleótidos o más de longitud, los cebadores y sondas también pueden ser de por lo menos 20 nucleótidos o más de longitud, o por lo menos 25 nucleótidos o más, o por lo menos 30 nucleótidos o más de longitud. Tales cebadores y sondas se hibridizan específicamente a una secuencia objetivo bajo condiciones de hibridización de severidad alta. Los cebadores y sondas de acuerdo con la presente invención pueden tener una complementariedad de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque las sondas difieren de la secuencia objetivo y la cual retiene la capacidad para hibridizar a secuencias objetivo se pueden diseñar por métodos convencionales.

"Condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" incluyen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará a su secuencia objetivo, a un grado mayor detectable que a otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia objetivo y diferirán dependiendo de la estructura del polinucleótido. Mediante el control de la severidad de las condiciones de hibridización y/o lavado, las secuencias objetivo se pueden identificar las cuales son 100% complementarías a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir alguna coincidencia en las secuencias tal que los grados menores de semejanza son detectados (sondeo heterólogo) . Las secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization wi th Nucleic acid probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier: New York; y Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y colaboradores, Eds., Greene Publishing and Wiley- Intrescience : New York (1995), y también Sambrook y colaboradores, (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual (5th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .

La especificidad comúnmente es la función de lavados post-hibridización, los factores críticos que son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Generalmente, las condiciones de hibridización y lavado de severidad alta se seleccionan para ser alrededor de 5°C menor que el punto de fusión térmico ™ para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda coincidida perfectamente. Comúnmente, bajo condiciones de severidad alta una sonda hibridizará a su subsecuencia objetivo, pero no otras secuencias. Un ejemplo de condiciones de hibridización de severidad alta para hibridización de ácidos nucleicos complementarios los cuales tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una técnica Southern blot o Northern blot es formamida 50% con 1 mg de heparina a 42 °C, con la hibridización llevándose a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de severidad muy alta es NaCl 0.15M a 72°C por alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado de severidad alta es un lavado SSC 0.2x a 65°C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para una descripción de solución amortiguadora SSC) . Las condiciones de hibridización ejemplares para la presente invención incluyen hibridización en SDS 7%, NaP04 0.25 M pH 7.2 a 67°C durante la noche, seguido por dos lavados en SDS 5%, NaP04 0.20 M pH 7.2 a 65 °C por 30 minutos cada lavado y dos lavados en SDS 1%, NaP04 0.20 M pH 7.2 a 65 °C por 30 minutos cada lavado. Un lavado de severidad media ejemplar para uno doble, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es lx SSC a 45°C por 15 minutos. Un lavado de severidad baja ejemplar para uno doble, por ejemplo, más que 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40 °C por 15 minutos. Para sondas de alrededor de 10 hasta 50 nucleótidos, las condiciones de severidad alta comúnmente involucran concentraciones de sal de menos que alrededor de ion de Na 1.0 M, comúnmente alrededor de concentración de ion de Na de 0.01 hasta 1.0 M (u otras sales) a pH de 7.0 hasta 8.3, y la temperatura comúnmente es por lo menos alrededor de 30 °C. Las condiciones de severidad alta también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) que aquella observado para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridización particular indica la detección de una hibridización específica. Los ácidos nucleicos que no hibridizan a otros bajo condiciones de severidad alta son todavía sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. Los siguientes son conjuntos ejemplares de condiciones de hibridización/lavado que se pueden usar para hibridizar secuencias de nucleótido que son sustancialmente idénticas a secuencias de nucleótido de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótido de referencia preferiblemente hibridiza a la secuencia de nucleótido de referencia en sulfato de dodecilo de sodio 7% (SDS) , NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en SSC 2X, SDS 1% a 50 °C, más deseablemente en sulfato de dodecilo de sodio 7% (SDS) , NaP04 0.5 M, EDTA lmM a 50 °C con lavado en SSC IX, SDS 0.1% a 50 °C, más deseablemente hasta en sulfato de dodecilo de sodio 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA ImM a 50°C con lavado en SSC 0.5X, SDS 0.1% a 50 °C, preferiblemente en sulfato de dodecilo de sodio 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA lmM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS 0.1% a 50 °C, más preferiblemente en sulfato de dodecilo de sodio 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA lmM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS 0.1% a 65 °C. Las secuencias de la presente invención se pueden detectar usando todas las condiciones anteriores. Para los propósitos de definición de la invención, se usan las condiciones de severidad alta. "Transformación" es un proceso para introducción de un ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo. En particular, "transformación" significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés . "Transformado/transgénico/recombinante" se refiere a un organismo hospedero tal como una bacteria o una planta en la cual una molécula de ácido nucleico heteróloga se ha introducido. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada establemente dentro del genoma del hospedero o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosomal . Así una molécula extracromosomal puede ser de autorreplicación. Las células, tejidos o plantas transformadas se entiende que abarcan no solamente el producto terminado de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un hospedero "no transformado", "no transgénico", o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo, una bacteria o planta, la cual no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga. Como se usa en la presente, "transgénico" se refiere a una planta, célula de planta, o multitud de células de planta estructuradas o no estructuradas que tienen integrado, vía técnicas bien conocidas de manipulación genética e inserción de gen, una secuencia de un ácido nucleico que representa un gen de interés dentro del genoma de la planta, y comúnmente dentro de un cromosoma de un núcleo de célula mitocondria u otro organelo que contiene cromosomas, en una ubicación del cromosoma diferente, o en un número de copias mayor que, aquel presente normalmente en la planta nativa o célula de planta. Las plantas transgénicas resultan de la manipulación e inserción de las secuencias de ácido nucleico, como opuesto a mutaciones que ocurren naturalmente, para producir una planta que ocurre no naturalmente o una planta con un genotipo que ocurre no naturalmente. Las técnicas para transformación de plantas y células de planta son bien conocidas en la técnica y pueden comprender por ejemplo, electroporación, icroinyección, transformación mediada por agrobacterias, y transformación balística. La nomenclatura de bases de ADN y aminoácidos como se establece en 37 C. F. R. § 1.822 se usa en la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a una línea mejorada genéticamente de maíz que produce la proteína de control de insectos, Cry3A055, y una enzima de isomerasa de fosfomanosa (PMl) que permite a la planta utilizar mañosa como una fuente de carbono. La invención particularmente se esboza para un evento de maíz transgénico designado MIR604 que comprende un genotipo novedoso, además de las composiciones y métodos para detección de ácidos nucleicos de este evento en una muestra biológica. La invención además se esboza para plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604, para semillas transgénicas de las plantas de maíz, y para métodos para producción de una planta de maíz que comprende el genotipo MIR604 por cruzamiento de un maíz endogámico que comprende el genotipo MIR604 con él mismo u otra línea de maíz. Las plantas de maíz que comprendeN el genotipo MIR604 de la invención son útiles en el control de plagas de insectos coleópteros que incluyen Dia rotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste, D . virgif ra zeae, el gusano de raíz de maíz mexicano, y D. longicornis barberi , el gusano de raíz de maíz del norte. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604 de la invención también son capaces de utilizar mañosa como una fuente de carbono . En una modalidad, la presente invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que comprende por lo menos 10 o más (por ejemplo, 15, 20, 25, ó 50) nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de planta de maíz del evento de maíz MIR604 y por lo menos 10 ó más (por ejemplo, 15, 20, 25 ó 50) nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604. También están incluidas las secuencias de nucleótido que comprenden 10 o más nucleótidos de secuencia de inserto contigua del evento MIR604 y por lo menos un nucleótido de ADN de flanqueo del evento MIR604 adyacente a la secuencia de inserto. Tales secuencias de nucleótido son diagnósticos para evento MIR604. La amplificación de ácido nucleico de ADN genómico del evento MIR604 produce un amplicón que comprende tales secuencias de nucleótido de diagnóstico. En otra modalidad, la invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido, que comprende por lo menos una secuencia de unión del evento MIR604 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y complementos de estas, en donde una secuencia de unión abarca la unión entre un cásete de expresión heterólogo insertado dentro del genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción y es diagnóstico para el evento. En otra modalidad, la presente invención abarca un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia de desde alrededor de 11 hasta alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y los complementos de estas. En otra modalidad, la invención abarca una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, y complementos de estas.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona un amplicón que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada' del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, y los complementos de estas . En otra modalidad, la presente invención abarca los cebadores de secuencia de flanqueo para detección del evento MIR 604. Tales cebadores de secuencia de flanqueo comprenden una secuencia de ácido nucleico aislado que comprende por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de nucleótidos 1-801 de SEQ ID NO: 3 (designada arbitrariamente en la presente como la secuencia de flanqueo 5'), o los complementos de esta. En un aspecto de esta modalidad los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y complementos de estas . En otra modalidad, la presente invención abarca cebadores de secuencia de flanqueo que comprenden por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 507-1570 de SEQ ID NO: 4 (designada arbitrariamente en la presente como la secuencia de flanqueo 3'), o los complementos de esta. En un aspecto de esta modalidad los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, y complementos de estas. En todavía otra modalidad, la presente invención, abarca un par de cebadores de polinucleótido que comprenden un primer cebador de polinucleótido y un segundo cebador de polinucleótido los cuales funcionan juntos en la presencia de una plantilla de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz MIR604, en donde la primera secuencia de cebador es o se complementa a un genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604, y la segunda secuencia de cebador de polinucleótido es o se complementa a la secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604. En un aspecto de esta modalidad el primer cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de posición 1-801 de SEQ ID NO: 3 o complementos de esta. En un primer aspecto más de esta modalidad, el prior cebador de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, o los complementos de estas. En otro aspecto de esta modalidad primer cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de posición 507-1570 de SEQ ID NO: 4 o complementos de esta. En un aspecto de esta modalidad el primer cebador de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, o los complementos de estas. En todavía otro aspecto de esta modalidad, el segundo cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 63, o los complementos de estas . En todavía un aspecto más de esta modalidad, el segundo cebador de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 16 hasta SEQ ID NO: 38, o los complementos de estas. En otro aspecto de esta modalidad, el primer cebador de polinucleótido, el cual se establece en SEQ ID NO: 15, y el segundo cebador de polinucleótido el cual se establece en SEQ ID NO: 28, funcionan juntos en la presencia de una plantilla de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4. En otro aspecto de esta modalidad, el primer cebador de polinucleótido, el cual se establece en SEQ ID NO: 45, y el segundo cebador de polinucleótido el cual se establece en SEQ ID NO: 27, funcionan juntos en la presencia de una plantilla de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4. Por supuesto, es bien conocido dentro de la experiencia en la técnica obtener secuencia adicional más externa en la secuencia de genoma que flanquea cualquier terminación de las secuencias de ADN heterólogas insertadas para uso como una secuencia de cebador que se puede usar en los pares de cebadores para amplificación de las secuencias que son diagnósticas para el evento MIR604. Para los propósitos de esta descripción, la frase "más externa en la secuencia de genoma que flanquea cualquier terminación de las secuencias de ADN heterólogas insertadas" se refiere específicamente a un movimiento secuencial hacia afuera desde las terminaciones de las secuencias de ADN heterólogas insertadas, los puntos a los cuales las secuencias de ADN insertadas son adyacentes a la secuencia de ADN genómico nativo, y externo en el ADN genómico del cromosoma particular en el cual las secuencias de ADN heterólogas se insertan. Preferiblemente, una secuencia de cebador que corresponde, o es complementaria a, una parte de la secuencia de inserto debe cebar la extensión transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Consecuentemente, una secuencia de cebador que corresponde o es complementaria a una parte de la secuencia de flanqueo genómica debe cebar la extensión transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Una primera secuencia puede ser, o se puede complementar a una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del cromosoma de la planta, o una secuencia de flanqueo genómica. Un experto en la técnica podría reconocer fácilmente el beneficio de si una secuencia de cebador podría necesitar ser, o podría necesitar estar complementada a, la secuencia como se establece dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada o como se establece en SEQ ID NO : 3 ó SEQ ID NO: 4 dependiendo de la naturaleza del producto deseado para ser obtenido a través del uso del conjunto anidado de cebadores proyectados para uso en la amplificación de una secuencia de flanqueo particular que contiene la unión entre la secuencia de ADN genómico y la secuencia de ADN heteróloga insertada. En otra modalidad, la presente invención abarca un método de detección de la presencia de ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en donde el método comprende: (a) el contacto de la muestra que comprende ADN con una sonda que hibridiza bajo condiciones de severidad altas con ADN genómico de evento de maíz MIR604 y no hibridiza bajo condiciones de severidad altas con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridización de severidad alta; y (c) detección de la hibridización de la sonda al ADN. En un aspecto de esta modalidad el amplicón comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, y complementos de estas . En otra modalidad, la presente invención abarca un método de detección de la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en donde el método comprende: (a) contacto de la muestra que comprende ADN con una sonda que hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y no hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridización de severidad alta; y (c) detección de la hibridización de la sonda al ADN. La detección puede ser por cualquier medio bien conocido en la técnica que incluye pero no se limita a fluorescente, quimioluminiscente, radiológico, inmunológico, u otra manera. En el caso en el cual la hibridización se proyecta para ser usada como un medio para amplificación de una secuencia particular para producir un amplicón el cual es diagnóstico para el evento de maíz MIR604, la producción y detección del amplicón, mediante cualquier medio bien conocido en la técnica, se proyecta para ser indicativo de la hibridización proyectada para la secuencia objetivo donde una sonda o cebador se utiliza, o secuencias donde se utilizan dos o más sondas o cebadores. El término "muestra biológica" se pretende ' que comprenda una muestra que contiene o es sospechosa de contener un ácido nucleico que comprende desde entre cinco y diez nucleótidos de cualquier lado del punto en el cual uno de los otros de las dos terminaciones terminales de la secuencia de ADN heteróloga insertada contacta la secuencia de ADN genómica dentro del cromosoma en el cual la secuencia de ADN heteróloga fue insertada, en la presente también se conoce como las secuencias de unión. Además, la secuencia de unión comprende como mínimo dos nucleótidos: aquellos que son el primer - nucleótido dentro del ADN genómico de flanqueo adyacente y ligado covalentemente al primer nucleótido dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada. En todavía otra modalidad, la presente invención abarca un kit para detección de la presencia de ácidos nucleicos MIR604 en una muestra biológica, en donde el kit comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4, que funciona como un cebador o sonda de ADN específica para el evento MIR604, y otros materiales necesarios para hacer posible la hibridización o amplificación de ácido nucleico. Se puede usar una variedad de métodos de detección que incluyen TAQMAN (Perkin Elmer) , amplificación térmica, reacción de cadena de ligasa, hibridización de southern, métodos de ELISA, y métodos de detección colorimétricos y fluorescentes. En particular la invención presente proporciona kits para detección de la presencia de la secuencia objetivo, esto es, por lo menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz en MIR604, en una muestra que contiene ácido nucleico genómico de MIR604. El kit se compone de por lo menos un polinucleótido capaz de enlazar al sitio objetivo o sustancialmente adyacente al sitio objetivo y por lo menos un medio para detección del enlazamiento del polinucleótido al sitio objetivo. El medio de detección puede ser fluorescente, quimioluminiscente, colorimétrico, o isotópico y puede estar acoplado por lo menos con métodos inmunológicos para detectar el enlazamiento. También se imagina un kit el cual pueda detectar la presencia del sitio objetivo en una muestra, esto es, por lo menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz de MIR604, tomando ventaja de dos o más secuencias de polinucleótido las cuales juntas son capaces de enlazar a secuencias de nucleótido adyacentes o dentro de alrededor de 100 pares base, o dentro de alrededor de 200 pares base, o dentro de alrededor de 500 pares base o dentro de alrededor de 1000 pares base de la secuencia objetivo y la cual se puede extender hacia otro para formar un amplicón el cual contiene por lo menos el sitio objetivo. En otra modalidad, la presente invención abarca un método para detección de proteína de evento MIR604 en una muestra biológica, el método comprende: (a) proteína de extracción de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604; (b) ensayo de la proteína extraída que usa un método inmunológico que comprende el anticuerpo específico para la proteína marcadora insecticida o seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detección del enlazamiento del anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable . Otra modalidad de la presente invención abarca una planta de maíz, o partes de la misma, que comprende en genotipo del evento transgénico MIR604, en donde el genotipo comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , o los complementos de las mismas. En un aspecto de esta modalidad, la planta de maíz es de las líneas de maíz endogámico CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, H8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT, y 2070BT. Alguien experto en la técnica reconocerá sin embargo, que el genotipo MIR604 puede hacer introgresión en cualquier variedad de planta que pueda procrearse con maíz, incluyendo especies de maíz, incluyendo especies de maíz silvestre, de esta manera las líneas endogámicas preferidas de esta modalidad no son un medio para limitarse. En otra modalidad, en la presente invención abarca una planta de maíz que comprende al menos una primera y una segunda secuencia de ADN ligada en conjunto para formar una secuencia de nucleótido contigua, en donde la primera secuencia de ADN esta dentro de una secuencia de unión y comprende al menos alrededor de 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste de nucleótidos 792-811 de SEQ ID NO:3; nucleótidos 497-516 de SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO : 6; y complementos de los mismos, en donde la segunda secuencia de ADN esta dentro de la secuencia de ADN de inserto heteróloga seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y complemento de las mismas; y en donde la primera y la segunda secuencias de ADN son útiles como cebadores o sondas de nucleótidos para detectar la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica. En un aspecto de esta modalidad, los cebadores nucleótidos se usan en el método de amplificación de ADN para amplificar a la secuencia de ADN efectivo del ADN de plantilla extraído de la planta de maíz y la planta de maíz se identifica de otras plantas de maíz por la producción del amplicón correspondiente a la secuencia de ADN que comprende SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO : 2 Las plantas de maíz de la invención pueden además caracterizarse en que distinguen el ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpnl resultando en una banda hibridizada cry3 A055 sencilla usando una sonda específica para cry3A055 bajo condiciones de alta severidad. En la presente se ejemplifica la sonda cry3A055 que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 56 ó SEQ ID 59.

Las plantas de maíz de la invención pueden además caracterizarse en que al digerir el ADN geonómico de la planta con la endonucleasa de restricción CPU resulta en una banda hibridizable pmi sencilla usando una sonda específica de pmi bajo condiciones de alta severidad. En la presente se ejemplifica una sonda pmi que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 62.

En una modalidad, la presente invención proporciona una planta de maíz, en donde el genotipo MIR604 confiere sobre la planta de maíz resistencia a los insectos o la capacidad para utilizar mañosas. En un aspecto de esta modalidad, la resistencia que confiere el genotipo a los insectos sobre la planta de maíz comprende el gen cry3A055. En otro aspecto de esta modalidad, el genotipo que confiere sobre la planta de maíz la capacidad de utilizar mañosa comprende un gen pmi. En una modalidad, la presente invención proporciona una muestra biológica derivada de la planta de maíz de evento MIR604, tejido, o semilla, en donde la muestra comprende una secuencia de nucleótido que es o es complementariamente a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia se detecta en la muestra usando un método de amplificación de ácidos nucleico o hibridación de ácido nucleico. En un aspecto de esta modalidad, las muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados totalmente o en parte para contener productos de maíz. En otra modalidad, la presente invención proporciona un extracto derivado de una planta de maíz de evento MIR604, tejido, o semilla, que comprende la secuencia de nucleótido que es o es complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. En un aspecto de esta modalidad, la secuencia se detecta en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico. En otro aspecto de esta modalidad, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales manufacturados completamente o en parte para contener productos de maíz. Aún en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una planta de maíz resistente a al menos una infestación de gusanos de raíz de maíz que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz precursora con una segunda planta de maíz precursora, en donde la primera o segunda planta de maíz precursora comprende el ADN del evento de maíz MIR604, por ello produciendo la pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar la planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación de gusanos de raíz del maíz; (c) individualizar la planta de progenie de primera generación, por ello produciendo una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; y (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que es al menos resistente a la infestación de gusanos de raíz del maíz; en donde las plantas de progenie de segunda generación comprenden la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir semillas de maíz híbridas que comprenden: (a) plantar semillas de una primera línea de maíz endogámica que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO : 4, y sembrar una segunda línea endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz que resultan del plantado hasta el momento de florecer; (c) emascular las flores de las plantas de una de las líneas endogámicas de maíz; (d) cruzar sexualmente las dos diferentes líneas endogámicas una con la otra; y (e) cosechar la semilla híbrida producida por ello. En un aspecto de esta modalidad, la primera línea de maíz endogámica proporciona los precursores femeninos. En otro aspecto de esta modalidad, la primera línea de maíz endogámica proporciona los precursores masculinos. La presente invención también abarca la semilla híbrida producida por el método divisado y las plantas híbridas crecen de la semilla. Alguien experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico de la presente invención puede reintegrarse sembrando en otras líneas de maíz que comprende en diferentes genotipos transgénicos. Por ejemplo, el maíz endogámico comprende el genotipo transgénico de la presente invención puede cruzarse con el maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico del evento Btll resistente a lepidópteros, que se conoce en la técnica, produciendo de esta manera semillas de maíz que comprenden, tanto el genotipo transgénico de la invención, como el genotipo transgénico Btll. Los ejemplos de otros eventos transgénicos que pueden cruzarse con un endogámico de la presente invención incluyen, los eventos tolerantes al glifosato GA21 y NK603, el evento MON802 resistente al insecto lepidópteros/tolerante al glifosato, el evento DBT418 resistente al lepidópteros, el evento DAS-06275-8, resistente al lepidópteros, el evento MS3 estéril macho, el evento B16 tolerante a la fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente al insecto lepidópteros, los eventos T14 y T25 tolerantes a fosfinotricina, el evento 176 resistente al insecto de lepidópteros, y el evento MON863 resistente a coleópteros, todos los cuales se conocen en la técnica. Se reconocerá además que otras combinaciones pueden hacerse con el genotipo transgénico de la invención y de esta manera estos ejemplos no deberán apreciarse como limitantes. Alguien experto en al técnica también reconocerá que la semilla de maíz transgénico que comprende el genotipo transgénico de la presente invención puede tratarse con varios químicos que tratan las semillas, incluyendo insecticidas, para aumentar o hacer sinergia, en la actividad insecticida de la proteína Cry3A055. Por ejemplo, la semilla de maíz transgénica de la presente invención puede tratarse con el insecticida comercial Cruiser®. Tal combinación puede usarse para incrementar el espectro de actividad y para incrementar la eficacia de la proteína y el químico expresado .

Reproducción o Cruza El genotipo transgénico de la presente invención puede hacer introgresión en cualquier maíz endogámico o híbrido que usa las técnicas de reproducción reconocidas en la técnica. El objetivo de la reproducción de plantas es combinar en una variedad o híbrido único varios rasgos característicos. Para cultivos de campo, estas características pueden incluir resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo para maduración del cultivo, mayor rendimiento, y calidad agronómica mejorada. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, es importante la uniformidad de características de la planta tales como germinación y establecimiento en reposo, velocidad de crecimiento, madurez, y altura de la planta y la mazorca. Los cultivos de campo son cultivados a través de técnicas que toman ventaja del método de polinización de planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma u otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza cruzadamente si el polen proviene de una flor en una planta diferente. Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por tipo para muchas generaciones se vuelven homogéneas en casi todas las ubicaciones del cromosoma del gen y producen una población uniforme de progenie de reproducción verdadera. Una cruza entre dos líneas homocigóticas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigóticas para muchas ubicaciones del cromosoma del gen. Una cruza de dos plantas, cada una heterocigótica en un número de ubicaciones del cromosoma del gen, producirá una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no serán uniformes. El maíz puede ser cruzado mediante ambas técnicas, la de autopolinización y polinización cruzada. El maíz tiene flores macho y hembra separadas en la misma planta, localizadas sobre la borla y la mazorca, respectivamente. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento hace volar el polen desde las borlas hasta las sedas que sobresalen de las puntas de las mazorcas . Un método confiable de control de la fertilidad del macho en plantas ofrece la oportunidad para reproducción de planta mejorada. Esto es especialmente cierto para desarrollo de híbridos de maíz, los cuales dependen de algún tipo de sistema de esterilidad del macho. Existen varias opcional para controlar la fertilidad masculina disponible para los cultivadores, tales como; emasculación (o retiro de espiguillas) manual o mecánica, esterilidad masculina citoplásmica, esterilidad masculina genética, gametocidas y similares . La semilla de maíz híbrido comúnmente se produce por un sistema de esterilidad masculina que incorpora el retiro de espiguillas manual o mecánico. Las varas alternas de dos maíces endogámicos se plantan en un campo y las borlas que portan el polen se remueven de uno de los endogámicos (femenino) . Proporcionando esto existe suficiente aislamiento de fuentes de polen de maíz externo, las mazorcas del endogámico con el retiro de espiguillas serán fertilizadas solamente desde el otro endogámico (masculino) , y la semilla que resulta es por lo tanto híbrida y formará plantas híbridas . El proceso de retiro de espiguillas laborioso, y ocasionalmente no confiable, puede ser evitado mediante el uso de uno de muchos métodos de conferir esterilidad masculina genética en la técnica, cada uno con sus propios beneficios y desventajas. Estos métodos usan una variedad de planteamientos tales como suministrar en la planta un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor específica de tejido macho o un sistema no codificante en el cual un gen crítico para fertilidad se identifica y un no codificante para ese gen se inserta en la planta (ver: Fabinjanski, y colaboradores, EPO 89/3010153.8 publicación no. 329,308 y solicitud de PCT No. PCT/CA90/00037 publicada Desarrollo de líneas de' Maíz endogámico. El uso de endogámicos estériles masculinos es, sin embargo, un factor en la producción de híbridos de maíz. Las técnicas de reproducción de planta conocidas en el arte y usadas en un programa de reproducción de planta de maíz incluyen, pero no se limita a, selección recurrente, retrocruzamiento, reproducción de linaje, selección mejorada de polimorfismo de longitud de restricción, selección mejorada de marcador genético y transformación. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigóticas, la cruza de estas líneas, y la evaluación de las cruzas. Los métodos de reproducción de linaje y reproducción de selección recurrente se usan para desarrollar líneas endogámicas de poblaciones de reproducción. Los programas de reproducción de planta de maíz combinan los antecedentes genéticos de dos o más líneas endogámicas u otras diferentes fuentes de germoplasma en acumulados de reproducción de los cuales las líneas endogámicas nuevas se desarrollan por autofecundación y selección de fenotipos deseados. Los endogámicos nuevos se cruzan con otras líneas endogámicas y los híbridos de estas cruzas se evalúan para determinar cuál de ellos tiene potencial comercial . La reproducción de planta y el desarrollo de híbridos, como se practica en un programa de reproducción de planta de maíz, son procesos caros y consumen tiempo. La reproducción de linaje inicia con la cruza de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables que se carecen en el otro o la cual complementa a la otra. Si los dos precursores originales no proporcionan todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. En el método de linaje, las plantas superiores son autofecundadas y seleccionadas en generaciones sucesivas. En las generaciones que suceden la condición heterocigótica da la forma para líneas homogéneas como un resultado de la autopolinización y la selección. Comúnmente en el método de reproducción de linaje cinco o más generaciones de autofecundación y selección se practican: Fx -> F2; F2 -> F3; F3 -> F4; F -^ F5; etc. La reproducción de selección recurrente, retrocruzamiento por ejemplo, se puede usar para mejorar una línea endogámica y un híbrido que se produce usando aquellos endogámico. El retrocruzamiento se puede usar para transferir una característica deseable específica de un endogámico o fuente a un endogámico que carece de esa característica. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante primero cruzamiento de un endogámico superior (precursor recurrente) a un endogámico donador (precursor no recurrente) , que porta el o los genes apropiados para la característica en cuestión. La progenie de esta cruza se aparea luego nuevamente con el precursor recurrente superior seguido por selección en la progenie resultante para la característica deseada a ser transferida del precursor no recurrente . Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento con selección de la característica deseada, la progenie será homogénea para las ubicaciones del cromosoma que controlan la característica que se transfiere, pero será como el precursor superior para esencialmente todos los otros genes . La última generación de retrocruzamiento es luego autofecundada para dar progenie de reproducción pura para el o los genes que se transfieren. Un híbrido desarrollado de endogámico que contienen el o los genes transferidos es esencialmente el mismo como un híbrido desarrollado de los mismos endogámicos sin el o los genes transferidos . Las líneas endogámicas de clase superior, que son, líneas endogámicas homocigóticas de reproducción pura, también se pueden usar como materiales de inicio para poblaciones de reproducción o fuentes de las cuales se desarrollan otras líneas endogámicas. Estas líneas endogámicas de las líneas endogámicas de clase superior pueden desarrollarse usando los métodos de reproducción de linaje y de reproducción de selección recurrente descritos anteriormente. Como un ejemplo, cuando la reproducción de retrocruzamiento se usa para crear estas líneas derivadas en un programa de reproducción de planta de maíz, los endogámico de clase superior se pueden usar como una línea madre o material de inicio o población de fuente y puede servir ya sea como el donador o el precursor recurrente .

Desarrollo de Híbridos de Maíz. Una cruza única de híbrido de maíz resulta de la cruza de dos líneas endogámicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie de híbrido de la primera generación se designa Fx. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de reproducción de planta de maíz, solamente las plantas de híbrido Fx se enfermaron. Los híbridos Fx preferidos son más energéticos que sus precursores endogámicos. Esta energía de híbrido, o heterosis, se puede manifestar en muchas características poligénicas, que incluyen crecimiento vegetativo aumentado y rendimiento aumentado. El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz involucra tres etapas: (1) la selección de plantas de varios acumulados de germoplasma para cruzas de reproducción inicial; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas de las cruzas de reproducción para varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas, las cuales, aunque diferentes una de otra, cultiva de verdad y son altamente uniformes; y (3) la cruza de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (Fi) . Durante el proceso de reproducción en maíz, la energía de las líneas disminuye . La energía se restaura cuando dos diferentes líneas endogámicas se cruzan para producir la progenie de híbrido (Fi) . Una consecuencia importante de la homocigoticidad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par definido de endogámico siempre será el mismo. Una vez que los endogámicos que dan un híbrido superior se han identificado, la semilla híbrida se puede reproducir por un tiempo indefinido tanto como la homogeneidad de los precursores endogámico se mantenga. Mucha de la energía del híbrido exhibida por los híbridos Fx se pierde en la siguiente generación (F2) . Consecuentemente, la semilla de híbridos no se usa para almacenamiento para planta. La producción de semilla híbrida requiere la eliminación o inactivación del polen producido por la madre femenina. La remoción o inactivación incompleta del polen proporciona el potencial para auto polinización. Esta semilla autopolinizada inadvertidamente puede ser cosechada no intencionalmente y empacada con la semilla híbrida.

Una vez que la semilla se planta, es posible identificar y seleccionar aquellas plantas autopolinizadas . Estas plantas autopolinizadas serán equivalente genéticamente a la línea de endogámico femenino usada para producir el híbrido. Como se palpa fácilmente por un experto en la técnica, las anteriores son solamente algunas de las diferentes formas mediante las cuales el endogámico de la presente invención se puede obtener por aquellos • que buscan hacer introgresión del genotipo transgénico de la invención en tras líneas de maíz. Están disponibles otros medios, y los ejemplos anteriores son solamente ilustrativos .

EJEMPLOS La invención además estará descrita por referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan para propósitos de ilustración solamente, y no están proyectados para ser limitativos a menos que se especifique de otra manera. Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar usadas en la presente son bien conocidas en la técnica y se describen por Ausubel (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994) ; J. Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed. , Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) ; y por T. J. Silhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) .

Ejemplo 1. Transformación y Selección del Evento MIR604. EL evento MIR604 fue producido por transformación mediada de Agrobacterium de la línea de maíz endogámico (Zea mays) A188. El callo embriogénico Tipo I se transformó esencialmente como se describe en Negrotto y colaboradores, (Plant Cell Repórts 19:798-803, 2000), incorporado en la presente por referencia, usando un fragmento de /ADN de plásmido pZM26 (Figura 1) . El pZM26 contiene una secuencia de nucleótido que comprende casetes de expresión de tándem. El primer cásete .de expresión se compone de una secuencia de promotor MTL (Patente de EUA No. 6,018,099) ligada operablemente a una secuencia de codificación cry3A055 además ligada operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción de la Terminal 3' de sintetasa nopalina. El segundo cásete de expresión se compone de un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbInt) (Christensen y colaboradores, 1992 PMB 18:675) ligado operablemente a una secuencia de codificación pmi ligada operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción de Terminal 3' de sintasa de nopalina. Los embriones inmaduros fueron extraídos de mazorcas de 8-12 días de edad y enjuagados con medio fresco en preparación para la transformación. Los embriones fueron mezclados con la suspensión de células Agrobacterium que albergan el vector de transformación pZM26, se pusieron en torbellino por 30 segundos, y dejado para incubar por unos 5 minutos adicionales. La solución de Agrobacterium fue aspirada y los embriones fueron luego movidos a placas que contienen un medio de cultivo no selectivo. Los embriones fueron cocultivados con el Agrobacterium remanente a 22 °C por 2-3 días en la oscuridad. Los embriones fueron transferidos a medio de cultivo alimentado con ticarcilina (100 mg/ml) y nitrato de plata (1.6 mg/1) e incubados en la oscuridad por 10 días. Los embriones que producen callo embriónico fueron transferidos a medio de cultivo de célula que contiene mañosa . Las plántulas regeneradas fueron evaluados por análisis de TAQMAN® PCR (ver Ejemplo 2) para la presencia de ambos genes el pmi y el cry3A055, además para la ausencia del gen de espectomicina de resistencia antibiótica (Spec) . Las plantas positivas para ambos transgenes, y las negativas para el gen spec, fueron transferidas al invernadero para mayor propagación. Los eventos positivos fueron identificados y separados por exclusión usando bioensayos de insectos contra gusano de raíz de maíz. Los eventos insecticidas fueron caracterizados por número de copias por el análisis TAQMAN. El MIR604 se seleccionó para más análisis con base en que tiene una copia única de los transgenes, buena expresión de proteína como se identificó por ELISA, y buena actividad insecticida contra gusano de raíz de maíz. El T0 MIR604 fue retrocruzado con la línea de maíz de endogámico CG00526, creando la población Tx. Las plantas Ti fueron auto polinizadas para crear la generación T2, y este proceso fue repetido para crear una generación T3. La evaluación de progenie de las plantas T3 se empleó para identificar familias homocigóticas (convertidas) . El endogámico CG0052 convertido de MIR604 fue cruzado con otras líneas endogámicas de clase superior para crear híbridos usados en más estudios .

Ejemplo 2. Detección de MIR604 por PCR TAQMAN 'El análisis de TAQMAN se llevó a cabo esencialmente como se describe en Ingham y colaboradores, (Biotechniques, 31:132-140, 2001) incorporada en la presente por referencia. Brevemente, el ADN genómico fue aislado de las hojas de plantas de maíz transgénicas y no transgénicas usando el kit de Puregene® Genomic DNA Extraction (Gentra Systems, Minneapolis, MN) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que todos los pasos fueron conducidos en placas de 96 pozos de 1.2 ml . El granulo de ADN seco se volvió a suspender en solución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 Mm, pH 8.0, EDTA 1 mM) : Las reacciones de TAQMAN PCR se llevaron a cabo en placas de 96 pozos. Para los cebadores y sondas de control de gen de maíz endógenos fueron diseñados específicos para el gen de deshidrogenada de alcohol de (adh) Zea mays (No. De Adquisición de Genbank AF044295) . Se reconocerá por la persona experta que otros genes de maíz se pueden usar como controles endógenos. Las reacciones fueron multiplexadas para amplificar simultáneamente cry3A055 y adh o pmi y adh . Para cada ejemplo, se generó una mezcla maestra por combinación de 20 µL de ADN genómico extraído con 35 µL de TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suplementada con cebadores para una concentración final de 900 nM cada uno, las sondas para una concentración final de 100 nM cada uno, y agua para un volumen final de 70 µL. Esta mezcla se distribuyó en tres réplicas de 20 µL cada una en placas de amplificación de 96 pozos y se sellaron con película de sello por calor ópticamente transparente (Marsh Bio Products) . La PCR se corrió en el instrumento ABI Prism 7700 que usa los siguientes parámetros de amplificación: 2 min a 50°C y 10 min a 95°C, seguido por 35 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C.

Los resultados del análisis de TAQMAN demostraron que el evento MIR 604 tuvo una copia del gen cry3A055 y una copia del gen pmi . Ejemplos de combinaciones de secuencia de cebador/sonda apropiadas las cuales fueron usadas son: Nombre del Cebador Secuencia del Cebador SEQ ID NO: Cry3A005 -delantero 5 ' -TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3 ' SEQ ID NO: 47 Cry3A005 -inverso 5 '-CGATCAGGTCCAGCACGG-3 ' SEQ ID NO: 48 Cry3A005 -sonda 5 ' -CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3 ' SEQ ID NO: 49 (5' etiqueta = FAM, 3' etiqueta = TAMRA) PMI-delantero 5 '-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3 ' SEQ ID NO: 50 PMI-inverso 5 ' -GCCGTGGCCTTTGACAGT-3 ' SEQ ID NO: 51 PMI-Sonda 5' -TGCCGCCAACGAATCACCGG-3 ' SEQ ID NO: 52 (5' etiqueta = FAM, 3' etiqueta = TAMRA) ZmADH-267delantero 5 ' -GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3 ' SEQ ID NO: 53 ZmADH-337Ínverso 5' -TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3 ' SEQ ID NO: 54 ZmADH-316sonda 5 ' -TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGT -3 ' SEQ ID NO: 55 (5' etiqueta = TET, 3' etiqueta = TAMRA) Ejemplo 3. Detección de MIR604 por técnica Southern blot. El ADN genómico usado para análisis de southern se aisló del tejido de hoja acumulado de diez plantas que representan la generación seis de retrocruzamiento (BC6) de MIR604 usando esencialmente el método de Thomas y colaboradores, (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993) , incorporado en la presente por referencia. Todas las plantas usadas para aislar ADN fueron analizadas individualmente usando TAQMAN PCR (como se describe en el Ejemplo 2) para confirmar la presencia de una copia única del gen cry3a055 y el gen pmi . Para los controles de segregados negativos, el ADN se aisló de tejido de hoja acumulado de cinco plantas que representan la generación BC4 del evento MIR604. Estas plantas de segregados negativos fueron analizadas individualmente usando TAQMAN PCR y los ensayos fueron negativos para la presencia del gen cry3A055 y el gen pmi , pero fueron, como se esperaba, positivo para el control interno del ensayo, el gen adh de maíz endógeno. El análisis de Southern se llevó a cabo usando técnicas de biología molecular convencional. EL ADN genómico (7.5 µg) fue digerido con enzima de restricción Kpnl, la cual tuvo un sitio de reconocimiento único dentro del inserto de T-ADN de MIR604 de plásmido pZM26 (figura 1) . Este planteamiento se permite para la determinación del número de copias de los elementos, que corresponden a la sonda específica usada para cada Southern, la cual ha sido incorporada en MIR604. Esto resulta en una banda de hibridización por copia del elemento presente en MIR604. Siguiendo la electroforesis de gel de agarosa y transferencia alcalina a una membrana Nutran®, las hibridizaciones se llevaron a cabo usando sondas generadas con PCR de longitud completa específica de elemento. La sonda usada en el Southern blot para cry3A055 y pmi comprende las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 61, respectivamente. Las sondas fueron etiquetadas con 32P vía cebado aleatorio usando el sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1633) . Se usaron las siguientes condiciones de hibridización de severidad alta: 1-2 millones de cpm/ml se agregaron al PerfectHyb (Sigma) suplementado con 100 µl/ml de ADN de Timo de Becerro (Invitrigen) precalentado a 65 °C. La prehibridización tiene lugar en la misma solución como anteriormente, a la misma temperatura durante la noche por al menos una hora. La hibridización se llevó a cabo a 65°C por 3 horas seguida por lavado 2X en 2X SSC, SDS 0.1% por 20 minutos a 65°C y 2X en SSC 0.1X, SDS 0.1% por 20 minutos a 65°C. En cada Southern estuvieron incluidas tres muestras de control: (1) ADN de un segregado negativo (no transformado) usado para identificar cualquier secuencia Zea mays endógena que pueda hibridizar en cruce con la sonda específica del elemento; (2) el ADN de un segregado negativo en el cual se introduce una cantidad de pZM26 digerido por Kpnl que es igual a un número de copia basado en la longitud de la sonda. Para demostrar la sensibilidad del experimento en la detección de una copia de gen único dentro del genoma Zea mays; y (3) el plásmido pZM26 digerido de Kpnl que es igual a un número de copia basado en la longitud de la sonda, como un control positivo para hibridización además para demostrar la sensibilidad del experimento.

Los datos de hibridización proporcionan evidencia confirmatoria para soportar el análisis TAQMAN PCR que MIR604 contiene una copia única de los genes cry3A055 y pmi , y que MIR604 no contiene ninguna de las secuencias de soporte de vector presente en pZM26. Como se espera para ambas sondas cry3A055 y pmi , el producto de digestión Kpnl resultó en una banda de hibridización del tamaño correcto, demostrando que una copia única de cada gen está presente en el evento MIR604. Adicionalmente, para la sonda de soporte la carencia de hibridización demuestra la ausencia de cualquier secuencia de soporte de vector pZM26 que está incorporada en MIR604 durante el proceso de transformación.

Ejemplo 4. Secuenciamiento del Inserto T-ADN. La secuencia de nucleótido del inserto de ADN de transgen entero presente en el evento MIR604 se determinó para demostrar la integridad general del inserto, lo contiguo de los elementos funcionales y para detectar cualquier cambio de par de base individual. El inserto de MIR604 fue amplificado por PCR de ADN derivado de la generación BC5 como dos fragmentos de traslape individual . Cada fragmento fue amplificado usando un cebador homólogo de polinucleótido para secuencias genómicas de planta que flanquea el inserto MIR604 y un cebador polinucleótido homólogo para el gen cry3A055. Para generar el fragmento 5', un homólogo de cebador del primer polinucleótido para la secuencia de flanqueo 5', 5'SI (SEQ ID NO: 15) se combinó con un segundo homólogo de cebador de polinucleótido para el ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5 'ASI (SEQ ID NO: 28) . Para generar el fragmento 3 ' , un primer homólogo de cebador de polinucleótido para la secuencia de flanqueo 3', 9268AS (SEQ ID NO: 45), se combinó con un segundo homólogo de cebador de polinucleótido para el ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5161S (SEQ ID NO: 28) .

La amplificación de PCR se llevó a cabo usando el sistema PCR Expand High Fidelity (Roche, Cat. No. 1732650) y los siguientes parámetros de amplificación: 2 minutos a 94 °C por 1 ciclo, seguido por 10 ciclos de 15 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55-65°C y 5 minutos a 68°C, seguido por 20 ciclos de 15 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55-65°C, y 5 minutos+5 segundos/ciclo de 72 °C, seguido por 1 ciclo de 7 minutos a 72°C. El amplicón que resulta de la amplificación de PCR usando la SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 28 comprende la secuencia de unión 5' (SEQ ID NO: 1). El amplicón que resulta de la aplicación de PCR usando SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 27 comprende la secuencia de unión 3' (SEQ ID NO: 2). Cada fragmento de secuenciamiento fue clonado individualmente en el vector pCR®-XL-TOPO (Invitrogen, Cat. No. K4700-20) y se identificaron y secuenciaron tres clones separados para cada fragmento. El secuenciamiento se llevó a cabo usando el analizador ABI3730XL usando química ABI BigDye® 1.1 o Big Dye 3.1 dGTP (para plantillas ricas de GC) . El análisis de secuencia se hizo usando empaque Phred, Phrap, y Consed de la Universidad de Washington y se llevó a cabo hasta un grado de error de menos que 1 en 10,000 bases (Ewing and Green, 1998) . La secuencia de consenso final se determinó por combinación de la secuencia de datos de los seis clones individuales (tres para cada fragmento de secuenciamiento) para generar una secuencia de consenso del inserto MIR604. .Además para validar cualquier discrepancia de par base individual entre el inserto MIR604 y el plásmido pZM26, los productos de PCR pequeños (aproximadamente 300-500 bp) específicos para cualquiera de las regiones donde una discrepancia de par base se observó en la secuencia de consenso inicial fue amplificada usando la misma metodología anterior. Para todas las discrepancias de par base putativas en el inserto MIR604, el secuenciamiento del producto de PCR directo resultó en picos claros únicos en todos los pares base en cuestión, indicando estas discrepancias probablemente están presentes en el inserto MIR604. La alineación se realizó usando el programa ClustalW con los siguientes parámetros: matriz de mareaje blosum55, castigo de abertura de brecha 15, castigo de extensión de brecha 6.66 (Thompson y colaboradores, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680) . Los datos de la secuencia de consenso para el inserto T-ADN MIT604 demuestran que la integridad general del inserto y continuidad de los elementos funcionales dentro del inserto como se proyectan en pZM26 han sido mantenidos. El análisis de secuencia reveló que ocurrieron algunos rompimientos en las terminaciones del borde derecho (RB) (SEQ ID NO: 57) y borde izquierdo (LB) (SEQ ID NO: 62) del inserto T-ADN durante el proceso de transformación que resulta en el evento MIR604. La porción RB del inserto T-ADN fue truncada por 44bp y la terminación LB del inserto T-ADN fue truncado por 43 bp. Estas eliminaciones no tienen efecto en la eficacia del inserto T-ADN y este fenómeno se ha observado previamente en transformación de Agrobacterium (Tinland & Hohn, 1995. Genetic Engineering, 17:209-229). Adicionalmente, se observaron tres cambios de par base en el inserto T-ADN MIR604. Una discrepancia ocurrió dentro del promotor MTL, una región reguladora que no codifica una proteína. Las dos discrepancias restantes ocurrieron dentro de la secuencia de codificación pmi y resultó en dos cambios de aminoácido; valina en posición 61 ha sido sustituida por alanita (V61A) y glutamina en posición 210 se ha sustituido por histidina (Q210H) . La alanita y valina ambas son aminoácidos alifáticos que resultan en una sustitución conservadora. El reemplazo de glutamina con histidina resulta en la sustitución de un residuo ácido para un residuo básico.

Ejemplo 5. Análisis de la Secuencia de ADN de flanqueo. La secuencia de ADN del genoma de maíz que flanquea el ADN heterólogo insertado dentro del genoma de la planta de maíz del evento MIR604 se obtuvo usando la tecnología OmniPlex™ esencialmente como se describe en Kamberov y colaboradores, (Proceedings of SPIE, Tools for Molecular Análisis and High-Throughput Screening, 4626:1-12, 2001), incorporado en la presente por referencia. Las secuencias de flanqueo 5' y 3' y las secuencias de unión fueron confirmadas usando procedimientos PCR estándar. Las secuencias de flanqueo y unión 5' fueron confirmadas usando un primer cebador de polinucleótido establecido en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 combinado con un segundo cebador de polinucleótido establecido en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. Las secuencias de flanqueo y unión 3' fueron confirmadas usando un primer cebador de polinucleótido establecido en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44 combinado con un segundo cebador de polinucleótido establecido en SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36. Será reconocido por la persona experta que otras secuencias de cebador se pueden usar para confirmar las secuencias de flanqueo y unión. El inserto MIR604 se encontró que flanquea en el borde derecho (secuencia de flanqueo 5') por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEQ ID NO: 5 y flanqueada en el borde izquierdo (secuencia de flanqueo 3') por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEQ ID NO: 6. La secuencia de unión 5' se establece en SEQ ID NO: 1. La secuencia de unión 3' se establece en SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 6. Detección de la proteína MIR604 vía ELISA Para caracterizar el rango de expresión de las proteínas Cry3A055 (el principio insecticida activo) e isomerasa de fosfomanosa (PMl) (el marcador seleccionable) en plantas de MIR604, las concentraciones de la proteína Cry3A055 y PMl fueron determinadas por ELISA en varios tejidos de planta y plantas completas en cuatro etapas de crecimiento (espiral, antesis, madurez de la semilla y envejecimiento) en dos híbridos (MIR604-B y MIR604-C) y un endogámico (MIR604-A) . Los híbridos fueron hemicigóticos para los transgenes en el evento MIR604, si el endogámico fue homocigótico para los transgenes . Las plantas completas y partes individuales (excepto polen) fueron reducidas a un polvo fino mediante el procesamiento que usa ya sea un molino de café, licuadora, molino Grindomix™ (Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA) , mortero con un pistilo o molino, o una combinación de estos dispositivos. Todo el procesamiento se hizo en la presencia ya sea de hielo seco o nitrógeno líquido. Las muestras fueron bien, mezcladas para asegurar homogeneidad. La muestra de tejido de planta completa, o una submuestra representativa, fue retenida para análisis, permitiendo suficiente tamaño de muestra para almacenamiento de archivo de muestras de tej ido de planta inversa. El por ciento de peso seco de cada muestra se determinó y las muestras procesadas fueron almacenadas a ca . -80°C hasta liofilización. El tejido fresco (excepto polen y silaje) y las muestras de la planta completa fueron extraídos. Para cada muestra analizada, una alícuota de 1.0 g del material fresco en polvo fue pesada en un tuvo de polipropileno de 15 ml, suspendido en 3 ml de solución amortiguadora de extracción [50 mM CAPS, NaCl 0.1M, EDTA 2mM, ditiotreitol 1 mM, HCl fluoruro de 4- (1-aminoetil) bencensulfonilo 1 mM, leupeptin 1 mM, pH 10] , y extraído usando un homogenizador Autogizer® (Tomtek; Hamden, CT, USA) . Después de centrifugación por 15 minutos a 10,000 x g a 4°C, el sobrenadante se usó para análisis de Cry3A055 y PMl por ELISA. Después del tratamiento con iodoacetamida como se describe por Hill y Straka (1988) , la proteína total en los extractos fue cuantificada usando el BCA™ Protein Assay Reagent (Pierce; Rockford, IL, USA) . Los extractos de polen fueron preparados por suspensión de polen 1:30 (w/v) en solución amortiguadora de extracción. Después de 30 minutos en hielo, las suspensiones de polen fueron interrumpidas por tres pasos a través de una célula de presión French a ca . 15,000 psi (1,054 kg/cm2), seguido por centrifugación a 14,000 x g por 5 minutos a 4°C. Los análisis de Cry3A055 y PMl por ELISA se realizaron en los sobrenadantes como se describe a continuación. La proteína total fue cuantificada como se describe a continuación. Los extractos de silaje fueron preparados por suspensión de silaje 1:25 (p/v) en 2X solución amortiguadora de extracción. Después de 30 minutos en hielo, las suspensiones de silaje fueron extraídas usando un homogeneizador Brinkmann Polytron® (Brinkmann; Westbury, NY, USA) . Después de centrifugación por 15 minutos a 10,000 x g a 4°C, el sobrenadante se usó para análisis de Cry3A055 y PMl por ELISA. La proteína total fue cuantificada como se describió anteriormente .

Cuantificación de Cry3A055. Los extractos preparados como se describieron anteriormente fueron analizados cuantitativamente para Cry3A055 por ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos policlonales anti Cry3A055 de conejo purificados de afinidad inmuno y anticuerpos policlonales anti Btt (Cry3A nativo de Bacillus thuringiensis subespecie tenebríonís) de cabra purificados de inmunoafinidad. El límite inferior de cuantificación del ELISA intercalado doble se estimó con base en la concentración más baja de la proteína de referencia pura que se encuentra en la porción lineal de la curva estándar, el volumen máximo de un extracto de control que podría se analizado sin interferencia antecedente, y el peso correspondiente de la muestra de la alícuota representada. Los niveles cuantificables de proteína Cry3A055 fueron detectados en todos los tejidos de planta derivada de MIR604 analizados excepto polen. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como promedio de las cinco muestras de tejido replicadas. Para silaje, se analizó una muestra; por lo tanto, no se pudo calcular el promedio. Los niveles de muestra de control estuvieron por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos. A través de todas las etapas de crecimiento, los niveles de Cry3A055 promedio medidos en hojas, raíces y todas las plantas estuvieron en el rango desde ca . 3-23 µg/g de peso fresco (4-94 µg/g de peso fresco) , ca. 2-14 µg/g de peso fresco (7-62 µg/g de peso seco), y alrededor de 0.9-11 µg/g de peso fresco (3-28 µg/g de peso seco), respectivamente. Los niveles de Cry3A055 promedio medidos en granos a la madurez de la semilla y envejecimiento están en el rango desde alrededor de 06-1.4 µg/g de peso fresco (0.8-2.0 µg de peso seco). Los niveles de Cry3A055 promedio medidos en tejido de piel a antesis estuvieron por debajo del límite inferior de cuantificación (LOQ), <0.1 µg/g de peso fresco (<1.0 µg/g de peso seco) . Los niveles de Cry3A055 promedio medidos en tejido de piel a madurez de semilla estuvieron en el rango desde alrededor de 0.6-1.9 µg/g de peso fresco (1-3 µg/g de peso seco) . Ninguna proteína Cry3A055 fue detectable en polen de ningún endogámico MIR604-A o híbridos MIR604-B y MIR604-C [límite de detección (LOD) = 0.07 µg/g de peso fresco, 0.15 MSí/ST ¿e peso seco] . Los niveles de Cry3A055 generalmente fueron similares entre los híbridos para cada tipo de tejido en cada momento de tiempo. Para la línea de endogámico, la expresión de Cry3A055 generalmente fue mayor que en los híbridos en hojas, raíces y plantas completas en las etapas de espiral y antesis, y en raíces a la madurez de la semilla. Los niveles de Cry3A055 medidos en tejidos silaje fueron en promedio 2.5 µg/g de peso fresco (7.3 µg/g de peso seco) durante 15, 29 y 75 días. Por comparación, el nivel de Cry3A055 medido en el material de la planta cortado antes de ensilado (Día 0 por silaje) fue alrededor de 8 µg/g de peso fresco (20 µg/g de peso seco) .

Cuantificación de PMl . Los extractos preparados como se describen anteriormente fueron analizados cuantitativamente para PMl por ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos de conejo policlonal purificados de Proteína A y de cabra policlonales purificados de inmunoafinidad específicos para PMl . El límite inferior de cuantificación del ELISA intercalado doble se estimó con base en la concentración más baja de proteína de referencia pura que se encuentra en la porción lineal de la curva estándar, el volumen máximo de un extracto de control que se podría analizar sin interferencia de antecedente, y el peso correspondiente de la muestra que la alícuota representada. La proteína PMl fue detectada en la mayoría de los tejidos de planta derivados de MIR604 analizados, aunque a niveles bajos. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como promedios de las cinco muestras de tejido replicadas. Para silaje, se analizó una réplica; por lo tanto, no se pudo calcular el promedio. Los niveles de muestra de control estuvieron por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos. A través de todas las etapas de las plantas, los niveles de PMl promedio medidos en hojas, raíces y todas las plantas estuvieron en el rango desde no detectable (ND) hasta ca . 0.4 µg/g de peso fresco (ND-2.1 µg/g de peso seco), debajo de LOQ (<0.03 µg/g de peso fresco) hasta alrededor de 0.2 µg/g de peso fresco (<0.1 - 1.0 µg/g de peso seco), y abajo del LOQ (<0.02 µg/g de peso fresco) hasta alrededor de 0.3 µg/g de peso fresco (<0.04 - 2 µg/g de peso seco), respectivamente.

Los niveles de PMl promedio medidos en granos en la madurez de la semilla y envejecimiento están en el rango desde por debajo de LOQ (<0.06 µg/g de peso freso) hasta alrededor de 0.4 µg/g de peso fresco (<0.07 - 0.5 µg/g de peso seco). Los niveles de PMl medidos en tejido de piel en antesis y madurez de semilla están en el rango desde por debajo de LOQ (<0.1 µg/g de peso fresco) hasta alrededor de 0.8 µg/g de peso fresco (<0.2 - 6.8 µg/g de peso seco) . PMl en polen en el rango desde alrededor de 1.9 - 2.6 µg/g de peso fresco (3.9 -5.2 µg/g de peso seco) . Los niveles de PMl generalmente fueron similares entre los genotipos endogámico e híbridos para cada tipo de tejido en cada momento de tiempo. El PMl no fue detectable en silaje en los tres momentos de muestreo (día 15, 29 y 75) , considerando que el nivel medido en el material de planta cortado antes de ensilado (Día 0 pre-silaje) fue alrededor de 0.3 µg/g de peso fresco (0.7 µg/g de peso seco) .

Niveles de proteína de Cry3A055 totales estimados por acre y por hectárea. Para la línea endogámica (MIR604-A) y ambos híbridos (MIR604-B y MIR604-C) , las plantas alcanzan su biomasa üiás grande en la madurez de la semilla. Las plantas también alcanzan sus niveles de Cry3A055 promedio estimados más altos en una base por acre (y por hectárea) en la madurez de la semilla y se estimó que contiene alrededor de 78, 141 y 240 g de Cry3A055/acre (193, 348 y 592 g/hectárea) por MIR604-A, MIR604-B y MIR604-C, respectivamente. Durante las estaciones de crecimiento y a través de los genotipos, se estima de Cry3A055 en plantas derivadas de MIR604 en el rango de niveles promedio desde alrededor de 8 g de Cry3A055/acre (21 g Cry3A055/hectárea) en la etapa de envejecimiento hasta alrededor de 240 g de Cry3A055/acre (592 g Cry3A055/hectárea) en la madurez de la semilla, asumiendo una densidad de plantado de 26,500 plantas por acre (65,500 plantas/hectárea) .

Ejemplo 7. Eficacia en Campo del MIR604 Gusano de Raíz de Maíz del Oeste y del Norte. Las plantas MIR604 fueron evaluadas para la eficacia contra el gusano de raíz de maíz del oeste y del norte en 12 localidades en los Estados Unidos. El MIR604 se evaluó con y sin la adición del tratamiento de semilla insecticida Cruiser®. Los grupos de control consistieron de semillas tratadas con dos diferentes grados de Cruiser® y uno de verificación no tratado. Los tratamientos consistieron de cuatro réplicas de dos filas de 17.5-20 pies (5.3-6.1 metros) espaciados 30" (76.2 cm) en el centro diseñados en un bloque completo aleatorio. Se seleccionaron diez plantas por tratamiento aleatoriamente y se evaluaron para la eficacia usando una escala de 0-3 en donde 0 = Ningún daño (el grado más bajo que se puede dar) ; 1 = Un nodo (círculo de raíces) , o el equivalente de un nodo completo, comido dentro de aproximadamente dos pulgadas (5 cm) de tallo (línea de tierra en el 7° nodo) ; 2 = Dos nodos completos comidos; 3 = tres o más nodos comidos (el grado más alto que se puede dar) . El daño entre los nodos completos comidos fue observado señalado como el porcentaje del nodo perdido, esto es, 1.5 = 1 % nodos comidos, 0.25 = Vi de un nodo comido. Los resultados, mostrados en la Tabla 1, demuestran que las raíces de dos líneas hermanas de MIR604, 3-11 y 3-12, sostuvieron significativamente menos daño de alimentación que las raíces de cualquier tratamiento Cruiser® o las raíces de control no tratadas. Las MIR604-3-11 y MIR6004-3-12 tuvieron grados de daño de raíz de 0.44 y 0.42, respectivamente, comparado con los tratamientos de Cruiser® de 0.25 y 1.25 mgA/Semilla, los cuales tuvieron daño en grados de 1.6 y 0.9, respectivamente, y la línea de control con un grado de daño de 2.14. Hubo una tendencia hacia grados de daño de raíz menores en las plantas de MIR604 cuyas semillas fueron tratadas con Cruiser®, sugiriendo que Cruiser® aumentó la proteína Cry3A055 o que hubo una sinergia posible entre Cruiser® y Cry3A055. Esto fue particularmente evidente en los tratamientos de 1.0 y 1.25 mgA/semilla MIR604 con grados de daño a raíz de 0.33 y 0.29, respectivamente.

Tabla 1. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semilla de Cruiser® . Línea de Maíz Tratamiento de Grado de Daño en Cruiser® Raíz (0-3 Escala (mgA/Semilla) CRW) MIR604-3-11 ¡5 0.44 MIR604-3-12 0 0.42 MIR604 0.25 0.43 MIR604 0.50 0.39 MIR604 1.0 0.33 MIR604 1.25 0.29 Híbrido de Control 0.25 1.60 Híbrido de Control 1.25 0.99 Híbrido de Control 0 2.14 La eficacia de MIR604 se comparó con estándares de insecticida granular comercial aplicados en el surco. El diseño experimental fue como se describió anteriormente. Los resultados en la Tabla 2 demuestran que la eficacia de MIR604 fue comparable con los estándares comerciales en plantas de protección contra daño en alimentación de gusano de raíz de maíz.

Tabla 2. Comparación de eficacia de MIR604 con insecticidas comerciales aplicados en surco. Tratamiento Grado de Daño de Raíz (0-3 Escala CRW) MIR604 0.43 Forcé® 3G 0.44 Aztec® 6.7G 0.32 Lorsban® 15 G 0.75 Verificación no tratada 2.14 Gusano de Raíz de Maíz Mexicano. Las plantas MIR604 fueron evaluadas para resistencia al gusano de raíz de maíz mexicano en dos localizaciones en Texas. El diseño experimental fue esencialmente como se describió anteriormente. Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que ambos hermanos MIR604 sostuvieron daño de alimentación menor que los verificados no tratados. Hubo una respuesta positiva para el control del gusano de raíz de maíz Mexicano cuando el Cruiser se agregó a la semilla de MIR604. Fue evidente un grado claro de respuesta. Los resultados mostrados en la Tabla 4 demostraron que la eficacia de MIR604 fue comparable con los estándares comerciales en plantas de protección contra daño de alimentación de gusano de raíz de maíz Mexicano.

Tabla 3. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semilla con Cruiser contra gusano de raíz de maíz Mexicano.

Tratamiento Grado de Cruiser6 Grado de Daño de (MgA/Semilla) Raíz (0-3 Escala CRW) MIR604-3-11 0 1.14 0.125 0.19 0.25 0.18 0.50 0.09 1.25 0.02 MIR604-3-12 0 0.68 0.125 0.46 0.25 0.18 0.50 0.21 1.25 0.04 Híbrido de Control Ó.125 1.59 1.25 0.71 0 2.76 Tabla 4. Eficacia de MIR comparado con insecticidas comerciales aplicados en el surco contra gusano de raíz de maíz Mexicano . Tratamiento Grado de Daño de Raíz (0-3 Escala CRW) MIR604 0.68 Forcé® 3G 0.66 Aztec® 6.7G 0.88 Lorsban® 15 G 0.81 Verificación no tratada 2.76 Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes están incorporadas en la presente por referencia hacia la misma extensión como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, es obvio que ciertos cambios y modificación se pueden practicar dentro del alcance de la presente invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de nucleótido de unión de evento de maíz MIR604 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 2, y complementos de estos.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de secuencia de ADN inserta heteróloga de evento de maíz MIR604 y por lo menos 10 nucleótidos contiguos de ADN de genoma de planta de maíz que flanquea la secuencia de ADN inserta del evento de maíz MIR604.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de secuencia de ADN inserta heteróloga de evento de maíz MIR604 y por lo menos 20 nucleótidos contiguos de ADN de genoma de planta de maíz que flanquean la secuencia de ADN inserta de evento de maíz MIR60

4. 4. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de secuencia de ADN inserta heteróloga de evento de maíz MIR604 y por lo menos 50 nucleótidos contiguos de ADN de genoma de planta de maíz que flanquean la secuencia de ADN inserta de evento de maíz MIR604.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y complementos de estos.

6. Un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de planta de maíz en el evento de maíz MIR604, caracterizado porque comprende una secuencia de desde alrededor de 11 hasta alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y complementos de estos.

7. Un amplicón, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6.

8. Una secuencia cebadora de polinucleótido para detección de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra, caracterizada porque comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de posición 1-801 como se establece en SEQ ID NO: 3, o los complementos de esta.

9. El cebador de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 15, y complementos de estas.

10. Un cebador de polinucleótido, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de posición 507-1570 como se establece en SEQ ID NO: 4, o los complementos de esta.

11. El cebador de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39 hasta SEQ ID NO: 46, y complementos de estas.

12. Un par de cebadores de polinucleótido, que comprende un primer cebador de polinucleótido y un segundo cebador de polinucleótido los cuales funcionan juntos en la presencia de una plantilla de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz MIR604, caracterizado porque la primera secuencia de cebador es o se complementa a un genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de planta de maíz de evento de maíz MIR604, y la segunda secuencia de cebador de polinucleótido es o se complementa a la secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de planta de maíz del evento de maíz MIR604.

13. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 1-801 como se establece en SEQ ID NO: 3, o los complementos de esta.

14. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 15, y complementos de estos.

15. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 507-1570 como se establece en SEQ ID NO: 4, o los complementos de esta.

16. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39 hasta SEQ ID NO: 46, y complementos de estos.

17. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el segundo cebador de polinucleótido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 62, ó SEQ ID NO : 63, o los complementos de estos .

18. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segundo cebador de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16 hasta SEQ ID NO: 38, y complementos de estos.

19. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido se establece en SEQ ID NO: 15 y el segundo cebador de polinucleótido se establece en SEQ ID NO: 28.

20. El par de cebadores de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer cebador de polinucleótido se establece en SEQ ID NO: 45 y el segundo cebador de polinucleótido se establece en SEQ ID NO: 27.

21. Un método de detección de una secuencia de ADN en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) contacto de la muestra con un par de cebadores que, cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN del evento de maíz MIR604, produce un amplicón que es diagnóstico para el evento de maíz MIR604; (b) realización de una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esa manera el amplicón; y (c) detección del amplicón.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el amplicón comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, y complementos de estas .

23. Un método de detección de la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra, el método caracterizado porque comprende: (a) contacto de la muestra con una sonda que hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN genómico a partir del evento de maíz MIR604 y no hibridiza bajo condiciones de severidad alta con ADN de una planta de maíz de control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridización de severidad alta; y (c) detección de hibridización de la sonda al ADN.

24. Un kit para la detección de la presencia de ácidos nucleicos de MIR604 en una muestra biológica, el kit caracterizado porque comprende por lo menos una molécula de ADN que comprende una longitud suficiente de nucleótidos contiguos que son o se complementan a SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO : 3 , ó SEQ ID NO : , que funciona como un cebador o sonda de ADN específico para evento de maíz MIR604

25. Un método de detección de proteína de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica caracterizado porque comprende: (a) extracción de proteína de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604; (b) ensayo de la proteína extractada usando un método inmunológico que comprende anticuerpo específico para la proteína marcadora insecticida o seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detección del enlazamiento del anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable.

26. Una planta de maíz, caracterizada porgue comprende una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, o los complementos de estas .

27. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpnl resulta en una banda de hibridización cry3A055 única que usa una sonda específica de cry3A055 bajo condiciones de severidad alta.

28. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la sonda comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 59.

29. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpnl resulta en una banda de hibridización pmi única que usa una sonda específica de pmi bajo condiciones de severidad alta.

30. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la sonda comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO: 62.

31. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque se deriva del evento MIR604.

32. Un kit para detección de la presencia de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende una primera molécula de sonda que comprende por lo menos 11 nucleótidos contiguos ue son o se complementan a una secuencia de nucleótido del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3 desde alrededor de la posición de nucleótido 792 a través de alrededor de la posición de nucleótido 811 y una segunda molécula de sonda que comprende por lo menos alrededor de 11 nucleótidos contiguos que son o se complementan a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 desde alrededor de la posición de nucleótido 497 a través de alrededor de la posición de nucleótido 516, en donde la molécula hibridiza específicamente hasta la secuencia de nucleótido bajo condiciones de hibridización de severidad alta.

33. Un método de detección de la presencia de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) contacto de la muestra con un primer cebador de polinucleótido y un segundo cebador de polinucleótido que funcionan juntos en una reacción de amplificación de ácido nucleico en la presencia de una plantilla de ADN del evento de maíz MIR604 para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz; (b) realización de una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esa manera el amplicón; y (c) detección del amplicón.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el amplicón comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, y complementos de estas.

35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el amplicón comprende SEQ ID NO: 1, en donde la primera secuencia de cebador de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 15, y complementos de estas, y en donde la segunda secuencia de cebador de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16 hasta SEQ ID NO : 38, y complementos de estas.

36. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el amplicón comprende SEQ ID NO: 2, en donde la primera secuencia de cebador de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39 hasta SEQ ID NO: 46, y complementos de estas, y en donde la segunda secuencia de cebador de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16 hasta SEQ ID NO: 38, y complementos de estas .

37. Un método de detección de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende : (a) contacto de una muestra que comprende ADN con una sonda de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de hibridización de severidad alta y de lavado con el ADN de MIR604 y no hibridiza bajo condiciones de hibridización de severidad alta y de lavado con ADN de una planta de maíz diferente a MIR60 ; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridización y lavado de severidad alta; y (c) detección de hibridización de la sonda al ADN de evento MIR604.

38. Una muestra biológica derivada de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604, caracterizada porque la muestra comprende una secuencia de nucleótido que es o se complementa a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia es detectable en la muestra usando una amplificación de ácido nucleico o método de hibridización de ácido nucleico.

39. La muestra biológica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de harina de maíz, alimento de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

40. Un extracto derivado de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido homologa o complementaria a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

41. El extracto de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la secuencia es detectable en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridización de ácido nucleico.

42. El extracto de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de harina de maíz, alimento de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

43. Un método para producción de una planta de maíz resistente a por lo menos gusano de raíz de maíz, caracterizado porque comprende: (a) cruzamiento sexual de una primera planta de maíz precursora con una segunda planta de maíz precursora, en donde la primera o la segunda planta de maíz precursora comprende ADN de evento de maíz MIR604, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) selección de una planta de progenie de primera generación que es resistente a por lo menos infestación de gusano de raíz de maíz; (c) autofecundación de la planta de progenie de primera generación, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; (d) selección de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que por lo menos es resistente a infestación de gusano de raíz de maíz; en donde las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.